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糖基转移酶(glycosyltransfereases, GTs)能把不同活化糖基转移到糖链、核酸、蛋白质、脂质以及各种有机复合物等特异受体分子上,形成多糖分子和糖基化衍生物[1-2],在生物代谢中作用巨大。糖基转移酶广泛参与植物代谢反应。首先,细胞的各种重要代谢产物如糖蛋白、糖脂、核酸、淀粉和蔗糖等的糖基都必须在糖基转移酶作用下添加上去[4-5];其次,组成细胞壁的纤维素、半纤维素和果胶等细胞组分的形成都需要糖基转移酶参与[2];另外,它还可以通过调节各种植物生长调节剂的糖基化,改变生长调节剂活性,参与植物生长发育以及对逆境因子的响应过程[6-7]。植物中糖基转移酶及其相应基因功能研究对了解植物代谢效应,以及植物细胞对胞内、胞外环境的响应都有重要意义。编码该类酶的基因在基因组中成员众多,如拟南芥Arabidopsis thanliana中有450多个,水稻Oryza sativa中有600多个,杨树Populus trichocarpa中有800多个[1, 3]。该类基因通常以基因家族形式存在,目前已知的糖基转移酶家族超过90个,其中植物中有40多个[3]。植物中GT8糖基转移酶基因家族组成复杂,该基因家族成员数量众多,仅拟南芥中就有41个属于GT8家族的基因[1]。根据编码蛋白序列特征和功能,可将GT8基因家族分成2大类。一类为半乳糖醛酸转移酶(gAlac uronosyl transferase, GAUT),包括GAUT和GATL(GAUT-Like)2个子类。目前研究认为:该类基因主要参与果胶和木聚糖的生物合成,如拟南芥中GAUT1编码的蛋白为半乳糖醛酸聚糖糖基转移酶,参与果胶合成[8]。AtGAUT12的突变能大幅度降低植株中木聚糖含量[9],GUX1,GUX2和GUX5也都参与植物木聚糖合成[10],而果胶和木聚糖是细胞壁合成所必需的,表明GT8家族的基因在植物细胞壁合成中发挥重要作用[11-12]。另一类包括植物类糖原淀粉合成起始蛋白(plant glycogenin-lilke starch intiation proteins, PGSIPs)和乳糖苷合成酶(galactinol synthses, GolSs)。其中PGSIPs参与淀粉生物合成的启动[13];GolSs则是棉子糖类多糖合成的关键酶,后者能够作为渗透调节剂在植物逆境响应中发挥重要作用[14-15]。糖基转移酶家族成员众多,糖基转移酶功能特异性很强,即使添加同一个活化糖基,也可能因为受体不同而需要不同糖基转移酶来完成[5];而且,不同家族成员在功能上也存在交叉现象[16]。这些问题给糖基转移酶基因功能研究带来了很大困难。植物中糖基转移酶相关基因功能研究仍处在起步阶段,林木中此类基因的具体功能更是知之甚少。桉树Eucalyptus是世界上三大用材树种之一,其生产和地域分布极易受到低温、干旱、高温和高盐等非生物逆境因子的影响。EgrGATL1(Eucgr. I01882)是巨桉Eucalyptus grandis GT8家族中一个基因成员,前期研究中发现该基因表达受低温胁迫诱导,表明该基因可能与巨桉逆境响应有一定关系。目前一般认为植物GATL子类中的基因也主要与果胶和木聚糖生物合成有关[9, 17-18],但在水稻中也发现多个OsGATL基因受低温、干旱和ABA处理的诱导,暗示植物中GATL基因可能在非生物逆境胁迫响应中发挥了一定功能[19]。本研究从EgrGATL的序列特征和低温、干旱和高盐胁迫以及脱落酸(ABA),茉莉酸甲酯(MeJA)处理下基因表达角度上,分析了EgrGATL1与巨桉抗逆的关系,为其进一步功能的研究提供依据。
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本研究所用材料为巨桉G5无性系,来源于中国林业科学研究院热带林业研究所曾炳山研究员实验室。无性系幼苗种植于浙江农林大学苗圃地。选取苗龄3个月,长势一致的巨桉无性系幼苗作为实验材料。在植物生长箱(Snijders MC1000,荷兰)中正常培养,日温为25 ℃,夜温为22 ℃;光照/黑暗为14 h/10 h;光强为150 μmol·m-2·s-1,相对湿度为70%。
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根据基因注释编号Eucgr. I01882,从https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_ Egrandis下载该基因核酸序列和蛋白序列。设计全长引物(表 1)进行聚合酶链式反应(PCR)扩增,测序验证。其编码蛋白氨基酸序列用Protparam(http://www.expasy.ch/tools)软件进行分子量、等电点分析。结构域搜寻用保守域数据库(CDD. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)结合EgrGATL1不同植物中同源蛋白多序列比对(Clustalx)以及GT8基因家族相关基因分析文献进行[1, 20]。
引物用途 引物名称 引物序列(5′→3′) 全长扩增 EgrGATL1-F CTTCTTCTTCCCATATCGCAGC EgrGATL1-F TTGATTCTCGAGCCGAACATAG qRT-PCR分析 Egr18SrRNA-qRT-F CGCGCTACACTGATGTATTC Egr18SrRNA-qRT-R GTACAAAGGGCAGGGACGTA EgrGATL1-qRT-F ATCTGCTTCCTCCTGCTCC EgrGATL1-qRT-R CCCTCAGGTACTCGAAATCC Table 1. List of primer sequences used in RT-PCR
EgrGATL1进化分类按照ULVSKOV对GATL基因的分类标准[21],分别选取不同子组中相应拟南芥GATL蛋白序列,与EgrGATL1一起,用MEGA软件构建1 000个自举重复无根邻接进化树,对其作进化分类。
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3个月苗龄巨桉幼苗于4 ℃低温生长箱中,为避免由于取样时间点不同对基因表达造成影响,实验采用先后间隔0,24,36,42,46 h依次放入生长箱处理,以25 ℃生长条件下幼苗作为对照(ck)。处理完毕后一起收获叶片(摘取枝条顶芽下面第3~5片完全展开的叶片),迅速投入液氮中,提取RNA进行数字表达谱(DGE)测序(诺禾致源)。结果中差异表达基因(>2倍)用加权基因共表达网络分析(WGCNA)计算与EgrNAC1具有共表达关系基因的Pearson系数(rco),根据rco大小进行基因排序。选取rco或rco绝对值>0.9的基因,将这些基因的编码蛋白序列在UniProtKB蛋白数据库中进行Blastp(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对,在域值E值<e-5范围内筛选匹配度最好的一项提取蛋白序列编码。然后将所有注释蛋白的序列编码提交到可视化整合蛋白注释数据库(DAVID)中,对比京都基因与基因组百科全书(KEGG)进行分析(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp),对能够在KEGG中找到相应代谢途径的共表达基因进行统计、分析。
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参考魏晓玲等[22]的方法,在生长箱中以25 ℃生长条件下幼苗作为对照(ck),-8,-4,0,4,8和42 ℃分别处理2 h;4 ℃不同时间处理实验同1.3。处理后植株叶片迅速放入液氮,用于RNA提取。高盐处理则将植株置于不同塑料容器(60 L)内,处理组塑料容器内保持植株栽培盆1/3高度的200 mmol·L-1氯化钠溶液,对照组则用清水保持同样液面高度。同样采用间隔0,24,48,60,66 h的方法依次放入处理苗;干旱处理用5,3,2,1 d不浇水植株作为处理组,正常浇水的作为对照。100 μmol·L-1 ABA和100 μmol·L-1 MeJA处理采用植株叶面喷施的方法,ABA以喷施激素溶液后6,12,24,48 h植株作为处理组;MeJA以喷施激素溶液后2,12,24 h植株作为处理组,未喷施植株作为对照组(ck)。实验结束后,统一收获叶片,提取RNA。实验设9株·处理-1,3株·重复-1,共3个重复。
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根据王亚红等[23]的方法提取样品RNA。组织特异性表达分析以正常生长条件下苗龄3个月的巨桉根、木质部、韧皮部和叶为RNA提取材料。RNA反转录利用PrimeScrip®RT reagent Kit(TaKaRa,大连,中国)试剂盒完成。定量荧光染料SYBR-Green(Takara,大连,中国)和BIO-RAD CFX96实时PCR系统(Bio-Rad,美国)用于EgrGATL1基因的定量RT-PCR。以Egr18SrRNA作为内参基因,实验设3个重复。结果用Bio-Rad CFX Manager(Version 1.5.5.34)软件进行分析。并用GraphPad(ver 4.0)进行作图。引物序列见表 1。