留言板

尊敬的读者、作者、审稿人, 关于本刊的投稿、审稿、编辑和出版的任何问题, 您可以本页添加留言。我们将尽快给您答复。谢谢您的支持!

姓名
邮箱
手机号码
标题
留言内容
验证码

玻璃化冻存对鲫鱼卵细胞活性的影响

沈蔷 章海敏 施旆旆 胡军祥

沈蔷, 章海敏, 施旆旆, 胡军祥. 玻璃化冻存对鲫鱼卵细胞活性的影响[J]. 浙江农林大学学报, 2014, 31(1): 83-88. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2014.01.013
引用本文: 沈蔷, 章海敏, 施旆旆, 胡军祥. 玻璃化冻存对鲫鱼卵细胞活性的影响[J]. 浙江农林大学学报, 2014, 31(1): 83-88. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2014.01.013
SHEN Qiang, ZHANG Haimin, SHI Peipei, HU Junxiang. Effects of vitrification in crucian carp(Carassius cuvieri) oocytes[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2014, 31(1): 83-88. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2014.01.013
Citation: SHEN Qiang, ZHANG Haimin, SHI Peipei, HU Junxiang. Effects of vitrification in crucian carp(Carassius cuvieri) oocytes[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2014, 31(1): 83-88. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2014.01.013

玻璃化冻存对鲫鱼卵细胞活性的影响

doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2014.01.013
基金项目: 

基金项目 项目编号

浙江省自然科学基金资助项目 LY13C110001

详细信息
    作者简介: 沈蔷,从事动物生理和低温生物学等研究。E-mail:shen.qiang.105@163.com
    通信作者: 胡军祥,教授,博士,从事动物生理和低温生物学等研究。E-mail:hjxy060222@163.com
  • 中图分类号: S965.117;Q959.46+8

Effects of vitrification in crucian carp(Carassius cuvieri) oocytes

  • 摘要: 以鲫鱼Carassius cuvieri未成熟的卵细胞为材料,研究了玻璃化冻存对鲫鱼卵细胞的存活率及琥珀酸脱氢酶(SDH)活性的影响。结果表明:鲫鱼卵细胞存活率在1~6 d下降明显,6~8 d下降趋势减弱,保持相对稳定;琥珀酸脱氢酶活性呈显著下降(P<0.05)。玻璃化冻存液VSd组的冻存效果最好,其组分为180.0 g·L-1 1,2-丙二醇,110.0 g·L-1甲醇,0.1 mol·L-1 海藻糖和40.0 g·L-1 聚乙二醇。该玻璃化冻存液配方及方法在一定时间内保存鲫鱼未成熟卵细胞具有一定的应用价值。
  • 图  1  不同玻璃化溶液(VS1-VS6组)对鲫鱼卵细胞存活率的影响(n=6)

    Figure  1  Changes of survival rate of VS1-VS6 (n=6)

    图  2  不同玻璃化溶液(VSa-VSe组)对鲫鱼卵细胞存活率的影响(n=5)

    Figure  2  Changes of survival rate of VSa-VSe (n=5)

    图  3  不同玻璃化溶液(VS1-VS6组)对鲫鱼卵细胞SDH活性的影响(n=6)

    Figure  3  SDH activity of eggs in VS1-VS6 (n=6)

    图  4  不同玻璃化溶液(VSa-VSe组)对鲫鱼卵细胞SDH活性的影响(n=5)

    Figure  4  SDH activity of eggs in VSa-VSe (n=5)

    表  1  不含海藻糖的玻璃化溶液

    Table  1.   Vitrification solutions without trehalose

    玻璃化溶液渗透性保护剂非渗透性保护剂
    1,2-丙二醇/(g.L-1)二甲基亚砜/(g.L-1)甲醇/(g.L-1)乙酰胺/(g.L-1)蔗糖/(mol.L-1)聚乙二醇/(g.L-1)
    VS1100.0120.0140.0150.00.450.0
    VS2120.0160.0120.0140.00.720.0
    VS3140.0200.0100.0130.00.360.0
    VS4160.0100.0150.0120.00.630.0
    VS5180.0140.0130.0110.00.270.0
    VS6200.0180.0110.0100.00.540.0
    下载: 导出CSV

    表  2  含海藻糖的玻璃化溶液

    Table  2.   Vitrification solutions with trehalose

    玻璃化溶液渗透性保护剂非渗透性保护剂
    1,2-丙二醇/(g.L-1)甲醇/(g.L-1)海藻糖/(mol.L-1)聚乙二醇/(g.L-1)
    VSa120.0140.00.0560.0
    VSb140.0130.00.1520.0
    VSc160.0120.0080.0
    VSd180.0110.00.1040.0
    VSe200.0150.00.20100.0
    下载: 导出CSV
  • [1] GUAN Mo,RAWSON D M,ZHANG Tiantian. Cryopreservation of zebrafish (Danio rerio) oocytes by vitrification[J]. Cryoletters,2010,31(3):230-238.
    [2] WALLACE R A,SELMAN K. Ultrastructural aspects of oogenesis and oocyte growth in fish and amphibians[J]. J Electron Microsc Technol,1990,16(3):175-201.
    [3] 吕众,张毅,魏华. 2种分离斑马鱼卵母细胞方法的比较[J]. 生物技术通报,2008(增刊):342-346.

    LÜ Zhong,ZHANG Yi,WEI Hua. Comparison of two separating methods of zebrafish oocytes culture in vitro[J]. Biotechnol Bull,2008(supp):342-346.
    [4] 杨琼霞. 玻璃化冻存小鼠脑细胞的研究[D]. 临安:浙江农林大学, 2008.

    YANG Qiongxia. Study on Mice Brain Cells Cryopreserved by Vitrification[D]. Lin'an:Zhejiang A & F University, 2008.
    [5] 黄佩龙,张绍志,虞效益,等. 玻璃化冻存对羊软骨细胞的影响[J]. 浙江农林大学学报,2011, 28(2):269-274.

    HUANG Peilong,ZHANG Shaozhi,YU Xiaoyi,et al. Vitrification of chondrocyte from Ovis aries[J]. J Zhejiang A & F Univ,2011,28(2):269-274.
    [6] PLACHINTA M,ZHANG T,RAWSON D M. Studies on cryoprotectant toxicity to zebrafish (Danio rerio) oocytes[J]. Cryoletters,2004,25(6):415-424.
    [7] ZHANG Qingjing, ZHOU Guangbin,WANG Yanping,et al. Cryoprotectants protect medaka (Oryzias latipes) embryos from chilling injury[J]. Cryoletters,2012,33(2):107-116.
    [8] 章龙珍,刘宪亭,鲁大椿,等. 鱼类胚胎冷冻保存前几个因子对其成活率影响的研究[J]. 淡水渔业,1992,22(1):20-24.

    ZHANG Longzhen,LIU Xianting,LU Dachun,et al. Effects of several factors on the survival rate of fish embryo before it cryopreserved[J]. Freshwater Fish,1992,22(1):20-24.
    [9] ZHANG Tiantian,RAWSON D M. Feasibility studies on vitrification of intact zebrafish (Brachydanio rerio) embryos[J]. Cryobiology,1996,33(1):1-13.
    [10] 章龙珍,刘宪亭,鲁大椿,等. 玻璃化液对鲢鱼胚胎成活的影响[J]. 淡水渔业,1996,26(5):7-10.

    ZHANG Longzhen,LIU Xianting,LU Dachun,et al. Effects of vitrification on the survival of silver carp embryo[J]. Freshwater Fish,1996,26(5):7-10.
    [11] 田永胜,陈松林,严安生,等. 鲈鱼胚胎的玻璃化冷冻保存[J]. 动物学报,2003,49(6):843-850.

    TIAN Yongsheng,CHEN Songlin,YAN Ansheng,et al. Cryopreservation of the sea perch (Lateolabrax japonicus) embryos by vitrification[J]. Acta Zool Sin,2003,49(6):843-850.
    [12] 陈宝安,王俊,薛萌,等. MTT比色法的改良及其在LAK细胞活性检测中的应用[J]. 东南大学学报:医学版,2001,20(3):150-152.

    CHEN Bao'an,WANG Jun,XUE Meng,et al. Improvements of MTT assay and its application to the detection of lymphokine activated killer cells' activity[J]. J Southeast Univ Med Sci Ed, 2001,20(3):150-152.
    [13] MAZUR P. Freezing of living cells:mechanisms and implications[J]. Am J Physiol Cell Physiol,1984,247:c125-c142.
    [14] ZHANG Tiantian,RAWSON D M,TOSTI L,et al. Cathepsin activities and membrane integrity of zebrafish (Danio rerio) oocytes after freezing t-196℃ using controlled slow cooling[J]. Cryobiology,2008,56(2):138-143.
    [15] ZERON Y,TOMCZA M,CROWE J,et al. The effect of liposomes on thermotropic membrane phase transitions of bovine spermatozoa and oocytes:implications for reducing chilling sensitivity[J]. Cryobiology,2002,45(2):143-152.
    [16] FUKU E,LIU Jianmin,DOWNEY B R. In vitro viability and ultrastructural changes in bovine oocytes treated with a vitrification solution[J]. Mol Reprod Dev,1995,40(2):177-185.
    [17] VALOJERDI M R,SALEHNIA M. Developmental potential and ultrastructural injuries of metaphase Ⅱ (MⅡ) mouse oocytes after slow freezing or vitrification[J]. J Assist Reprod Cenet,2005,22(3):119-127.
    [18] GHETLER Y A,YAVIN S,SHALGI R,et al. The effect of chilling on membrane lipidphase transition in human oocytes and zygotes[J]. Hum Reprod,2005,120:3385-3389.
    [19] CUMMINS J M. The role of mitochondria in the establishment of oocytes:functional competence[J]. Eur J Obstet & Gynecol Repord Bil,2004,115:s23-s29.
    [20] 汪亚平,王祖熊. 几种鱼类线粒体ATP酶活性的比较研究[J]. 水生生物学报,1993,17(3):216-221.

    WANG Yaping,WANG Zuxiong. A comparative study of activities of the mitochondria ATPase of the liver cells in several fishes[J]. Acta Hydrobiol Sin,1993,17(3):216-221.
    [21] BARRETO M C,PINTO R E,ARRABACA J D,et al. Inhibition of mouse liver respiration by Chelidonium majus isoquinoline alkaloids[J]. Toxi Lett,2003,146(1):37-47.
    [22] PIASECKA M,WENDA-ROZEWICKA L,OGONSKI T. Computerized aic studies as methods to evaluate the function of the mitochondrial sheath in rat spermatozoa[J]. Andrologia,2001, 33(1):1-12.
  • [1] 金京, 谢榕, 李霞, 周柳江, 杜永斌, 顾宇彤, 樊建庭.  3种不同寄主植物对黄脊竹蝗取食偏好性和生长发育的影响 . 浙江农林大学学报, 2020, 37(6): 1143-1148. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20190723
    [2] 李亚藏, 冯仲科, 黄季夏, 杨柳.  基于GIS和RS的东北地区东北虎生境适宜性评价 . 浙江农林大学学报, 2016, 33(2): 265-271. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2016.02.011
    [3] 于静, 劳秀杰, 陈彦永, 何小江, 代兵, 赵阿勇, 王晓杜, 宋厚辉.  猪圆环病毒2型实时荧光定量PCR检测方法的建立 . 浙江农林大学学报, 2016, 33(2): 357-363. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2016.02.023
    [4] 杨晓兰, 巩合德.  滇西北小型啮齿动物对不同植物种子的捕食差异调查 . 浙江农林大学学报, 2015, 32(3): 440-445. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2015.03.017
    [5] 杜雪, 李进军, 卢立志, 赵阿勇.  胆固醇7α-羟化酶基因研究进展 . 浙江农林大学学报, 2013, 30(5): 755-760. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2013.05.019
    [6] 余运威, 应叶青, 任丽萍, 胡加付, 赵阿勇.  浙江临安竹林土壤动物群落结构特征及多样性 . 浙江农林大学学报, 2012, 29(4): 581-587. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2012.04.015
    [7] 徐跃, 宋敏国, 杨仙玉, 袁进强.  中华大蟾蜍皮肤galectin-3 cDNA分子多样性及氨基酸变异分析 . 浙江农林大学学报, 2012, 29(4): 574-580. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2012.04.014
    [8] 汪荣.  福建滨海水鸟栖息地主成分分析与评价 . 浙江农林大学学报, 2011, 28(3): 472-478. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2011.03.020
    [9] 黄佩龙, 张绍志, 虞效益, 胡军祥.  玻璃化冻存对羊软骨细胞的影响 . 浙江农林大学学报, 2011, 28(2): 269-274. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2011.02.016
    [10] 朱曦, 王青良, 詹印波, 韩甫, 蒋洪赟, 周雯, 何于波.  浙江普陀山岛两栖爬行动物区系及分布 . 浙江农林大学学报, 2009, 26(5): 708-713.
    [11] 朱桂寿, 丁良冬, 俞根连, 周晓丽.  浙江省野生动物驯养繁殖业现状分析 . 浙江农林大学学报, 2008, 25(1): 109-113.
    [12] 邝粉良, 刘宁, 仓决卓玛, 李建川, 杨乐, 李福秀.  藏北黑颈鹤繁殖前期的昼间活动时间分配 . 浙江农林大学学报, 2007, 24(6): 686-691.
    [13] 韦福民, 陈水华, 范忠勇, 陈苍松, 方一峰.  大盘山国家级自然保护区鸟类群落及其分布特征 . 浙江农林大学学报, 2007, 24(4): 456-462.
    [14] 曹明, 李伟, 周伟, 张兴勇, 张仁功.  哀牢山自然保护区南华片黑颈长尾雉繁殖早期取食地选择 . 浙江农林大学学报, 2007, 24(2): 203-208.
    [15] 孟秀祥, 张东晶, 潘世秀, 惠岑怿, 冯金朝, 周宜君.  雌性圈养马麝行为的初步研究 . 浙江农林大学学报, 2007, 24(1): 72-76.
    [16] 胡忠军, 王淯, 薛文杰, 姜海瑞, 徐宏发.  陕西紫柏山自然保护区林麝种群密度 . 浙江农林大学学报, 2007, 24(1): 65-71.
    [17] 张纵, 梁南南, 郭玉东, 赵军.  鸟类保护的城市园林多样性途径探析 . 浙江农林大学学报, 2007, 24(4): 511-515.
    [18] 潘世秀, 孟秀祥, 冯金朝, 周宜君, 徐宏发.  小型林间独栖反刍动物栖息地选择研究进展 . 浙江农林大学学报, 2007, 24(3): 357-362.
    [19] 杨琼霞, 殷舒, 申屠垠, 高欣, 孙益, 胡军祥.  山核桃外果皮提取液对小鼠的辐射防护作用 . 浙江农林大学学报, 2006, 23(6): 604-607.
    [20] 陶树兴.  复混肥料中化肥含量对3种肥料微生物存活率的影响 . 浙江农林大学学报, 2006, 23(5): 507-511.
  • 加载中
  • 链接本文:

    https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.2014.01.013

    https://zlxb.zafu.edu.cn/article/zjnldxxb/2014/1/83

图(4) / 表(2)
计量
  • 文章访问数:  3075
  • HTML全文浏览量:  546
  • PDF下载量:  613
  • 被引次数: 0
出版历程
  • 收稿日期:  2013-03-04
  • 修回日期:  2013-04-27
  • 刊出日期:  2014-02-20

玻璃化冻存对鲫鱼卵细胞活性的影响

doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2014.01.013
    基金项目:

    基金项目 项目编号

    浙江省自然科学基金资助项目 LY13C110001

    作者简介:

    沈蔷,从事动物生理和低温生物学等研究。E-mail:shen.qiang.105@163.com

    通信作者: 胡军祥,教授,博士,从事动物生理和低温生物学等研究。E-mail:hjxy060222@163.com
  • 中图分类号: S965.117;Q959.46+8

摘要: 以鲫鱼Carassius cuvieri未成熟的卵细胞为材料,研究了玻璃化冻存对鲫鱼卵细胞的存活率及琥珀酸脱氢酶(SDH)活性的影响。结果表明:鲫鱼卵细胞存活率在1~6 d下降明显,6~8 d下降趋势减弱,保持相对稳定;琥珀酸脱氢酶活性呈显著下降(P<0.05)。玻璃化冻存液VSd组的冻存效果最好,其组分为180.0 g·L-1 1,2-丙二醇,110.0 g·L-1甲醇,0.1 mol·L-1 海藻糖和40.0 g·L-1 聚乙二醇。该玻璃化冻存液配方及方法在一定时间内保存鲫鱼未成熟卵细胞具有一定的应用价值。

English Abstract

沈蔷, 章海敏, 施旆旆, 胡军祥. 玻璃化冻存对鲫鱼卵细胞活性的影响[J]. 浙江农林大学学报, 2014, 31(1): 83-88. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2014.01.013
引用本文: 沈蔷, 章海敏, 施旆旆, 胡军祥. 玻璃化冻存对鲫鱼卵细胞活性的影响[J]. 浙江农林大学学报, 2014, 31(1): 83-88. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2014.01.013
SHEN Qiang, ZHANG Haimin, SHI Peipei, HU Junxiang. Effects of vitrification in crucian carp(Carassius cuvieri) oocytes[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2014, 31(1): 83-88. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2014.01.013
Citation: SHEN Qiang, ZHANG Haimin, SHI Peipei, HU Junxiang. Effects of vitrification in crucian carp(Carassius cuvieri) oocytes[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2014, 31(1): 83-88. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2014.01.013
  • 玻璃化冷冻保存技术对鱼类卵细胞的冷冻保存仍少见报道[1]。鱼类的卵与一般细胞相比由于其体积大,相对比表面积小,含水率高,卵黄多等特点,限制了水分的渗出和抗冻剂渗入的速率。同时由于卵细胞具有高度的冷冻敏感性,容易造成冷冻损伤[2]。因此,探索适合于鱼类卵细胞玻璃化冷冻保存技术,可为建立鱼卵细胞库提供技术与方法。本研究以鲫鱼Carassius cuvieri未成熟的卵细胞为材料,对几种毒性相对较低的渗透性抗冻剂的混合比例、玻璃化冻存对卵细胞存活率和琥珀酸脱氢酶(SDH)活性的影响进行研究,以期为鱼类卵细胞冷冻保存及损伤机制的研究提供实验依据。

    • 选取性发育成熟的雌性鲫鱼,用体积分数为75%乙醇消毒,剪开腹部,取出两侧卵巢,置于D-hank’s液中。去除卵巢周围的脂肪、结缔组织及血块等,撕开卵巢外膜并轻轻抖动,用移液管轻轻吹打卵细胞5~10次至卵细胞单个分离。用D-hank’s 溶液洗涤分离好的卵细胞2~3次[6]

    • 实验根据本课题组已成功冻存胚脑[4]、软骨[5]等细胞的玻璃化溶液为基础进行改良。根据Plachinta等[6]、Zhang 等[7]的研究结果,选用了对鱼卵细胞毒性较低的1,2-丙二醇(PG)为主因子,辅以二甲基亚砜、甲醇、乙酰胺、蔗糖、海藻糖和聚乙二醇(平均分子量为4000)等保护剂成分,再根据章龙珍等[8]和 Zhang 等[9]研究的耐受极限浓度,通过预实验确定各组分的浓度范围,然后进行均匀设计,以是否含有海藻糖分成2 组,共11 种玻璃化溶液(表 1~2),并根据Guan等[1]、章龙珍等[10]和田永胜等[11]的方法进行玻璃化形成能力检测,各组均能形成玻璃化。

      表 1  不含海藻糖的玻璃化溶液

      Table 1.  Vitrification solutions without trehalose

      玻璃化溶液渗透性保护剂非渗透性保护剂
      1,2-丙二醇/(g.L-1)二甲基亚砜/(g.L-1)甲醇/(g.L-1)乙酰胺/(g.L-1)蔗糖/(mol.L-1)聚乙二醇/(g.L-1)
      VS1100.0120.0140.0150.00.450.0
      VS2120.0160.0120.0140.00.720.0
      VS3140.0200.0100.0130.00.360.0
      VS4160.0100.0150.0120.00.630.0
      VS5180.0140.0130.0110.00.270.0
      VS6200.0180.0110.0100.00.540.0

      表 2  含海藻糖的玻璃化溶液

      Table 2.  Vitrification solutions with trehalose

      玻璃化溶液渗透性保护剂非渗透性保护剂
      1,2-丙二醇/(g.L-1)甲醇/(g.L-1)海藻糖/(mol.L-1)聚乙二醇/(g.L-1)
      VSa120.0140.00.0560.0
      VSb140.0130.00.1520.0
      VSc160.0120.0080.0
      VSd180.0110.00.1040.0
      VSe200.0150.00.20100.0
    • 将鲫鱼卵细胞在0 ℃下进行预平衡,采用三步平衡法:取100粒卵在1∶2稀释的玻璃化液中平衡10 min,再在1∶1稀释的玻璃化液中,平衡10 min后,取出转入玻璃化液中平衡10 min,分装入2.0 mL冷冻保存管中。

    • 将上述冷冻管进行标记,直接投入到液氮(-196 ℃)中保存,冻存时间为:1,2,3,4,6和8 d。

    • 从液氮中取出的冷冻管直接投入37 ℃的水浴中,充分振荡使其快速复温融化。

    • 复温融化后样品迅速转移到无菌离心管中。然后加入2倍体积的1.5 mol·L-1的蔗糖溶液,摇匀、静置10 min,去上清液,再加入2倍体积的0.5 mol·L-1的蔗糖溶液重悬浮,然后静置10 min,去上清液,加2倍体积的D-hank’s液重悬浮3次,去上清,加D-hank’s液摇匀备用。

    • 以台盼蓝拒染法检测细胞存活率。计算公式为: 细胞的存活率=(洗脱后的活细胞数/洗脱后的细胞数)×100%。

    • 根据Mosmann的方法[12]稍加改进,取冻存后洗脱的卵细胞于16孔无菌培养板中,加入1.0 mL 培养液,再加入5.0 g·L-1的 MTT溶液100 μL,放入37 ℃的50.0 mL·L-1二氧化碳培养箱中孵育240 min,使MTT充分被还原,然后加入1.0 mL二甲基亚砜,摇匀30 min,使结晶物充分溶解后,在酶标仪上测定570 nm处的吸光值。

    • 以上方法均随机选取多个样本,每个样本多次重复。采用Excel和SPSS软件对数据进行处理,利用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行分析,比较结果用字母a,b,c,d,e,f在图中标记,图中在表示标准误差的误差线上方的字母相同表示差异不显著(P>0.05),字母不同表示差异显著(P<0.05)。

    • 图 1所示为不含海藻糖组(VS1~VS6)玻璃化冻存液对鲫鱼卵细胞存活率的影响。经1~8 d的冻存后,各组卵细胞的存活率都随冻存天数的延长而呈下降趋势,6 d后下降趋势减弱。VS1组和VS3组在1~2及3~6 d的存活率下降幅度较大(P<0.05),在2~3 d和6~8 d之间变化不明显(P>0.05);VS2组的存活率在1,3,4和6 d之间存在显著性差异(P<0.05);VS4组的存活率在1,2,4和6 d之间存在显著性差异(P<0.05);VS5组的存活率除在2~3 d之间变化不明显外,在其他各天数之间都有显著变化(P<0.05);VS6组各天数之间均存在显著性差异(P<0.05)。比较各组存活率,VS4组的卵细胞存活率最高,经过1,2,3,4,6和8 d冻存后,卵细胞的存活率分别为65.49%±0.49%,57.97%±1.68%,56.79%±0.40%,54.89%±1.26%,41.82%±1.87%,39.96%±0.82%。

      图  1  不同玻璃化溶液(VS1-VS6组)对鲫鱼卵细胞存活率的影响(n=6)

      Figure 1.  Changes of survival rate of VS1-VS6 (n=6)

      图 2所示为海藻糖组(VSa~VSe)玻璃化冻存液在经过1~8 d的冻存后,对卵细胞存活率的影响。各组卵细胞的存活率都随冻存天数的延长而呈下降趋势,6 d后下降趋势减弱。VSa组和VSc组的存活率在1,2,4和6 d之间存在显著性差异(P<0.05);VSb组的存活率除在3~4 d之间下降不明显(P>0.05)外,在其他各天数之间都有显著性下降(P<0.05);VSd组的存活率在1,3,4和6 d之间存在显著性差异(P<0.05);VSe组的存活率在前6 d下降较快(P<0.05),在6~8 d之间变化不明显(P>0.05)。在各组玻璃化液中,VSd组的卵细胞存活率要高于其他组,经过1,2,3,4,6和8 d冻存后,卵细胞的存活率分别为64.40%±2.12%,60.24%±3.36%,57.20%±3.55%,51.90%±1.14%,40.29%±3.14%,37.98%±1.13%。

      图  2  不同玻璃化溶液(VSa-VSe组)对鲫鱼卵细胞存活率的影响(n=5)

      Figure 2.  Changes of survival rate of VSa-VSe (n=5)

    • 图 3所示为不含海藻糖组(VS1~VS6)玻璃化冻存液在经过不同时间的冻存后,对鲫鱼卵细胞内琥珀酸脱氢酶(SDH)活性的影响。随着冻存天数的延长,冻存后的细胞内SDH活性逐渐降低。VS1组的SDH活性在前6 d下降幅度较大(P<0.05),在6~8 d变化不明显(P>0.05);VS2组的SDH活性在1,2,4和6 d之间存在显著性差异(P<0.05);VS3,VS4和VS5的细胞经检测后发现,其吸光值在2~3 d之间无显著性变化(P>0.05)。VS6组各天数之间均存在显著下降(P<0.05)。从整体上来看,在各组玻璃化液中,VS4组冻存后卵细胞内的SDH活性要明显高于其他组,在经过1,2,3,4,6和8 d冻存后,MTT实验检测到的吸光值分别为0.581±0.010,0.469±0.006,0.462±0.007,0.373±0.006,0.291±0.008,0.272±0.011。

      图  3  不同玻璃化溶液(VS1-VS6组)对鲫鱼卵细胞SDH活性的影响(n=6)

      Figure 3.  SDH activity of eggs in VS1-VS6 (n=6)

      图 4为海藻糖组(VSa~VSe)玻璃化冻存液对卵细胞内琥珀酸脱氢酶(SDH)活性的影响。在冻存过程中,卵细胞内SDH活性逐渐降低。VSa组的SDH活性在前6 d下降幅度较大(P<0.05),在6~8 d变化不明显(P>0.05);VSb和VSc组各天数之间均存在显著性下降(P<0.05);VSd组的SDH活性在1,2,4和6 d之间存在显著性差异(P<0.05);VSe的细胞经检测后发现,其吸光值在2~4 d之间无显著性差别(P>0.05)。比较各组玻璃化冻存液,VSd组冻存后鲫鱼卵细胞内的SDH活性要明显高于其他组,在经过1,2,3,4,6和8 d冻存后,MTT实验检测到的吸光值分别为0.585±0.007,0.490±0.009,0.473±0.008,0.423±0.014,0.305±0.016,0.290±0.016。

      图  4  不同玻璃化溶液(VSa-VSe组)对鲫鱼卵细胞SDH活性的影响(n=5)

      Figure 4.  SDH activity of eggs in VSa-VSe (n=5)

    • 玻璃化溶液的组分和冷冻保护剂的配比是冻存获得成功的关键,玻璃化冻存液应具备低毒、高渗和高玻璃化形成能力等特征。大多数玻璃化冻存液在高浓度使用时,对卵细胞有较大毒性,容易造成细胞渗透损伤[13]。冷冻保护剂的混合使用可能使单独使用时的毒性得到部分中和。本研究根据Guan等[1]、Plachinta等[6]、Zhang等[7]和Zhang等[14]的研究结果,结合本课题组已有的研究成果[4-5],选用1,2-丙二醇、二甲基亚砜、甲醇和乙酰胺等为渗透性保护剂,海藻糖、蔗糖和聚乙二醇等为非渗透性保护剂,配制成玻璃化溶液。1,2-丙二醇具有较低毒性和较强玻璃化形成能力。二甲基亚砜在大量实验中被证明具有易玻璃化和高渗透性等特点。乙酰胺是一种具有较高渗透性及毒性中和能力的保护剂。甲醇已被证明在斑马鱼Danio rerio的胚胎以及几种鱼类精子的冷冻保存具有明显效果[6]。海藻糖对生物体或生物大分子具有抗脱水、抗冷冻、抗高渗等非特异性保护作用。结果表明:不含海藻糖组的玻璃化溶液VS4和海藻糖组的VSd 冻存鲫鱼卵细胞后的存活率较高,其组分分别为160.0 g·L-1 1,2-丙二醇,100.0 g·L-1 二甲基亚砜,150.0 g·L-1甲醇,120.0 g·L-1 乙酰胺,0.6 mol·L-1蔗糖,30.0 g·L-1 聚乙二醇以及180.0 g·L-1 1,2-丙二醇,110.0 g·L-1甲醇,0.1 mol·L-1 海藻糖,40.0 g·L-1 聚乙二醇。且发现在海藻糖的浓度明显低于蔗糖时,2组的存活率并没有显著差异。海藻糖可能比蔗糖更适合作为玻璃化冷冻保护剂。

      卵细胞膜对冷冻非常敏感,容易在冷冻过程中损伤[15],影响卵细胞的进一步发育[16]及受精时精卵质膜的融合。当细胞处于过冷状态时,细胞膜上从液态转变为凝胶态,同时,细胞膜的不等收缩会导致机械性的膜破裂及膜表面结构的改变,从而导致细胞死亡[17-18]。本研究以台盼蓝拒染法来检测玻璃化冻存后鲫鱼卵细胞的存活率,发现随着冻存天数的延长,细胞存活率成下降趋势,在6 d后基本达到稳定。我们认为玻璃化冷冻保存过程中冻存液浓度变化以及冰晶形成等都会对膜造成损伤,加入混合冷冻保护剂可以减轻这种损伤。

      线粒体是卵细胞中最丰富的细胞器之一,数量巨大[19],其主要功能是为卵细胞的成熟、受精及卵裂提供能量。线粒体对环境因素的作用非常敏感,许多环境因素的影响都能迅速引起线粒体发生变化[20]。琥珀酸脱氢酶(SDH)位于线粒体内膜上,它参与线粒体内多种与细胞生命活动相关的反应,如呼吸链的电子传递、三磷酸腺苷(ATP)的合成等[21]。因此,SDH 活性检测对评价冷冻前后线粒体功能具有重要意义[22]。卵细胞经玻璃化冻存后,SDH 活性显著下降。可能是细胞在冷冻与解冻后,线粒体部分损伤,使线粒体内的酶分布发生改变,甚至引起酶的释放。这些酶游离出来进入基质,影响了酶的稳定性和活性;也有可能是冷冻保护剂的高毒性引起酶复合蛋白体解聚,造成酶系结构和功能的变化。

    • 从本研究结果分析,随着冻存天数的延长,鲫鱼卵细胞的存活率下降较为明显,但6 d后,存活率基本趋于稳定;而鲫鱼卵细胞的琥珀酸脱氢酶(SDH)活性则持续降低。玻璃化冻存液VSd组的配方及玻璃化冻存方法对保存鱼鲫鱼卵细胞有一定效果,但有待进一步研究和改进。

参考文献 (22)

目录

    /

    返回文章
    返回