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木质素是一种广泛分布于植物细胞壁中无定形的芳香性高聚物,是除纤维素外自然界中储量位居第2位的可再生资源。随着木质素化学分解方法研究的进展以及光谱、色谱等分析技术在木质素化学研究中的广泛应用,对木质素化学结构的认识也越加深刻。但是,人们对木质素结构的认识在很大程度上是基于对分离木质素的研究,而木质素主要分布在植物细胞的微纤丝之间,并且与高聚糖有着复杂的化学或物理链接,迄今为止尚未找到一种理想的分离方法,使木质素完全地无变化地从植物原料中分离出来[1-2],因此,分离方法在很大程度上影响着木质素的结构研究。一直以来都是用球磨木质素(MWL)来分析木质素的化学结构[3-4],但因为得率低,MWL是否能代表植物原料中全部原本木质素也存有争议[5],纤维素酶解木质素(CEL)因为得率高,且结构与MWL相似,被认为可代表植物中的原本木质素[6]。CEL的一个主要缺点为酶水解过程中的酶不能在后期分离纯化时完全除去。WU等[7]在此基础上提出了一种从阔叶木、针叶木中有效分离木质素的新方法:EMAL(enzymatic /aicdlolysis lignins)。该分离方法结合酶处理与温和酸水解,使木质素-碳水化合物间的化学链接能在温和的化学条件下,选择性地有效打开,为木质素高效分离提供了保证。相对于传统的球磨木质素,该分离方法通过球磨、酶水解及温和酸水解的协同作用,可以明显提高木质素的得率。但众所周知,酸处理将导致木质素α-醚键的断裂。LEE等[1]和MESHITSUKA等[8]研究表明:球磨后木质纤维原料木质素在二氧六环-水溶液中的溶出与球磨时间有关,胞间层木质素较易溶出,随着球磨时间的延长,次生壁木质素的溶出逐渐增多。因此,利用传统方法分离木质素,缩短球磨时间不仅降低了分离木质素的得率,也使得到的木质素缺乏代表性。木质纤维原料由纤维素、半纤维素和木质素构成,纤维素大部分分子规律性排列形成结晶结构,只有部分分子规律性差,形成无定形区。纤维素酶只能作用于植物原料的非结晶区, 对于结晶区并不起作用,如果直接将木质纤维素用于酶解,效果很差。因此, 在酶解前必须先改变纤维素的晶体结构,才能促进纤维素的降解,达到提高酶解效率的作用。选用合适溶剂进行溶解再生来改善结晶区的结构可以提高酶解效率[9-10]。WANG等[11]提出的LiCl/DMSO全溶体系,作用于球磨木粉,结果表明:再生前后的木质素结构单元没有发生变化,而纤维素的结晶区受到一定程度的破坏。本研究以毛竹Phyllostachys edulis竹材为原料,借助LiCl/DMSO溶剂体系溶解再生处理,通过纤维素酶水解分离出非木材木质纤维原料中的木质素,并与传统方法得到的MWL和CEL进行了比较。
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相对于传统的木质素分离技术,由于部分木质素和碳水化合物间存在着共价键链接[17],又有部分的木质素-碳水化合物复合体(LCC)溶于二氧六环与水的溶液中[18-19],使得从纤维原料中分离得到高纯度、高得率木质素受到一定局限。经比较分析,利用LiCl/DMSO溶剂体系对球磨竹粉的溶解再生可高效分离木质素。对竹材来说,球磨2 h再经LiCl/DMSO溶剂体系的溶解再生分离得到的木质素得率可达48.2%,是CEL方法的2倍多,是MWL方法(得率为5.1%)的9倍。球磨时间的缩短,木质素的溶出可借助于LiCl/DMSO溶剂体系对物料的渗透润胀来改善,使之有更多的木质素裸露出来,通过聚糖的酶解来提高木质素在有机溶剂中的溶出,这样可以避免因为长时间的球磨带来木质素结构上的损伤。所以LiCl/DMSO溶剂体系的处理有助于提高竹材木质素的得率。另外,从表 1可看出:竹材的RCEL总糖质量分数为9.0 g·kg-1,CEL为12.0 g·kg-1。RCEL的纯度略高于CEL。
样品 得率/% 葡聚糖/(g·kg-1) 木聚糖/(g·kg-1) 总糖/(g·kg-1) CEL 25.3 1.0 5.0 12.0 RCEL 48.2 6.0 1.0 8.0 Table 1. Isolation yield and sugar content of purified lignin samples from bamboo
由表 2可以看出:碳、氢和氧元素质量分数差别不大,竹材CEL和RCEL的氮质量分数均为3 g·kg-1,氮元素在木质素中质量分数均在10 g·kg-1以下,不会影响到其化学结构的分析[20]。
样品 碳/(g.kg-1) 氢/(g·kg-1) 氮/(g-kg-1) 氧/(g·kg-1) CEL 588 58 3 351 RCEL 588 57 3 352 Table 2. Element analysis of CEL and RCEL isolated from bamboo
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凝胶渗透色谱(GPC)是一种木质素分子量快速测定的简单可靠的方法。但是木质素是不均一的高聚物,分析其不均匀性,即多分散性对了解整个木质素分子量的变化有重要影响。由表 3可以看出:竹材的CEL和RCEL的重均分子量(Mn)和数均分子量(Mw)相近,数均分子量约6 000,重均分子量12 000。RCEL的得率高于CEL。LiCl/DMSO溶剂体系的溶解润胀,一方面破坏了部分与木质素相连的纤维素结晶区,纤维素被酶水解成单糖溶出,木质素则留在底物里;另一方面,通过破坏纤维素结晶区,会将原来彼此包覆的木质素释放出来。最终都会导致分离木质素得率的增加。从表 3看到:RCEL的重均分子量高、分散性大,说明非木材纤维原料的木质素大分子之间仍存在着较大的差异,体现了非木材纤维原料木质素大分子结构的复杂性。竹材RCEL的分散性与CEL一致,都为2.0。
样品 Mn Mw Mw/Mn CEL 6 118 12 265 2.0 RCEL 6 013 12 237 2.0 Table 3. Average molecular weight and polydispersity index (Mw/Mn) of CEL and RCEL from bamboo
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红外光谱能反映木质素的微细结构,根据木质素红外光谱特征吸收谱带测定分析木质素所带有的功能基,例如羰基、羟基、甲氧基、C—H键和C—C键等[21]。由图 1可看出:竹材CEL和RCEL红外光谱特征峰基本一致,表明两者的官能团组成基本相同,CEL和RCEL在其结构上没有明显的差异:表征苯环骨架伸缩振动的1 597、1 512和1 419 cm-1吸收峰均显示出较强的吸收,这是木质素结构的基本特征峰,说明其苯环骨架结构保存完好。在1 704 cm-1出现明显吸收峰,这些吸收峰是非共轭羰基、酯基的特征吸收峰;另外,在1 327 cm-1有紫丁香基的吸收,愈创木基单元的伸缩振动在1 234 cm-1也有明显吸收,表明CEL和RCEL中均含有一定量的愈创木基单元、紫丁香基单元。木质素芳环单元结构在LiCl/ DMSO溶解再生过程中没有明显破坏。对吸收峰归属的划分结果见表 4。
序号 波数/cm-1 谱峰归属 CEL RCEL 1 3 425 3 425 羟基中的O—H伸缩振动 2 2 939,2 854 2 939,2 854 甲基、亚甲基中的C—H伸缩振动 3 1 704 1 704 非共轭酮,羰基和脂中C?襒O伸缩振动 4 1 597 1 597 芳香环的伸缩振动和C?襒O振动 5 1 512 1 512 芳香环骨架伸缩振动 6 1 458 1 458 甲基或亚甲基的C—H变形振动 7 1 419 1 419 芳香环上的C—H平面变形振动 8 1 327 1 327 缩合的S和G型(G型5位缩合) 9 1 234 1 234 愈创木基环和C?襒O伸缩振动 10 1 126 1 126 S型特征,仲醇和C?襒O伸缩 11 1 049 1 049 在仲醇和脂肪醚中的C—O变形振动 12 833 833 C—H平面外的变形 Table 4. Assignment of FTIR spectra of CEL and RCEL isolated from bamboo
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图 2为原料竹材、球磨竹材及溶解后再生竹材的X射线衍射曲线,未经任何处理的原料竹粉(B)结晶度(ICr)为58.4%,再生竹材(RMB)与球磨竹材(MB)ICr分别为26.5%和24.6%。由图 2可以看出:竹材的曲线明显不同于球磨竹材和再生竹材。结合表 5的结晶度可以看出:对于溶解后再生的球磨竹材原料,其得率为86.0%,高聚糖的得率81.0%,即处于无定形区的部分碳水化合物会在LiCl/DMSO处理过程中溶出,因而其结晶度略高于球磨样品。与40~80目的原料相比,结晶区有了明显的破坏。对于经过溶解再生后的样品,一方面可改善聚糖的酶水解,另一方面溶剂体系的深入渗透,会有更多的木质素敞露出来,有利于后续有机溶剂的提取、分离。
Figure 2. X-ray pattern of original bamboo (B), ball milled bamboo (MB), and regenerated bamboo with ball milling (RMB)
样品 得率/% rH:rG:rS rS/rG rH rG rS 合计 CEL 0.6 0.8 1.3 2.7 20:31:49 1.6 RCEL 0.6 0.7 1.2 2.5 23:28:49 1.7 Table 5. Nitrobenzene oxidation products yields and S/G molar ratio of CEL and RCEL isolated from bamboo
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碱性硝基苯氧化一般用于木质素的结构单元分析,未缩合的对羟基苯基(H)、愈创木基(G)和紫丁香基单元(S)在碱性高温条件下分别氧化为对羟基苯甲醛、香草醛和紫丁香醛。木质素结构中未缩合单元含量越高,则木质素的缩合程度越低。表 5显示了酶解木质素和溶解再生后的酶解木质素的碱性硝基苯氧化结果。从表 5可以看出:竹材CEL的得率为2.7%,RCEL为2.5%,CEL的未缩合程度要高于RCEL。另外,硝基苯氧化的结果表明:竹材CEL和RCEL均属于GSH类型的木质素,含有丰富的紫丁香基单元,其中紫丁香基单元在未缩合单元中的占比达一半。从对羟基苯基、愈创木基和紫丁香基单元的得率、比例及紫丁香基单元的质量分数可说明2种分离出来的木质素的结构单元比例没有明显的不同。
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木质素是一种复杂、非结晶性的空间立体结构的大分子有机物,以苯基丙烷单元为主体,经各种醚键、碳碳键等连接而成,且含有丰富的羟基和甲氧基等官能团,结构的复杂性会影响其热裂解[22]。由图 3可以看出:竹材CEL和RCEL的热解曲线在100~800 ℃的热重曲线大致相同。在200~600 ℃内,残余物质量分数由94.4%减少至33.2%,减少了63.9%。超过600 ℃时,木质素中热解残余物中已不存在木质素苯丙烷单元,此时的苯丙烷单元组成的大分子结构发生了彻底的解构[23]。在600~800 ℃内RCEL残余物质量分数的减少值为5.0%,CEL为7.0%,此热解特性的差异主要在于木质素中化学结构的不同。经前述分析,竹材RCEL的缩合程度要高于CEL,从而导致其热解需要更高的能量。分析结果表明:竹材CEL和RCEL的热分解过程主要发生在200~600 ℃。
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由图 4可看出:竹材CEL和RCEL在结构单元方面没有任何差异,化学位移在6.25×10-6~6.80×10-6, 6.80×10-6~7.20×10-6及7.30×10-6~7.60×10-6分别对应于紫丁香基、愈创木基及对羟基苯基单元,分离出来的CEL和RCEL都属于GSH型木质素。化学位移处在3.48×10-6~4.00×10-6有较强烈的谱峰吸收,应归属于甲氧基上质子。从图 4发现:2种分离木质素CEL和RCEL的各种官能团包括羟基和甲氧基峰形都十分明显,表现出丰富的官能团特征,表明分离木质素的官能团保持较好。另外,化学位移在1.60×10-6~2.22×10-6内为芳基侧链脂肪族醋酸酯上质子,2.22×10-6~2.50×10-6的谱峰归于芳香族醋酸酯上质子。