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木兰属Magnolia植物分布范围广, 多为高大乔木或灌木, 抗性强, 株型优美, 早春季节开花, 花色艳丽, 具有较高的观赏价值, 在园林绿化中应用广泛[1], 具有广阔的市场价值。目前, 杂交育种是木兰属新品种选育的主要手段之一, 大部分种间杂交均表现为亲和[2]。花粉活力的高低直接影响杂交育种工作的成败。花粉活力的测定方法有直接授粉、离体萌发、染色法等[3]。直接授粉花粉生活力易受柱头可授性、授粉时期、花粉与柱头亲和性等因素影响[4]。根据染色原理不同, 染色法分为氯化三苯基四氮唑(TTC)、碘-碘化钾法、联苯胺法、醋酸洋红染色法等, 该方法虽简单易操作, 但所测得的花粉活力受花粉自身特性的影响较大, 如花粉壁的厚度、花粉内各种酶活性的强弱等[5], 未成熟、衰老或败育的花粉仍能染色[6]。离体培养法为花粉提供的条件与花粉在柱头内萌发的条件相似[7], 所得花粉活力与花粉在柱头上的活力最接近, 是检测花粉活力的最佳方法。近年来, 已有许多木兰属植物花粉形态、生活力及其储藏特性的相关研究, 如二乔玉兰Magnolia soulangeana[8], 天女木兰Magnolia sieboldii[9], 紫玉兰Magnolia liliflora[10], 景宁木兰Magnolia sinostellata[11]等, 研究表明不同植物适宜的培养基组分及质量浓度要求不同, 花粉离体培养中所需的萌发条件也不同。本研究在综合前人研究的基础上, 以望春玉兰Magnolia biondii, 长花玉兰Magnolia ‘Changhua’, 丹馨玉兰Magnolia ‘Danxin’, 黄山木兰Magnolia cylindrica等为试验材料, 研究不同培养基组分、培养温度及时间对花粉萌发的影响。旨在筛选出各植物材料适宜的培养基及花粉萌发最佳条件, 为木兰属植物的育种工作提供依据。
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望春玉兰、长花玉兰、丹馨玉兰、黄山木兰等4种木兰属植物均来自于浙江农林大学苗圃地, 将所采集花药置于硫酸纸上, 自然干燥24~36 h, 待花药开裂后收集花粉, 并放置于硅胶中干燥, -80 ℃条件下储藏备用。
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采用离体培养法。蔗糖质量浓度梯度为0, 50, 100, 150, 200 g·L-1; 硼酸质量浓度梯度为0, 50, 100, 200, 300 mg·L-1; PEG-4000质量浓度梯度为0, 150, 200, 250, 300 g·L-1。
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在单因子试验的基础上, 选取对试验材料影响较大的培养基组分及质量浓度, 进行L9(33)正交试验(表 1), 以得到最佳培养基组分。
编号 P蔗糖/(g·L-1) P硼酸/ (mg·L-1) PPEG-4000/(g·L-1) 花粉萌发率/% 望春玉兰 长花玉兰 丹馨玉兰 黄山木兰 1 0 50 150 61.16 ± 4.05 abc 29.55 ± 3.89 bcd 12.24 ± 0.93 de 29.20 ± 4.73 c 2 0 100 200 58.34 ± 1.69 abc 20.74 ± 0.52 cd 11.95 ± 1.92 e 30.43 ± 2.14 c 3 0 200 250 54.95 ± 4.84 bc 18.78 ± 2.55 d 19.26 ± 2.83 bcd 18.36 ± 1.19 c 4 50 50 200 69.23 ± 5.48 a 35.85 ± 6.55 bc 21.09 ± 1.80 bc 50.02 ± 2.75 b 5 50 100 250 58.68 ± 1.38 abc 31.79 ± 3.63 bcd 16.50 ± 2.45 cde 69.54 ± 5.06 a 6 50 200 150 65.37 ± 0.62 abc 29.43 ± 4.89 bcd 18.12 ± 0.75 cde 64.64 ± 5.92 ab 7 100 50 250 68.50 ± 8.40 ab 37.66 ± 6.81 ab 25.58 ± 3.46 ab 56.37 ± 4.11 ab 8 100 100 150 52.86 ± 2.35 c 34.73 ± 6.68 bcd 29.79 ± 0.99 a 51.76 ± 9.96 b 9 100 200 200 65.86 ± 0.83 abc 51.47 ± 4.27 a 28.56 ± 2.80 a 50.85 ± 2.09 b R(望春玉兰) 6.28 9.67 4.68 R(长花玉兰) 18.27 1.13 6.61 R(丹馨玉兰) 13.50 2.57 0.09 R(黄山木兰) 35.40 5.96 4.77 说明:同列数据后不同小写字母表示差异显著(P < 0.05) Table 1. Pollen germination rate of four Magnolia species in orthogonal design experiment
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利用最佳培养基, 把4种试验材料分别置于15, 20, 25, 30, 35 ℃下进行离体培养, 培养12 h后, 根据实验结果, 确定最适萌发温度。在最适温度条件下, 分别培养3, 6, 9, 12, 15 h, 确定最佳培养条件。
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采用离体培养法, 在双凹载玻片内滴入培养液, 将充分混匀后的花粉均匀点入培养液中, 将载玻片置于铺有湿润滤纸的培养皿内, 25 ℃, 8 400 lx人工气候培养箱中培养12 h。在显微镜下观察统计, 花粉管长度等于或超过花粉粒直径的花粉即视为已萌发。重复3次·处理-1,观察视野3个·重复-1, 所统计的花粉粒不少于50粒·视野-1。花粉萌发率=(萌发的花粉粒数/视野中花粉粒总数)×100%。
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使用Excel 2010对数据进行统计, 利用SPSS 22.0对原始数据进行反正弦转换并进行单因素方差分析(Duncan’s), 各处理间差异显著性水平为0.05。