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赭曲霉毒素(ochratoxin)是曲霉属Aspergillus和青霉属Penicillium一些产毒菌株的次级代谢产物,包括赭曲霉毒素A,B,C,D和a等7种结构类似化合物[1];其中赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)毒性最大,在自然界分布最广泛,对农产品的污染也最严重,是严重危害人类健康的毒素之一。OTA在食物中较稳定且不易分解,在霉变谷物、饲料等中最常见,现已被证明具有弱诱变性、免疫毒性,能引起免疫抑制,并具有致癌、致畸、致突变作用。世界卫生组织建议,谷物、豆类及其产品中的OTA限量标准为5.0 μg·kg-1,而牛奶中OTA是“零容忍”毒素之一。目前中国对OTA的检测主要依靠薄层层析法(TLC),高效液相色谱法(HPLC),酶联免疫吸附法(ELISA)等仪器分析技术。这些方法虽然具有特异性强、灵敏度高的特点,但由于使用的仪器与试剂相对比较昂贵,样品处理过程繁琐,不适宜用来进行快速检测。胶体金免疫层析技术是20世纪80年代初期开发的一种免疫分析方法,它是在单克隆抗体技术、胶体金免疫技术和新材料技术基础上发展起来的快速检测技术[2-4]。该技术以微孔膜为固相载体,将已知的特异性抗原固定于硝酸纤维素(NC)膜上作为检测线。当加入待测样品后,样品经毛细管的扩散作用首先与胶体金标记物相结合,并继续在扩散作用下泳动至检测线,标记物与待测物的复合物被检测线的抗原或抗体截获,从而呈现红色的可见条带[5]。本法具有快速、灵敏度高、特异性强、稳定性好、操作简单等优点,结果判断直观可靠,容易被基层单位人员掌握,适合现场快速筛查和基层大面积推广,现在已广泛应用于临床诊断及药物检测等领域[6]。本研究应用胶体金免疫层析技术,将OTA单抗与胶体金偶联物固化在结合垫上,OTA-BSA(BSA,Bovine serum albumin,牛血清白蛋白)偶联物固化在检测线,羊抗鼠IgG固化在质控线,以制备一种快速检测食品和饲料中赭曲霉毒素A的方法。
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利用已制备的胶体金标记抗体,匹配Pall vivid 90 NC膜和Pall vivid 170 NC膜测试。试验结果如图 4所示,Pall vivid 170 NC膜的条带更清晰,所以选择Pall vivid 170 NC膜。
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检测结果显示:当OTA-BSA终质量浓度为4.8 g·L-1(原15.6 g·L-1),质控线用羊抗鼠IgG配制终质量浓度为1.5 g·L-1(原10.0 g·L-1),NC膜的包被量为1.0 μL·cm-1的时候所呈现的条带最清晰、最均匀,因此选择此方案为最佳包被方案。
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当用PBS检测试纸条时,检测线与质控线均出现红色条带,随着加入的OTA样品质量浓度的增加,检测线的红色条带颜色逐渐变浅,当OTA标准品质量浓度达到1.0 μg·L-1的时候,检测线的红色条带与对照组相比显著变浅。质量浓度达到10.0 μg·L-1检测线未出现红色条带(图 5),其中质控线出现红色条带,因此判断该OTA试纸条的肉眼可视检测限为1.0 μg·L-1,肉眼可视的消线质量浓度为10.0 μg·L-1。
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由于桔毒素、伏马毒素B1、玉米赤霉烯酮与胶体金-OTA单抗不发生非特异性反应,因此结合垫上的胶体金-OTA单抗在毛细管的扩散作用下泳动至T线,与T线的OTA-BSA相结合,试纸条均呈现2条红色条带。以上毒素不同质量浓度下特异性检测结果如表 1所示,表明本研究所制备的试纸条与桔毒素、伏马毒素B1、玉米赤霉烯酮均无交叉反应,特异性良好。
表 1 赭曲霉毒素A检测试纸条特异性试验结果
Table 1. Specificial results of the OTA test strip
毒素种类 不同质量浓度下特异性试验结果 1 10 10.0 μg·L-1 桔毒素 阴性 阴性 阴性 伏马毒素B1 阴性 阴性 阴性 玉米赤霉烯酮 阴性 阴性 阴性
An Ochratoxin A test strip based on a lateral-flow immunochromatographic assay
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摘要: 针对霉菌毒素精准检测技术的开发对于保障食品安全至关重要。利用胶体金与赭曲霉毒素A单抗偶联物和赭曲霉毒素A-BSA偶联物(OTA-BSA),开发了一种快速检测赭曲霉毒素A的方法。研究结果表明:①当OTA-BSA配制终质量浓度为4.8 g·L-1,质控线用羊抗鼠IgG配制终质量浓度为1.5 g·L-1,硝酸纤维素(NC)膜的包被量为1.0 μL·cm-1时呈现最清晰、最均匀的条带。②赭曲霉毒素A胶体金快速检测试纸条的灵敏度达到1.0 μg·L-1,检测时间仅为5 min,非常适合现场快速检测。该检测试纸条具有携带方便、灵敏度高、特异性强等优点。由于本方法检测时间短,灵敏度高,与传统的仪器和酶联免疫检测方法相比,在野外和临床检测中更具有推广应用价值。图5表1参12Abstract: To develop an accurate and precise detection method to screen Ochratoxin A (OTA) contaminants for food safety concerns, a lateral-flow immunochromatographic assay for OTA detection was developed using colloidal nanoparticles, monoclonal OTA antibodies, and the OTA-BSA (bovine serum albumin) conjugate. The test strip was treated with PBS for negative control and OTA standard samples (ranging from 1 to 10 μg·L-1) for measurement, and 4 replications. Results over the entire growth period showed that (1) the optimized concentration of OTA-BSA was 4.8 g·L-1 and goat-anti mouse (IgG) concentration was 1.5 g·L-1. The suitable coating volume of OTA-BSA and IgG in Nitrocellulose (NC) membranes was 1.0 μL·cm-1 with (2) a sensitivity for this test strip of 1.0 μg·L-1. The entire detection procedure for OTA was completed within 5 min. This test strip provided advantages of easy carrying, high sensitivity, and specificity, thereby serving as a suitable and valuable screening tool for field and clinical detection compared to traditional equipment and to the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-based method. [Ch, 5 fig. 1 tab. 12 ref.]
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表 1 赭曲霉毒素A检测试纸条特异性试验结果
Table 1. Specificial results of the OTA test strip
毒素种类 不同质量浓度下特异性试验结果 1 10 10.0 μg·L-1 桔毒素 阴性 阴性 阴性 伏马毒素B1 阴性 阴性 阴性 玉米赤霉烯酮 阴性 阴性 阴性 -
[1] 孙亚宁, 胡骄飞, 邓瑞广, 等. 赭曲霉毒素A人工抗原的合成与鉴定[J]. 食品工业科技, 2011, 32(5): 172 - 175. SUN Yaning, HU Jiaofei, DENG Ruiguang, et al. Synthesis and identification of ochratoxin A artificial immunogen[J]. Sci Technol Food Ind, 2011, 32(5): 172 - 175. [2] SHYU R H, SHYU H F, LIU H W, et al. Colloidal gold-based immunochromatographic assay for detection of ricin [J]. Toxicon, 2002, 40(3): 255 - 258. [3] 赖卫华, 熊勇华, 陈高明, 等. 应用胶体金试纸条快速检测赭曲霉毒素A 的研究[J]. 食品科学, 2005, 26(5): 204 - 207. LAI Weihua, XIONG Yonghua, CHEN Gaoming, et al. Preparation of colloidal gold strip for rapid detection of ochratoxin A [J]. Food Sci, 2005, 26(5): 204 - 207. [4] 邓省亮, 赖卫华, 许杨. 胶体金标记免疫层析法快速检测黄曲霉毒素B1的研究[J]. 食品科学, 2007, 28(2): 232 - 236. DENG Shengliang, LAI Weihua, XU Yang. Study on gold immunochromatography assay for rapid detection of aflatoxin B1 [J]. Food Sci, 2007, 28(2): 232 - 236. [5] 林彤, 独军政, 丛国政, 等. 胶体金标记免疫层析技术的最新应用进展[J]. 安徽农业科学, 2010, 38(16): 8429 - 8431. LIN Tong, DU Junzheng, CONG Guozheng, et al. Latest application of gold immunochromatographic assay [J]. J Anhui Agric Sci, 2010, 38(16): 8429 - 8431. [6] 舒文祥, 徐炜, 李艳, 等. 胶体金免疫层析法快速检测赭曲霉毒素A研究[J]. 粮食与油脂, 2011(10): 20 - 22. SHU Wenxiang, XU Wei, LI Yan, et al. Study on gold immunochromatography assay for rapid detection of ochratoxin A [J]. J Cereals Oils, 2011(10): 20 - 22. [7] 夏骏. 三聚氰胺胶体金免疫层析方法的建立[D]. 南昌: 南昌大学, 2013. XIA Jun. Development Colloidal Gold Lateral Flow Assay for Detection of Melamine [D]. Nanchang: Nanchang University, 2013. [8] 韦素梅, 李炜, 刘云龙. 影响赭曲霉毒素A免疫层析试纸条最低检出限的因素[J]. 粮食与食品工业, 2013, 20(2): 55 - 58. WEI Sumei, LI Wei, LIU Yunlong. Affections of the minimum detection limit of OTA colloidal gold strip[J]. Cereal Food Ind, 2013, 20(2): 55 - 58. [9] 李鑫, 李培武, 张奇, 等. 农产品中赭曲霉毒素A免疫层析试纸条快速检测技术研究[J]. 中国油料作物学报, 2014, 36(5): 648 - 652. LI Xin, LI Peiwu, ZHANG Qi, et al. Development of an immunochromatographic assay for ochratoxin A in agro-products [J]. Chin J Oil Crop Sci, 2014, 36(5): 648 - 652. [10] ZIMMERLI B, DICK R. Determination of ochratoxin A at the ppt level in human blood, serum, milk and some foodstuffs by high-performance liquid chromatography with enhanced fluorescence detection and immunoaffinity column cleanup: methodology and Swiss data [J]. J Chromatogr B Biomed Sci Appl, 1995, 666(1): 85 - 99. [11] SCOTT P M. Methods of analysis for ochratoxin A [G]// de VRIES J W, TRUCKSESS M W, JACKSOW L S. Mycotoxins and Food Safety. New York: Springer, 2002: 117 - 134. [12] MOON J, KIM G, LEE S. Development of nanogold-based lateral flow immunoassay for the detection of ochratoxin A in buffer systems [J]. J Nanosci Nanotechnol, 2013, 13(11): 7245 - 7249. -
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https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.2016.03.023