Waters 600-2998高效液相色谱仪（Waters Symmetry C18 250×4.6×5 μm），SPE净化柱（C18，Vac 3 cc/200 mg），美国Waters公司生产；IKA RV10基本型立式旋转蒸发仪，中国广州仪科实验室技术有限公司生产；超声波清洗仪KQ-500，中国昆山市超声仪器有限公司生产；摇摆式万能高速粉碎机，中国温岭市林大机械有限公司生产；CGD-8侧挂式电动打孔机，中国临沂华森林业药械有限责任公司生产。

松材线虫恒温扩增核酸试纸条检测试剂盒及相关配件，中国杭州优思达生物技术有限公司生产。

甲维盐标准品（质量分数为97%），阿维菌素标准品（质量分数为99%），中国浙江海正药业有限公司生产；啶虫脒标准品（质量分数为97%），中国郑州绿康化工有限公司生产；苦参碱（质量分数为99%），中国西安瑞仁生物技术有限公司生产；甲醇、乙腈等试剂为色谱纯，其他试剂均为分析纯，中国国药集团化学试剂有限公司生产。

6种注干药剂分别为质量分数为1.0%的阿维菌素微胶囊悬浮剂（A），质量分数为3.0%的甲维盐松材线虫注干防治剂（B），质量分数为3.2%的阿维菌素注干剂（C），质量分数为5.0%的啶虫脒注干剂（D），质量分数为1.0%的甲维盐松材线虫注射液（E），质量分数为0.3%的苦参碱松材线虫疫苗注射液（F）。均购买自市场（鉴于行业关系，不提供生产厂家）。

注干试验地于浙江省景宁畲族自治县沙湾镇仙姑村3，4，11和12号小班松材线虫病发生区，为独立山头，共计33.3 hm²，距村1 000 m，属纯马尾松林，平均树高15 m，平均胸径20 cm，密度1 050株· hm^-2左右。将试验地随机划分为8块标准样地，标准样地0.67 hm²，样地间距大于500 m。其中6种注干药剂各1块，清理及不清理枯死松树处理各1块作为对照。除清理枯死松树对照标准样地（仅2013年1月10日清理）外，其他试验标准样地不进行枯死松树处理（2012年9月至2015年1月）。于2013年1月10日注干药剂标准样地选择500株健康马尾松树按照厂家使用要求注干施药（50 mL·株^-1），药剂注干部位距离地面松树基部10 cm处，注干后用红色喷漆进行编号标记并在册记录，清理枯死松树和不清理枯死松树对照区分别选择500株健康马尾松进行标记并编号。注药当日（2013年1月10日），分别调查统计7块标准样地（除清理枯死松树对照样地）的松树枯死数量，并分别于2014年1月10日和2015年1月10日调查8块标准样地中，标记500株马尾松树的死亡数量。

①样品采集：用高枝剪勾取注药3个月和1 a后的相同试验马尾松主干树枝5段（至少50 cm长），每种注干药剂取样30株树，其中每标准样地中死亡马尾松树全部取样，于实验室内自然阴干，粉碎机打成细小木屑后备用。②样品提取和净化^[13]：称取备用木屑100.0 g于1 000 mL三角瓶中，加入300 mL V（丙酮）∶V（水）=1∶1混合液，震荡提取30 min，重复3次，过滤去除残渣后合并提取液，40 ℃水浴减压浓缩至干，用10 mL V（甲醇）∶V（水）=80∶20混合液溶解，2 000 转·min^-1离心5 min，取上清液过0.45 μm滤膜，待净化。采用C18-SPE柱净化，分别用5 mL的V（甲醇）∶V（水）=80∶20混合液活化和平衡小柱，取1 mL待净化提取液上样，然后用20 mL甲醇淋洗3次后（上样和洗脱过程中流速保持1 mL·min^-1），收集洗脱液150 mL圆底烧瓶中，无水硫酸镁干燥30 min后，40 ℃水浴减压浓缩至干，用1 mL甲醇溶解残留物后待高效液相色谱（HPLC）检测。③样品残留量检测分析：各种药剂的分析方法参考下列国家标准和文献并加以改进：甲维盐和阿维菌素参照SNT 2114-2008《进出口水果和蔬菜中阿维菌素残留量检测方法 液相色谱法》测定，啶虫脒参照GB/T 23584-2009《水果、蔬菜中啶虫脒残留量的测定》进行测定，苦参碱参照文献^[14]的方法测定。采用外标法将各药剂将配制成质量浓度为0.1，0.5，1.0，5.0，10.0 mg·L^-1的系列标准工作溶液，按照分析方法中注干药剂的仪器色谱条件进行测定，并绘制标准曲线。④添加回收率：将未注药的空白木段，阴干，粉碎，30 ℃下烘箱烘干至质量不再变化，每20 g空白木屑中添加一定量的药剂标准品，将空白木屑中药剂添加水平调整到分别为0.05 mg·kg^-1，重复3次，按上述①②③顺序方法对样品进行提取、净化，测定添加回收率。

将样地中注干后所有死亡松树进行取样、线虫分离并统计松材线虫含量，利用松材线虫恒温扩增核酸试纸条检测试剂盒进行阳性检测、结果读判。结果描述及判定标准为：阴性：仅在质控区C出现1条红线，表示样品中无松材线虫。阳性：出现2条红线，1条检测线，1条质控线，表示样品中存在松材线虫。无效：无红色线条出现，表明核酸试纸条失效或一次性核酸检测装置损坏，使用原样本重新扩增和检测。

数据采用软件SPSS 20.0进行统计分析。

林间各处理防治效果见表 1。由表 1可知：与不清理死树对照区相比，各种注干药剂施药对松材线虫病的防治效果显著，均与对照组差异显著（P<0.05）。各注干药剂在注干2 a后将马尾松的死亡率控制在0.4%~4.4%，防治效果为58.49%~96.23%；6种防治药剂中，3.0%甲维盐注干防治剂、3.2%阿维菌素注干剂、5.0%啶虫脒注干剂防治效果较好，1 a后其注干标准样地松树死亡率分别为0.4%,0.8%和0.6%，防治效果均大于82.61%，药后2 a其防治效果均大于86.79%，与其他几种处理有显著性差异（P<0.05）；1.0%阿维菌素微胶囊悬浮剂及1.0%甲维盐注射液的防治效果大于79.25%；0.3%苦参碱疫苗注射液较差。清理死树对照也有一定的效果，松树死亡率分别仅为2.0%和4.0%，不清理死树对照样地的马尾松死亡率最高，2 a后高达10.6%，与整片林地防治前的平均死亡率相当（约为10.0%）。

采用高效液相色谱测定了各药剂的质量分数，添加回收率均在85%以上。6种药剂有效成分在药后3个月和1 a在树体内均能被检测到（表２）。其中,5.0%啶虫脒注干剂与3.0%甲维盐注干防治剂在药后3个月检测，树体内残留药剂质量分数最高，分别为（5.67 ± 1.07）和（2.65 ± 0.35） mg·kg^-1；而在药后1 a，3%甲维盐注干防治剂、1.0%甲维盐注射液在树体内残留质量分数较高，分别为（0.95 ± 0.11）和（0.15 ± 0.04） mg·kg^-1，说明各药剂能在树体内有一定的持效期。对药后死亡松树进行药剂残留量检测，所有药剂均未被检测到。

采用松材线虫恒温扩增核酸试纸条检测试剂盒，对样地中注干后所有死亡松树采用贝尔曼漏斗法进行线虫分离，并进行线虫阳性检测。结果表明：所有死亡松树内均含有松材线虫，含线虫数量至少为897.34条·g^-1。

研究了6种药剂注干施药防控松材线虫的林中效果，并初步测定了药剂主要成分注药3个月和1 a后在树体内残留动态及添加回收率。各药剂有效成分注干后在松树体内均能被检测到，其中5.0%啶虫脒注干剂与3.0%甲维盐注干防治剂在药后3个月检测质量分数最高，分别为（5.67 ± 1.07）和（2.65 ± 0.35） mg·kg^-1，均高于药剂对松材线虫的95%致死浓度值（LC95）0.75 mg·kg^-1，而在药后1 a，3.0%甲维盐注干防治剂质量分数较高为（0.95 ± 0.11） mg·kg^-1，依然高于LC95 （0.75 mg·L^-1）^[13]，注药2 a后，尽管马尾松的死亡率由防治1 a后的0.2%~2.4%增加至防治2 a后的0.4%~4.4%，药剂持效期有所下降，但其防治效果还是有所提高，所有药剂在注干2 a后防治效果在80%以上（除0.3%苦参碱疫苗注射液外），说明各药剂能在树体内有一定的持效期且能一定程度杀死线虫。

药剂在树木体内传导与蒸腾作用有极其密切的关系。药剂在树体内的长距离输导发生在木质部（向顶性）或韧皮层（向顶性和向基性）^[15]，而在散孔材和针叶树体内的输导则是在整个木质部边材中进行^[16]。接种试验和组织病理学研究表明：树脂道泌脂细胞最先受到线虫侵袭，造成轴向和射线薄壁细胞死亡^[17]。受害树木木质部中的射线薄壁细胞的死亡可以使管胞空穴化，因而造成木质部输水堵塞，致使药剂在树体内传导缓慢甚至不能传导^[18-19]。同时，树木的种类、树龄及天气条件如温度、湿度、风速等都会影响树木对水分及药剂的吸收和传导，杀虫剂的理化性质对传导速度和传导量的影响更为明显，因此，即使药剂注干，仍可能传导不充分或不传导，从而导致部分树木受松材线虫病危害而缓慢死亡^[20]。对药后死亡松树体内没有检测到药剂残留量，说明药剂并未随树木蒸腾作用在体内传导，没有对松材线虫起到预防作用。对死亡松树中进行松材线虫检测均呈阳性且线虫数量均大于897.34条·g^-1也证明了残留检测结果。

本试验中，砍伐松林中死树是一种传统的防治手段，但不能清除林中且有隐蔽性“松材线虫病潜在携带者”的松树^[2]。据FUTAI^[21]报道：松树感染松材线虫后，受到外界环境如气候变冷、温度过高等影响，松材线虫在松树体内繁殖受到严重影响，进入“潜伏期”，致使松树不能立刻表现出症状或发病死亡，但这些松树缓慢的变化，难逃松材线虫的传播媒介松墨天牛Monochamus alternatus的“法眼”，依然可以传播松材线虫。野外观察结果证实，在线虫侵染的初期，进入树木的线虫大多分布在侵染点周围，线虫群体的增长则是在病树分泌树脂停止和出现外部症状后开始，树脂道、射线和形成层内出现空洞，并缓慢延伸至皮层和木质部，引起组织的破坏，导致松树在1~2 a内死亡^[22]。实验中清理死树对照区2 a后，松树死亡率还是有明显的增加（表 1），与上述研究结果相符。

注干施药防治松材线虫，是一种“打点控面”的防治技术，注入树体内的药剂在一定程度上可以灭杀松材线虫^{[6, 12, 23]}，也可影响松墨天牛的生长发育，控制松墨天牛种群密度，抑制其传播松材线虫^[24]。上述6种药剂注药2 a后的松树死亡率较不清理死树对照区域明显降低。从防治后的数据得知，高浓度的甲维盐、阿维菌素系列药剂防效均在80%以上，对新疫点的拔除，老疫点控制均具有实际应用价值，推荐在重点防治区预防应用。