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硝态氮（NO3--N）和铵态氮（NH4+-N）均是植物能够直接吸收利用的氮源，由于两者的形态和离子性质存在差异，植物对其吸收途径、运输方式和同化过程也不相同，常表现出对NO3--N和NH4+-N的选择性吸收[1-2]，因此对植物生长和代谢产生不同生理效应[3-5]。有研究表明，不同形态氮素显著影响菠菜Spinacia oleracea的营养品质和抗氧化酶活性，完全供应NH4+-N时，菠菜叶片膜脂过氧化程度较高[6]。全铵或全硝营养下，掌叶半夏Pinellia pedatisecta叶片丙二醛质量分数较高，膜脂过氧化程度高，铵硝比为1:1时丙二醛质量分数最低，相关酶活性最高[7]。硝铵比为75:25和50:50条件下，菜用大豆Glycine max具有较低的抗氧化酶活性和丙二醛质量分数，受到的氧化胁迫较低[8]。可见，了解植物对NH4+-N或NO3--N的生理响应，探讨促进植物良好生长的氮素形态配比，对指导林地科学施肥具有重要意义。雷竹Phyllostachys violascens具有成林快、出笋早、笋期长等优点，是优良的散生笋用竹种，对区域水源涵养、水土保持、固碳释氧和调节气候等方面也发挥着巨大的生态保护作用[9-10]。自20世纪80年代以来，以大量施肥和冬季覆盖为主要措施的集约经营技术的推广，使雷竹林产量和经济效益明显提高。然而，长期过量施肥和林地覆盖会导致雷竹林地土壤劣变、立竹结构不合理、出笋量减少及氮素利用率下降、环境污染等负面问题[11]，因此，合理施肥就成为雷竹林可持续经营的重要研究内容。为此，本研究以雷竹盆栽苗为试材，通过设置不同的硝铵配比处理，试图明确土壤中不同氮素形态供应对雷竹抗氧化系统的生理影响机制，探讨促进雷竹生长的最优硝铵比，以期为雷竹林合理施用氮肥提供参考。
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2014年9月在浙江省临安市太湖源镇（30°20′N，119°37′E）雷竹林中挖取立竹胸径基本一致[（2.48±0.26）cm]，生长健壮的1年生不带宿土的竹苗进行全梢竹盆栽（鞭长约35 cm），栽植1株·盆-1，容器规格为50 cm × 45 cm（盆高×口径）的黑色有孔圆形塑料盆。每盆填基质干质量为（9.30±0.05）kg，基质为m（红壤）:m（细砂）=3:1均匀混合而成，pH值为pH 5.8，全氮421.76 mg·kg-1，全磷37.35 mg·kg-1，全钾80.01 mg·kg-1。试验共栽植60盆盆栽苗。盆栽雷竹苗置于有1层遮阳网的荫棚中进行水分适时人工供应的生理恢复培育，养护至2015年5月中旬，选取生长状况基本一致的盆栽苗进行不同氮素形态配比的试验处理。试验期间平均气温为23.5 ℃，日最高气温28.2 ℃，日最低气温18.3 ℃。
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试验为氮素形态比例单因素试验，用硝酸钠（NaNO3）提供硝态氮（NO3--N），用硫酸铵[（NH4）2SO4]提供铵态氮（NH4+-N），设5个NO3--N:NH4+-N比例（硝铵比）的处理。T1：1:0，T2：2:1，T3：1:1，T4：1:2，T5：0:1。重复3次·处理-1，3盆·次-1。根据雷竹生长对主要养分的需求[m（氮）:m（五氧化二磷）:m（氧化钾）=3:1:2]和施肥量的要求[12]，施总氮12.50 g·盆-1，磷肥[Ca（H2PO4）2·H2O] 22.94 g·盆-1，钾肥（KCl）15.91 g·盆-1。为防止试验过程中硝化作用的进行，在每盆土壤中添加硝化抑制剂二氰二胺（C2H4N4）1.00 g。
于2015年5月10日进行氮素试验处理，根据试验设计用电子天平（JJ500Y，d=0.01 g）称取各处理需添加的硝酸钠、硫酸铵和磷肥、钾肥的量，把称量好的肥料溶于水中，傍晚浇入试验盆栽雷竹苗的盆土中，试验前适量控水以利于养分在盆土中的扩散。试验期间适时适量浇水。每盆底下放置1只托盘，每次浇水时用清水清洗托盘内部，并将水倒入盆中，防止盆土中营养的流失。
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试验处理20 d（即2015年6月1日），选取每个处理的雷竹盆栽苗各3盆进行取样，取每个处理每盆立竹竹冠的上部、中部、下部无病虫害的混合成熟叶20片，及1年生竹鞭上的二级根（根径0.5~2.0 mm）10 g左右。测定叶片、二级根的丙二醛（MDA）、可溶性蛋白质质量分数和抗氧化酶活性。
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酶液的提取：采用混合取样法，取0.2 g新鲜叶片或根系置于预冷的研钵中，加入5.0 mL预冷的50 mmol·L-1磷酸缓冲液（pH 7.8）冰浴研磨，再用相同磷酸缓冲液定容至10.0 mL，4 ℃ 10 500 r·min-1离心15 min，取上清液（粗酶液）4 ℃保存备用。
丙二醛质量分数用硫代巴比妥酸法测定，超氧化物岐化酶（SOD）活性用氮蓝四唑（NBT）光化还原法测定，过氧化物酶（POD）活性用愈创木酚氧化法测定，过氧化氢酶（CAT）活性用紫外吸收法测定，可溶性蛋白质质量分数用考马斯亮蓝G250显色法测定[13]。重复测定3次·指标-1。
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试验数据在Excel 2003统计软件中进行整理和作图表，方差分析和多重比较分别采用SPSS 16.0统计软件中的Oneway ANOVA和Duncan（α=0.05）方法完成。试验数据均表示为平均值±标准误差。
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由图 1可知，随着NH4+-N比例的增加，雷竹叶片和根系丙二醛质量分数均呈先降低后升高的变化趋势。相同的硝铵比处理下，叶片丙二醛质量分数均高于根系丙二醛质量分数，是根系的1.06~1.55倍。说明与根系相比，雷竹叶片对不同形态氮素营养的响应更为敏感。单一供应NO3--N或NH4+-N营养处理的雷竹叶片和根系丙二醛质量分数均高于硝铵混合营养供应。就叶片而言，T1，T4和T5处理间无显著性差异，均显著高于T2和T3处理，T3处理的丙二醛质量分数最低，分别是T1，T5处理的0.46，0.41倍；就根系而言，不同氮素形态处理间丙二醛质量分数差异显著，由高到低的处理分别是T1，T5，T4，T2和T3，T3处理的丙二醛质量分数分别是T1和T5处理的0.40，0.43倍。说明单一氮素形态营养处理提高了雷竹细胞膜的膜脂过氧化程度，可能对细胞膜造成伤害，而混合营养处理相反，有利于雷竹生长，并且在NO3--N/NH4+-N为1:1时最佳。
图 1 不同硝铵比处理下雷竹叶片和根系丙二醛质量分数
Figure 1. The MDA contents in leaves and roots of Phyllostachys violascens with different ratios of NO3--N to NH4+-N
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由表 1可知：随着NH4+-N比例的增加，雷竹叶片POD活性逐渐增加，叶片SOD，CAT活性和根系SOD，CAT，POD活性均呈先升高后降低的变化趋势。相同的硝铵比处理下，叶片抗氧化酶活性均高于根系，也说明叶片较根系对氮素形态的响应更为积极。不同氮素形态处理的雷竹叶片SOD活性有显著差异，以T4处理最高，分别较单一氮素形态的T1和T5处理增加了32.78%和113.39%。叶片CAT活性也以T4处理最高，与T5处理无显著差异，但显著高于其他处理，分别较T1和T5处理增加了201.83%和8.14%。叶片POD活性在各处理间差异显著，以T5处理最高。根系SOD活性以T3处理最高，与T2处理无显著差异，但显著高于其他处理，较T1和T5处理增加了12.13%和514.28%。根系CAT和POD活性以T4处理最高，前者较T1和T5处理提高了99.39%和8.37%，后者提高了74.98%和20.36%。说明施加合理的硝铵比混合氮素养分能提高雷竹叶片和根系的抗氧化酶活性，及时清除活性氧积累，有利于雷竹生长，其中以NO3--N/NH4+-N为1:1和1:2时最佳。
表 1 不同硝铵比处理下雷竹叶片和根系超氧化物歧化酶（SOD），过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）活性
Table 1. The SOD, CAT, and POD activities in leave and roots of Phyllostachys violascens with different ratios of NO3--N to NH4+-N
处理 SOD/(×16.67 nkat·g-1) CAT/(×16.67 nkat·g-1) POD/(×16.67 nkat·g-1) 叶片 根系 叶片 根系 叶片 根系 T1(1:0) 741±37 d 473±26 b 2 216±163 d 278±27 d 21 964±710 d 15 467±332 c T2(2:1) 794±31 c 510±7 a 4 409±121 c 357±18 c 23 304±912 cd 22 046±1 139 b T3(1:1) 864±12 b 531±12 a 5 557±441 b 436±16 b 25 206±957 c 23 003±2 606 b T4(1:2) 984±19 a 309±16 c 6 687±151 a 554±32 a 36 489±931 b 27 063±1 114 a T5(0:1) 461±31 e 86±8 d 6 184±277 a 511±45 a 55 299±1 540 a 22 486±694 b 说明：同列比较，不同小写字母表示差异显著（P < 0.05），相同小写字母表示差异不显著（P > 0.05）。 -
由图 2可知：相同的硝铵比处理下，雷竹叶片可溶性蛋白质质量分数远高于根系。随着营养供应中NH4+-N比例的增加，雷竹叶片和根系可溶性蛋白质质量分数均呈先升高后降低的变化趋势。其中，叶片可溶性蛋白质质量分数在T2，T5处理间无显著差异，显著低于T3，T4处理，而显著高于T1处理，在T5处理达到最高。根系可溶性蛋白质质量分数在T2和T4处理间无显著差异，显著高于T5和T1处理，而显著低于T3处理。硝铵混合营养供应下叶片和根系的可溶性蛋白质质量分数总体上高于单一氮素形态供应，说明适当的硝铵比混合营养供应有利于雷竹叶片和根系的蛋白质合成，其中NO3--N/NH4+-N为1:1和1:2时较佳。
图 2 不同硝铵比处理下雷竹叶片和根系可溶性蛋白质质量分数
Figure 2. The soluble protein contents in leaves and roots of Phyllostachys violascens with different ratios of NO3--N to NH4+-N
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适宜的氮素形态及配比对植物的生长发育和生理代谢是有利的，但高比例的NO3--N或NH4+-N可能对植物产生氧化胁迫，加快膜脂过氧化进程，减少蛋白质和糖类的合成，降低氮同化能力，从而影响植物良好生长与丰产[14]。本研究结果表明：单一氮素形态处理的雷竹叶片和根系丙二醛质量分数均高于混合营养处理，硝铵比为1:1时最低，这与杭白菊Chrysanthemum morifolium[15]和大豆[8]的研究结果一致，表明单一营养处理会对细胞膜造成伤害，不利于植物良好生长。
营养供应中适当增加铵态氮比例可以提高植物叶片净光合速率、促进光合产物的合成，而充足的光合产物有利于抗坏血酸的合成代谢，从而提高植物的抗氧化防御能力[16]。本研究结果表明：随着NH4+-N比例的增加，雷竹叶片POD活性逐渐上升，叶片SOD，CAT活性和根系SOD，CAT，POD活性均呈先升高后降低的变化趋势，且叶片和根系抗氧化酶活性在硝铵比1:1和1:2时较高，促使雷竹体内过氧化氢清除，降低膜脂过氧化程度。产生这种现象的原因可能是单一氮素形态处理抑制了抗氧化酶活性，不利于活性氧的及时清除，从而造成过氧化产物的积累[8]。这意味着适宜的硝铵比对减轻雷竹的氧化损伤具有正效应，其中以硝铵比1:1和1:2时抗氧化酶活性较高。
植物体内含量最丰富的核酮糖-1, 5-二磷酸羧化酶（Rubisco）约占可溶性蛋白的50%以上，因此，可溶性蛋白质质量分数可以反映Rubisco活性的高低[17]。本研究表明：随着NH4+-N比例的增加，叶片和根系的可溶性蛋白质质量分数均呈先升高后降低的变化趋势，这与卢凤刚等[18]在韭菜Allium tuberosum中的研究结果一致，并在硝铵比为1:1和1:2时可溶性蛋白质质量分数较高。这意味着此时Rubisco蛋白含量较高及固定二氧化碳羧化能力较强。产生这种现象的原因与单一氮素形态供应下活性氧积累并攻击蛋白质，使蛋白质氧化，而氧化的蛋白质极易受到蛋白酶的催化而分解[19]，从而导致可溶性蛋白质含量减少。所以，进一步表明单一氮素形态供应会使植物细胞内的“微生态”处于恶性循环中[20]，不利于植物的健康生长。
综上所述，与单一氮素形态供应相比较，混合氮素营养供应下雷竹丙二醛质量分数较低，可溶性蛋白质质量分数和抗氧化酶活性均能维持在较高水平，其中，以硝铵比为1:1时更为显著，表明所受的膜脂过氧化程度最低，抗氧化能力最强。不同氮素形态及配比营养供应对雷竹生长过程中的过氧化产物和抗氧化系统会产生显著影响，说明不同氮素形态处理下抗氧化系统与雷竹丰产有着密切的联系，有待于进一步深入研究。
Antioxidant system response to different forms and ratios of nitrogen in leaves and roots of Phyllostachys violascens
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摘要: 氮素是植物必须的营养元素，对植物生长影响重大。由于硝态氮（NO3--N）和铵态氮（NH4+-N）的形态差异，两者对植物养分吸收和生理代谢的影响不同。针对雷竹Phyllostachys violascens培育中存在氮肥施用不当的问题，通过设置NO3--N和NH4+-N不同比例，即硝铵比为1:0，2:1，1:1，1:2，0:1的5个氮素形态营养处理，测定了雷竹叶片和根系的丙二醛、可溶性蛋白质质量分数和抗氧化酶活性。结果表明：相同的硝铵比处理下，雷竹叶片丙二醛、可溶性蛋白质质量分数和抗氧化酶活性均高于根系，叶片较根系对氮素营养的响应更为敏感。随着NH4+-N增加，雷竹叶片和根系丙二醛质量分数均呈先降低后升高趋势，且在硝铵比为1:1时最低；抗氧化酶活性总体上呈先升高后降低趋势，混合营养处理的抗氧化酶活性均较高，其中叶片超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性在硝铵比为1:2时最高，过氧化物酶（POD）在纯铵处理时最高；根系SOD活性在硝铵比为1:1时最高，CAT和POD活性在硝铵比为1:2时最高；可溶性蛋白质质量分数也呈先升高后降低趋势，叶片和根系分别在硝铵比为1:2和1:1时最高。综合分析认为：混合氮素形态营养供应的雷竹叶片和根系的丙二醛质量分数较单一氮素形态供应低，且可溶性蛋白质质量分数和抗氧化酶活性均能维持在较高水平，说明混合氮素形态营养处理下雷竹受到的膜脂过氧化程度较低，抗逆性较强。Abstract: Nitrogen (N), a necessary plant nutrient for plant growth can be applied as nitrate nitrogen (NO3--N) or ammonium nitrogen (NH4+-N) but may have different effects on nutrient absorption and physiological metabolism of the plant. To determine a proper N fertilizer for Phyllostachys violascens cultivation, an experiment supplying N fertilizer with five different ratios of NO3--N and NH4+-N (1:0, 2:1, 1:1, 1:2, and 0:1) was conducted. Contents of malondialdehvde (MDA), soluble protein, and antioxidant enzyme activities were determined. Results showed that for the same treatment ratios of NO3--N and NH4+-N, MDA content, soluble protein, and antioxidant enzyme activities were higher in leaves than in roots. As the concentration of NH4+-N increased, the MDA content in leaves and roots first decreased and then increased with the lowest MDA having a ratio of 1:1. Antioxidant enzyme activities first increased and then generally decreased having higher levels with mixotrophism. Superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) activities in leaves were highest with the 1:2 ratio; whereas SOD activity in roots was highest with the 1:1 ratio, and CAT and peroxidase (POD) activities were highest with the 1:2 ratio. Soluble protein content also increased first and then decreased with the highest for leaves in a 1:2 ratio and for roots in a 1:1 ratio. With mixed nutrition, MDA content was lower, but soluble protein content and antioxidant enzyme activities remained at much higher levels. Thus, with a mixture of NO3--N and NH4+-N at a 1:1 ratio, the degree of oxidative damage to leaves and roots of Phyllostachys violascens was least, and antioxidant enzyme activities were stronger, thereby boosting growth and biomass accumulation.
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图 1 不同硝铵比处理下雷竹叶片和根系丙二醛质量分数
Figure 1 The MDA contents in leaves and roots of Phyllostachys violascens with different ratios of NO3--N to NH4+-N
图 2 不同硝铵比处理下雷竹叶片和根系可溶性蛋白质质量分数
Figure 2 The soluble protein contents in leaves and roots of Phyllostachys violascens with different ratios of NO3--N to NH4+-N
表 1 不同硝铵比处理下雷竹叶片和根系超氧化物歧化酶（SOD），过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）活性
Table 1. The SOD, CAT, and POD activities in leave and roots of Phyllostachys violascens with different ratios of NO3--N to NH4+-N
处理 SOD/(×16.67 nkat·g-1) CAT/(×16.67 nkat·g-1) POD/(×16.67 nkat·g-1) 叶片 根系 叶片 根系 叶片 根系 T1(1:0) 741±37 d 473±26 b 2 216±163 d 278±27 d 21 964±710 d 15 467±332 c T2(2:1) 794±31 c 510±7 a 4 409±121 c 357±18 c 23 304±912 cd 22 046±1 139 b T3(1:1) 864±12 b 531±12 a 5 557±441 b 436±16 b 25 206±957 c 23 003±2 606 b T4(1:2) 984±19 a 309±16 c 6 687±151 a 554±32 a 36 489±931 b 27 063±1 114 a T5(0:1) 461±31 e 86±8 d 6 184±277 a 511±45 a 55 299±1 540 a 22 486±694 b 说明：同列比较，不同小写字母表示差异显著（P < 0.05），相同小写字母表示差异不显著（P > 0.05）。 
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https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.2017.01.003
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图(2) / 表(1)
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