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《全国土壤污染状况调查公报》显示，中国耕地土壤污染点位超标率高达19.4%，重金属污染点位超标率为15.5%，其中镉的点位超标率为7.0%，居首位[1]。镉是一种毒性很强的人体非必需元素，极易被作物吸收进入食物链，从而危害人体健康[2]。如何阻遏环境中的镉进入食物链，已成为当前土壤及生态环境领域的研究热点之一[3]。目前，微生物修复技术成为镉污染治理的研究方向之一[4]。蒋成斌[5]筛选到2种耐镉细菌：腐败希瓦菌Shewanella putrefaciens和假单胞菌Pseudomonas sp.，在LB(Luria-Bertani)固体和液体培养上耐受重金属镉离子(Cd2+)浓度分别达到150和40 mmol·L−1。张欣等[6]在模拟镉轻度污染(1 mg·kg−1)试验中通过施入微生物菌剂(枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、光合细菌和乳酸菌)后使菠菜Spinacia oleracea镉含量平均下降14.5%。王微等[7]和何小三等[8]利用硅藻土制备的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa菌剂能够显著促进镉胁迫苗期水稻Oryza sativa的生长，抑制镉在根、茎鞘、叶片中的迁移与积累。汪敦飞等[9]研究指出：耐镉铜绿假单胞菌及其菌剂能显著提高镉胁迫水稻苗期的根系活力，增强水稻叶片抗氧化酶系统的活力，提高水稻叶片抗氧化物的含量，从而有效缓解水稻镉胁迫效应。假单胞菌为革兰氏阴性菌，环境适应能力强，世代周期短，具有根际促生能力，已被广泛用作生防菌[10-11]。本课题组前期从水稻根际土壤筛选了1株耐镉的假单胞菌TCd-1，能在高达900 mg·L−1 Cd2+下生长，在100 mg·L−1镉处理下，菌株体内吸收的镉质量分数为9.04 mg·g−1，镉富集系数达到90.4，具有较强镉富集能力，因此有应用于镉污染的修复潜力[12]。但该菌株的培养条件有待优化。响应面分析法是一种综合试验设计和数学建模的方法，既能有效减少试验次数又能考察各个因素之间的交互作用[13-14]，在优化试验设计中，被人们广泛使用[15]。胡瑞萍等[16]利用响应面法优化了枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis NHS1菌株培养基组分，使芽孢含量比优化前提高1.5倍。印杨等[17]利用响应面法优化了生防菌株(巨大芽孢杆菌Megaterium bacillus RB10)的发酵培养条件参数，证实了Box-Behnken设计的有效性和模型的准确可靠[17]。袁辉林[18]以植物促生菌SZ7-1为研究对象，在5 L自动发酵罐中采用单因素试验设计及响应曲面法进行扩大培养，结果表明：优化后的培养条件更利于菌株的生长，且活菌数是优化前的1.62倍。刘江红等[19]通过响应面法优化了芽孢杆菌Bacillus S2的培养条件，使最优乳化指数(E24)提高为81.20%。巩志金等[20]利用响应面法优化了铜绿假单胞菌产鼠李糖脂的发酵培养基，结果使其产量提高了14.43%。本研究基于响应面法通过单因素筛选试验、Plackett-Burman试验、Box-Behnken 试验和响应面分析法，对TCd-1菌株培养条件进行优化，以期为菌株潜在价值的开发利用和菌剂制备提供技术支持。
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供试菌株为耐镉的假单胞菌Pseudomonas sp. TCd-1(专利号CN 103952333A)[21]，甘油保存于−80 ℃冰箱。菌株活化时取出塑料冻存管，立即置于30~40 ℃恒温水浴锅中匀速摇动进行快速复苏，待冻存管内结冰全部溶解后，开启冻存管，将内容物转移至种子液培养基内培养。
种子液培养条件：采用牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化钠 5.0 g，琼脂 15.0~20.0 g，1.0 L蒸馏水，pH 7.2~7.4)。菌株长出后选取直径约为3 mm的菌落进行平板划线法过夜培养，再从2次培养的固体培养基上挑取1环菌落至100 mL的三角瓶，150 r·min−1，37 ℃，恒温培养18 h，制成菌株种子液。发酵培养条件：牛肉膏蛋白胨液体培养基100 mL，质量分数为0.5%氯化钠，1.0%种子液，150 r·min−1，37 ℃恒温培养24 h。
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在发酵培养条件下，选择不同氮源：N1为酵母粉，N2为硫酸铵[(NH4)2SO4]，N3为硝酸铵(NH4NO3)，N4为蛋白胨，N5为硝酸钾(KNO3)，N6为氯化铵(NH4Cl)，N7为硝酸纳(NaNO3)，设置质量分数为0.5%、1.0%、1.5% 3个水平；不同碳源：C1为牛肉膏，C2为可溶性淀粉，C3为葡萄糖，C4为蔗糖，设置质量分数为0.1%、0.3%、0.5% 3个水平；不同无机盐：W1为氯化钙(CaCl2)，W2为氯化镁(MgCl2)，W3为氯化钠(NaCl)，W4为氯化钾(KCl)，W5为磷酸氢二钠(Na2HPO4)，W6为硫酸钠(Na2SO4)，W7为磷酸二氢钠(NaH2PO4)，设置质量分数为0.2%、0.5%、0.8% 3个水平。以菌株最大吸收波长660 nm下的吸光度D(660)作为评价指标，筛选最适的碳源、氮源、无机盐及其质量分数。
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根据单因素试验得到的最适碳源(牛肉膏)、氮源(酵母粉)、无机盐(MgCl2)，进行Plackett-Burman试验。试验设计如表1。试验次数 n=12，各因素水平设置为高低2个水平，高水平(1)取值为低水平(−1)的1.25倍，其中 D、H、K为空白试验，用于误差估计。考察牛肉膏(A)、酵母粉(B)、MgCl2(C)、培养温度(E)、初始pH(F)、接菌量(G)、培养时间(I)和转速(J) 8个因素对菌株生长的影响，确定影响菌株生长的关键因素。
表 1 Plackett-Burman试验设计因素和水平
Table 1. Factors and levels of Plackett-Burman design
因素 水平 因素 水平 因素 水平 −1 1 −1 1 −1 1 A 牛肉膏/% 4.0 5.0 E 温度/% 30.0 37.50 I 培养时间/h 20 24 B 酵母粉/% 0.8 1.0 F 初始pH 6.0 7.50 J 转速/(r·min−1) 160 200 C MgCl2/% 4.0 5.0 G 接菌量/% 1.0 1.250 K 空白3 D 空白1 H 空白2 -
根据Plackett-Burman试验筛选得到的显著影响菌株生长的关键因素(酵母粉、温度、初始pH)，确定最陡爬坡试验的步长和方向，获得最佳的响应区域。
以最陡爬坡试验得到最佳响应区域(2号试验)作为Box-Behnken试验设计的中心点，各因素取3个水平，以(−1，0，1)表示，设计包括了5个中心点(0，0，0)，即酵母粉0.9%、温度35 ℃、pH 7，共17个组合的响应面试验。各处理3次重复。
表 4 最陡爬坡试验
Table 4. Factors and levels of steepest ascent design
试验
号B 酵
母粉/%E 温
度/℃F 初
始pH编码 吸光度 1 0.8 40 8.0 (−1，1，1) 1.079±0.058 c 2 0.9 35 7.0 (0，0，0) 1.720±0.006 a 3 1.0 30 6.0 (1，−1，−1) 1.681±0.015 b 说明：不同小写字母表示差异显著(P＜0.05) -
根据Box-Behnken试验结果，进行方差分析，并拟合线性回归方程，检验拟合防方程的符合程度；利用拟合方程获得最佳培养条件，并在最佳培养条件下进行验证试验。
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数据处理和作图使用Excel 2016进行，统计分析使用Design Experts 10和IBM SPSS 22。试验结果以平均值±标准差表示，采用Duncan法进行数据差异显著性检验(P=0.05)。
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结果表明：碳源种类及其质量分数显著影响菌株的生长(图1A)，菌液吸光度随牛肉膏、可溶性淀粉质量分数的提高而增大，而葡萄糖和蔗糖质量分数对菌液吸光度的影响较小。各处理中以0.5%牛肉膏培养的吸光度(1.257)最高，显著高于其他各处理(P＜0.05)，比可溶性淀粉的最大值高10.8%，比葡萄糖和蔗糖的最大值分别提高了17.7%和23.6% (图1A)。不同氮源及其质量分数显著(P＜0.05)影响菌株的生长(图1B)，有机氮源(酵母粉、蛋白胨)更利于菌株生长，各处理中以1.0%酵母粉处理的吸光度(1.266)最高，比1.0%蛋白胨高14.2%，比硫酸铵、硝酸铵、硝酸钾、氯化铵和硝酸钠处理的最大吸光度分别高出62.7%、79.8%、76.8%、52.7%、87.0%。不同无机盐显著(P＜0.05)影响菌株的生长(图1C)。培养基含0.5%镁离子时的菌液吸光度(1.197)最高，而钙离子最不利于菌株生长；培养基含0.5%的氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、硫酸钠、磷酸二氢钠与含0.8%的氯化镁、氯化钾、磷酸二氢钠间无显著性差异。可见，选择0.5%牛肉膏、1.0%酵母粉及0.5% MgCl2作为基础培养基是最合适的。
图 1 不同碳源(A)、氮源(B)、无机盐(C)对菌株生长影响
Figure 1. Effect of carbon source(A)，nitrogen source(B)，inorganic salt (C) on the growth of strains
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Plackett-Burman试验结果显示：菌株生长在不同处理间存在显著差异(表2)，以8号、9号、10号吸光度高，且之间无显著性差异。9号吸光度 (1.802)最高，比最低5号(0.981)的值高83.7%。
表 2 Plackett-Burman 试验结果
Table 2. Results of Plackett-Burman design
试验号 A 牛肉膏 B 酵母粉 C 氯化镁 D 空白1 E 温度 F pH G 接菌量 H 空白2 I 时间 J 转速 K 空白3 吸光度 1 1 1 −1 1 1 1 −1 −1 −1 1 −1 1.235±0.078 f 2 −1 1 1 −1 1 1 1 −1 1 −1 −1 1.358±0.030 e 3 1 −1 1 1 −1 1 1 1 −1 −1 −1 1.563±0.058 b 4 −1 1 −1 1 1 −1 1 1 −1 −1 1 1.397±0.021 de 5 −1 −1 1 −1 1 1 −1 1 −1 1 1 0.981±0.042 h 6 −1 −1 −1 1 −1 1 1 −1 1 1 1 1.440±0.028 cd 7 1 −1 −1 −1 1 −1 1 1 1 1 −1 1.121±0.026 g 8 1 1 −1 −1 −1 1 −1 1 1 −1 1 1.756±0.010 a 9 1 1 1 −1 −1 −1 1 −1 −1 1 1 1.802±0.003 a 10 −1 1 1 1 −1 −1 −1 1 1 1 −1 1.783±0.012 a 11 1 −1 1 1 1 −1 −1 −1 1 −1 1 1.195±0.096 fg 12 −1 −1 −1 −1 −1 −1 −1 −1 −1 −1 −1 1.492±0.041 bc 说明：不同小写字母表示差异显著(P＜0.05) 进一步的因子分析(表3)结果表明：在设定的试验条件下，显著影响菌株生长的因子为酵母粉(B)、温度(E)和pH (F)，显著性程度从大到小依次为温度、酵母粉、pH。确定这3个因素为影响菌株生长的关键因素，进行最陡爬坡试验。
表 3 Plackett-Burman试验显著性分析结果
Table 3. Results of Plackett-Burman design
来源 均方和 自由度 均方 F P 显著性 效应系数 显著性排序 效应正负 模型 0.780 00 8 0.098 00 70.01 0.002 5 ** 1.430 A 牛肉膏 0.004 07 1 0.004 07 2.91 0.186 5 0.018 7 ＋ B 酵母粉 0.200 00 1 0.200 00 141.15 0.001 3 ** 0.130 2 ＋ C 氯化镁 0.004 84 1 0.004 84 3.46 0.159 8 0.020 5 ＋ E 温度 0.540 00 1 0.540 00 387.22 0.000 3 ** −0.210 1 − F pH 0.017 00 1 0.017 00 12.45 0.038 7 * −0.038 3 − G 接菌量 0.004 76 1 0.004 76 3.40 0.162 2 −0.020 6 ＋ I 时间 0.000 03 1 0.000 03 0.022 0.892 7 0.002 8 ＋ J 转速 0.013 00 1 0.013 00 9.49 0.054 1 −0.033 4 − 说明：*表示差异显著(P＜0.05)，**表示差异极显著(P＜0.01) -
参照表3因子的正负效应可知：因素B、因素E、因素F各具有不同正、负效应系数，即酵母粉(B)具有正效应(+)，依次增大；温度(E)具有负效应(−)，依次减小；pH (F)具有负效应(−)，依次减小。
最陡爬坡试验结果(表4)显示：随着酵母粉质量分数逐渐增大，温度和pH逐渐减小，菌株吸光度呈现先升高后下降的变化趋势。2号的吸光度达到最高水平(1.720)，比1号和3号分别高出2.3%和59.4%，以此确定为因子的最大相应值响应区域，即酵母粉质量分数为0.9%，温度为35 ℃，pH 7的组合可作为Box-Behnken试验设计的中心点(0，0，0)。
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Box-Behnken试验结果表明：不同试验组合间存在显著差异(表5)。14 号吸光度(1.785)最高，比2号(0.922)高93.6%，即14号(0，0，0)：酵母粉质量分数为0.9%，温度为35 ℃，pH 7条件下的吸光度高于2号(0，1，1)：酵母粉质量分数为0.8%，温度为40 ℃，pH=7条件下的吸光度。
表 5 Box-Behnken试验设计
Table 5. Results of Box-Behnken design
试验序号 B 酵母粉/% E 温度/℃ F 初始pH 吸光度 试验序号 B 酵母粉/% E 温度/℃ F 初始pH 吸光度 1 0 0 0 1.505±0.007 g 10 1 −1 0 1.770±0.023 ab 2 0 1 1 0.922±0.014 j 11 −1 0 −1 1.634±0.021 f 3 1 0 1 1.655±0.035 ef 12 1 0 −1 1.670±0.007 ef 4 −1 −1 0 1.056±0.027 h 13 0 0 0 1.749±0.024 ef 5 0 0 0 1.661±0.018 ef 14 0 0 0 1.785±0.007 a 6 0 −1 −1 0.941±0.042 ig 15 −1 1 0 1.754±0.010 abc 7 −1 0 1 1.524±0.013 g 16 0 0 0 1.733±0.003 bc 8 0 1 −1 0.967±0.060 i 17 0 −1 1 1.727±0.009 cd 9 1 1 0 1.690±0.010 de 说明：不同小写字母表示差异显著(P＜0.05) -
回归模型的方差分析结果表明：模型多元相关性系数为0.9958 (表6)，表明仅有0.042 0%的变异不能由此模型解释；回归模型P＜0.01，表明模型是极显著的。模型失拟项的显著性水平P=0.146＞0.05，表明模型失拟不显著。方差分析结果显示，Box-Behnken设计的模型显著性水平P＜0.000 1，表明所采用的拟合模型达到极显著水平，具有统计学意义。由表6可知，3个因素的影响程度从大到小次序为温度(E)、酵母粉(B)、pH(F)；B、E、F、E2 对响应值Y(吸光度)的影响达到极显著水平，EF显著影响Y值。此外，回归方程的相关系数R2=0.9958，变异系数为2.08%，说明该回归方程拟合度高，变异几率低，适用于该菌株试验条件下各影响因素的统计分析。该响应面拟合方程为：Y=1.750 0+0.050 0B−0.307 0E−0.033 3F−4.000 0E−0.030 0BE−0.011 0BF−0.040 7EF−0.023 6B2−0.441 0E2−0.034 9F2。依据单因素和Plackett-Burman试验的结果选择设定的酵母粉(B)、温度(E)和pH(F)的取值范围，利用响应面拟合方程得到3个关键因素的拟合值：酵母粉为1.0%，pH为6.3，温度为33 ℃。该拟合值条件下模型的预测吸光度最大，为1.856。
表 6 Box-Behnken试验回归模型方差分析
Table 6. Variance analysis of regression model of Box-Behnken test
来源 均方和 自由度 均方 F 显著性 来源 均方和 自由度 均方 F 显著性 模型 1.638 00 9 0.182 00 182.747 ** B2 0.002 36 1 0.002 36 2.371 B 0.020 00 1 0.020 00 20.091 ** E2 0.820 50 1 0.820 00 824.161 ** E 0.756 00 1 0.756 00 759.257 ** F2 0.005 14 1 0.005 14 5.159 F 0.008 90 1 0.008 91 8.951 ** 残差 0.006 97 7 0.001 00 BE 0. 000 06 1 0.000 06 0.064 失拟项 0.004 91 3 0.001 64 3.179 不显著 BF 0.000 48 1 0.000 48 0.486 纯误差 0.002 06 4 0.000 52 EF 0.006 64 1 0.006 64 6.672 * 总和 1.644 00 16 说明：变异系数为2.08%，相关系数为0.995 8，校正决定系数为0.9903，预测系数为0.950 3。*表示显著差异(P＜0.05)，**表示极显 著差异(P＜0.01) -
综合单因素筛选试验、Plackett-Burman及 Box-Behnken试验模型的拟合值，得到菌株最佳培养条件为：牛肉膏质量分数为0.5%，酵母粉1.0%，氯化镁 0.5%，pH 6.3，温度33 ℃，接菌量1.25%，转速160 r·min−1，培养时间24 h。利用最佳培养条件，进行重复试验验证，得到菌液的吸光度为1.801±0.015，与模型预测的最大值(1.856)相接近，接近程度97.03%，表明模型准确可信，能真实评价各因素及其交互作用对菌株生长的不同影响。同时，与未优化前培养条件下菌株吸光度(1.078±0.021)相比，优化后该值提高了67.07%，达到预期目的。
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Plackett-Burman 是一种基于非完全平衡块原理的近饱和的两水平试验设计方法。通过N次试验最多可以考察N−1个因素，用最少试验次数可以从众多因素中快速有效地筛选出最为重要的几个主效因子，每个因素取低和高2个水平，高水平取低水平的1.25倍[22-23]。
在本试验中，Plackett-Burman试验从多个因素[牛肉膏(A)、酵母粉(B)、氯化镁(C)、培养温度(E)、初始pH(F)、接菌量(G)、培养时间(I)和转速(J)]中快速筛选出具有显著影响的因素为：酵母粉、pH和温度。其中酵母粉之所以能显著影响菌株生长，在于它能提供优质氮源满足细菌繁殖所必需，而且天然酵母粉主要由多种酵母菌自然繁殖而成，是一种纯天然、无污染的健康营养源[24]。有机氮源比无机氮源含有更丰富的氨基酸、维生素及生长因子等营养物质，其中氨基酸可以直接参与微生物体内的转氨或脱氨作用(图1)，更适用于菌株生长。温度是诸多因素中显著影响因素之一，因为可能随着温度升高，菌体生长速度及营养消耗的速率也随之加快，明显缩短进入生长稳定期的时间；从酶本身特性来看，酶具有高效催化性，能够降低生化反应的活化能，但酶本身作用条件较温和，对温度比较敏感，很容易因温度过高而丧失活性[25]。温度也会影响细胞膜的流动性，进而影响膜内外物质(水分、有机物、各种离子等)的交换和吸收。pH 显著影响菌株生长速率可能在于其对菌株生长需要的酶、各种生物大分子的稳定性造成破坏等，导致失去生物活性；pH也会影响到培养基中金属离子的存在形式，造成其不易或者不被吸收；pH同样会影响微生物细胞膜所带电荷状态，进而改变细胞膜的通透性，最终直接或间接影响微生物对所需营养物质的吸收和代谢产物的排出。
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响应面分析是利用统计学和数学模型的方法对需要优化的多因素系统进行建模和分析[13-15]，Box-Behnken试验设计是其中拟合模型之一，目前常被用于生物发酵过程培养基和培养条件的优化。该方法不仅可以建立连续变量的曲面模型和拟合方程，还可以对影响微生物生长和发酵过程的各种因子及其交互作用进行评价，确定最佳水平范围，通过最少的试验组数获得更为精确有效的结论，极大地节约资源和降低成本，使其效应最大化[26]。
细菌生长和培养是一个动态发酵过程，受外部发酵环境以及内部培养基成分的共同影响。此次试验以牛肉膏蛋白胨培养基为基础，通过单因素试验、Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验、Box-Behnken试验确定菌株培养基组分和外部培养条件，系统优化了重金属镉耐性假单胞菌TCd-1培养体系，为后续进一步深入研究其菌剂制备及应用于重金属镉污染土壤的修复效应奠定了基础。
Optimization of culture conditions of Cd-tolerant strain Pseudomonas TCd-1 based on response surface methodology
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摘要:
目的 利用响应面法优化耐镉菌株假单胞菌Pseudomonas TCd-1的培养条件。 方法 以基础发酵培养条件为对照，菌株吸光度D(660)作为评价指标，利用单因素试验确定培养基组分的最佳碳源、氮源和无机盐种类，通过Plackett-Burman试验设计评价牛肉膏、酵母粉、氯化镁、培养温度、初始pH、接菌量、培养时间和转速8个因素对菌株生长的影响，进而确定显著影响因素，然后进行最陡爬坡试验获得显著影响因素的最优组合，结合Box-Behnken试验设计和响应面分析，优化假单胞菌TCd-1的培养条件。 结果 菌株培养基组分的最佳碳源、氮源和无机盐分别为牛肉膏、酵母粉和氯化镁；影响菌株生长的显著性因素为酵母粉、培养温度、初始pH；基于响应面法优化后的培养条件为：牛肉膏质量分数为0.5%，酵母粉1.0%，氯化镁0.5%，pH 6.3，温度33 ℃，接菌量1.25%，转速160 r·min−1，培养时间24 h。 结论 根据最佳条件, 进行重复试验得到优化后的菌液吸光度D(660)比对照提高了67.07%，与模型预测值相一致，表明优化后的条件显著促进了菌株的生长，达到预期目的。图1表6参26 -
关键词:
- 假单胞菌 /
- 镉 /
- Plackett-Burman设计 /
- 优化培养 /
- 响应面法
Abstract:Objective This study aims to optimize the culture conditions of Cd-tolerant Pseudomonas TCd-1 based on response surface methodology. Method Taking the basic fermentation conditions as the control, and the absorbance D(660) value of the strain as the evaluation index, the single factor test was carried out to determine the best carbon source, nitrogen source, and inorganic salt species of the culture medium components. The Plackett-Burman test design was used to evaluate the influence of 8 factors on the growth of the strain, including beef extract, yeast powder, magnesium chloride, culture temperature, initial pH, inoculation quantity, culture time, and rotation speed. The best combination of significant factors was obtained by the steepest climbing test. The culture conditions of TCd-1 were optimized by combining the box Behnken design test and response surface analysis. Result The best carbon source, nitrogen source, and inorganic salt of the strain culture medium components were beef extract, yeast powder, and magnesium chloride. The significant factors affecting the growth of the strain were yeast powder, culture temperature, and initial pH. The optimized culture conditions based on response surface methodology included beef extract 0.5%, yeast powder 1.0%, magnesium chloride 0.5%, pH 6.3, temperature 33 ℃, inoculation rate 1.25%, rotation speed 160 r·min−1, and culture time 24 h. Conclusion According to the optimal conditions, the D(660) value of the optimized bacterial solution is 67.07% higher than that of the control after repeated experiments, which is consistent with the predicted value of the model, indicating that the optimized conditions could significantly promote the growth of the strain and achieve the desired goal.[Ch, 1 fig. 6 tab. 26 ref.] -
Key words:
- Pseudomonas sp. /
- Cd /
- Plackett-Burman design /
- optimized culture /
- response surface methodology
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在城市化快速发展的背景下，城镇建设用地的扩张导致生态空间衰减、系统结构失衡、生态功能下降等问题凸显[1]，生态环境面临多重压力和干扰，引起的景观生态风险值得关注。绿色空间是城镇地域范围内对于改善区域生态环境、维持生态系统物质能量循环具有重要作用的生态空间，是由耕地、林地、草地、水域等不同土地单元镶嵌而成的复合生态系统[2−4]。当前，国内外学者对绿色空间的研究主要集中在绿色空间结构与功能[5]、景观格局动态演化[6−7]及生态环境效益[8−9]等方面。景观生态风险评价用于评估自然或人为因素干扰对生态系统及其组分产生不利影响的可能性及损失[10]，基于景观格局指数构建景观生态风险评价模型能够定量揭示生态环境健康程度及风险压力的时空分布特征[11]。现有研究主要集中于景观生态风险的静态分析，对时空动态分析视角下景观生态风险演变特征的分析相对薄弱，且研究尺度集中在城市[12−13]、城市群[14−15]、流域[16−17]等典型地区，对具有特殊地域特征的苏南水网地区的研究相对较少。
苏南水网地区位于经济发达、人口密集的长江三角洲，河流、湖荡众多，水系纵横交错，形成了独特的地域生态空间特征。随着城镇建设用地的迅速扩张，苏南水网地区绿色空间日趋破碎化，生态系统稳定性下降。本研究以苏南水网地区江苏省昆山市为研究对象，利用2000、2010、2020年土地利用数据，定量测度其绿色空间景观格局变化引起的景观生态风险，并探究景观生态风险时空演变特征，依据风险等级转移变化特征划定绿色空间管控分区，提出分区调控策略，为优化水网地区空间景观布局，保护地区生态安全，合理开发绿色空间资源提供理论依据，也为地区景观生态风险管理提供决策支持。
1. 研究区概况与数据来源
1.1 研究区概况
昆山市位于长江三角洲地区江苏省苏州市东部，31°06′~31°32′N，120°48′~121°09′E，全市下辖周庄镇、锦溪镇、淀山湖镇等10个镇，总面积为931 km2。根据《昆山市统计年鉴》，2000—2020年昆山市户籍总人数增加47.3万人，城镇化率由57.31%提升至78.95%，国内生产总值(GDP)增长4 075.96亿元，经济建设水平居于全国经济百强县首位。昆山市境内地势平坦，属北亚热带季风性湿润气候，四季分明，雨量充沛。境内河港纵横交错，湖荡星罗棋布，水域面积占16.4%，包含白莲湖、傀儡湖、明镜荡等湖荡，水网地区风貌特征明显。
1.2 数据来源及处理
采用2000、2010、2020年3期 Landsat TM/OLI 遥感影像，数据集来源于地理空间数据云平台(
http://www.gscloud.cn/ )，空间分辨率为30 m×30 m。利用ENVI 5.3软件对各期遥感影像数据进行校准、图像拼接裁剪等处理。参考中国科学院土地利用/土地覆盖分类系统及GB/T 21010—2017《土地利用现状分类》相关标准，结合苏南水网地区地域特点，将研究区划分为耕地、林地、草地、水域、建设用地和未利用地等6类土地利用类型，其中耕地、林地、草地和水域为绿色空间，建设用地和未利用地为非绿色空间。对解译后的土地利用类型数据进行精度验证，Kappa系数均＞0.85，符合解译精度要求。2. 研究方法
2.1 风险小区的划分
为了便于景观生态风险指数的空间化表达，本研究基于ArcGIS的渔网分析功能划分景观生态风险小区。依据研究区面积大小及数据精度，采用等间距采样的方法将研究区划分为1.5 km×1.5 km正方形格网，共划分景观生态风险样本小区489个(图1)，利用 Fragstats 4.2软件计算各个样本小区内的生态风险指数，作为每个风险小区中心点的景观生态风险值。
2.2 景观生态风险评价模型
景观格局指数是反映景观结构组成和空间配置特征的定量指标[18]。基于景观格局指数的生态风险评价方法能够有效评估生态系统受到外部干扰的强弱和内部抵抗力的大小[19]。根据相关研究成果[20−21]，依据景观格局与生态风险之间的关联，选取景观干扰度指数($ {E}_{i} $)、景观脆弱度指数($ {V}_{i} $)和景观损失度指数($ {R}_{i} $)来构建景观生态风险评价模型。
各景观格局指数计算方法及生态学含义详见表1。
表 1 景观格局指数及计算方法Table 1 Landscape pattern index and their calculation methods指数名称 计算方法 生态学含义 土地利用生态风险指数
(IERk)${I_{{\text{ER}}k}} = \displaystyle \sum \limits_{i = 1}^N \dfrac{{{A_{ki}}}}{{{A_k}}} \times {R_i} $ Aki为第k个风险小区内土地利用类型i的面积；Ak为第k个风险小区的面积；Ri为第i类景观的景观损失度指数 景观损失度指数(Ri) Ri=Ei×Vi Ei为景观干扰度指数，Vi为景观脆弱度指数 景观干扰度指数($ {E}_{i} $) $ {E}_{i}={aC}_{i}+{bN}_{i}+{cD}_{i} $ 表示不同类型景观生态系统所受外界干扰的程度，主要与人类的开发活动有关。其中：$ a、b、c $分别为$ {C}_{i} $、$ {N}_{i}{\mathrm{、}D}_{i} $的权重，且$ a+b+c= $1，参考前人研究[11, 22]，将$ a、b、c $分别赋值为0.5、0.3和0.2 景观破碎度指数($ {C}_{i} $) $ {C}_{i}=\dfrac{{n}_{i}}{{A}_{i}} $ 表示景观被分割的破碎化程度，值越大表明景观破碎程度越高 景观分离度指数($ {N}_{i} $) $ {N}_{i}=\dfrac{A}{2{A}_{i}}\sqrt{\dfrac{{n}_{i}}{A}} $ 表示某一景观类型中不同斑块间的分离程度，值越大表明景观空间分布越离散，景观结构稳定性越低。$ {n}_{i} $为景观类型$ i $的斑块个数；$ {A}_{i} $为景观类型$ i $的面积；$ A $为景观总面积 景观优势度指数($ {D}_{i} $) $ {D}_{i}=\dfrac{\left(\dfrac{{n}_{i}}{N}+\dfrac{{q}_{i}}{Q}\right)}{4}+\dfrac{{A}_{i}}{2A} $ 表示斑块在景观中的地位，值越大代表斑块对景观格局演变影响越大。$ {q}_{i} $为景观类型$ i $斑块出现的样方数；$ Q $为样方总数；$ N $为斑块总数 景观脆弱度指数($ {V}_{i} $) $ {V}_{i}={I}_{{\mathrm{LS}}}\times \left(1-{I}_{{\mathrm{LA}}}\right) $ 表示不同景观类型抵抗外界干扰的敏感程度。其中：ILS为景观敏感度指数，可通过景观干扰度指数和景观易损度指数相乘而得，景观易损度指数根据前人研究成果[23−24]，结合研究区实际情况赋以权重：未利用地为6，水域为5，耕地为4，草地为3，林地为2，建设用地为1；ILA为景观适应度指数，由斑块丰富密度指数、香农多样性指数、香农均匀度指数相乘而得。3种指数均由Fragstats软件计算而得 3. 结果与分析
3.1 昆山市绿色空间演变特征分析
3.1.1 绿色空间面积组成对比分析
通过ArcGIS软件对遥感影像图进行分类处理，得到昆山市2000、2010和2020年3个时期土地利用类型图(图2)，并统计得到各土地利用类型面积与占比(表2)。从分析结果来看：2000—2020年昆山市各绿色空间类型面积发生了较大变化，其中耕地面积下降明显，减少20 203.11 hm2，占比下降21.70%；水域面积在2000—2010年小幅增加，占比上升2.24%，2010—2020年水域面积明显下降，减少了
5905.17 hm2，占比下降6.34%；林地面积共减少72.90 hm2，而草地面积则增加了143.64 hm2，两者在绿色空间中占比很小。总体而言，研究期间昆山市绿色空间总面积明显减少，反映了建设用地扩张不断侵占市域内的绿色空间，以耕地面积的缩减最为突出。
图 2 2000—2020年昆山市土地利用类型示意图Figure 2 Land use type map of Kunshan City from 2000 to 2020表 2 2000—2020年昆山市各用地类型面积变化Table 2 Changes in the area of various land types in Kunshan City from 2000 to 2020土地利用类型 2000年 2010年 2020年 面积/hm2 百分比/% 面积/hm2 百分比/% 面积/hm2 百分比/% 绿色空间 耕地 68 884.11 73.98 51 240.51 55.03 48 681.00 52.28 林地 122.85 0.13 112.59 0.12 49.95 0.05 草地 36.36 0.04 78.66 0.08 180.00 0.19 水域 15 156.36 16.28 17 247.87 18.52 11342.70 12.18 合计 84 199.68 90.43 68 679.63 73.75 60253.65 64.70 非绿色空间 建设用地 8 833.95 9.49 24 386.49 26.19 32828.04 35.26 未利用地 81.36 0.09 48.96 0.05 33.39 0.05 合计 8 915.31 9.58 24 435.45 26.24 32861.43 35.31 3.1.2 绿色空间面积转移矩阵分析
为了进一步揭示昆山市绿色空间用地类型的时空演变规律，本研究采用土地利用转移矩阵对昆山市各用地类型之间的转移方向和转换数量进行分析，结果如表3所示。2000—2020年昆山市各绿色空间类型转移存在明显差异：耕地净转出量最大，总量达33 918.84 hm2，主要流向建设用地，转出面积达26 327.86 hm2，转出贡献率为77.62%，反映出建设用地侵占耕地现象普遍；水域面积整体呈现先小幅增加后逐渐减少的趋势，其中2000—2010年水域面积小幅增加了2 091.51 hm2，主要由耕地转入，2010—2020年，水域面积持续减少，主要向耕地和建设用地转出，转出总面积为7 150.64 hm2。总体来看，2000—2020年昆山市绿色空间类型转移以耕地和水域的转出为主，均主要转向建设用地。这反映出昆山市在经济社会快速发展下人为开发建设活动对绿色空间侵占现象较为明显，耕地和水域等绿色空间面临较大生态压力。
表 3 2000—2020年昆山市地类转移矩阵Table 3 Land class transfer matrix in Kunshan City from 2000 to 2020时间段 土地利用类型 绿色空间/hm2 非绿色空间/hm2 转出合
计/hm2面积变化
合计/ hm2耕地 林地 草地 水域 建设用地 未利用地 2000—2010 绿色空间 耕地 46 613.56 41.62 71.57 6 168.10 15 825.59 6.48 68 726.91 −17 577.88 林地 46.23 41.28 0.07 29.54 5.62 0.00 122.74 −10.60 草地 14.15 0.00 0.16 15.64 6.29 0.11 36.36 42.30 水域 3 464.97 28.70 5.97 10 742.95 853.90 2.02 15 098.51 2 033.98 非绿色空间 建设用地 975.40 0.53 0.90 174.01 7 672.25 0.20 8 823.28 15 544.60 未利用地 34.72 0.00 0.00 2.25 4.23 40.15 81.36 −32.40 转入合计 51 149.03 112.14 78.66 17 132.48 24 367.89 48.96 92 889.16 − 时间段 土地利用类型 绿色空间/hm2 非绿色空间/hm2 转出合
计/ hm2面积变化
合计/ hm2耕地 林地 草地 水域 建设用地 未利用地 2010—2020 绿色空间 耕地 39 356.15 8.54 127.00 1 161.04 10 502.27 6.64 51 161.64 −2 650.12 林地 65.13 25.78 0.13 17.69 3.57 0.00 112.30 −62.47 草地 2.17 0.00 1.46 0.00 74.73 0.30 78.66 101.34 水域 6 482.98 14.97 37.18 9 906.54 667.66 6.89 17 116.24 −5 812.93 非绿色空间 建设用地 2 592.59 0.53 14.22 217.65 21 538.87 1.19 24 365.05 8 439.75 未利用地 12.50 0.00 0.00 0.38 17.71 18.37 48.96 −15.57 转入合计 48 511.52 49.82 180.00 11 303.31 32 804.80 33.39 92 882.85 − 说明：−表示无此项。 3.2 昆山市绿色空间景观生态风险时空演变分析
3.2.1 绿色空间景观格局指数时序变化
运用Fragstats软件计算得到昆山市2000、2010、2020年各绿色空间类型景观格局指数。统计结果表明：2000—2020年昆山市绿色空间景观格局发生了较大变化(表4)。①研究期间耕地破碎度和分离度指数显著上升，表明建设用地快速扩张，促使耕地空间分布趋于离散，破碎化程度加剧，景观优势度不断降低，受外界干扰程度增加。景观损失度逐年上升。②水域破碎度指数先下降后上升，总体呈上升趋势，景观优势度降低，且水域周边城镇较为密集，易受人为活动干扰，使景观脆弱程度不断增加，损失度上升。③林地破碎度、干扰度、脆弱度指数均先下降后上升，总体呈下降趋势，表明林地斑块分布逐渐聚集，景观结构稳定性提升。④草地破碎度指数先上升后下降，表明草地斑块在空间上趋于集聚与整合，抗外界干扰能力提高，景观脆弱度与损失度有所降低。
表 4 2000—2020年昆山市绿色空间景观格局指数变化Table 4 Change of green space landscape pattern index in Kunshan City from 2000 to 2020土地利用类型 年份 斑块数量 斑块面积/hm2 破碎度 分离度 优势度 干扰度 脆弱度 损失度 耕地 2000 1378 68 884.11 0.020 0.973 0.647 0.431 0.082 0.035 2010 4401 51 240.51 0.086 0.987 0.602 0.459 0.087 0.040 2020 4667 48 681.00 0.096 0.992 0.597 0.465 0.088 0.041 林地 2000 494 122.85 4.021 1.000 0.092 2.329 0.222 0.516 2010 355 112.59 3.153 1.000 0.076 1.892 0.180 0.340 2020 172 49.95 3.443 1.000 0.046 2.031 0.193 0.392 草地 2000 56 36.36 1.540 1.000 0.025 1.075 0.153 0.165 2010 195 78.66 2.479 1.000 0.017 1.551 0.221 0.343 2020 123 180.00 0.683 1.000 0.047 0.651 0.093 0.060 水域 2000 4128 15 156.36 0.272 1.000 0.417 0.520 0.124 0.064 2010 3566 17 247.87 0.207 1.000 0.399 0.483 0.115 0.056 2020 3770 11 342.70 0.332 1.000 0.365 0.539 0.128 0.069 3.2.2 绿色空间景观生态风险时空分布格局
基于景观生态风险评价指标计算结果，在ArcGIS 10.2中利用克里金插值法对昆山市生态风险值进行空间插值，得到昆山市绿色空间景观生态风险空间分布图，使用自然断点法将景观生态风险值(IERk)划分为5个等级：低生态风险(0＜IERk≤0.026)、较低生态风险(0.026＜IERk≤0.031)、中生态风险(0.031＜IERk≤0.037)、较高生态风险(0.037＜IERk≤0.041)和高生态风险(IERk＞0.041)，结果如图3，并统计得到不同景观生态风险等级的面积及占比(表5)。
图 3 2000—2020年昆山市绿色空间景观生态风险空间分布示意图Figure 3 Spatial distribution of ecological risks in green space landscape of Kunshan City from 2000 to 2020表 5 2000—2020年昆山市绿色空间景观生态风险等级面积及比例Table 5 Area and proportion of landscape ecological risk level of green space in Kunshan City from 2000 to 2020年份 低风险区 较低风险区 中等风险区 较高风险区 高风险区 面积/hm2 比例/% 面积/hm2 比例/% 面积/hm2 比例/% 面积/hm2 比例/% 面积/hm2 比例/% 2000 1 116.90 25.66 1 830.87 42.06 918.09 21.09 345.15 7.93 141.48 3.25 2010 642.78 19.94 1 210.41 37.55 745.56 23.13 409.32 12.70 215.82 6.69 2020 452.70 15.93 961.02 33.81 692.64 24.37 455.58 16.03 280.26 9.86 2000—2020年昆山市绿色空间景观生态风险整体呈上升趋势，呈现“南北高，中间低”的空间分布特征。高、较高风险区面积明显上升，面积占比分别增加8.10%、6.61%，主要分布于淀山湖、白莲湖等湖荡密集地区，且不断向湖荡周围辐射扩张。该区域绿色空间类型以水域为主，由于围网养殖等人为活动对水域干扰程度加大，景观损失度逐年增加，使区域风险等级不断升高。中风险区面积小幅上升，面积占比增加3.28%，集中分布于渡头村、双洋潭等地区，并逐步沿较高风险区外围向四周扩散，区域内耕地、水域交错分布，受人为活动干扰较大，生态稳定性下降。较低、低风险区面积明显缩减，占比分别减少8.25%和9.73%，主要分布于研究区中部白渔潭村、荣家厍及北部范潭村、横泾等地区，且分布逐渐变得零散破碎，人为开发建设活动频繁，绿色空间不断减少，抗干扰能力减弱，景观生态风险值有增强趋势。
3.2.3 绿色空间景观生态风险等级空间变化
借助景观生态风险等级变化分布(图4)分析2000—2020年期间研究区各风险等级的变化情况。①风险等级升高区域的面积为21 503.12 hm2，占绿色空间总面积的36.69%，其中较低风险区域上升为中风险的区域面积最大，为6 413.09 hm2，其次为中风险区域上升为较高风险区域。主要分布在白莲湖、明镜荡、汪洋荡等地区，区域内湖荡、耕地镶嵌分布，城镇建设用地的扩张使生态斑块破碎化程度加剧，生态结构和功能受到损害，生态系统稳定性和恢复力下降。②风险等级基本不变区域的面积为31 026.25 hm2，占绿色空间总面积的52.61%，其中较低风险区域面积最大，为13 102.74 hm2。主要分布在白渔潭村、荣家厍、范潭村片区等。该区域生态环境相对较好，生态系统结构和整体格局较为完整，对外界干扰具备一定的抵御能力，可维持基本的生态功能。③风险等级降低区域的面积为5 241.88 hm2，占绿色空间总面积的10.70%，其中中风险区域下降为较低风险区域面积最大，为2 925.90 hm2，其次为较低风险区域下降为低风险区域。在空间上集中在大渔新村、朱家湾村、黄家埭等地区。区域内具有较好的生态基底，生态斑块间连续性较强且受经济建设活动干扰较小，生态系统稳定性提高，能够提供较好的生态服务效益。
图 4 2000—2020年昆山市绿色空间景观生态风险等级变化示意图Figure 4 Change of landscape ecological risk level of green space in Kunshan City from 2000 to 20203.3 基于景观生态风险评价的昆山市绿色空间分区调控策略
基于2000—2020年昆山市绿色空间景观生态风险等级变化特征，将风险等级升高、不变和降低的区域分别划定为重点修复区、协调缓冲区和优化利用区。依据《苏州市“十四五”生态环境保护规划》《昆山市生态环境保护“十四五”规划》《昆山市国土空间总体规划(2021—2035)》等规划政策，结合调控分区的景观生态风险水平，提出有针对性的空间分区调控策略。
3.3.1 重点修复区实施生态保育，降低绿色空间生态风险
重点修复区为景观生态风险等级升高的区域，主要表现为较低风险向中风险、中风险向较高风险转移。片区内绿色空间破碎度增加，生态系统稳定性下降，景观生态风险水平不断上升。应加强生态保育与生态修复，对淀山湖、白莲湖等主要核心水域开展生态治理与修复工程，提升水域生态涵养功能；系统梳理、串通河网水系，在河网沿线严格管控开发强度大的建设活动；对破碎的绿色空间斑块进行整合，特别是南部长白荡、明镜荡等水域密集地区，着力提升水网景观的连通性和抗干扰能力，维护绿色空间的完整性与稳定性。
3.3.2 协调缓冲区加强缓冲区建设，筑牢绿色空间生态安全屏障
协调缓冲区为景观生态风险等级基本不变的区域，片区内绿色空间生态稳定性较强，能够抵御一定程度的外界干扰，景观生态风险维持在稳定水平。这些区域可作为生态缓冲地，提升绿色空间抗风险能力。通过强化河流水系、滨水绿带等生态廊道结构连通性[25]，串联湖荡、农田大型生态斑块，构建水陆联动的网络化生态空间格局；加强傀儡湖、阳澄湖等生境敏感区的缓冲区建设，构建区域生态安全屏障，维护生态保护网络边界，增强区域景观生态风险缓冲能力。
3.3.3 优化利用区优化生态建设，发挥绿色空间生态效益
优化利用区为景观生态风险等级降低的区域，主要表现为中风险向较低风险、较低风险向低风险转换。片区内绿色空间生态系统结构较为完整，对外界干扰具有较强的适应能力，景观生态风险水平有所下降。应依托片区内良好的生态优势，适度优化建设，提升水网空间活力，维护生态系统的稳定性。首先明确生态保护红线边界，保护绿色空间健康稳定发展；其次对绿色空间进行分级分类管控，加强对城市生态森林公园、夏驾河湿地公园等核心生态资源的保护与管理，定期监测与评估生态用地的环境状况；同时在生态保护基础上优化建设，结合黄家埭等地区独特的水网空间优势开展科普教育、休闲游憩等服务，提升绿色空间的生态效益。
4. 讨论与结论
4.1 讨论
本研究表明：绿色空间用地类型转变与景观生态风险具有关联性。研究期间昆山市南部水域及周边地区由于城镇用地扩张，耕地、水域等绿色空间面积持续减少，生态系统结构稳定性下降，景观生态风险等级呈上升趋势。这与于淑会等[26]、陈斌等[27]的研究结论一致。水网地区以纵横交错的河流、湖荡为主体，水域面积较大，易受外界城镇建设用地扩张的干扰而破碎化，景观脆弱度高。本研究结果表明：水域范围内的景观生态风险指数普遍较高。这与何钊全等[28]对延安市的研究存在一定差异。延安市地处黄土丘陵区，林地和耕地是优势景观类型，受经济发展和建设用地扩张影响较大，林地、耕地破碎化程度加剧，抗干扰能力下降，景观损失度增加，使林地与耕地的景观生态风险值较高。
本研究在快速城镇化背景下，基于景观生态风险评价，加强绿色空间分区规划调控，对提升区域生态安全水平，优化国土空间结构，促进区域可持续发展具有一定理论指导意义。但研究仍存在一定局限性：①研究侧重从景观空间结构变化视角来评价绿色空间景观生态风险状况，对社会、经济等层面影响因素研究不足，还需进一步完善景观生态风险影响因素和驱动机制研究。②生态过程具有复杂性和抽象性，其具体演变过程很难做到定量表述。需要对生态风险展开多尺度分析，深入探讨景观格局生态风险和生态过程的耦合关系，为区域风险管理提供更加科学的依据。
4.2 结论
①2000—2020年昆山市绿色空间总面积持续减少，其中耕地面积缩减最多；水域面积先小幅增加后持续减少，总体呈减少趋势；林地、草地面积占比较小，维持相对平稳。研究区用地类型转换主要表现为耕地和水域转向建设用地。②2000—2020年昆山市绿色空间景观格局变化特征明显，耕地空间分布在建设用地扩张影响下趋于分散，破碎化程度加大，损失度增加；水域破碎度指数先下降后上升，总体破碎度呈增大趋势，景观受外界干扰增加；林地破碎度、干扰度和脆弱度呈下降趋势，斑块分布呈集聚态势；草地破碎度指数先上升后下降，总体破碎度呈下降趋势，空间分布趋于集聚，景观损失度降低。③2000—2020年昆山市绿色空间景观生态风险等级总体呈上升趋势，其中高风险区、较高风险区面积显著扩大，占比分别增加8.10%、6.61%，空间分布上主要集中在南部淀山湖、白莲湖等水域密集地区，并有进一步向外围蔓延发展的趋势；较低风险区、低风险区面积缩减明显，占比分别下降8.25%和9.73%；景观生态风险以低风险等级向更高一级转变为主，绿色空间受人工建设干扰生态风险不断增强。④依据景观生态风险等级变化特征将研究区划分为重点修复区、协调缓冲区和优化利用区。
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图 1 不同碳源(A)、氮源(B)、无机盐(C)对菌株生长影响
不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)
Figure 1 Effect of carbon source(A)，nitrogen source(B)，inorganic salt (C) on the growth of strains
表 1 Plackett-Burman试验设计因素和水平
Table 1. Factors and levels of Plackett-Burman design
因素 水平 因素 水平 因素 水平 −1 1 −1 1 −1 1 A 牛肉膏/% 4.0 5.0 E 温度/% 30.0 37.50 I 培养时间/h 20 24 B 酵母粉/% 0.8 1.0 F 初始pH 6.0 7.50 J 转速/(r·min−1) 160 200 C MgCl2/% 4.0 5.0 G 接菌量/% 1.0 1.250 K 空白3 D 空白1 H 空白2 
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表 4 最陡爬坡试验
Table 4. Factors and levels of steepest ascent design
试验
号B 酵
母粉/%E 温
度/℃F 初
始pH编码 吸光度 1 0.8 40 8.0 (−1，1，1) 1.079±0.058 c 2 0.9 35 7.0 (0，0，0) 1.720±0.006 a 3 1.0 30 6.0 (1，−1，−1) 1.681±0.015 b 说明：不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)
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表 2 Plackett-Burman 试验结果
Table 2. Results of Plackett-Burman design
试验号 A 牛肉膏 B 酵母粉 C 氯化镁 D 空白1 E 温度 F pH G 接菌量 H 空白2 I 时间 J 转速 K 空白3 吸光度 1 1 1 −1 1 1 1 −1 −1 −1 1 −1 1.235±0.078 f 2 −1 1 1 −1 1 1 1 −1 1 −1 −1 1.358±0.030 e 3 1 −1 1 1 −1 1 1 1 −1 −1 −1 1.563±0.058 b 4 −1 1 −1 1 1 −1 1 1 −1 −1 1 1.397±0.021 de 5 −1 −1 1 −1 1 1 −1 1 −1 1 1 0.981±0.042 h 6 −1 −1 −1 1 −1 1 1 −1 1 1 1 1.440±0.028 cd 7 1 −1 −1 −1 1 −1 1 1 1 1 −1 1.121±0.026 g 8 1 1 −1 −1 −1 1 −1 1 1 −1 1 1.756±0.010 a 9 1 1 1 −1 −1 −1 1 −1 −1 1 1 1.802±0.003 a 10 −1 1 1 1 −1 −1 −1 1 1 1 −1 1.783±0.012 a 11 1 −1 1 1 1 −1 −1 −1 1 −1 1 1.195±0.096 fg 12 −1 −1 −1 −1 −1 −1 −1 −1 −1 −1 −1 1.492±0.041 bc 说明：不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)
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表 3 Plackett-Burman试验显著性分析结果
Table 3. Results of Plackett-Burman design
来源 均方和 自由度 均方 F P 显著性 效应系数 显著性排序 效应正负 模型 0.780 00 8 0.098 00 70.01 0.002 5 ** 1.430 A 牛肉膏 0.004 07 1 0.004 07 2.91 0.186 5 0.018 7 ＋ B 酵母粉 0.200 00 1 0.200 00 141.15 0.001 3 ** 0.130 2 ＋ C 氯化镁 0.004 84 1 0.004 84 3.46 0.159 8 0.020 5 ＋ E 温度 0.540 00 1 0.540 00 387.22 0.000 3 ** −0.210 1 − F pH 0.017 00 1 0.017 00 12.45 0.038 7 * −0.038 3 − G 接菌量 0.004 76 1 0.004 76 3.40 0.162 2 −0.020 6 ＋ I 时间 0.000 03 1 0.000 03 0.022 0.892 7 0.002 8 ＋ J 转速 0.013 00 1 0.013 00 9.49 0.054 1 −0.033 4 − 说明：*表示差异显著(P＜0.05)，**表示差异极显著(P＜0.01)
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表 5 Box-Behnken试验设计
Table 5. Results of Box-Behnken design
试验序号 B 酵母粉/% E 温度/℃ F 初始pH 吸光度 试验序号 B 酵母粉/% E 温度/℃ F 初始pH 吸光度 1 0 0 0 1.505±0.007 g 10 1 −1 0 1.770±0.023 ab 2 0 1 1 0.922±0.014 j 11 −1 0 −1 1.634±0.021 f 3 1 0 1 1.655±0.035 ef 12 1 0 −1 1.670±0.007 ef 4 −1 −1 0 1.056±0.027 h 13 0 0 0 1.749±0.024 ef 5 0 0 0 1.661±0.018 ef 14 0 0 0 1.785±0.007 a 6 0 −1 −1 0.941±0.042 ig 15 −1 1 0 1.754±0.010 abc 7 −1 0 1 1.524±0.013 g 16 0 0 0 1.733±0.003 bc 8 0 1 −1 0.967±0.060 i 17 0 −1 1 1.727±0.009 cd 9 1 1 0 1.690±0.010 de 说明：不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)
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表 6 Box-Behnken试验回归模型方差分析
Table 6. Variance analysis of regression model of Box-Behnken test
来源 均方和 自由度 均方 F 显著性 来源 均方和 自由度 均方 F 显著性 模型 1.638 00 9 0.182 00 182.747 ** B2 0.002 36 1 0.002 36 2.371 B 0.020 00 1 0.020 00 20.091 ** E2 0.820 50 1 0.820 00 824.161 ** E 0.756 00 1 0.756 00 759.257 ** F2 0.005 14 1 0.005 14 5.159 F 0.008 90 1 0.008 91 8.951 ** 残差 0.006 97 7 0.001 00 BE 0. 000 06 1 0.000 06 0.064 失拟项 0.004 91 3 0.001 64 3.179 不显著 BF 0.000 48 1 0.000 48 0.486 纯误差 0.002 06 4 0.000 52 EF 0.006 64 1 0.006 64 6.672 * 总和 1.644 00 16 说明：变异系数为2.08%，相关系数为0.995 8，校正决定系数为0.9903，预测系数为0.950 3。*表示显著差异(P＜0.05)，**表示极显 著差异(P＜0.01)
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链接本文:
https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20190587
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