下载:
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园林绿化废弃物包括树木、花草等植物在生长过程中的自然凋落物或者人为修剪的植物残体[1]，主要成分有木质素、纤维素和多糖等[2]。其中，木质素由于组分种类多样，结构复杂且无规则，降解比较困难[3-5]。堆肥是一种较好的降解园林绿化废弃物的方式[6]，堆肥过程中多个微生物群体共同作用，分泌木质素降解相关酶系而使园林绿化废弃物中的木质素降解[7]。因此，通过研制微生物菌剂，使分泌木质素降解酶酶系的菌株迅速构建优势群落，能有针对性地加快园林绿化废弃物中木质素的降解，提高堆肥效率和质量[8-9]。但是，新菌剂的制备需要在选定目标菌株的条件下，对菌剂制作涉及的培养基配方和发酵条件进行优化。优化过程主要包括试验设计、数学建模和优化设计3个部分[10]。合理的试验设计能用较少的试验数据进行建模，从而获取各因素范围内的最优解。用于发酵条件优化的方法多为响应面法[11-12]，但胡欣颖等[13]研究发现：人工神经网络算法比响应面法在预测实验结果方面更准确，误差更小。目前，运用人工神经网络算法对木质素降解菌发酵条件进行优化的研究鲜有报道。因此，本研究拟从北京市植物园的腐叶土和朽木中筛选木质素降解菌，对其进行鉴定，并通过单因素试验对菌株的培养时间、接种量和培养基配方(碳源和氮源)进行优化；采用均匀试验结合Python实现人工神经网络建模与优化，寻找菌株最佳发酵条件，为园林绿化废弃物中木质素的降解提供高效菌剂。
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腐叶土和朽木采集于北京市植物园。PDA培养基：称取200.00 g土豆，去皮去芽切成小块后加蒸馏水微沸30 min，保留滤液并用蒸馏水补足1 L，制成马铃薯浸汁；葡萄糖 20.00 g，蛋白胨15.00 g，琼脂 20.00 g，pH自然[14]。PDA-苯胺蓝培养基：称取0.10 g苯胺蓝溶于1 L PDA培养基中，pH自然。PDA-愈创木酚培养基：量取0.1 mL愈创木酚溶于1 L PDA培养基中，pH自然。PDB液体培养基：马铃薯浸汁(同PDA培养基)，葡萄糖 20.00 g，蛋白胨15.00 g，pH自然。基本发酵培养基：葡萄糖10.00 g·L−1、蛋白胨5.00 g·L−1，酵母粉3.00 g·L−1、酒石酸铵10.00 g·L−1、五水合硫酸铜0.25 g·L−1、氯化钠1.00 g·L−1、pH自然[15]。所有培养基均121 ℃高压蒸汽灭菌 20 min。
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将采集的样品捣碎[16]，称取10.00 g加入装有90 mL无菌水的三角瓶中，在28 ℃、200 r·min−1下震荡摇匀后静置1 h。取上清液1.0 mL稀释成不同质量浓度梯度(10−3~10−7 g·L−1)的溶液，取不同质量浓度稀释液0.1 mL，加入PDA培养基中涂布均匀，28 ℃下培养5~7 d，观察菌落形态，用平板划线分离法纯化菌株。将得到的纯菌株以点接法接到PDA-苯胺蓝平板和PDA-愈创木酚平板中，用苯胺蓝平板褪色圈法和愈创木酚平板变色圈法确定该菌株是否具有降解木质素的能力。
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观察PDA-苯胺蓝平板上菌体形态特征，并挑取少量菌丝于显微镜下拍照记录。菌株送往北京睿博兴科生物技术有限公司进行内转录间隔区(ITS)测序，测序结果与Genebank数据库中已知的真菌序列BLAST检索对比，采用 Mega 5.0 软件与相近种菌株构建系统发育树[17]。
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将菌株接种至装有100.0 mL PDB液体培养基的三角瓶中，在IS-RDD3台式恒温振荡器中以30 ℃、200 r·min−1培养3 d，制得种子液。
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木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶活性的测定参照田林双[18]的方法。3种木质素降解相关酶酶活性总和标记为总酶活。生物量的测定用称干质量法[19]。
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试验数据采用Excel 2007和SPSS 22.0进行处理。发酵条件优化用单因素方差分析法，平均值多重比较用LSD最小显著性差异法(P＜0.05)。均匀试验利用人工神经网络[20]建模与优化(基于深度学习框架Pytorch[21])。将本实验目标建模为回归任务，并采用SmoothL1损失函数[22]以平滑训练过程。训练过程中，采用k-折交叉验证(k-fold cross-validation)和自适应矩估计(Adam)算法[23]优化神经网络。
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PDA-苯胺蓝平板上褪色圈的出现表示该菌株具有分泌锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶的能力，PDA-愈创木酚平板上显色圈的出现表示该菌株具有分泌漆酶的能力[24]。由表1可知：筛选得到的22株菌(分别命名为Q01~Q22)中，共有10株菌出现褪色圈或/和显色圈。其中：Q01、Q02、Q09和Q11既能出现褪色圈又能出现显色圈，说明这些菌株具备分泌3种木质素降解酶的能力。根据褪色圈和显色圈的出现时间及直径可知(表1)，Q01于48 h时在PDA-苯胺蓝平板上出现褪色圈，12 h时在PDA-愈创木酚培养基上出现显色圈，在72 h时显色圈最大，因此，选定菌株Q01为目标菌株。
表 1 不同菌株选择培养基的显色和褪色结果
Table 1. Coloring and decoloring results of different strains on selective mediums
菌株 苯胺蓝褪色结果 愈创木酚显色结果 12 24 36 48 72 12 24 36 48 72 h Q01 − − − + ++ + ++ +++ ++++ ++++ Q02 − − − − + − − − + ++ Q06 − − − − − − − − − + Q09 − − − − + − − − − + Q11 − + + ++ +++ − − − + + Q12 − + ++ +++ +++ − − − − − Q14 − + + ++ ++ − − − − − Q17 − + + + + − − − − − Q19 − + + + + − − − − − Q22 − + + ++ ++ − − − − − 说明：−表示不褪色(或不显色)；+、+ +、+ + +、+ + + +表示 褪色(或显色)圈逐渐增大 -
菌株Q01在PDA-苯胺蓝平板上的菌落形态为白色圆形，菌丝为致密的短绒状，向四周扩展，紧贴平板生长(图1A、图1B)；前期生长较慢，1~2 d有菌丝长出，此后生长较快，3~5 d铺满整个平板。显微形态可见，菌丝较细长，有分支(图1C)，孢子呈球状或柱状(图1D)，菌丝可观察到隔膜和锁状联合(图1E，如箭头所示)。
图 1 菌株Q01在选择培养基中显色和褪色表现及显微镜观察
Figure 1. Color development and fading performance of strain Q01 in selective medium and microscopic observation
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构建菌株Q01系统发育树(图2)可知：菌株Q01与栓菌属Trametes真菌的同源性相似度最高，达到100%。结合形态特征可确定菌株Q01为栓菌属真菌。
图 2 基于ITS 序列构建的菌株Q01系统发育树
Figure 2. Phylogenetic tree of strain Q01 constructed based on ITS sequence
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分别在12瓶100 mL基本发酵培养基中接种体积分数为12.5%的菌株Q01种子液，于30 ℃、200 r·min−1下培养，每24 h取出1瓶，测量菌株木质素降解相关酶活性和1 mL菌液中生物量的干质量。由图3可知：3种木质素降解相关酶的酶活性达到最高值时间不同，其中漆酶活性在培养5 d时达最高(3 835.25×16.67 nkat·L−1)，锰过氧化物酶活性在培养2 d时达最高(1 690.60×16.67 nkat·L−1)，木质素过氧化物酶活性在培养8 d时达到最高(1 096.88×16.67 nkat·L−1)。3种木质素降解相关酶在木质素降解中具有同样重要的作用[25]，但不同木质素降解酶活性最高值时间不同，因此以3种木质素降解相关酶的总酶活性作为确定培养时间的依据。随着木质素降解，真菌生物量逐渐增多[26]。图3可知：菌株Q01的总酶活性与生物量均在培养5 d时最高，因此选择培养时间为5 d进行后续研究。
图 3 培养时间对菌株产生木质素降解相关酶及生物量的影响
Figure 3. Changes in culture time to the enzymes and biomass related to lignin degradation produced by the strain
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分别在100 mL 基本发酵培养基中接种体积分数为5.0%、7.5%、10.0%、12.5%和 15.0%的种子液，于30 ℃、200 r·min−1下培养5 d，测定菌株木质素降解相关酶活性和菌株生物量。由图4可知：总酶活性在菌液体积分数为12.5%时最高，达到5 129.80×16.67 nkat·L−1。随菌液体积分数增加，菌株生物量呈先上升后下降趋势，体积分数为12.5%时达到最高。与缪晓磊[19]对竹林毛栓菌Trametes sp. 接种量优化的结果一致。可见菌株的繁殖速度受接种量影响，当接种量较少时，菌株需要更多时间适应环境后繁殖生长；而接种量较多时，大量菌株接触新环境，迅速繁殖，使液体培养基黏稠不透气，溶解氧下降，影响菌株的后续生长[19]。因此，综合总酶活性和生物量的变化，选取体积分数12.5%为最适接种量。
图 4 接种量对菌株产生木质素降解相关酶及生物量的影响
Figure 4. Changes in the amount of inoculum to produce lignin degradation related enzymes and biomass
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以基本发酵培养基为对照，分别用 10.00 g·L−1蔗糖、麦芽糖、木质素磺酸钠和可溶性淀粉替代对照中10.00 g·L−1的葡萄糖，接种体积分数为12.5%，于30 ℃、200 r·min−1下培养5 d。由图5可知：以葡萄糖为碳源时，菌株Q01漆酶活性达3 675.23×16.67 nkat·L−1，显著高于其他碳源(P＜0.05)；认为简单的糖有利于菌体生长[27]，可以缩短漆酶的生产时间，与刘宇等[15]结果相似。但就总酶活性和生物量而言，以木质素磺酸钠为碳源对菌株Q01生长和木质素降解相关酶分泌效果最好，最显著(P＜0.05)，其中总酶活性为6 474.16×16.67 nkat·L−1，总生物量为0.065 g。可能原因是来源于木质素的木质素磺酸钠能刺激菌株Q01分泌木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶，并促进细胞快速生长，使生物量最高，与熊乙[28]研究结果相似。综合考虑各碳源生产成本及对菌株Q01生长的促进效果，选择木质素磺酸钠为菌株Q01的液体培养基碳源。
图 5 碳源对菌株产生木质素降解相关酶及生物量的影响
Figure 5. Effect of carbon source on lignin degradation related enzymes and biomass produced by the strain
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以基本发酵培养基为对照，有效含氮量按1.52 g·L−1进行换算，分别用7.00 g·L−1的豆饼粉、6.50 g·L−1尿素、14.30 g·L−1硫酸铵、11.00 g·L−1硝酸钾替代对照组中的酒石酸铵，发酵培养条件为30 ℃、200 r·min−1，培养5 d。由图6可知：以豆饼粉为有机氮源发酵时，菌株Q01总酶活性最高、生物量最大，与其他无机氮源差异显著(P＜0.05)。豆饼粉营养丰富，含大量碳水化合物、蛋白质及少量异黄酮类物质和可溶性多糖，可作为发酵氮源及生长因子。有研究表明[29]：在培养某些真菌时，培养基中添加豆饼粉有利于生物量的积累。综合考虑各氮源生产成本及对菌株Q01生长的促进效果，选择豆饼粉作为菌株Q01的液体培养基氮源。
图 6 氮源对菌株产生木质素降解相关酶及生物量的影响
Figure 6. Effect of nitrogen source on lignin degradation related enzymes produced by the strain and biomass
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均匀试验设计6因素5水平的10组试验，获取实测值，再通过基于SmoothL1损失函数的人工神经网络模型的训练及自适应矩估计(Adam)算法寻优，得到仿真值。对比实测值和仿真值(表2)可知：3种酶活性误差均小于10.0%，生物量的仿真值基本与观察值相同，可知该模型预测值可信赖。
表 2 均匀试验设计及结果
Table 2. Uniform test design and results
试验号 木质素
磺酸钠/
(g·L−1)蛋白胨/
(g·L−1)酵母粉/
(g·L−1)豆饼粉/
(g·L−1)五水合
硫酸铜/
(g·L−1)氯化钠/
(g·L−1)锰过氧化
物酶活性/
(×16.67 nkat·L−1)木质素过氧
化物酶活性/
(×16.67 nkat·L−1)漆酶活性/
(×16.67 nkat·L−1)总酶活性/
(×16.67 nkat·L−1)生物量/
g实测值1 6.00 5.00 3.00 11.00 0.20 1.50 4 296.20 1 520.43 219.19 6 035.83 0.037 仿真值1 6.00 5.00 3.00 11.00 0.20 1.50 3 186.76 2 888.58 218.40 6 293.73 0.037 实测值2 8.00 10.00 1.00 11.00 0.25 1.25 4 200.35 3 790.22 252.62 8 243.18 0.055 仿真值2 8.00 10.00 1.00 11.00 0.25 1.25 4 190.01 3 799.79 288.91 8 278.71 0.049 实测值3 10.00 2.50 4.00 9.00 0.35 1.00 4 095.77 3 605.59 318.60 8 019.96 0.048 仿真值3 10.00 2.50 4.00 9.00 0.35 1.00 4 094.32 3 712.88 282.19 8 089.38 0.048 实测值4 12.00 7.50 1.00 9.00 0.15 0.75 4 601.21 5 278.06 313.29 10 192.56 0.014 仿真值4 12.00 7.50 1.00 9.00 0.15 0.75 4 607.23 4 178.73 318.24 9 104.20 0.024 实测值5 14.00 12.50 4.00 7.00 0.20 0.50 5 263.50 5 028.28 399.44 10 691.23 0.059 仿真值5 14.00 12.50 4.00 7.00 0.20 0.50 5 290.88 4 799.66 366.29 10 456.83 0.062 实测值6 6.00 2.50 2.00 7.00 0.30 1.50 4 453.06 3 746.77 178.82 8 378.66 0.123 仿真值6 6.00 2.50 2.00 7.00 0.30 1.50 4 446.86 4 033.08 306.97 8 786.91 0.092 实测值7 8.00 7.50 5.00 5.00 0.35 1.25 3 999.91 4 387.53 186.13 8 573.57 0.042 仿真值7 8.00 7.50 5.00 5.00 0.35 1.25 4 018.98 3 644.46 276.89 7 940.33 0.047 实测值8 10.00 12.50 2.00 5.00 0.15 1.00 3 215.62 4 322.37 363.36 7 901.34 0.050 仿真值8 10.00 12.50 2.00 5.00 0.15 1.00 4 289.80 3 890.43 295.93 8 476.16 0.050 实测值9 12.00 5.00 5.00 3.00 0.25 0.75 5 411.65 3 822.80 432.66 9 667.11 0.063 仿真值9 12.00 5.00 5.00 3.00 0.25 0.75 5 287.09 4 905.21 374.46 10 566.76 0.063 实测值10 14.00 10.00 3.00 3.00 0.30 0.50 5 120.37 4 356.31 385.32 9 862.00 0.060 仿真值10 14.00 10.00 3.00 3.00 0.30 0.50 5 241.27 4 754.60 362.81 10 358.68 0.061 -
根据模型预测得到最优发酵培养基组成并进行实验验证。由表3可知：优化后的发酵培养基酶活性和生物量，实测值与预测值误差约为3.0%；结合图3可知：优化前锰过氧化物酶活性为357.29×16.67 nkat·L−1、木质素过氧化物酶活性为445.27×16.67 nkat·L−1、总酶活性为4 637.81×16.67 nkat·L−1、生物量为0.071 g；即在优化培养基上生长的菌株Q01，其生物量比优化前提高1.27倍，锰过氧化物酶活性提高31.71倍，木质素过氧化物酶活性提高19.12倍，总木质素酶酶活性提高4.38倍。
表 3 人工神经网络寻优结果
Table 3. Optimization results of artificial neural network
试验号 木质素磺酸钠/
(g·L−1)蛋白胨/
(g·L−1)酵母粉/
(g·L−1)豆饼粉/
(g·L−1)五水合硫酸铜/
(g·L−1)氯化钠/
(g·L−1)锰过氧化物酶活性/
(×16.67 nkat·L−1)木质素过氧化物酶活性/
(×16.67 nkat·L−1)漆酶活性/
(×16.67 nkat·L−1)总酶活性/
(×16.67 nkat·L−1)生物量/
g预测值 14.00 12.30 5.00 3.00 0.12 0.53 11 727.39 8 795.36 505.56 21 028.31 0.093 7 实测值 14.00 12.30 5.00 3.00 0.12 0.53 11 328.73 8 514.41 484.73 20 327.87 0.090 0 -
通过苯胺蓝平板褪色圈法和愈创木酚平板变色圈法筛选出目标菌株Q01。经鉴定，菌株Q01为栓菌属Trametes真菌。实验证明人工神经网络模型预测结果可值得信赖。根据单因素试验和人工神经网络算法结果，确定菌株Q01的最优发酵条件：培养时间5 d，温度30 ℃，转速200 r·min−1，接种菌液体积分数为12.5%，培养基配方为木质素磺酸钠14.00 g·L−1、蛋白胨12.30 g·L−1、酵母粉5.00 g·L−1、豆饼粉3.00 g·L−1、五水合硫酸铜0.12 g·L−1、氯化钠0.53 g·L−1、pH自然。
菌株Q01在优化后的发酵条件下制得的液体菌剂具有高酶活性和高生物量的特点，可促进园林绿化废弃物堆体初始微生物的数量增长，提高木质素降解相关酶的酶活性，加快木质素的降解。
Screening and identification of a lignin degrading strain and its optimized liquid fermentation conditions
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摘要:
目的 制作应用于园林绿化废弃物的以木质素降解菌为原材料的高效液体菌剂。 方法 通过苯胺蓝平板褪色圈法和愈创木酚平板变色圈法从分离纯化得到的22株菌中筛选目标菌株，并用内转录间隔区(ITS)测序法对目标菌株进行鉴定，然后通过单因素试验对目标菌株的培养时间、接种量和培养基配方(碳源和氮源)进行优化，最后根据单因素试验结果，采用均匀实验结合人工神经网络算法寻找目标菌株的最佳发酵条件。 结果 根据平板褪色和显色结果，选定菌株Q01为目标菌株。经鉴定，菌株Q01为栓菌属Trametes真菌。根据单因素试验和均匀试验结果，确定菌株Q01的最优发酵条件为培养时间5 d，接种菌液体积分数为12.5%；培养基配方为木质素磺酸钠14.00 g·L−1、蛋白胨12.30 g·L−1、酵母粉5.00 g·L−1、豆饼粉3.00 g·L−1、五水合硫酸铜0.12 g·L−1、氯化钠0.53 g·L−1、pH自然。优化条件后菌株Q01的生物量提高1.27倍，锰过氧化物酶活性提高31.71倍，木质素过氧化物酶活性提高19.12倍，漆酶活性略有降低，但3种木质素酶的总酶活性提高了4.38倍。 结论 菌株Q01在优化后的发酵条件下制得的液体菌剂具有高酶活性和高生物量的特点，在降解园林绿化废弃物木质素方面具有一定应用潜力。图6表3参29 Abstract:Objective The purpose is to produce a high efficient liquid inoculum with lignin-degrading bacteria as raw materials for garden waste. Method The target strains were screened from 22 isolated and purified strains by the aniline blue plate fading circle method and the guaiacol plate fading circle method, and were identified by Internal Transcribed Spacer (ITS) sequencing, and then the single factor test was used to optimize the culture time, inoculum amount and medium formula (carbon and nitrogen source) of the target strains. Finally, according to the results of single factor test, the optimal fermentation conditions of the target strains were found by uniform experiment combined with artificial neural network algorithm. Result According to the results of plate fading and color development, strain Q01 was selected as the target strain and was identified as Trametes. According to the results of single factor test and uniform test, the optimal fermentation conditions for strain Q01 were determined as the culture time of 5 days, inoculation amount 12.5%. The medium formula was composed of sodium lignosulfonate 14.00 g·L−1, peptone 12.30 g·L−1, yeast powder 5.00 g·L−1, soybean cake powder 3.00 g·L−1, copper sulfate pentahydrate 0.12 g·L−1, sodium chloride 0.53 g·L−1, and natural pH. Under the optimized conditions, the biomass, manganese peroxidase activity and lignin peroxidase activity of strain Q01 increased by 1.27 times, 31.71 times and 19.12 times respectively. Laccase activity decreased slightly, but the total enzyme activities of three kinds of lignin enzymes increased by 4.38 times. Conclusion The liquid inoculum prepared by strain Q01 under optimized fermentation conditions has the characteristics of high enzyme activity and high biomass, which has certain application potential in degrading lignin in garden waste. [Ch, 6 fig. 3 tab. 29 ref.] -
Key words:
- lignin degrading bacteria /
- screening /
- laccase /
- manganese peroxidase /
- lignin peroxidase /
- fermentation conditions
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杨柳科Salicaceae柳属Salix植物种类繁多，有450~520种；分布广泛，主要分布在北半球[1]，在中国属于原生树种；适应性强，耐湿，抗旱，耐低温，抗风性好，又具有很高的观赏价值。柳蓝叶甲Plagiodera versicolora又名柳圆叶甲，属鞘翅目Coleoptera叶甲科Chrysomelidae，是柳树主要食叶害虫，易在柳树较多或集中的地方大量发生。目前柳蓝叶甲仍以化学防治为主，因此对环境污染较大[2]。如何安全有效地预防和控制柳蓝叶甲的危害成为亟待解决的问题。植物抗虫性是植物与昆虫共同进化过程中形成的遗传性状，具有专一性、累积性、持续性、与环境的协调性、与其他防治措施的兼容性等特点，提高植物抗性是害虫综合防治策略中的一项重要措施[3-5]。在促使植物具有抗虫性的诸多因素中，化学因素起着重要作用[6]。穆丹等[7]研究证明：植物的气味能够有效调节和诱导柳蓝叶甲的行为。MATSUDA等[8]研究发现：绿原酸对某些柳树甲虫具有拮抗作用。IKONEN等[9]研究表明：叶甲拒食的柳叶中有高含量的绿原酸和水杨酸。由于技术的限制，植物次生代谢物基因转录和调控机制仍然没有得到解决。代谢组学技术在理解代谢网络和转录基因功能方面起着关键作用[10-14]。随着质谱、核磁共振等相关技术的迅速发展，代谢组学与其他组学技术的结合成为代谢组学研究的热点[12-14]。本研究选取旱柳S. matsudana、 黄花柳S. caprea、 垂柳S. babylonica以及三蕊柳S. triandra的3个无性系进行抗虫性测定，根据结果将柳树分成抗虫组与非抗虫组，再通过代谢组学技术分析抗虫组与非抗虫组之间的差异次生代谢物，为选育抗虫性强的柳树品种提供依据。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
选取三蕊柳的3个无性系W10、W4、W21，对照包括旱柳K24，黄花柳HHL，垂柳BD3，共6个材料。
1.2 试验方法
1.2.1 抗虫性指标测定
在养虫盒底部放入湿润的滤纸，在每个供试材料上摘取完整嫩叶，用浸湿的棉球包裹叶柄以防止叶片失水，把嫩叶放于湿润的滤纸上，接入相同龄期的30只柳蓝叶甲幼虫，每个材料均设3组重复，每组5片叶，7 d后观察幼虫存活数量并计算存活率。
1.2.2 代谢组学分析
植物代谢组学是一种高通量、无偏倚的综合分析[15]。将供试样品根据抗虫性指标测定的结果分为非抗虫组和抗虫组，采集新鲜叶片，液氮速冻用箔纸包好，−80 ℃冰箱保存备用。基于UPLC-Q-TOF-MS和GC-MS的代谢组学分析方法，对不同样品的代谢谱进行分析[16]。OPLS-DA是代谢组学数据分析中常用的分析方法，是PLS-DA的扩展[17]，通过去除与分组无关的系统自身差异筛选代谢差异物，使分离达到最大化[18]，再通过差异聚类热图分析[19]对样品和指标进行分类。
1.3 数据分析
使用Excel 2010对数据进行整理；使用SPSS 20.0对数据进行独立样本t检验以及相关性分析；使用Origin 8.0作图。用OPLS-DA、单维分析(t检验)和差异倍数筛选组间差异代谢物。筛选获得的差异代谢物用
http://www.hmdb.ca/ 和https://metlin.scripps.edu/ 数据库进行定性。2. 结果与分析
2.1 室内幼虫存活率
由图1可见：喂食黄花柳、旱柳、垂柳的幼虫平均存活率分别为90%、98%、93%，其中，喂食旱柳的幼虫存活率最高。喂食三蕊柳3个无性系的幼虫存活率均为0，在接虫后的第4天全部死亡。因此，把柳树分类非抗虫组(旱柳K24、黄花柳HHL和垂柳BD3)以及抗虫组(三蕊柳的3个无性系W10、W4和W21)。
2.2 正交偏最小二乘法判别分析
由OPLS-DA得分图(图2)显示：不同抗性组合模型参数中R2X=0.615，说明该模型对自变量X的解释程度为61.5%；R2Y=0.997，表示对分类变量Y的解释程度为99.7%；Q2=0.844，表示该模型对样本变量的预测程度为84.4%，说明OPLS-DA模型稳定性良好且预测能力较强。OPLS-DA的得分图显示非抗虫组与抗虫组的数据点在OPLS1上完全区分，表明两者存在明显化学差异。
图 2 非抗虫组与抗虫组OPLS-DA得分图Figure 2 OPLS-DA score chart of non-insect resistant group and insect resistant group2.3 差异代谢物火山图
从图3可以看出：在指定阈值P＜0.01时，共筛选出23种显著差异代谢物。结果显示：抗虫组与非抗虫组比较，其中上调的差异代谢物数目为15种，下调的代谢物数目为8种。
2.4 差异代谢物筛选
不同柳树样本中共检测到651个物质信号，经过标准样品数据库和参考文献比对，对有生物学重复的，采取将差异倍数，t检验的P值和OPLS-DA模型的变量投影重要度(VIP)相结合的方法来筛选差异代谢物，筛选的标准为差异倍数FC＞1，t检验P＜0.01和VIP＞1。由表1可见：经筛选后，非抗虫组与抗虫组共筛选出23种主要的差异代谢产物。其中阿魏酰胍丁胺、抗坏血酸、没食子酸、绿茶儿茶酚、没食子儿茶素、杨梅苷、葡萄酸铜、D-(−)-阿拉伯糖、4-羟基-3-甲氧基肉桂酸乙酯、N-阿魏酰胍丁胺、葡糖酸、2′, 4′, 5, 7-四羟基异黄酮、N-乙酰-DL-色氨酸、异泽兰黄素-3-葡萄糖苷、十六聚甲烷基鞘氨醇等15种产物表现为上调，而槲皮素-3-O-(6″-O-乙酰基)-β-D-吡喃半乳糖苷、橙皮甙、芦丁、聚半乳糖醛酸、2, 5-二羟基苯甲酸、槲皮素O-乙酰己烯苷、3-羟基-5-甲基苯酚-1-氧化基-β-D-葡萄糖、槲皮素等8种产物表现为下调。并且其中异泽兰黄素-3-葡萄糖苷在非抗虫组中并未检测到，但其在抗虫组的含量较高。
表 1 差异代谢物筛选Table 1 Differential metabolite screening化合物 CAS编号 非抗虫组
代谢物丰度抗虫组
代谢物丰度FC P VIP 调节变化 阿魏酰胍丁胺 N/A 360 000 1 923 333 5.343 0.001 1.708 上调 抗坏血酸 50-81-7 4 197 336 37 266 667 8.879 0.004 1.647 上调 槲皮素-3-O-(6″-O-乙酰基)-β-D-吡喃半乳糖苷 N/A 59 033 333 16 443 333 0.279 0.005 1.643 下调 没食子酸 149-91-7 74 367 501 333 6.741 0.002 1.697 上调 橙皮甙 520-26-3 20 766 667 1 596 673 0.077 0.001 1.695 下调 绿茶儿茶酚 970-74-1 1 613 333 17 633 333 10.930 0.007 1.708 上调 没食子儿茶素 4233-96-9 10 050 000 32 900 000 3.274 0 1.707 上调 杨梅苷 17912-87-7 2 901 667 39 633 333 13.659 0 1.708 上调 芦丁 153-18-4 48 933 333 6 833 339 0.140 0.010 1.618 下调 葡萄酸铜 815-82-7 122 700 521 000 4.246 0.003 1.661 上调 聚半乳糖醛酸 25990-10-7 58 167 30 233 0.520 0.009 1.608 下调 D-(−)-阿拉伯糖 10323-20-3 674 333 1 220 000 1.809 0.010 1.603 上调 4-羟基-3-甲氧基肉桂酸乙酯 N/A 70 100 221 667 3.162 0.008 1.594 上调 N-阿魏酰胍丁胺 N/A 265 000 1 373 333 5.182 0 1.721 上调 2, 5−二羟基苯甲酸 490-79-9 34 966 667 12 733 333 0.364 0 1.692 下调 槲皮素O-乙酰己烯苷 N/A 53 433 333 10 726 667 0.201 0.005 1.627 下调 葡糖酸 133-42-6 526 333 2 393 333 4.547 0.001 1.689 上调 2′, 4′ , 5, 7-四羟基异黄酮 1156-78-1 2 000 003 12 063 333 6.032 0.009 1.594 上调 3-羟基-5-甲基苯酚-1-氧化基-β-D-葡萄糖 N/A 2 373 333 158 433 0.067 0.002 1.682 下调 槲皮素 20364-84-5 52 666 667 6 833 339 0.130 0.007 1.626 下调 N-乙酰-DL-色氨酸 87-32-1 24 970 264 333 10.586 0.007 1.617 上调 异泽兰黄素 3-葡萄糖苷 N/A 9 31 866 667 3 540 740.740 0.007 1.694 上调 十六聚甲烷基鞘氨醇 N/A 4 260 000 6 223 333 1.461 0.009 1.675 上调 说明：CAS编号是美国化学文摘服务社(chemical abstracts service, CAS)为化学物质编制的登记号；N/A表示该物质并未查询到
CAS编号2.5 差异聚类热图
筛选具有显著差异(P＜0.05)的代谢物进行聚类热图分析，进一步挖掘特征，并对筛选后的差异代谢物归一化处理。由图4显示：抗虫组样本丰度明显区别于非抗虫组样本，抗虫组样本组内也有差异但不明显，非抗虫组中黄花柳的样本成分分布丰度与垂柳和旱柳存在差异。可以看出：能明显划分成4个区域冷暖色差分异，在非抗虫组丰度高而在抗虫组中丰度低的代谢物，为8种下调代谢产物；在抗虫组中丰度高而在非抗虫组中丰度低的代谢物为15种上调代谢物。
3. 讨论与结论
本研究对4种不同柳树无性系进行了室内饲虫，结果显示三蕊柳对柳蓝叶甲表现出了高抗性；通过应用代谢组学方法对非抗虫组与抗虫组的次生代谢产物进行测定，筛选并最终鉴定出23种主要的差异代谢产物。上调次生代谢物包括阿魏酰胍丁胺、抗坏血酸、没食子酸、绿茶儿茶酚、没食子儿茶素、杨梅苷、葡萄酸铜、D-(−)-阿拉伯糖、4-羟基-3-甲氧基肉桂酸乙酯、N-阿魏酰胍丁胺、葡糖酸、2′, 4′, 5, 7-四羟基异黄酮、N-乙酰-DL-色氨酸、异泽兰黄素-3-葡萄糖苷、十六聚甲烷基鞘氨醇等15种。下调次生代谢物包括槲皮素-3-O-(6″-O-乙酰基)-β-D-吡喃半乳糖苷、橙皮甙、芦丁、聚半乳糖醛酸、2, 5-二羟基苯甲酸、槲皮素O-乙酰己烯苷、3-羟基-5-甲基苯酚-1-氧化基-β-D-葡萄糖、槲皮素等8种。这些差异特定代谢物影响的机制尚待进一步研究。
凌嘉昊[20]通过调查野外虫害等级和室内取食率来对比簸箕柳S. suchowensis和三蕊柳的抗虫性，发现三蕊柳表现出了高抗性，与本研究结果一致；该研究还发现三蕊柳的挥发物会使柳蓝叶甲产生趋避反应，并且鉴定分析显示22种挥发物组分在释放量方面有显著差异。而本研究发现：柳蓝叶甲的幼虫对三蕊柳存在取食行为，在接虫后的第4天全部死亡，表明三蕊柳除挥发物会对柳蓝叶甲产生趋避反应外，其次生代谢产物可能会对柳蓝叶甲幼虫产生毒害作用，或缺乏幼虫生长发育所必需的营养物质而导致其死亡。黄酮类物质是植物中一类重要的次生代谢物质，可以影响昆虫的行为和代谢，使之产生忌避、拒食等行为，破坏昆虫的正常代谢，严重时导致昆虫中毒甚至死亡，是对昆虫有毒的一类次生代谢产物[21]。生物碱是一大类含氮的碱性物质，对昆虫的防御作用主要表现在阻碍昆虫的取食以及引起昆虫中毒2个方面[22]。有研究表明：树木中的酚酸类物质含量越高，对天牛Cerambycidae的抗性就越强，但不同酚酸在不同无性系间的变化规律随其种类的不同而不同[23]。本研究可为培育抗虫性强、性状优良的柳树品种提供理论基础，三蕊柳的具体抗虫机制还有待进一步研究。
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图 1 菌株Q01在选择培养基中显色和褪色表现及显微镜观察
Figure 1 Color development and fading performance of strain Q01 in selective medium and microscopic observation
图 2 基于ITS 序列构建的菌株Q01系统发育树
Figure 2 Phylogenetic tree of strain Q01 constructed based on ITS sequence
图 3 培养时间对菌株产生木质素降解相关酶及生物量的影响
Figure 3 Changes in culture time to the enzymes and biomass related to lignin degradation produced by the strain
图 4 接种量对菌株产生木质素降解相关酶及生物量的影响
Figure 4 Changes in the amount of inoculum to produce lignin degradation related enzymes and biomass
图 5 碳源对菌株产生木质素降解相关酶及生物量的影响
Figure 5 Effect of carbon source on lignin degradation related enzymes and biomass produced by the strain
图 6 氮源对菌株产生木质素降解相关酶及生物量的影响
Figure 6 Effect of nitrogen source on lignin degradation related enzymes produced by the strain and biomass
表 1 不同菌株选择培养基的显色和褪色结果
Table 1. Coloring and decoloring results of different strains on selective mediums
菌株 苯胺蓝褪色结果 愈创木酚显色结果 12 24 36 48 72 12 24 36 48 72 h Q01 − − − + ++ + ++ +++ ++++ ++++ Q02 − − − − + − − − + ++ Q06 − − − − − − − − − + Q09 − − − − + − − − − + Q11 − + + ++ +++ − − − + + Q12 − + ++ +++ +++ − − − − − Q14 − + + ++ ++ − − − − − Q17 − + + + + − − − − − Q19 − + + + + − − − − − Q22 − + + ++ ++ − − − − − 说明：−表示不褪色(或不显色)；+、+ +、+ + +、+ + + +表示 褪色(或显色)圈逐渐增大 
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表 2 均匀试验设计及结果
Table 2. Uniform test design and results
试验号 木质素
磺酸钠/
(g·L−1)蛋白胨/
(g·L−1)酵母粉/
(g·L−1)豆饼粉/
(g·L−1)五水合
硫酸铜/
(g·L−1)氯化钠/
(g·L−1)锰过氧化
物酶活性/
(×16.67 nkat·L−1)木质素过氧
化物酶活性/
(×16.67 nkat·L−1)漆酶活性/
(×16.67 nkat·L−1)总酶活性/
(×16.67 nkat·L−1)生物量/
g实测值1 6.00 5.00 3.00 11.00 0.20 1.50 4 296.20 1 520.43 219.19 6 035.83 0.037 仿真值1 6.00 5.00 3.00 11.00 0.20 1.50 3 186.76 2 888.58 218.40 6 293.73 0.037 实测值2 8.00 10.00 1.00 11.00 0.25 1.25 4 200.35 3 790.22 252.62 8 243.18 0.055 仿真值2 8.00 10.00 1.00 11.00 0.25 1.25 4 190.01 3 799.79 288.91 8 278.71 0.049 实测值3 10.00 2.50 4.00 9.00 0.35 1.00 4 095.77 3 605.59 318.60 8 019.96 0.048 仿真值3 10.00 2.50 4.00 9.00 0.35 1.00 4 094.32 3 712.88 282.19 8 089.38 0.048 实测值4 12.00 7.50 1.00 9.00 0.15 0.75 4 601.21 5 278.06 313.29 10 192.56 0.014 仿真值4 12.00 7.50 1.00 9.00 0.15 0.75 4 607.23 4 178.73 318.24 9 104.20 0.024 实测值5 14.00 12.50 4.00 7.00 0.20 0.50 5 263.50 5 028.28 399.44 10 691.23 0.059 仿真值5 14.00 12.50 4.00 7.00 0.20 0.50 5 290.88 4 799.66 366.29 10 456.83 0.062 实测值6 6.00 2.50 2.00 7.00 0.30 1.50 4 453.06 3 746.77 178.82 8 378.66 0.123 仿真值6 6.00 2.50 2.00 7.00 0.30 1.50 4 446.86 4 033.08 306.97 8 786.91 0.092 实测值7 8.00 7.50 5.00 5.00 0.35 1.25 3 999.91 4 387.53 186.13 8 573.57 0.042 仿真值7 8.00 7.50 5.00 5.00 0.35 1.25 4 018.98 3 644.46 276.89 7 940.33 0.047 实测值8 10.00 12.50 2.00 5.00 0.15 1.00 3 215.62 4 322.37 363.36 7 901.34 0.050 仿真值8 10.00 12.50 2.00 5.00 0.15 1.00 4 289.80 3 890.43 295.93 8 476.16 0.050 实测值9 12.00 5.00 5.00 3.00 0.25 0.75 5 411.65 3 822.80 432.66 9 667.11 0.063 仿真值9 12.00 5.00 5.00 3.00 0.25 0.75 5 287.09 4 905.21 374.46 10 566.76 0.063 实测值10 14.00 10.00 3.00 3.00 0.30 0.50 5 120.37 4 356.31 385.32 9 862.00 0.060 仿真值10 14.00 10.00 3.00 3.00 0.30 0.50 5 241.27 4 754.60 362.81 10 358.68 0.061
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表 3 人工神经网络寻优结果
Table 3. Optimization results of artificial neural network
试验号 木质素磺酸钠/
(g·L−1)蛋白胨/
(g·L−1)酵母粉/
(g·L−1)豆饼粉/
(g·L−1)五水合硫酸铜/
(g·L−1)氯化钠/
(g·L−1)锰过氧化物酶活性/
(×16.67 nkat·L−1)木质素过氧化物酶活性/
(×16.67 nkat·L−1)漆酶活性/
(×16.67 nkat·L−1)总酶活性/
(×16.67 nkat·L−1)生物量/
g预测值 14.00 12.30 5.00 3.00 0.12 0.53 11 727.39 8 795.36 505.56 21 028.31 0.093 7 实测值 14.00 12.30 5.00 3.00 0.12 0.53 11 328.73 8 514.41 484.73 20 327.87 0.090 0
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[1] 王琳, 李素艳, 孙向阳, 等. 不同配比园林绿化废弃物和蘑菇渣混合蚯蚓堆肥的效果[J]. 浙江农林大学学报, 2019, 36(2): 326 − 334. WANG Lin, LI Suyan, SUN Xiangyang, et al. Mixing garden wastes and spent mushroom compost of different ratios for vermicomposting [J]. J Zhejiang A&F Univ, 2019, 36(2): 326 − 334. [2] 蔡琳琳, 李素艳, 龚小强, 等. 好氧堆肥-蚯蚓堆肥结合法处理绿化废弃物与牛粪[J]. 浙江农林大学学报, 2018, 35(2): 261 − 267. CAI Linlin, LI Suyan, GONG Xiaoqiang, et al. Composting-vermicomposting of green waste processing spiked with cow dung [J]. J Zhejiang A&F Univ, 2018, 35(2): 261 − 267. [3] HIMMEL M E, DING Shiyou, JOHNSON D K, et al. Biomass recalcitrance: engineering plants and enzymes for biofuels production [J]. Science, 2007, 315(5813): 804 − 807. [4] KAMIMURA N, SAKAMOTO S, MITSUDA N, et al. Advances in microbial lignin degradation and its applications [J]. Curr Opin Biotechnol, 2019, 56: 179 − 186. [5] 刘瑜, 赵佳颖, 周晚来, 等. 城市园林废弃物资源化利用研究进展[J]. 环境科学与技术, 2020, 43(4): 32 − 38. LIU Yu, ZHAO Jiaying, ZHOU Wanlai, et al. Progress on resource utilization of urban garden waste [J]. Environ Sci Technol, 2020, 43(4): 32 − 38. [6] 孟童瑶, 李素艳, 邹荣松, 等. 固定化木质素降解菌对园林废弃物堆肥的影响[J]. 浙江农林大学学报, 2021, 38(1): 38 − 46. MENG Tongyao, LI Suyan, ZOU Rongsong, et al. Effect of immobilized lignin-degrading bacteria on green waste composting [J]. J Zhejiang A&F Univ, 2021, 38(1): 38 − 46. [7] 梁丛颖, 林璐. 环境微生物介导的木质素代谢及其资源化利用研究进展[J]. 微生物学通报, 2020, 47(10): 3380 − 3392. LIANG Congying, LIN Lu. Environmental microorganisms driven lignin biodegradation and their roles in lignin utilization [J]. Microbiol China, 2020, 47(10): 3380 − 3392. [8] 康跃, 李素艳, 孙向阳, 等. 园林废弃物木质素降解真菌的筛选、鉴别及其能力研究[J]. 林业科学研究, 2019, 32(3): 80 − 87. KANG Yue, LI Suyan, SUN Xiangyang, et al. Study on screening, identification and capability of lignin-degrading fungi for landscaping waste [J]. For Res, 2019, 32(3): 80 − 87. [9] 赵恺凝, 赵国柱, 国辉, 等. 园林废弃物堆肥化技术中微生物菌剂的功能与作用[J]. 生物技术通报, 2016, 32(1): 41 − 48. ZHAO Kaining, ZHAO Guozhu, GUO Hui, et al. The function and role of microbial agents in composting technology of garden waste [J]. Biotechnol Bull, 2016, 32(1): 41 − 48. [10] 李信军, 冯晓晓, 金慧清, 等. 2株内生真菌菌株固态发酵培养基优化[J]. 微生物学通报, 2016, 43(3): 550 − 558. LI Xinjun, FENG Xiaoxiao, JIN Huiqing, et al. Optimization of solid-state fermentation media for growth of two endophytic fungal strains [J]. Microbiol China, 2016, 43(3): 550 − 558. [11] 汪敦飞, 朱胜男, 肖清铁, 等. 基于响应面法的耐镉假单胞菌TCd-1培养条件优化[J]. 浙江农林大学学报, 2020, 37(5): 914 − 921. WANG Dunfei, ZHU Shengnan, XIAO Qingtie, et al. Optimization of culture conditions of Cd-tolerant strain Pseudomonas TCd-1 based on response surface methodology [J]. J Zhejiang A&F Univ, 2020, 37(5): 914 − 921. [12] 王维乐, 牟志美, 张淑君, 等. 响应面法优化Paraconiothyrium variabile GHJ-4产漆酶发酵条件[J]. 应用与环境生物学报, 2011, 17(3): 321 − 325. WANG Weile, MU Zhimei, ZHANG Shujun, et al. Optimization of fermentation conditions of Paraconiothyrium variabile GHJ-4 for laccase production by response surface methodology [J]. Chin J Appl Environ Biol, 2011, 17(3): 321 − 325. [13] 胡欣颖, 李洪军, 李少博, 等. 对比研究响应面法和BP神经网络-粒子群算法优化调理松板肉加工工艺[J]. 食品与发酵工业, 2019, 45(24): 179 − 187. HU Xinying, LI Hongjun, LI Shaobo, et al. A comparative study of the optimization of processing technology of conditioning pine board meat by response surface methodology and BP neural network-particle swarm optimization [J]. Food Ferment Ind, 2019, 45(24): 179 − 187. [14] 周宇光. 菌种目录[M]. 4版. 北京: 北京科学技术文献出版社, 2012: 694. [15] 刘宇, 汤斌, 李松, 等. Trametes sp. LS-10C产漆酶发酵培养基优化及其漆酶对偶氮染料的脱色性能[J]. 环境科学学报, 2017, 37(1): 193 − 200. LIU Yu, TANG Bin, LI Song, et al. Optimization of fermentation medium for laccase production by Trametes sp. LS-10C and its properties in the decolorization of azo dyes [J]. Acta Sci Circumstantiae, 2017, 37(1): 193 − 200. [16] 冯波, 林元山, 胡超, 等. 一株木质素降解菌的筛选、鉴定及其漆酶发酵条件的优化[J]. 湖南师范大学自然科学学报, 2015, 38(2): 12 − 16, 73. FENG Bo, LIN Yuanshan, HU Chao, et al. Screening and Identification of a lignin degrading strain and optimization of fermentation conditions for laccase [J]. J Nat Sci Hunan Norm Univ, 2015, 38(2): 12 − 16, 73. [17] 李雪玲, 姚一建. 基于28S rDNA序列构建侧耳属系统发育树[J]. 菌物学报, 2004, 23(3): 345 − 350. LI Xueling, YAO Yijian. Assembling phylogenetic tree of Pleurotus based on 28S rDNA sequencing [J]. Mycosystema, 2004, 23(3): 345 − 350. [18] 田林双. 木质素降解相关酶类测定标准方法研究[J]. 畜牧与饲料学, 2009, 30(10): 13 − 14. TIAN Linshuang. Research on standard method for determining ligninolytic enzyme activity [J]. Anim Husbandry Feed Sci, 2009, 30(10): 13 − 14. [19] 缪晓磊. 竹林毛栓菌的诱变选育及其产酶条件优化[D]. 杭州: 浙江农林大学, 2019. MIAO Xiaolei. Mutation Breeding of Trametes sp. from Bamboo Forest and Optimization of Enzyme Production Conditions [D]. Hangzhou: Zhejiang A&F University, 2019. [20] SUN Yong, YANG Gang, XU Mengxia, et al. A simple coupled ANNs-RSM approach in modeling product distribution of Fischer-Tropsch synthesis using a microchannel reactor with Ru-promoted Co/Al2O3 catalyst [J]. Int J Energy Res, 2020, 44(2): 1046 − 1061. [21] FLORENCIO F, VALENÇA T, MORENO E D, et al. Performance analysis of deep learning libraries: TensorFlow and PyTorch [J]. J Comp Sci, 2019, 15(6): 785 − 799. [22] LIU Yuliang, JIN Lianwen. Deep matching prior network: toward tighter multi-oriented text detection[C]//IEEE. 30th IEEE Conference on Computer Vision and Pattern Recognition. Honolulu: IEEE, 2017: 1962 − 1969. [23] AN Yang, WANG Xiaocen, CHU Ronghe, et al. Event classification for natural gas pipeline safety monitoring based on long short-term memory network and Adam algorithm [J]. Struct Health Monit, 2020, 19(4): 1151 − 1159. [24] 邓诗贵, 杨晨军, 冯加洲, 等. 一株木质素降解白腐菌的筛选、鉴定及其产漆酶培养基的优化[J]. 食品研究与开发, 2019, 40(16): 178 − 184. DENG Shigui, YANG Chenjun, FENG Jiazhou, et al. Screening and intification of a lignin-degrading wite rot fungi and optimization of its laccase-producing medium [J]. Food Res Dev, 2019, 40(16): 178 − 184. [25] 唐菊, 段传人, 黄友莹, 等. 白腐菌木质素降解酶及其在木质素降解过程中的相互作用[J]. 生物技术通报, 2011(10): 32 − 36. TANG Ju, DUAN Chuanren, HUANG Youying, et al. Characteristics of ligninolytic enzymes of white-rot fungus and their interactions in the process of lignin degradation [J]. Biotechnol Bull, 2011(10): 32 − 36. [26] 习兴梅. 农林废物堆肥化中木质纤维素降解微生物学研究[D]. 长沙: 湖南大学, 2007. XI Xingmei. Research of Lignocelluses Biodegradation by Different Microorganisms in Agriculture and Forestry Waste Composting [D]. Changsha: Hunan University, 2007. [27] 杨柳, 吕丹丹, 邓杰勇, 等. 粗毛栓菌(Trametes hirsuta)D2固态发酵山核桃蒲壳产漆酶的营养条件研究[J]. 微生物学通报, 2014, 41(10): 1955 − 1960. YANG Liu, LÜ Dandan, DENG Jieyong, et al. Nutritional conditions for laccase production by Trametes hirsuta D2 in solid-state fermentation using hickory hull [J]. Microbiol China, 2014, 41(10): 1955 − 1960. [28] 熊乙. 木质纤维素降解菌的筛选鉴定及降解产物研究[D]. 太谷: 山西农业大学, 2019. XIONG Yi. Screening and Identification of Lignocellulose Degrading Bacteria and Degradation Products Research [D]. Taigu: Shanxi Agricultural University, 2019. [29] 彭志妮, 郭丽琼, 张新超, 等. 蛹虫草固体发酵大豆基质的成分及抗氧化活性变化研究[J]. 菌物学报, 2011, 30(2): 338 − 342. PENG Zhini, GUO Liqiong, ZHANG Xinchao, et al. Compositions and antioxidant activities of soybean substrate during solid-state fermentation by Cordyceps militaris [J]. Mycosystema, 2011, 30(2): 338 − 342. -
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