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氮素的吸收、同化与运转直接影响着作物的生长发育状况，对作物生长至关重要。传统计算植株氮质量分数的方法需要破坏性取样，且要进行室内化学分析，具有一定程度上的滞后性和缓慢性。叶绿素仪具有快速、简便和无损的特点，常被用来监测诊断作物氮素营养[1]。前人基于作物高产条件下建立的土壤、作物分析仪器开发（SPAD）值与产量的关系确定了适宜SPAD值[2-4]。近年来，在小麦Triticum aestivum，玉米Zea mays，茅草Imperata cylindrica，水稻Oryza sativa等作物上利用SPAD值估算作物氮质量分数快速无损诊断氮素营养状况已经被广泛应用[3]，但传统的叶片氮营养诊断方法有不少的缺点，例如准确度低，诊断费时费力，且破坏样本和诊断相对滞后[5-7]。若采用SPAD测量仪诊断氮素营养方法则较为省时省力且能够实时监测，但SPAD测量仪所测量出的数据受很多环境因素影响，在某些情况下会出现准确度低和稳定性较差等缺点。前人主要以单叶SPAD作为诊断方法进行研究[8]，凌启鸿等[9]研究表明顶3叶与顶4叶的叶色差可以准确诊断水稻植株氮素的丰亏，李刚华等[8]研究表明顶3叶可作为较为理想指示叶诊断水稻氮素营养状况，姜继萍等[10]研究表明水稻顶4叶和顶3叶间的差值与施氮水平之间存在明显的相关性，李杰等[11]研究表明顶3叶SPAD值乘顶4叶SPAD值/顶部4张叶片平均SPAD值与田块表观供氮量之间具有显著的线性关系。前人大都基于顶3叶与顶4叶对水稻氮素营养诊断进行研究，而不同叶位构建归一化SPAD指数（normalized differential SPADij，INDSPADij）与氮素营养之间关系的研究较少。本研究通过不同叶位建立归一化SPAD指数与水稻氮素营养之间的定量关系，通过归一化SPAD值估算氮质量分数，从而快速精确地诊断水稻氮素营养，并通过不同叶位与氮素营养状况的相关性高低判定更能指示水稻植株氮质量分数的叶位，以期为水稻氮素营养诊断提供参考。
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于2015年在浙江省德清县浙江农林大学现代农业科技园，选用2个水稻品种：‘甬优538’‘Yongyou 358’，5月28日播种，大田用种量为18.0 kg·hm-2，秧龄为25 d，2本·丛-1，移栽稻密度为18.0万穴·hm-2；行距28.0 cm ×株距20.0 cm。‘秀水134’‘Xiushui 134’，5月28日播种，大田用种量为45.0 kg·hm-2，秧龄25 d，4本·丛-1，移栽稻密度为25.5万穴·hm-2。行距28.0 cm ×株距14.0 cm。2品种独立试验，设置5个氮肥水平，重复3次，采用随机区组设计，小区15个·品种-1。小区之间以田埂相隔，埂上覆膜，独立排灌。南北行向，小区东西长8.0 m，南北宽4.0 m，面积为32.0 m2。耕作层土壤有机质为20.10 g·kg-1，全氮为1.19 g·kg-1，碱解氮为104.64 mg·kg-1，速效磷为46.45 mg·kg-1，速效钾为81.49 mg·kg-1。
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设置5个氮肥水平，施肥量分别为0（N0对照），70.0（N1），140.0（N2），210.0（N3），280.0（N4）kg·hm-2。m（基肥）:m（糵肥）:m（穗肥）=4:2:4（表 1）。在施用基肥时，一次性施入过磷酸钙990.0 kg·hm-2；氯化钾基肥用175.0 kg·hm-2，穗肥用175.0 kg·hm-2，所有小区水平一致。
表 1 不同时期氮肥用量
Table 1. Nitrogen consumption at different stages
编号 氮肥/（kg·hm-2） 组成/（kg·hm-2） 基肥 蘖肥 穗肥 N0 0 0 0 0 N1 70.0 28.0 14.0 28.0 N2 140.0 56.0 28.0 56.0 N3 210.0 84.0 42.0 84.0 N4 280.0 112.0 56.0 112.0 -
通过分析顶部4张叶片SPAD值的变化特征，明确叶位SPAD归一化指数与植株氮质量分数的定量关系，构建最优的叶位SPAD组合指数，实时可靠地反映水稻植株氮素营养状况。
叶位SPAD组合指数的计算方法如下：叶位SPAD归一化指数INDSPADij=（ISPADi-ISPADj）/（ISPADi+ISPADj）。其中：ISPADi和ISPADj分别代表水稻冠层主茎第i和j叶位的SPAD值，i，j≤4。
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用MINOLTA产SPAD-502型叶绿素计，在水稻拔节前期、拔节期、孕穗期、抽穗期、开花期和灌浆前期，选取4株健康主茎测定其顶部4张完全展开叶上部1/3处、中部和下部1/3处的SPAD值，取平均值作为各叶片的SPAD值[8]。
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水稻拔节前期、拔节期、孕穗期、抽穗期、开花期、灌浆前期、灌浆中期和成熟期，分别选取代表性水稻植株4株·小区-1，根据植株器官发育情况，将样品植株分离为叶、茎和穗，放入恒温干燥箱内烘干，在105 ℃杀青30 min，80 ℃烘干48 h至恒量后称量。样品粉碎后使用半微量凯氏定氮法测定水稻植株不同器官的全氮质量分数。
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图 1和图 2显示：L1~L4分别代表水稻冠层的顶1，顶2，顶3及顶4叶片，N0~N4分别代表 5个施氮水平0，70.0，140.0，210.0，280.0 kg·hm-2。从图 1可以看出：‘甬优538’在不同时间SPAD值出现明显差异，进入衰老期后期SPAD值进入持续下降阶段，大部分植株在衰老期前后L4的SPAD值下降数值明显大于L1，L2和L3。‘秀水134’SPAD值呈现先降低后增加再降低趋势，进入衰老期后，SPAD值下降明显。
图 1 ‘甬优538’水稻冠层叶片SPAD值在不同的5个施氮水平下的动态变化趋势
Figure 1. Trend of dynamic change of SPAD value of canopy leaf of 'Yongyou 538' rice under different 5 nitrogen fertilizer levels
图 2 ‘秀水134’水稻品种冠层叶片SPAD值在不同的5个施氮水平下的动态变化趋势
Figure 2. Trend of dynamic change of SPAD value of canopy leaf of 'Xiushui 134' rice under different 5 nitrogen fertilizer levels
从图 1~2可以看出：‘甬优538’和‘秀水134’绝大部分L4的SPAD数值大于L3和L2，其中L1的数值在生育期中大部分低于L2，L3和L4。因为氮素都是从下往上运输的，所以最接近根部的L4的SPAD值大于其他叶片。又因为L1测定SPAD值时展开程度不同，L1对光能的利用效果不佳从而导致叶片颜色偏浅，SPAD数值低于其他叶片数值。
2015年的大田试验（对照除外），在移栽后30 d至移栽后90 d的生育期内，植株冠层叶片的SPAD值可以从叶片叶色的变化中看出，经过各个生育期叶色比对可以发现叶色经历了“二黑二黄”2次交替波动的变化，施氮量的增加叶色的变化程度明显随之加大。大田水稻在移栽后的30 d，即水稻处于分集高峰期，水稻叶片经历了的第一次叶色“黑黄”交替变化，这一时期水稻SPAD值达到一个峰值，从大田材料可观察到冠层叶色较深，随后变淡。水稻冠层叶片的深浅交替变化有助于分蘖数的增加，促进秧苗在育苗阶段的生长，保证在生育后期拥有充足的穗数。在植株进入这一阶段时植株氮代谢活跃，冠层叶片生长旺盛，分蘖数有所增加。其中‘甬优538’N4和‘秀水134’N3，N4的分蘖高峰期往后偏移。分蘖数量和施氮量等影响分蘖的终止日期，在分蘖的中后期，水稻植株对土壤供氮水平要求较高以求达到分孽所需的含氮水平。因而随着施氮量的增加，分孽的终止日期将延迟，分蘖期因此有所延长。所以高氮水平下水稻的分蘖高峰期也随之向后偏移[12-13]。
由于品种条件的影响，‘秀水134’秧苗生长较‘甬优538’偏慢，水稻处于抽穗期时（即‘甬优538’在移栽后的75 d后，‘秀水134’在移栽后的85 d后），叶片开始大量积累营养物质，叶片在这一阶段叶绿素和氮质量分数有所升高，叶片颜色较深，为之后的抽穗期提供物质储备。在植株进入抽穗期，穗部将大量接收叶片的营养物质，叶色又变淡（SPAD值下降），即水稻植株冠层叶片发生了第2次黑黄交替。“二黑二黄”是水稻植株茎秆生长增粗、防倒伏、稻穗增重增大的时期。通常“二黑”（2次颜色较深的时期）促进光合作用的进行，从而有效促进了碳水化合物的累积。若在生育期中“二黑”未出现或不明显，表明植株生长发育减缓，会造成以下后果：叶片偏小，抽穗期提早，穗部发育不良穗粒不足，导致产量降低。图 1和图 2可以看出：不同的施氮水平的水稻均会表现2次叶片颜色交替的现象（即SPAD值2次升降），不同的施肥水平和不同的施肥时间只会影响冠层叶片颜色深浅交替变化的幅度和出现的时间，并不能使这一变化的规律消失。有研究[9]认为，无论在何种施氮水平下，水稻冠层叶在生育期均会产生“黑黄”交替变化趋势，因为这是其自身内在因素控制的，不同的施氮水平无法使这一现象消失。
图 1和图 2表明：2个品种在不同施氮条件下，水稻L1的SPAD值普遍小于L4和L3。分析原因，在移栽后35 d左右，叶位靠下的L4及L3已经比较成熟且已完全展开[10]，因而SPAD值较大。而L1为新生叶片，叶位靠上，因其可能为完全成熟且未完全展开，并且从大田实地观察也可以得出：L1叶面积较小，颜色较其他叶片较浅，导致SPAD值在大部分情况下小于L3和L4。
‘甬优358’在N0条件下及‘秀水134’在N0和N1条件下，水稻的L2的SPAD值大于L3及L4。分析原因，水稻植株缺氮条件下，L2会优先接收氮素营养，顶部叶片光合作用效率高于底部叶片，所以L2的SPAD值明显偏大。随着施氮水平的提高，L2~L4的SPAD差值变小，在而在氮素供给充足的情况下，L3和L4的SPAD值明显变大，出现了L3和L4的SPAD值大于L2的现象，推测是因为施氮量的增加，充足的氮素不仅可以满足新叶的生长也可以保证靠近根部的下位叶的氮素营养。可见，充足的氮素供应可以使不同叶位的功能叶生长发育更加平衡。另外也可以推测：L3和L4相比L2对氮素营养状况的相关性更高，因而更适合作为植株氮营养诊断的理想指示叶。通过不同叶片SPAD值表现可以看出氮素优先供应上部叶片，前期营养生长氮素主要供应L2，后期生殖生长氮素主要供应L1，当氮素充足的时候下部叶片能得到足够的养分供应，而当植株出现氮素亏缺，老叶最先衰老，下部叶片表现最为明显，因此，L4对氮素反应最为敏感，其次是L3，L4可以作为水稻植株氮素营养变化的指示叶片。此外，L1与L4的SPAD值差值比较发现，两者之间的差值随氮水平的升高逐渐减小。根据这一现象，可以利用上位叶和下位叶差值大小来判断叶片氮质量分数的高低，为下一步推断水稻施氮是否充足提供依据。
田间试验表明：水稻播种期、移栽期、拔节期、孕穗期、开花期和成熟期分别为5月28日、6月21日、8月10日、8月27日、9月7日和10月20日。图 3可以看出：随着施氮水平的增加水稻冠层叶片SPAD值逐渐增加，这说明施氮量越高，水稻叶片叶绿素质量分数也越高。
图 3 不同施氮量水平下‘甬优538’和‘秀水134’水稻冠层叶片SPAD值在的动态变化趋势
Figure 3. Trend of dynamic change of leaf SPAD values of 'Yongyou 538 'and 'Xiushui 134' under different 5 nitrogen fertilizer levels
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由图 4可知：在各生育时期地上部冠层叶片氮质量分数随着施氮量的增加不断增加，5个施氮水平之间存在显著差异（P＜0.05）。过量施氮会引起水稻干物质增加变缓，而冠层叶片氮浓度仍呈不断增加趋势。
图 4 不同施氮水平下水稻冠层叶片氮质量分数随移栽后天数的变化趋势
Figure 4. Variation trend of nitrogen concentration of rice leaf under different nitrogen levels with the days after transplantation
研究证实：水稻冠层不同叶位叶片SPAD差值与叶片氮质量分数为指数式回归关系，且此关系受年份、品种和生育时期影响较小[14]。本研究结果表明：以INDSPAD14与冠层叶片氮质量分数之间相关系数最为显著（图 5和图 6）。
图 5 ‘甬优358’水稻INDSPAD14与冠层叶片氮质量分数的定量关系
Figure 5. Quantitative relationship between the N content of leaf and INDSPAD14 in'Yongyou 358'
图 6 ‘秀水134’水稻INDSPAD14与冠层叶片氮质量分数的定量关系
Figure 6. Quantitative relationship between the leaf N content of rice and INDSPAD14 in'Xiushui 134'
为了减少品种和环境等因素对SPAD与植株氮质量分数关系的影响，对大田试验的‘甬优358’和‘秀水134’分别构建了归一化SPAD指数（INDSPADij）与植株氮质量分数之间关系，结果发现INDSPAD14与N0~N4所有不同施氮量组别之间呈显著正相关（P＜0.05），‘甬优358’水稻品种决定系数R的范围为0.69~0.96，‘秀水134’决定系数R的范围为0.64~0.94，INDSPAD14与植株氮质量分数的定量关系受施氮量和环境的影响较小而保持稳定，可以用INDSPAD14来估算水稻植株氮质量分数。相比前人利用单叶SPAD和遥感等方法估算氮质量分数，本研究利用INDSPAD14估算水稻植株氮质量分数，简单快速，可以减少取样对植株带来的破坏以及植株品种、土壤、天气等对诊断的影响，仅测量水稻植株L1和L4 SPAD，即可估算出实际氮质量分数。另外，INDSPAD14指数对水稻植株氮素营养的估算效果优于INDSPAD13指数，进一步证明了L4较L3更能指示植株氮质量分数。李刚华等[8]研究表明：L3可作为较为理想指示叶诊断水稻氮素营养状况，与本研究结果不同。
水稻L1与L4的归一化SPAD指数与水稻冠层叶片氮质量分数存在显著的相关关系，能较好估计水稻冠层叶片氮质量分数，模型不易受环境因素影响，具有较高稳定性。后续研究将建立INDSPAD14与水稻氮营养指数之间的定量关系，用于水稻氮素营养诊断。
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不同的施氮量的水稻均会表现出2次叶片颜色交替的现象（即SPAD值2次升降），这是其自身内在因素控制的，不同的施氮量无法使这一现象消失。水稻植株缺氮条件下，植株靠近根部的叶位L3和L4的SPAD值小于植株顶部叶片（L2）叶片的SPAD值。随着施氮量的提高，出现了L3和L4的SPAD值大于L2的现象。推测出L3和L4相比L2对氮素营养状况的相关性更高，更适合作为植株氮营养诊断的理想指示叶。
发现INDSPAD14与N0~N4所有不同施氮量组别之间呈显著正相关，‘甬优358’水稻品种决定系数R为0.69~0.96，‘秀水134’品种决定系数R为0.64~0.94，INDSPAD14与植株氮质量分数的定量关系受施氮量和环境的影响较小而保持稳定，用INDSPAD14估算氮质量分数较为准确，顶4叶相较其他叶片更能指示水稻植株氮质量分数。
Characteristics and diagnosis of nitrogen nutrition for rice canopy leaf SPAD value changes
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摘要: 建立水稻Oryza sativa氮营养诊断模型，实时反映水稻植株氮素营养状况，对水稻田间管理至关重要。于2015年在浙江省德清市开展田间试验，选择‘甬优538’‘Yongyou 538’和‘秀水134’‘Xiushui 134’作为代表品种，设置5个施氮水平0（N0），70.0（N1），140.0（N2），210.0（N3），280.0（N4）kg·hm-2，通过研究不同施氮水平下2个水稻品种冠层叶片作物分析仪器开发值（SPAD）变化规律，探究5个不同施氮水平下植株氮质量分数的变化趋势，并利用归一化SPAD指数（INDSPAD14）估算植株氮质量分数。结果表明：顶4叶相较其他叶片更能指示水稻植株氮质量分数，归一化SPAD指数与N0~N4所有不同施氮量组别之间冠层叶片氮质量分数呈显著正相关（P < 0.05），‘甬优358’水稻品种决定系数为0.69~0.96，‘秀水134’品种决定系数为0.64~0.94。该指数可以对水稻冠层叶片氮质量分数快速估测。Abstract: Nitrogen(N) is important for rice growth. To establish a rice (Oryza sativa) nitrogen nutrition diagnostic model that could reflect the N status of a rice organism and that could be convenient for rice field management, a rice community test was conducted in Deqing City, Zhejiang Province in 2015. Oryza sativa 'Yongyou 538' and 'Xiushui 134' were taken as the representative cultivars. Five levels of N were established:0(N0)(ck), 70.0(N1), 140.0(N2), 210.0(N3), and 280.0(N4) kg·hm-2. Measurement of rice SPAD (soil and plant analyzer development) values were made using a portable SPAD-502 meter and followed by a correlation analysis. Results showed that the fourth leaf from the top was a good indication of plant nutrition status. There was a significant positive correlation between the normalized SPAD index (INDSPAD14) and N content in canopy leaves with the N0-N4 treatments. The coefficients of determination for 'Yongyou 358' r2=0.69-0.96 and for 'Xiushui 134' r2=0.64-0.94. By analyzing the relationship between INDSPAD14 and plant N content, a diagnostic model of rice N concentration was established.
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Key words:
- botany /
- Oryza sativa /
- canopy leaf /
- SPAD value /
- nitrogen
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酸雨已经成为全球十大环境问题之一[1]。欧洲、北美东部和东南亚，以及中国南方地区是世界上受酸雨危害最为严重的地区，而且酸雨区域还在不断扩大[2]。大量研究表明：酸雨对森林土壤的理化性质[3]、养分组成[4]、土壤微生物[5]以及土壤酶活性[6]等均具有明显的影响。张萍华等[7]研究发现，模拟酸雨对白术Atractylodes macrocephala根际土壤脱氢酶、过氧化氢酶、脲酶和蛋白酶等活性具有明显的抑制作用，对磷酸酶活性有一定的促进作用；模拟酸雨对砖红壤中淀粉酶、过氧化氢酶、酸性磷酸酶、脲酶等的活性有不利影响[8]。土壤-凋落物界面是植被对土壤生态系统产生直接和间接影响的最为重要的生态过程之一，也是生态系统内物质循环最为活跃的场所[9]。凋落物分解产物能够提高土壤脲酶、蔗糖酶和脱氢酶活性[10]；新鲜凋落物可以通过调节土壤pH值来改变土壤酶活性[11]；也有研究显示凋落物分解过程与土壤酚氧化酶、木聚糖酶、纤维素分解酶、过氧化物酶活性密切相关[12-13]。酸雨除了直接影响土壤生态系统外，还会影响森林凋落物分解和化感物质的释放[14]，间接对土壤酶活性产生影响[6]。模拟酸雨加快了南美蟛蜞菊Wedelia trilobata凋落物的分解，提高了其周围土壤中凋落物层的化感潜力[15]；模拟酸雨能够降低青冈Cyclobalanopsis glauca，木荷Schima superba和马尾松Pinus massoniana等植物凋落物的分解速率[16]；水榆花楸Sorbus alnifolia叶凋落物早期分解速率和脱氢酶活性受酸雨的抑制[17]；酸雨会降低凋落物的分解速率，并抑制大多数酶的活性[6]。关于酸雨和凋落物复合作用对植物根际土壤酶活性的研究鲜见报道。柳杉Cryptomeria fortunei是中国特有用材树种，浙江省临安市天目山国家级自然保护区为柳杉分布的中心之一[18]。一些学者对天目山柳杉液流特征[19]、自毒作用[20]和病虫害[21]等方面进行了研究。目前，天目山柳杉长势逐渐减弱，林内幼苗极为稀少，天然更新困难，其种群结构和景观生态功能逐渐衰退。天目山地处重酸雨区[22]，且柳杉林地有凋落物覆盖，酸雨胁迫和凋落物分解导致土壤环境的改变是否是柳杉长势减弱和幼苗建立失败的原因？本研究以柳杉幼苗根际土壤为研究对象，分析了模拟酸雨胁迫和柳杉凋落物分解的情况下柳杉幼苗根际土壤酶活性的变化，旨在为研究酸雨和凋落物分解对天目山柳杉林地土壤环境以及柳杉苗木生长的影响提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
取3年生柳杉实生苗（由江西林业种苗公司提供），株高30~40 cm，于2012年4月栽植于花盆中（φ=26 cm，h=35 cm），1株·盆-1。栽植幼苗所用土壤取自浙江农林大学植物园园土，土壤类型为山地红壤。去除土壤中原有的植物碎屑、死根等杂质，并与2~4 mm粒径蛭石以4∶1（V∶V）混合后移置花盆中，各花盆内的供试土壤性质基本一致：土壤有机碳（12.1±0.3） g·kg-1，总氮（429.1±16.2） mg·kg-1，总磷（216.7±12.0） mg·kg-1，总钾（1.7±0.1） g·kg-1，速效磷（20.6±2.3） mg·kg-1，速效钾（692.8±14.7） mg·kg-1，酸碱度pH 3.9±0.3。盆栽苗置于温室中，常规管理，缓苗2个月后进行处理。柳杉凋落物于2012年5月取自天目山柳杉林，自然风干，保存备用。根据浙江省临安市多年自然降水监测的结果[22]，本研究采用分析纯浓硫酸和硝酸按摩尔浓度比4∶1的比例配制模拟酸雨母液，并用蒸馏水稀释成pH 4.0的模拟酸雨溶液。
1.2 试验设计
选取长势相近的盆栽苗24盆，随机分为4组，分别进行处理。试验设酸雨处理组（AR，acid rain），凋落物处理组（L，litter），酸雨与凋落物复合处理组（AR+L）和对照组（ck），重复6盆·组-1。经过对天目山柳杉林地凋落物实地调查和计算，凋落物按500 g·m-2的密度均匀平铺于花盆中土壤表层。酸雨按照当地多年平均降雨量进行喷淋，隔4 d喷1次，450 mL·次-1·盆-1；凋落物处理组和对照组以自来水（pH 6.8）做模拟降水进行喷淋，喷淋量同酸雨。分别在处理30 d和90 d时取土，在不损伤幼苗根系的前提下，距离幼苗10 cm左右，按照栽植时幼苗主根深度，去除表层5 cm土壤后采集土壤，采集深度为10 cm，去除明显的植物根系等杂质。土样带回实验室，自然风干后过筛，进行土壤酶活性分析。
1.3 试验方法
土壤酶活性测定主要参照关松荫[23]的方法进行。过氧化物酶活性和多酚氧化酶活性采用邻苯三酚比色法测定，硝酸还原酶活性采用酚二磺酸比色法测定，脲酶活性采用苯酚钠比色法测定，酸性磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法测定，蛋白酶活性采用茚三酮比色法测定，蔗糖酶活性采用3，5-二硝基水杨酸比色法测定，过氧化氢酶活性采用紫外分光光度法[24]测定。
1.4 数据处理
采用SPSS 18.0统计分析软件进行数据处理和统计分析。
2. 结果与分析
2.1 不同处理对土壤氧化还原酶活性的影响
3种处理对不同土壤氧化还原酶活性具有不同程度的影响（图 1）。酸雨处理对土壤硝酸还原酶活性无显著影响（图 1A）。30 d时，对土壤过氧化物酶和过氧化氢酶活性具有极显著的抑制作用（P＜0.01），与对照相比分别降低了18.4%和17.0%（图 1B，图 1C），对土壤多酚氧化酶活性具有极显著的促进作用（P＜0.01），与对照相比提高了47.9%（图 1D）。90 d时，对土壤过氧化物酶、过氧化氢酶和多酚氧化酶活性均表现为促进作用，与对照相比分别提高了12.7%（P＜0.05），33.3%和31.5%（P＜0.01）。
图 1 不同处理对土壤氧化还原酶活性的影响Figure 1. Effect of different treatment on the activity of soil oxidoreductase凋落物处理30 d时，促进了土壤硝酸还原酶活性，与对照相比提高了18.4%（P＜0.01）；抑制了土壤过氧化物酶和过氧化氢酶活性，与对照相比分别降低了23.5%和28.0%（P＜0.01）；对土壤多酚氧化酶活性无显著影响。90 d时，凋落物处理促进了土壤硝酸还原酶、过氧化物酶和多酚氧化酶活性，与对照相比分别提高了19.1%，21.9%（P＜0.01）和8.1%（P＜0.05），抑制了过氧化氢酶活性，与对照相比降低了10.5%（P＜0.05）。
酸雨与凋落物复合处理对土壤过氧化物酶活性无显著影响。30 d时，复合处理使土壤硝酸还原酶活性比对照降低了55.6%（P＜0.01）；对土壤过氧化氢酶活性的影响不显著；使土壤多酚氧化酶活性比对照提高了39.1%（P＜0.01）。90 d时，复合处理使土壤硝酸还原酶活性比对照降低了65.7%（P＜0.01）；使土壤过氧化氢酶和土壤多酚氧化酶活性分别比对照提高了46.9%和17.7%（P＜0.01）。
2.2 不同处理对土壤水解酶活性的影响
3种处理对不同土壤水解酶活性的影响程度不同（图 2）。30 d时，酸雨处理对土壤蔗糖酶活性无显著影响（图 2A）；对土壤脲酶活性具有极显著的促进作用（P＜0.01），与对照相比提高了16.2%（图 2B）；对土壤蛋白酶和酸性磷酸酶活性具有抑制作用（图 2C，D），与对照相比分别降低了11.9%（P＜0.05）和21.7%（P＜0.01）。90 d时，酸雨处理对土壤脲酶活性无显著影响；对土壤蔗糖酶、蛋白酶和酸性磷酸酶活性具有抑制作用，与对照相比分别降低了14.1%（P＜0.05），21.5%和34.3%（P＜0.01）。
图 2 不同处理对土壤水解酶活性的影响Figure 2. Mffect of different treatment on the activity of soil hydrolase30 d时，凋落物处理促进了土壤蔗糖酶和脲酶活性，比对照分别提高了35.6%和24.0%（P＜0.01）；抑制了土壤蛋白酶活性，比对照降低了14.8%（P＜0.05）；对土壤酸性磷酸酶活性无显著影响。90 d时，凋落物处理对土壤蔗糖酶和脲酶活性的影响不显著；抑制了土壤蛋白酶和酸性磷酸酶活性，比对照分别降低了43.0%和39.0%（P＜0.01）。
酸雨与凋落物复合处理30 d时，对土壤酸性磷酸酶活性无显著影响；对土壤蔗糖酶、脲酶和蛋白酶活性具有促进作用，与对照相比分别提高了10.6%（P＜0.05），50.4%（P＜0.01）和14.0%（P＜0.05）。90 d时，复合处理对土壤蔗糖酶和脲酶活性具有促进作用，与对照相比分别提高了17.3%和33.1%（P＜ 0.01）；对土壤蛋白酶和酸性磷酸酶活性具有抑制作用，与对照相比分别降低了43.5%（P＜0.01）和14.4%（P＜0.05）。
3. 讨论
模拟酸雨对土壤蔗糖酶、蛋白酶和酸性磷酸酶活性具有显著抑制作用；短时间处理对土壤过氧化物酶和过氧化氢酶活性具有抑制作用，长时间处理后转变为促进作用；短时间处理对土壤脲酶活性的促进作用也达到显著水平。在Wang等[6]、张萍华等[7]研究中也有一致结果。王涵等[25]研究发现：土壤酸化抑制了土壤多酚氧化酶和脲酶的活性，而本研究却发现模拟酸雨淋洗土壤使土壤多酚氧化酶极显著提高，短时间内对土壤脲酶活性的促进作用也达到显著水平。这种差异可能是由于不同类型土壤的酸缓冲容量不同，导致模拟酸雨对土壤酶活性的影响不同。砖红壤过氧化氢酶、酸性磷酸酶和脲酶等酶活性随模拟酸雨pH增大而上升[8]，棕壤磷酸酶、脲酶等酶活性却未受到土壤酸化的影响[26]。土壤中多酚氧化酶的活性与酚酸类化感物质的累积量变化趋势一致[27]，俞飞等[20]研究报道柳杉林地表层土壤中含有阿魏酸、肉桂酸和对羟基苯甲酸。本研究发现模拟酸雨使土壤多酚氧化酶活性极显著提高，模拟酸雨刺激柳杉幼苗根系分泌化感物质引起土壤酶活性变化也可能是产生酶活性差异的原因之一。本研究发现，模拟酸雨没有对土壤硝酸还原酶活性产生显著影响，其原因也可能与土壤中的化感物质有关[28]，但其具体机制还需进一步研究。
Hu等[29]和徐秋芳等[30]的研究表明：凋落物能够促进土壤脲酶、蔗糖酶和多酚氧化酶的活性；林晗等[31]研究发现，不同的凋落物配比能够使土壤过氧化氢酶活性下降，本研究结果与其相一致。张丽萍等[32]和陆耀东等[33]研究发现，凋落物促进了酸性磷酸酶和蛋白酶活性，本研究结果却与其相反，凋落物种类不同可能是产生差异的主要原因[13]。土壤酶来源于动物、植物和微生物及其分泌物，并且主要来源于微生物[34]，凋落物不同导致土壤微生物量、区系组成以及代谢过程不同，从而使土壤酶的数量和活性也不同[10]。研究表明，柳杉未分解凋落物、半分解凋落物中均含有酚酸类化感物质[20]，凋落物的化感作用会影响土壤微生物特性，改变幼苗根系的代谢活力，从而引起土壤酶活性的改变；同时化感物质也会直接对土壤酶活性产生影响。
研究发现，复合处理改变了模拟酸雨和凋落物对土壤酶活性的影响，尤其缓解了凋落物对土壤硝酸还原酶的促进作用、模拟酸雨和凋落物对土壤过氧化物酶、过氧化氢酶、蛋白酶活性短时间处理后和对酸性磷酸酶活性长时间处理后的抑制作用，增强了模拟酸雨和凋落物对土壤脲酶活性的促进作用。Wang等[6]研究发现，模拟酸雨处理凋落物和土壤混合物，使土壤过氧化氢酶活性提高、硝酸还原酶和酸性磷酸酶活性降低，这与本研究结果基本相同；但土壤多酚氧化酶、脲酶和蔗糖酶的变化却与本研究相反，其原因可能与凋落物对酸雨的缓冲作用[35]以及酸雨对凋落物的淋洗作用有关。凋落物覆盖在土壤表层，能够固持酸雨，延缓酸雨对土壤和幼苗根系的刺激过程，并使自身的pH值发生变化，改变物质释放模式和分解酶活性，加速凋落物中酶的溶解和渗出，直接补充土壤酶含量；同时由于凋落物的特殊性质使酸雨淋溶出的化感物质溶液浓度有所不同，从而引起凋落物化感作用强度的改变。
4. 小结
长时间酸雨淋溶会降低植物根际土壤蛋白酶、酸性磷酸酶和蔗糖酶等水解酶活性；凋落物分解会提高土壤硝酸还原酶活性，降低土壤过氧化氢酶、蛋白酶和酸性磷酸酶活性；酸雨与凋落物复合处理短时间内促进了土壤蛋白酶活性，长时间处理后则对其活性有极显著的抑制作用；抑制了土壤硝酸还原酶活性，缓解了酸雨和凋落物对土壤过氧化物酶、过氧化氢酶、多酚氧化酶、酸性磷酸酶和蔗糖酶等酶活性的显著抑制作用，同时也增强了对土壤脲酶活性的促进作用。表明酸雨和林地凋落物长时间并存，会降低土壤对含蛋白质有机物的转化能力，提高土壤对尿素的水解能力和减少硝态氮的损失；同时也可以缓解酸雨和凋落物对土壤磷素转化的抑制作用，提高土壤有机质转化和腐殖质合成能力。
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图 1 ‘甬优538’水稻冠层叶片SPAD值在不同的5个施氮水平下的动态变化趋势
Figure 1 Trend of dynamic change of SPAD value of canopy leaf of 'Yongyou 538' rice under different 5 nitrogen fertilizer levels
图 2 ‘秀水134’水稻品种冠层叶片SPAD值在不同的5个施氮水平下的动态变化趋势
Figure 2 Trend of dynamic change of SPAD value of canopy leaf of 'Xiushui 134' rice under different 5 nitrogen fertilizer levels
图 3 不同施氮量水平下‘甬优538’和‘秀水134’水稻冠层叶片SPAD值在的动态变化趋势
Figure 3 Trend of dynamic change of leaf SPAD values of 'Yongyou 538 'and 'Xiushui 134' under different 5 nitrogen fertilizer levels
图 4 不同施氮水平下水稻冠层叶片氮质量分数随移栽后天数的变化趋势
Figure 4 Variation trend of nitrogen concentration of rice leaf under different nitrogen levels with the days after transplantation
图 5 ‘甬优358’水稻INDSPAD14与冠层叶片氮质量分数的定量关系
Figure 5 Quantitative relationship between the N content of leaf and INDSPAD14 in'Yongyou 358'
图 6 ‘秀水134’水稻INDSPAD14与冠层叶片氮质量分数的定量关系
Figure 6 Quantitative relationship between the leaf N content of rice and INDSPAD14 in'Xiushui 134'
表 1 不同时期氮肥用量
Table 1. Nitrogen consumption at different stages
编号 氮肥/（kg·hm-2） 组成/（kg·hm-2） 基肥 蘖肥 穗肥 N0 0 0 0 0 N1 70.0 28.0 14.0 28.0 N2 140.0 56.0 28.0 56.0 N3 210.0 84.0 42.0 84.0 N4 280.0 112.0 56.0 112.0 
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