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磷是植物生长和发育的必需营养元素，通过多种途径参与植物的代谢过程，对植物的生长发育起到关键作用[1]。在植物生长发育过程中，植物体所需的养分、水分主要通过植物根部进行吸收和运输供应。根部作为直接接触土壤或基质的器官，在低磷逆境中最先受到胁迫[2]。为了适应低磷环境，植物根在进化过程中形成了多种调节磷的吸收以及平衡策略。例如，植物根系会分泌大量的酸性磷酸酶与有机酸，其通过根系，降低土壤的pH，使植物在低磷的土壤中能够活化、动员有机磷[3]，进而提高了有效磷质量分数，促进了植物对土壤中磷的吸收；并且，酸性磷酸酶还可以促进植物体内的磷脂化合物发生水解，并促进植物体内磷的循环，促进有机磷的重复利用[4]。
在正常情况下，植物体细胞内活性氧(ROS)的产生和清除处于一种相对稳定的平衡状态[5]，但在低磷胁迫时，ROS原有的状态被打破，其过量产生会使植物细胞发生膜脂过氧化，并且生成有害物质，破坏细胞膜的结构并影响其功能[6]。ROS的增加导致丙二醛(MDA)过量生产，MDA作为植物细胞膜脂过氧化的产物之一，其含量高低可以反映膜脂过氧化的水平以及细胞膜的损伤程度，可视为植物抗逆性的重要指标。为了消除活性氧对植物造成的伤害，植物自身进化出了一系列措施，包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)等主要的抗氧化酶等协同作用的抗氧化体系，从而维持了植物细胞膜的稳定性，提高了植物低磷胁迫下的生理抗性；同时，植物还会通过提高根系活力等共同参与调节，以应对低磷胁迫所带来的损伤[7]。
马尾松Pinus massoniana是重要的用材树种，主要分布在中国的亚热带和热带地区，占中国森林总面积的3.6%，是中国亚热带地区荒坡造林的主要先锋树种。马尾松适应能力强，具有耐干旱、耐瘠薄、速生丰产等特点，同时在保持水土、涵养水源、维持区域生态平衡等方面发挥巨大作用[8−9]。然而，在中国南方热带和亚热带地区的酸性土壤中，磷易与铁、铝等金属元素及土壤黏粒等通过吸附、固定等方式保持不溶形式，使土壤中有效磷转化为难溶性磷，最终加重土壤磷对植物的限制[10]，因此，中国南方黄红壤普遍存在pH低、有效磷缺乏等问题[11]。近年来，大气氮沉降逐渐加剧，土壤环境中的氮素有效性随之增加，造成原有低磷土壤中的有效磷水平相对更低，这不但扰乱了土壤的养分平衡，还使得植物对土壤有限磷素的吸收和利用受到影响[12−14]。
结合全国土壤调查和全国第2次土壤普查养分分级标准得知：土壤磷素在马尾松人工林中存在严重亏缺，马尾松林地土壤有效磷在0~20和20~40 cm土层中分别处于缺和极缺状态[15−16]。对全国马尾松林调查发现：大部分地区马尾松并未表现出缺磷症状并且生长依旧良好，这说明马尾松对低磷胁迫的适应有应对机制[17]。而马尾松幼苗对低磷胁迫研究所设置的磷质量分数多高于马尾松生长的实际磷质量分数，如谢钰容等[18]对不同种源的马尾松盆栽低磷胁迫的研究中设置0~100 mg·kg−1的有效磷添加；唐敏[19]对不同种源马尾松种子及幼苗的低磷胁迫响应中设置磷质量分数为0~20 mg·kg−1；徐向华等[17]对马尾松低磷胁迫下生理生化响应研究中设置磷质量分数为0~31 mg·kg−1。以上研究相较于大量样地调查(马尾松分布区14个省32个研究地点113个样地)和文献资料分析所得的磷质量分数(2.250 0 mg·kg−1)要高很多[16]。鉴于此，本研究选择易控制的马尾松幼苗为对象，通过研究幼苗根系生理变化和根抗氧化酶系统的响应，探究马尾松应对低磷胁迫的生理生化特征，以期为阐明其耐低磷的机制提供支持。
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研究地点位于湖北省宜昌市秭归县湖北长江三峡库区(秭归)森林生态系统国家定位观测研究站(30°53′N，110°54′E，海拔296 m)，该区属亚热带大陆性季风气候，年均气温为19.0 ℃。
2021年5月1日，选择苗高、地径长势基本一致的2年生马尾松幼苗(苗高为61.0 cm，地径为5.4 mm)移栽入直径16.5 cm，高17.0 cm的花盆中，按m(石英砂)∶m(蛭石)∶m(珍珠岩)=7∶2∶1的比例混合作为幼苗培养基质。移栽后的马尾松幼苗放入透明遮雨棚中，1个月内用Hoagland营养液培养，进行缓苗处理，1个月后对苗木进行不同磷处理。根据中国马尾松林土壤肥力特征调查所获得的马尾松林0~20 cm土层土壤有效磷质量分数的中位数(2.250 0 mg·kg−1)作为对照(ck)[16]，将磷酸二氢钾(KH2PO4)配制成不同浓度的溶液，用氯化钾(KCl)调整使钾离子(K+)浓度一致，用稀盐酸(HCl)调整氯离子(Cl−)浓度，使营养液pH为5.5，并保持其他营养元素浓度相同。每隔3 d，将40 mL营养液沿基质表层幼苗茎干浇下，共浇灌5次，营养液浇灌完成时间为6月15日。使马尾松幼苗盆栽基质中的有效磷质量分数分别为：0 (P0)、0.562 5 (P1)、1.125 0 (P2)、2.250 0 (ck)、4.500 0 (P3)、9.000 0 mg·kg−1 (P4)，每个处理15盆，进行相同光照和水分条件管理。
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在磷处理完成后，结合马尾松生长季节(3月下旬至10月上旬)[20]，分别于处理后1.5个月(8月1日)和3个月(9月16日)，从每个处理中随机选取3株马尾松整株幼苗，共计收获36株。采集时，将植株用剪刀从根茎交界处剪取地上部、地下部，取根系用清水冲洗干净并轻轻擦去表面水分，以备后续生理生化指标测定。
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采用北京索莱宝科技有限公司生产的试剂盒对酸性磷酸酶(ACP)活性、丙二醛(MDA)质量摩尔浓度、过氧化物酶(POD)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性进行测定。取根鲜样剪碎混匀，用万分之一天平称取0.100 0 g的样品，将样品放入研钵中，加入1 mL提取液在冰上研磨至匀浆，4 ℃下离心10 min，ACP离心转速为10 000 r·min−1，MDA、SOD、POD、CAT离心转速为8 500 r·min−1，取上清液处理后于酶标仪并计算，酶活性单位为16.67 nkat·g−1，MDA质量摩尔浓度单位为nmol·g−1。根系活力采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法测定[21]，有机酸采用酸碱滴定法测定[22]。
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数据采用Excel 2016和SPSS 26统计分析软件进行处理。运用双因素方差分析比较不同磷质量分数和不同采样时间及其交互作用对马尾松幼苗根系的ACP酶活性、有机酸质量摩尔浓度、根系活力、MDA质量摩尔浓度、SOD活性、POD活性、CAT活性的影响；用单因素(ANOVA)和多重比较(LSD, α=0.05)分析不同磷质量分数处理间生理生化指标的差异；用t检验比较2个采样时间生理生化指标的差异；用Pearson相关系数分析各生理生化指标间的相关性。所有处理在SPSS 26中进行，用Origin 2022软件作图。
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由图1A可知：不同磷质量分数处理下马尾松幼苗根ACP活性在不同采样时间差异极显著(P＜0.01)。2个采样时间的马尾松幼苗根ACP活性随磷质量分数的增加而降低。在8月，P1、P2、P3处理的ACP活性与ck相比均无显著差异；P0处理的ACP活性显著高于ck (P＜0.05)，是ck的1.45倍；P4处理的ACP活性显著低于ck (P＜0.05)，相较ck降低了60.92%。而随着胁迫处理时间的增加，9月P3和P4处理的ACP活性均显著低于ck (P＜0.05)，而P0、P1、P2处理与ck无显著差异。
图 1 不同磷质量分数下马尾松幼苗根ACP活性和有机酸质量摩尔浓度
Figure 1. ACP activity and organic acid content in root of P. massoniana seedlings in different phosphorus concentrations
由图1B可知：不同磷质量分数下马尾松幼苗根有机酸质量摩尔浓度存在显著差异(P＜0.05)，而不同采样时间差异不显著，且磷质量分数与采样时间对有机酸质量摩尔浓度无交互影响。其中，P2、P3处理的根有机酸质量摩尔浓度与ck差异不显著；P0、P1处理的有机酸质量摩尔浓度显著高于ck (P＜0.05)，分别是ck的1.25、1.14倍，P4处理的有机酸质量摩尔浓度显著低于ck (P＜0.05)，相比于ck降低了12.53%。整体而言，根系有机酸总量随着磷质量分数的增加呈下降趋势。说明在低磷条件下，马尾松幼苗根系可通过自身调节提高ACP活性，增加有机酸质量摩尔浓度以提高对磷的利用效率，从而适应低磷胁迫环境。
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由图2可见：不同磷质量分数处理间的马尾松幼苗根系活力在不同采样时间下存在极显著差异(P＜0.01)。其中：在8月，ck处理的马尾松幼苗根系活力与P2处理无显著差异；P0、P1、P3、P4处理的根系活力显著高于ck (P＜0.05)，分别是ck的1.82、1.35、1.49、1.34倍。而在9月，ck处理与P2、P3处理差异不显著；P0和P1处理的根系活力显著低于ck (P＜0.05)；仅P4处理根系活力显著高于ck (P＜0.05)，是ck的1.25倍。在9月，马尾松幼苗根系活力表现出随磷质量分数的升高而增强。综上所述，在低磷胁迫前期，根系活力虽然保持较高水平，但随着胁迫时间的增加，根系活力急剧下降。
图 2 不同质量分数下马尾松幼苗根系活力
Figure 2. Root vigor of P. massoniana seedlings in different phosphorus concentrations
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MDA是植物经受逆境情况下产生的，是一种广泛使用的损伤标志物，其质量摩尔浓度随胁迫程度发生变化[23]。从图3A可以看出：马尾松幼苗根MDA质量摩尔浓度在不同磷质量分数间和不同采样时间下存在极显著差异(P＜0.01)。ck处理的MDA质量摩尔浓度与P1、P2、P3处理无显著差异，马尾松幼苗根MDA质量摩尔浓度随着磷质量分数的降低呈不同程度的增加，尤其在P0处理下，MDA质量摩尔浓度显著高于ck (P＜0.05)，是ck的1.37倍，P4处理则显著低于ck (P＜0.05)，相比于ck降低了18.98%。同时，随着时间的推移，MDA质量摩尔浓度也明显增加，9月马尾松幼苗根MDA质量摩尔浓度显著高于8月(P＜0.05)，涨幅为21.34%。由此可见，缺磷导致MDA积累增加，植物损伤程度增强，且随着胁迫时间增加，MDA也不断积累。MDA积累是马尾松幼苗应答低磷环境的生理变化之一。
图 3 不同磷质量分数下马尾松幼苗根MDA质量摩尔浓度及SOD、CAT、POD活性差异
Figure 3. MDA content and the SOD、CAT and POD activity in root of P. massoniana seedlings in different phosphorus concentrations
不同磷质量分数处理下的马尾松幼苗根SOD、CAT和POD活性均存在极显著差异(图3，P＜0.01)，MDA质量摩尔浓度以及SOD、CAT、POD活性随着磷质量分数的增加而降低。P2、P3、P4处理的SOD、POD、CAT活性均与ck无显著差异，P0、P1处理的SOD、POD、CAT活性显著高于ck (P＜0.05)。其中：P0、P1处理的SOD活性分别是ck的1.67、1.47倍(图3B)；相较于ck处理，P0、P1处理的POD活性分别增加了66.11%和54.43%(图3C)；P0、P1处理的CAT活性分别是ck的1.47、1.26倍(图3D)。
同时，随着处理时间的增加，MDA质量摩尔浓度和POD活性显著增加了21.34%、26.15%(P＜0.05)。SOD、CAT活性在不同采样时间无差异，而POD活性在9月显著高于8月(P＜0.05)，是8月的1.26倍。上述结果说明马尾松幼苗可通过提高抗氧化酶的活性来应对低磷胁迫。
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由表1可知：马尾松幼苗根ACP活性与有机酸质量摩尔浓度相关系数为0.472，呈极显著正相关(P＜0.01)，即有机酸质量摩尔浓度的增加有利于ACP活性的提高；MDA质量摩尔浓度与SOD、POD、CAT活性相关系数分别为0.695、0.694、0.712，呈极显著正相关(P＜0.01)，即在低磷胁迫下膜脂过氧化产物MAD质量摩尔浓度增加，使细胞膜受到破坏，SOD、POD、CAT酶活性增强以适应低磷胁迫的损伤；根系活力与ACP活性呈显著正相关(P＜0.05)，与POD活性呈极显著正相关(P＜0.01)。
表 1 不同磷质量分数下马尾松幼苗根生理变化指标的Pearson相关性分析
Table 1. Pearson correlation analysis of the physiological indexes of P. massoniana seedlings under different phosphorus concentrations
指标 有机酸总量 根系活力 MDA SOD活性 POD活性 CAT活性 ACP活性 0.472** 0.392* 0.215 0.466** 0.287 0.415* 有机酸总量 1 −0.190 0.702** 0.658** 0.577** 0.640** 根系活力 1 −0.308 −0.095 −0.432** −0.162 MDA 1 0.695** 0.694** 0.712** SOD活性 1 0.670** 0.671** POD活性 1 0.672** 说明：*表示相关显著(P＜0.05)；**表示相关极显著(P＜0.01) -
在逆境中，植物的根部是最先受到环境胁迫影响的器官，而在植物对低磷环境的响应中，ACP与根的联系最紧密，可以促进根有机磷的重复利用[24]。如ZAHEER等[25]研究认为：植物的ACP活性可衡量植物生理的磷营养情况；程丽莉等[26]对落叶松Larix gmelinii幼苗的研究发现：低磷胁迫下，幼苗根组织内ACP活性增加。本研究也发现：在处理1.5个月后，马尾松幼苗根ACP活性随磷胁迫程度的增加而增强，说明幼苗为满足自身生长对磷元素的需要，通过提高根中ACP活性以增强体内磷的利用效率[27]。但是随着胁迫时间的推移，幼苗生长自身对磷元素的需求有所差异，使得各磷质量分数根ACP活性的差异在2个采样时间有所不同。此外，为维持植物体内有效磷水平，根需要保持旺盛的有机酸分泌活动。俞元春等[28]研究表明：缺磷胁迫下杉木Cunninghamia lanceolata和马尾松苗木根系有机酸分泌量显著增加。在本研究中，马尾松幼苗根有机酸分泌量随着磷质量分数的增加而下降，且有机酸质量摩尔浓度与ACP活性呈极显著正相关，这说明有机酸质量摩尔浓度的增加有利于ACP活性的增强。在磷胁迫下，马尾松幼苗通过提高根ACP活性和增加有机酸分泌量来提高磷的利用效率，进而适应低磷环境。
在逆境条件下，根系活力是表征植物抵御逆境胁迫能力高低的重要生理指标，会直接影响植物的生长状况。研究表明：低磷胁迫下根系活力会降低[29−30]。如崔博文[31]对7个种源马尾松幼苗研究发现：其中4个种源在轻度、中度低磷胁迫时，其根系活力较对照升高，而当低磷胁迫达到重度时，根系活力下降；另外3个种源根系活力随磷胁迫程度增加而降低。然而本研究中，第2次采样时根系活力随磷质量分数的降低而降低，这与上述研究结果一致，说明随磷胁迫程度的增加，根系活力显著下降。但是在处理仅为2个月，即第1次采样时，无磷处理根系活力显著高于ck与其他处理，这可能是在低磷胁迫初期，马尾松幼苗为满足自身生长对磷元素的需求，通过提高对基质中磷的吸收能力，促进根系生长，以此提高根系活力[32-35]。
活性氧的产生和清除在植物正常代谢中处于一个动态平衡的状态，而逆境会导致细胞内活性氧含量上升，并破坏植物膜系统[36]。活性氧的积累会引起膜脂过氧化，MDA作为植物细胞膜脂过氧化的产物之一，在一定程度上能够反映植物体的受害程度[37−38]。MDA的积累会刺激植物保护酶(SOD、POD、CAT)系统活性的提高，通过这些保护酶之间相互协调，加快清除MDA，保持稳定平衡的状态。如于姣妲等[39]对低磷胁迫下杉木的生理响应研究发现：杉木幼苗的根系和叶片会通过改变SOD、POD和CAT 3种保护酶活性来抑制MDA的形成，从而降低MDA对细胞膜系统的破坏。本研究也发现：不同磷质量分数处理下MDA质量摩尔浓度与SOD活性、POD活性和CAT活性均显著正相关，且随着磷质量分数的降低，MDA质量摩尔浓度与SOD活性、POD活性、CAT活性均呈上升趋势，这与乔光等[32]对不同种源马尾松幼苗低磷胁迫的生理响应结果一致。与此同时，随着处理时间的增加，第2次采样时间的根MDA质量摩尔浓度和POD活性均显著高于第1次采样，表明马尾松细胞膜受到的破坏随磷胁迫程度和时间的推移而加重，马尾松幼苗根受到磷胁迫的影响产生更多的自由基，膜脂过氧化程度加快，导致MDA质量摩尔浓度增加，但在受到低磷胁迫后，保护酶系统被激活，其活性增强以提高清除自由基的能力。由此可见，马尾松幼苗中存在着MDA质量摩尔浓度和保护酶活性的保持动态平衡的低磷生理应答机制。
本研究发现：不同磷质量分数下，马尾松幼苗根ACP活性与有机酸质量摩尔浓度随磷胁迫程度的增加而升高，以提高植物体对磷的活化、吸收与利用；在胁迫前期，根系活力在无磷处理下显著高于其他处理，但随着胁迫时间增加，根系活力随磷质量分数的降低而下降，尤其是无磷、低磷处理的根系活力急剧下降；根MDA质量摩尔浓度、SOD活性、POD活性、CAT活性，随磷质量分数的下降而升高，低磷环境下MDA质量摩尔浓度增高，SOD活性、POD活性、CAT活性也随之增强以修复MDA带来的损伤。可见，低磷胁迫下马尾松幼苗会通过调整生理、生化的变化机制来应对低磷环境。
Physiological and biochemical responses of seedling roots of Pinus massoniana to different phosphorus concentrations
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摘要:
目的 研究不同质量分数度下马尾松Pinus massoniana幼苗根系生理生化特征，以探究马尾松应对磷胁迫的生理生化机制，为低磷区域的马尾松人工林经营提供理论支持。 方法 以2年生马尾松幼苗为材料，采用石英砂盆栽的方法，基于全国马尾松林土壤有效磷质量分数(2.250 0 mg·kg−1)，设计0 (P0)、0.562 5 (P1)、1.125 0 (P2)、2.250 0 (ck)、4.500 0 (P3)、9.000 0 (P4) mg·kg−1共6个有效质量分数度，分析了2个采样时间[8月(处理1.5个月)与9月(处理3.0个月后)]马尾松幼苗根系活力及酸性磷酸酶(ACP)活性、有机酸质量摩尔浓度、丙二醛(MDA)质量摩尔浓度以及3种抗氧化保护酶活性[超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)]的差异。 结果 ①随着磷质量分数的增加，ACP活性与有机酸质量摩尔浓度均呈下降趋势。其中，P0处理的ACP活性在8和9月均显著高于ck (P＜0.05)，P4处理的ACP活性在8和9月均显著低于ck (P＜0.05)；在9月，P3处理的ACP活性也显著低于ck (P＜0.05)；在2个采样时间段，P0和P1处理的有机酸质量摩尔浓度显著高于ck (P＜0.05)，P4处理的有机酸质量摩尔浓度显著低于ck (P＜0.05)。②8月ck的根系活力显著低于P0、P1、P3、P4处理(P＜0.05)，而9月根系活力随磷质量分数的增加而增加。③MDA随着磷质量分数的降低而增加，P0处理显著高于ck (P＜0.05)，P4处理则显著低于ck (P＜0.05)。仅P0和P1处理的3种抗氧化保护酶活性处理显著高于ck (P＜0.05)。 结论 低磷胁迫会使马尾松幼苗根系MAD增加并影响其根系活力，但是马尾松幼苗通过增加根ACP活性与有机酸质量摩尔浓度以及抗氧化系统酶活性来应对低磷胁迫的影响。图3表1参39 Abstract:Objective This study, with an investigation of the physiological and biochemical responses of roots in Pinus massoniana seedlings to different phosphorus (P) concentrations, is aimed to explore the physiological and biochemical mechanisms of P. massoniana in response to low P stress, so as to provide theoretical support for the managements of P. massoniana plantations in low phosphorus area. Method First, two-year-old seedlings of P. massoniana planted in potted with quartz sand were treated with six available P concentrations, including 0 (P0)、0.562 5 (P1)、1.125 0 (P2)、2.250 0 (ck)、4.500 0 (P3)、9.000 0 (P4) mg·kg−1 before a control check (ck, 2.250 0 mg·kg−1) with the effective phosphorus content of the national P. massoniana forest soil survey. Then, the physiological and biochemical characteristics of roots, including activities of acid phosphatase (ACP), total organic acid content (TOC), root vigor, malondialdehyde (MDA) and activities of three antioxidant protective enzymes including superoxide dismutase (SOD), peroxidase (POD) and catalase (CAT), were determined and analyzed in both 1.5 and 3.0 months after treatments. Result (1) Both ACP activity and organic acid content decreased with the increase of phosphorus concentration with the ACP activity of P0 in August and September being significantly higher than that of ck (P＜0.05), and the ACP activity of P4 being significantly lower than ck both in August and September (P＜0.05) whereas in September, the ACP activity of P3 was also significantly lower than that of ck (P＜0.05) with the organic acid content in P0 and P1, and organic acid content in P4 being significantly lower than in ck (P＜0.05) in two sampling times. (2) In August, the root vigor in ck was significantly lower than in P0, P1, P3 and P4 (P＜0.05), and in September, the root vigor increased with the increase of phosphorus concentration. (3) The root MDA content increased with the decrease of phosphorus concentration with the MDA content in P0 being significantly higher than that in ck (P＜0.05), and the MDA content in P4 being significantly lower than that in ck (P＜0.05). The antioxidant enzyme activities showed a tendency of increasing as phosphorus concentration decreased whereas SOD, POD and CAT were significantly higher in P0 and P1 than that in ck (P＜0.05) though their activities showed no significant variation among ck, P2, P3 and P4 treatments. Conclusion In response to low P stress, P. massoniana seedlings had their MAD, ACP, TOC and antioxidant system enzyme activities increased in roots with the root vigor regulated. [Ch, 3 fig. 1 tab. 39 ref.] -
Key words:
- Pinus massoniana seedlings /
- phosphorus /
- root vigor /
- antioxidant protective enzymes
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植物在生长发育过程中会通过不断调整基因的表达来适应各种逆境，而转录因子(TFs)是其调控过程的关键因子[1]。研究表明：锌指同源结构域(ZF-HD)转录因子作为一种同源异形盒(HB)蛋白在调控植物生长发育以及响应多种生物和非生物胁迫方面发挥着重要作用[2-3]。ZF-HD不仅具有同源结构域(HD)，还包括1个高度保守的锌指结构域(ZF)[4]，ZF是由2对保守的半胱氨酸(Cys)和/或组氨酸(His)残基结合单个锌离子组成的指环状结构蛋白，可特异性与DNA/RNA序列结合，并参与蛋白质互作[2, 5]；HD是1个约60个氨基酸的DNA结合域(DBD)，这段序列折叠成一个识别螺旋附着在DNA的大沟上，特异性地结合DNA来激活或抑制靶基因的表达[6]。为了方便研究该家族的进化史，HU等[7]将ZF-HD重新命名为ZHD。
ZHD蛋白可分ZHD和小锌指(MIF)两类，两者都含有ZF结构域，但MIF缺少HD结构域[8]。2001年ZHD首次在黄花菊Flaveria trinervia中被鉴定出来[9]，随后拟南芥Arabidopsis thaliana[10]、水稻Oryza sativa[11]、葡萄Vitis vinifera[8]、大白菜Brassica rapa ssp. pekinensis[2]、番茄Solanum lycopersicum[3]、茶树Camellia sinensis[5]和黄瓜Cucumis sativus[12]等的ZHD被陆续发现。研究表明：ZHD能够调控植物的抗逆性，如过表达AtZHD1可以提高拟南芥的耐旱性[13]；OsZHD1基因过表达导致水稻叶片卷曲下垂，降低水稻的耐旱性[14]；在大豆Glycine max中，过表达GmZF-HD1和GmZF-HD2会与编码钙调蛋白的GmGaM4基因启动子结合增强大豆的抗病能力[15]；TaZFHD1参与小麦Triticum aestivum生长发育过程中茉莉酸(JA)、脱落酸(ABA)和乙烯(ET)信号转导过程，调节小麦对胁迫的抗性[16]；大白菜中的BraZF-HD受光、低温等非生物胁迫诱导表达[2]；此外，水稻ZHDs与OsDREB1B基因的启动子结合调节水稻对低温、干旱和机械损伤的抗性[17]。ZHD广泛存在于植物中，在植物对环境胁迫响应过程中起着重要的作用。
毛果杨Populus trichocarpa是研究木本植物生长发育、材质材性以及抗逆性状的重要模式植物，但是目前毛果杨ZHD (PtrZHD)家族及非生物胁迫响应特性的研究尚无报道。本研究通过生物信息学手段鉴定了毛果杨全基因组内的PtrZHDs基因，并对其编码蛋白特征、系统发育、基因扩张、基因结构与保守基序、启动子顺式作用元件和表达特性进行分析，为研究该家族基因的功能提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 材料
将来自中国科学院分子植物科学卓越创新中心的野生型毛果杨‘Nisqually-1’通过组织培养扩繁后，选取长势一致的4周龄组培苗随机分成6组，用质量分数为8%的聚乙二醇(PEG 6000，来自邢台鑫蓝星科技有限公司)水溶液处理0、3、12、24、48和72 h，分别采集各处理组植株的根、茎和叶部组织，经液氮速冻后保存于−80 ℃冰箱，每组处理重复3次。
1.2 PtrZHD家族成员鉴定及理化性质分析
利用拟南芥ZHD家族成员的氨基酸序列比对Phytozome (
https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html )网站中毛果杨基因组数据库获得候选序列，将得到的序列上传到Pfam (http://pfam.xfam.org/ )和SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/ )数据库，去除不含ZF-HD_dimer (PF04770)结构域的序列得到全部的PtrZHDs[12]。从Phytozome数据库中获取PtrZHD家族基因的染色体位置、基因序列以及开放阅读框长度等信息，并根据基因所在染色体号及位置对其进行命名。在ExPasy (https://web.expasy.org/protparam/ )网站预测PtrZHD家族分子质量、等电点和氨基酸序列长度。1.3 PtrZHD家族系统发育分析
将鉴定出的毛果杨ZHD氨基酸序列与已知的拟南芥[10]、水稻[11]和大白菜[2]的ZHD氨基酸序列在MEGA X软件的ClustaW程序中进行多重序列比对，采用邻近法(NJ)构建系统进化树，步长设为10000次，得到系统发育进化树数据[18]，经EvolView(
https://www.evolgenius.info/ evolview/ )网站可视化。1.4 PtrZHD家族同源基因的同义替换率(Ks)和非同义替换率(Ka)分析
将PtrZHD家族基因的蛋白质编码序列(CDs)在美国国家生物信息中心(NCBI)网站(
https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi )进行BLAST比对，以超过300 bp且同源性超过80%为标准鉴定同源基因对[19]，同源关系经TBtools[20]软件可视化。利用TBtools计算同源基因的Ks、Ka以及Ka/Ks[20-21]。1.5 PtrZHD家族结构及保守型基序分析
从毛果杨数据库(
https://genome.jgi.doe.gov/portal/pages/dynamicOrganismDownload.jsf?organism= Ptrichocarpa )获得PtrZHD外显子和内含子长度及位置信息，并通过TBtools软件可视化。使用MEME (https://meme-suite.org/meme/tools/meme )网站对PtrZHD家族进行保守基序分析，保守域数目设置为15，结果由TBtools软件可视化。1.6 PtrZHD家族启动子区顺式作用元件分析
利用TBtools软件从毛果杨基因组数据中提取PtrZHD家族起始密码子前2 000 bp的序列作为启动子区域，上传至PlantCARE(
http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html )网站进行顺式作用元件分析[22]，获得的数据通过TBtools软件可视化。1.7 PtrZHD家族表达特性分析
1.7.1 组织表达特异性
将野生型毛果杨通过组织培养扩繁后，挑选长势一致的4周龄组培苗，分别采集根、茎和叶组织，提取RNA后反转录成cDNA，用于实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析。每组处理重复3次，采用2−∆∆CT法计算相对表达量，并通过TBtools软件可视化。
1.7.2 干旱胁迫下的响应特性
将长势一致的1月龄组培苗随机分成6组。用质量分数为8%的PEG 6000处理0、6、12、24、48和72 h。分别采集各处理组植株的根、茎和叶组织，提取RNA后反转录成cDNA进行qRT-PCR分析。每组处理重复3次，采用
$2^{-\Delta\Delta{\rm{C}}_{\rm{t}}} $ 法计算相对表达量，并通过TBtools软件可视化。1.7.3 RNA提取、反转录及qRT-PCR分析
利用植物总RNA试剂盒(TSP412，北京擎科生物科技有限公司)提取总RNA，然后采用PrimeScriptTMRT reagent Kit [Perfect Real Time，宝生物工程(大连)有限公司 ] 试剂盒反转录RNA，获得cDNA后进行qRT-PCR分析。将PtrZHD家族蛋白质编码区序列上传至上海生工定量引物设计网站(
https://www.sangon.com/new PrimerDesign )设计定量引物，以PtrActin为内参基因[19]。在赛默飞ABI 7500荧光定量PCR仪上进行试验，体系如下：2×TransStart TOP/Tip Green qPCR Super mix 10 μL、定量引物上下游混合引物(10 μmol·L−1) 0.4 μL、cDNA 1.5 μL，Passive Reference DyeⅡ(50×) 0.4 μL，加去离子水补充至20 μL体系。反应程序：94 ℃预变性30 s；94 ℃变性5 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸35 s，40次循环。2. 结果与分析
2.1 PtrZHD家族成员的鉴定及编码蛋白的基本特征
将所有含ZF-HD_dimer (PF04770)结构域的序列上传到Pfam和SMART数据库，去除冗余序列后从毛果杨基因组中鉴定出21个PtrZHD (表1)，根据基因所在染色体及染色体上的位置信息，将它们分别命名为PtrZHD1~PtrZHD21。PtrZHD家族基因编码蛋白的基本特征分析表明：各PtrZHD所编码蛋白的长度为73~339个、分子量为8.28~37.98 kDa、等电点为6.39~9.31、编码序列长度为222~1 020 bp，蛋白长度、分子量、等电点和编码序列长度差异明显。表明PtrZHD家族基因及其编码蛋白特征存在较大差异，即该家族各个成员的生物学功能发生了分化。
表 1 毛果杨ZHD家族基因概况Table 1 Overview of ZHD gene family in P. trichocarpa登录号 基因名 基因位置 蛋白长度/个 分子量/kDa 等电点 编码序列长度/bp Potri.002G035200.1 PtrZHD1 Chr02: 2259632..2261632 293 32.84 8.22 882 Potri.002G102900.1 PtrZHD2 Chr02: 7442579..7444098 262 27.92 7.28 789 Potri.003G000400.1 PtrZHD3 Chr03: 70322..71164 253 28.01 7.71 762 Potri.003G146700.1 PtrZHD4 Chr03: 16229434..16229655 73 8.28 7.73 222 Potri.004G11.300.1 PtrZHD5 Chr04: 12287585..12289662 334 36.77 8.70 1005 Potri.004G126600.1 PtrZHD6 Chr04: 12337842..12338677 130 14.17 6.81 393 Potri.004G135100.1 PtrZHD7 Chr04: 15528323..15529129 268 29.44 8.83 807 Potri.004G229600.1 PtrZHD8 Chr04: 23480758..23482600 271 30.06 8.39 816 Potri.005G11.300.1 PtrZHD9 Chr05: 9522291..9525287 339 37.98 9.19 1020 Potri.005G158800.1 PtrZHD10 Chr05: 16017482..16019310 257 27.73 6.43 774 Potri.005G227900.1 PtrZHD11 Chr05: 23746838..23749246 290 32.32 8.88 873 Potri.007G024100.1 PtrZHD12 Chr07: 1814109..1816426 331 36.75 9.31 996 Potri.008G086000.1 PtrZHD13 Chr08: 5402319..5403293 324 35.57 8.83 975 Potri.010G169400.1 PtrZHD14 Chr10: 17139193..17140688 332 36.41 9.21 999 Potri.012G040900.1 PtrZHD15 Chr12: 3680805..3681724 182 20.66 6.39 549 Potri.013G108900.1 PtrZHD16 Chr13: 12226035..12227366 281 31.74 7.71 846 Potri.015G032700.1 PtrZHD17 Chr15: 2637644..2638216 190 21.44 6.17 573 Potri.017G082700.1 PtrZHD18 Chr17: 9830334..9831749 161 17.36 5.93 486 Potri.017G082900.1 PtrZHD19 Chr17: 9903467..9905775 337 37.23 8.23 1014 Potri.019G021400.1 PtrZHD20 Chr19: 2418959..2419646 132 14.83 8.83 399 Potri.019G081300.1 PtrZHD21 Chr19: 11464924..11465688 184 20.87 9.91 555 表 2 同源基因的Ka/Ks及同源性Table 2 Ka/Ks values and homologous status of homologous genes同源基因 非同义替换率(Ka) 同义替换率(Ks) Ka/Ks 同源片段长度/bp 同源性 基因1 基因2 PtrZHD1 PtrZHD11 0.06 0.32 0.19 787 0.90 PtrZHD2 PtrZHD10 0.04 0.19 0.21 711 0.92 PtrZHD3 PtrZHD8 0.08 0.36 0.22 682 0.86 PtrZHD5 PtrZHD19 0.08 0.35 0.23 779 0.88 PtrZHD6 PtrZHD18 0.07 0.18 0.39 357 0.91 PtrZHD9 PtrZHD12 0.08 0.29 0.28 875 0.85 PtrZHD13 PtrZHD14 0.09 0.36 0.25 838 0.85 PtrZHD15 PtrZHD17 0.05 0.27 0.19 496 0.90 2.2 PtrZHD家族的进化
利用双子叶植物(拟南芥、毛果杨和大白菜)与单子叶植物(水稻)的ZHD蛋白序列构建系统进化树(图1)，PtrZHD家族分为2个种类(ZHD和MIF)，这2个种类可以分成7个亚族(Ⅰ~Ⅶ)[5, 8, 12]，PtrZHD不同亚族中即包括单子叶植物又包括双子叶植物，表明该基因家族的分化早于单双子叶植物的分化。
图 1 毛果杨、拟南芥、水稻和大白菜ZHD家族系统进化树Figure 1 Phylogenetic tree of ZHD protein family in P. trichocarpa, A. thaliana , O. sativa and B. rapa ssp. pekinensis2.3 PtrZHD家族的扩张
PtrZHD家族成员在毛果杨染色体上的分布(图2)显示：21个PtrZHD不均匀地分布在毛果杨12条染色体上；4、5号染色体上分别分布4和3个ZHD，2、3、17和19号染色体上各分布2个ZHD，7、8、10、12、13和15号染色体上只分布1个ZHD，1、6、9、11、14、16和18号染色体上无ZHD分布。PtrZHD家族编码序列Blast结果表明：PtrZHD1和PtrZHD11、PtrZHD2和PtrZHD10、PtrZHD3和PtrZHD8、PtrZHD5和PtrZHD19、PtrZHD6和PtrZHD18、PtrZHD9和PtrZHD12、PtrZHD13和PtrZHD14以及PtrZHD15和PtrZHD17有共线性关系(图2和表2)，同源片段长度大于300 bp且同源性超过80%，是进化过程中由于全基因组复制和串联复制而形成的同源基因[3, 22]，表明PtrZHD可能通过全基因组复制和串联复制进行家族扩张。8对同源基因的Ka/Ks均小于1(表2)，说明PtrZHD家族在进化过程中经历了纯化选择，留存的基因较为保守[3]。
图 2 PtrZHD家族基因染色体定位及同源性分析Figure 2 Chromosome localization and homology analysis of PtrZHD gene2.4 PtrZHD家族基因结构及其编码蛋白保守基序
PtrZHD家族21个成员中有11个成员含有内含子(图3B)，这与之前报道的其他物种ZHD家族中有内含子的成员数量较少的研究结果稍有不同[5, 12]。PtrZHD蛋白具有2个保守性较高的基序：同源结构域序列(Motif 1)和锌指结构域序列(Motif 2)(图3C)。Motif 2与DNA的特异性结合有关；Motif 1与蛋白二聚体的形成有关[7]。所有的PtrZHD蛋白都具有Motif 1，而且除了PtrZHD4和亚族Ⅴ(MIF)的成员之外，其他家族成员都含Motif 2，说明该家族成员在进化过程中比较保守。
图 3 PtrZHD家族基因结构和蛋白保守基序分析Figure 3 Analysis of gene structure and protein conserved motif of PtrZHD gene2.5 PtrZHD家族启动子区顺式作用元件
PtrZHD家族启动子区顺式作用元件可分为2个大类(图4)：第一大类为植物激素响应元件，共有5种，分别为生长素响应元件(AuxRR-core、TGA-element)，水杨酸响应元件(TCA-element)，茉莉酸甲酯响应元件(CGTC-motif、TGACG-motif)，脱落酸响应元件(ABRE)和赤霉素响应元件(P-box、GARE-motif)；第二大类为非生物胁迫响应元件，共有4种，分别为厌氧诱导元件(ARE)、干旱诱导性结合位点(MBS)、抗病和胁迫诱导元件(TC-rich repeats)和低温响应元件(LTR)。PtrZHD家族各基因启动子区存在不同类型的作用元件，但处于同一亚族的各基因含有相似的作用元件(图4)，亚族Ⅰ主要包含茉莉酸甲酯响应元件、脱落酸响应元件、赤霉素响应元件和厌氧诱导元件；亚族Ⅱ主要包含水杨酸响应元件和茉莉酸甲酯响应元件；亚族Ⅲ主要包含厌氧诱导元件、MYB干旱诱导性结合位点以及抗病和胁迫诱导元件；亚族Ⅳ主要包含生长素响应元件，水杨酸响应元件，茉莉酸甲酯响应元件，脱落酸响应元件和厌氧诱导元件；亚族Ⅴ主要包含水杨酸响应元件、赤霉素响应元件、厌氧诱导元件和MYB干旱诱导性结合位点；亚族Ⅵ主要包含茉莉酸甲酯响应元件、厌氧诱导元件、MYB干旱诱导性结合位点和低温响应元件；亚族Ⅶ主要包含水杨酸响应元件、茉莉酸甲酯响应元件和厌氧诱导元件。以上结果说明：PtrZHD家族可能对植物激素和逆境胁迫有响应能力，虽然不同基因之间响应元件种类存在差异，但是同一亚族基因启动子区顺式作用元件种类基本相同。
图 4 PtrZHD家族基因启动子区顺式作用元件分析Figure 4 Analysis of cis-acting elements in promoter region of PtrZHD gene2.6 PtrZHD家族组织表达与干旱胁迫响应特征
为了了解ZHD在毛果杨生长发育和环境响应中的潜在功能，利用qRT-PCR对毛果杨ZHD家族成员在根、茎和叶组织中的表达模式进行分析。结果(图5)表明：毛果杨21个PtrZHDs中有1、7和13个分别在根、茎和叶部组织偏好表达。亚族Ⅰ和Ⅲ的成员主要在叶中高表达；亚族Ⅱ和Ⅳ的成员全都在叶中高表达；亚族Ⅴ成员主要在茎中高表达；亚族Ⅵ成员主要在茎和叶中高表达；亚族Ⅶ成员在茎中高表达。毛果杨ZHD家族成员在根、茎和叶中有不同的表达特性，但同一亚族各成员偏好表达部位基本相同，说明ZHD在毛果杨根、茎和叶部组织中的生物学功能产生了分化，但同一亚族各成员功能相似。
图 5 PtrZHDs组织表达特异性分析Figure 5 Analysis of tissue expression specificity of PtrZHDs gene从图6可知：在根中，随着干旱胁迫时间的增加，部分PtrZHD的表达量显著上调，达到峰值后逐渐降低，PtrZHD3、PtrZHD8、PtrZHD9、PtrZHD10、PtrZHD11、PtrZHD5、PtrZHD13和PtrZHD14在干旱胁迫下表达量呈持续上升趋势，PtrZHD1、PtrZHD6在干旱胁迫下表达量下降；在茎中，大部分PtrZHD在干旱胁迫后显著上调表达，达到峰值后逐渐降低，而PtrZHD2、PtrZHD3、PtrZHD5、PtrZHD6和PtrZHD7在干旱胁迫下表达量呈持续上升趋势；在叶中，大部分PtrZHD在干旱胁迫后表达量同样呈先升后降的趋势，PtrZHD5、PtrZHD7和PtrZHD20在干旱胁迫下表达量持续下降，而PtrZHD1和PtrZHD18在干旱胁迫下表达量呈持续上升趋势。从响应速度来看，根中大部分PtrZHD基因响应干旱胁迫的快速上升期发生在6、12或72 h，而在茎和叶中的快速上升期发生在6或12 h。表明毛果杨ZHD家族各成员响应干旱胁迫且在胁迫中发挥不同的作用。
图 6 不同组织中PtrZHDs在干旱胁迫下的表达谱分析Figure 6 Expression profile analysis of PtrZHDs gene in different tissues under drought stress3. 讨论
ZHD是植物特有的转录因子，在植物生长发育和逆境胁迫响应中起着重要作用[6, 15]。本研究从全基因水平鉴定出21个PtrZHDs家族成员，进化分析表明(图1)：21个PtrZHDs可以分为2个不同的种类(ZHD和MIF)、7个亚族(Ⅰ~Ⅶ)，这与葡萄[8]、茶树[5]和黄瓜[12]中的分类基本一致。
PtrZHD家族有76%的成员涉及全基因组复制和串联复制现象，说明该基因家族扩张的主要方式是全基因组复制和串联复制[22-23]，基因复制可以提供丰富的遗传物质有助于毛果杨适应外界环境。PtrZHD家族同源基因的Ka/Ks均小于1，表明纯化作用在该基因家族进化过程中存在一定的选择压力[3]，说明PtrZHD家族基因具有较强的保守性。同时，PtrZHD家族基因编码蛋白保守基序分析发现：21个PtrZHD蛋白具有2个保守性较高的基序Motif 1和Motif 2，进一步说明PtrZHD家族在进化过程中较为保守。
启动子分析发现：虽然PtrZHD家族启动子区顺式作用元件的种类不同，但处于同一亚族基因启动子区顺式作用元件类型基本相同，同时，同一亚族基因编码蛋白的保守基序也基本相同，表明PtrZHD家族不同亚族的生物学功能产生了分化，但同一亚族各基因的生物学功能基本相同；PtrZHD家族成员在毛果杨根、茎和叶部组织中具有偏好性表达特征，但同一亚族基因的偏好表达部位基本相同。
毛果杨中具有内含子的ZHD占比(52%)多于拟南芥(0%)[2]、水稻(33%)[24]、玉米Zea mays(13%)[24]、黄瓜(38%)[14]、苦荞麦Fagopyrum tataricum (20%)[25]、大白菜(3%)[2]和番茄(4%)[3]等草本植物，内含子增多可以加大转录本的多样性，提高生物的抗逆能力[26]。因此，毛果杨ZHD的内含子比草本植物多的原因可能是毛果杨生命周期长、生存空间大，需要应对更为复杂的环境挑战，所以进化出了更多含有内含子的基因以保证其正常生长发育。
ZHD能够调控植物的生长发育和对干旱胁迫的抗性，如过表达AtZHD1可以提高拟南芥的耐旱性[13]，OsZHD1基因过表达导致水稻叶片卷曲下垂，降低水稻的耐旱性[14]；毛果杨亚族Ⅱ中的PtrZHD2、PtrZHD10与AtZHD1、OsZHD1聚类在一起，且同时在叶部组织中高表达，表明PtrZHD2和PtrZHD10可能通过调控毛果杨叶片的生长发育来响应干旱胁迫的。生物在遭受胁迫时，基因的相关顺势作用元件会影响其自身的转录以响应胁迫[27]，PtrZHD家族基因启动子区含有MYB干旱诱导性结合位点，而且PtrZHD家族基因在干旱胁迫下的表达量会随着胁迫时间的增加而发生变化，进一步说明在毛果杨干旱胁迫的响应中，PtrZHD家族基因发挥着重要的调控作用。
4. 结论
本研究在全基因组水平上鉴定出21个PtrZHDs，通过系统发育将其分为7个亚族；同源性及Ka、Ks分析表明：PtrZHD通过全基因组复制和串联复制进行家族扩张且在进化过程中经历了纯化选择；启动子顺式作用元件分析表明：PtrZHD家族基因能够响应干旱胁迫信号；基因结构和基序分析表明：PtrZHD家族基因功能发生了分化但同一亚族基因生物学功能基本相同；组织表达特异性和干旱胁迫下的表达模式表明：毛果杨ZHD在不同组织中行使特定的生物学功能且能够响应干旱胁迫。
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图 1 不同磷质量分数下马尾松幼苗根ACP活性和有机酸质量摩尔浓度
Figure 1 ACP activity and organic acid content in root of P. massoniana seedlings in different phosphorus concentrations
图 2 不同质量分数下马尾松幼苗根系活力
Figure 2 Root vigor of P. massoniana seedlings in different phosphorus concentrations
图 3 不同磷质量分数下马尾松幼苗根MDA质量摩尔浓度及SOD、CAT、POD活性差异
Figure 3 MDA content and the SOD、CAT and POD activity in root of P. massoniana seedlings in different phosphorus concentrations
表 1 不同磷质量分数下马尾松幼苗根生理变化指标的Pearson相关性分析
Table 1. Pearson correlation analysis of the physiological indexes of P. massoniana seedlings under different phosphorus concentrations
指标 有机酸总量 根系活力 MDA SOD活性 POD活性 CAT活性 ACP活性 0.472** 0.392* 0.215 0.466** 0.287 0.415* 有机酸总量 1 −0.190 0.702** 0.658** 0.577** 0.640** 根系活力 1 −0.308 −0.095 −0.432** −0.162 MDA 1 0.695** 0.694** 0.712** SOD活性 1 0.670** 0.671** POD活性 1 0.672** 说明：*表示相关显著(P＜0.05)；**表示相关极显著(P＜0.01) 
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