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近年来，全球气候变暖，降雨量减少以及不适当的灌溉，导致干旱以及半干旱地区土壤盐渍化愈加严重，土壤盐渍化成为全球农业生产中面临的重大难题[1-2]。目前，中国可耕地面积中约1/5的盐渍化土地，总面积高达0.98亿hm2[2]。中国是世界人口大国，人均耕地面积不足0.1 hm2，如何利用盐渍化的土地，促进粮食产量的增加是艰巨的课题[3]，因此，研究植物的耐盐性和生理机制，筛选及培育耐盐作物品种成为农业研究领域的热点之一。
在长期的进化过程中，植物进化出多种应对盐胁迫的防御机制，其中报道较多的主要有4种：①渗透调节平衡机制。分为有机渗透调节和无机渗透调节。无机渗透调节是植物细胞通过吸收钠离子(Na+)和钾离子(K+)等无机离子作为渗透调节剂，将Na+在细胞内区隔化，从而使根和地上部积累较多的Na+，但不会出现明显的毒害症状[4-6]。有机渗透调节则是指植物通过自身合成并积累一些可溶性无毒的有机小分子物质，如糖类、氨基酸类和甜菜碱等来维持细胞渗透平衡[7-8]。如盐胁迫下，苹果Malus pumila通过积累可溶性有机溶质和无机盐离子来降低胞内渗透势[9-10]，番茄Lycopersicon esculentum叶片中可溶性糖含量升高[11]。②离子的区域化与pH调节机制。植物细胞利用跨膜运输将Na+和K+等无机离子转运至液泡中，使之与细胞质隔绝，降低渗透势，避免细胞器遭受毒害[12]。同时，植物自身可以分泌有机酸从而调节根细胞中的pH稳态，缓解盐胁迫对根系的毒害[13]。③抗氧化防御系统机制。在高盐胁迫下，植物细胞质膜因受到水分胁迫或者离子胁迫而受损，从而导致脂质过氧化，使细胞内积累大量的活性氧，当积累的活性氧超过了细胞自身的清除能力就会对细胞造成损伤[8, 14-15]。在长期的进化过程中，植物自身会产生活性氧清除系统，包括一些抗氧化酶类等抗氧化物质，如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)等，它们是衡量植物抗逆性的重要指标[6,16-17]。④内源激素和信号转导途径。研究发现植物内源激素在盐胁迫反应中起着重要作用，如脱落酸(ABA)、乙烯(ET)、茉莉酸(JA)等[18-20]。同时，蛋白激酶途径、ABA途径(ABA依赖型、ABA不依赖型)、盐超敏感(SOS)途径等[21-24]信号转导途径也参与了植物对盐胁迫的响应，并在其中发挥重要作用。
植物激素信号调控网络是植物应对各种非生物胁迫所必须的[25]。茉莉酸(jasmonic acid，JA)作为重要的植物逆境激素在调控植物耐盐性方面发挥着重要的作用。耐盐水稻Oryza sativa品种内源茉莉酸含量高于盐敏感品种，外源茉莉酸甲酯处理能够提高水稻幼苗耐盐性和大豆Glycine max幼苗对盐胁迫的抗性[26-27]。盐胁迫下，水稻JA信号调控基因OsJAZ9与OsbHLH062互作介导离子稳态或通过增强抗氧化能力，从而增加对盐胁迫的耐受性[28-29]；内源茉莉酸通过维持番茄体内活性氧稳态来提高番茄的耐盐性[30]。但是，目前关于JA信号如何调控植物的耐盐性仍鲜有报道。茉莉酰氨基酸结合物合成酶(jasmonoyl amino acid conjugate synthase，JAR1)催化JA形成JA-Ile，AtJAR1基因发生突变后可导致JA信号传递中断。因此，本研究运用CRISPR/Cas9基因编辑技术创建拟南芥Arabidopsis thaliana AtJAR1基因突变体，并考察突变体对盐和ABA胁迫下的种子萌发和根系生长影响，以及盐胁迫下突变体对K+的吸收转运和AtHAK5表达量的影响，从而解析JA信号通路在植物耐盐性中的可能生理机制。
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CRISPR/Cas9靶序列的设计和载体的构建参照WANG等[31]和朱丽颖等[32]的方法。以拟南芥茉莉酰氨基酸结合物合成酶AtJAR1为靶基因，选取鸟嘌呤和胞嘧啶含量高、特异性较强的2个关键片段作为靶序列，获得双靶点CRISPR/Cas9基因编辑载体。以哥伦比亚野生型拟南芥为材料，使用农杆菌Agrobacterium tumefaciens侵染法进行拟南芥遗传转化[33-34]。
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CRISPR/Cas9编辑载体具有mCherry荧光蛋白报告基因，因此，本研究参考朱丽颖等[32]的方法，挑选T1代转基因阳性种子，提取转基因阳性植株的基因组DNA，在目标基因靶序列2端设计引物进行PCR扩增(约200 bp)，利用质量浓度8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE，丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的质量比为29∶1)对PCR产物进行检测[32]。
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取播种后21 d的植株整个地上部，称其鲜质量。每个株系设置5个生物学重复，用单因素方差分析对株系间的差异显著性进行分析。
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1 mL 体积分数为75%乙醇溶液清洗3 min，弃乙醇加入1 mL 体积分数为35%的漂白水和体积分数为0.05% 吐温20混合溶液，轻轻摇晃混匀5 min，弃混合溶液；最后加入1 mL灭菌超纯水，清洗5次，置于4 ℃避光春化2 d。
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在1/2 MS植物培养基上添加不同浓度NaCl，分别配成0、75、100、125 mmol·L−1 NaCl的1/2 MS植物培养基。将ABA溶于体积分数为70%的乙醇中，配置成25 mmol·L−1的母液，参考STASWICK等[35]的浓度。用体积分数为70%的乙醇进行稀释，分别配成含0、0.25、0.50、1.00、5.00、10.00、20.00 μmol·L−1ABA的1/2 MS植物培养基。
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将消毒后的种子均匀点在添加有不同浓度NaCl(0、75、100、125 mmol·L−1)和ABA (0、1、5、10、20 μmol·L−1)的1/2 MS植物培养基上，置于22 ℃、14 h光照/10 h黑暗的温室中培养。隔24 h统计1次萌发率，连续6 d，以拟南芥胚根穿透种皮时即认定萌发。每个浓度重复3次。萌发率=试验时间(d)的萌发种子总数/供试种子总数×100%。
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将消毒春化后的种子单粒点于1/2 MS植物竖直培养基上，于22 ℃、16 h光照/8 h黑暗的条件下竖直培养5 d后，移栽在添加不同浓度NaCl(0、50、100 mmol·L−1)和ABA(0、0.25、0.50、1.00 μmol·L−1)的1/2 MS植物竖直培养基上，继续培养7 d，以根长来评估它们的生长状况。
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将1/2 MS植物培养基上生长7 d幼苗，移栽至装有1/5 Hoagland培养液的蓝色花盆中(配方见表1)，培养14 d后对每个株系分别进行盐处理和对照处理。盐处理更换外源添加50 mmol·L−1NaCl的培养液，在处理0和24 h时，分别取每个株系的根部样品用于基因实时表达量的检测。处理2 d后，将每个株系的地上部和根部用去离子水润洗后分别转入做好标记的信封中，放入恒温60 ℃烘箱连续烘6 h以上进行杀青。
表 1 1/5 Hoagland水培培养液配方
Table 1. 1/5 Hoagland formula for hydroponic culture solution
组成 母液浓度/
(mol·L−1)母液添加体
积/(mL·L−1)水培液中浓
度/(mmol·L−1)组成 母液浓度/
(mol·L−1)母液添加体
积/(mL·L−1)水培液中浓
度/(mmol·L−1)KNO3 1.0 1.25 1.25 KH2PO4 0.5 1.00 0.50 Ca(NO3)·4H2O 1.0 1.00 1.00 Fe盐① 1.00 MgSO4·7H2O 0.4 1.00 0.40 微量元素② 0.10 说明：①1 000倍铁盐母液的配置：称取5.56 g七水合硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)放入100 mL烧杯中，边加水边搅拌；将7.50 g 二水合乙 二胺四乙酸二钠(EDTA·2Na·2H2O)放入1 L烧杯中加水煮沸，缓慢加入FeSO4溶液，于微波炉中煮沸2 min；避光放入60 ℃烘 箱烘2 h以上；室温静置，冷却后定容至1 L，即为浓度为20 mmol·L−1的母液。使用时稀释1000倍。②10 000倍微量元素母液的 配置：称取H3BO3 6.18 g；MnCl2·4H2O 0.99 g；CuSO4·5H2O 1.25 g；ZnSO4·7H2O 1.44 g；H2MoO4 0.08 g；NaCl 0.20 g溶解 于水中，冷却后定容至1 L。使用时稀释10 000倍 -
将待测样品研磨后，称取50 mg左右样品用称量纸送至洁净干燥的消解管底部，每个样本设置3次生物学重复，依次加入7 mL浓硝酸、1 mL 质量分数为30%的过氧化氢水溶液，室温放置2 h，最后放入微波消解仪消解。利用石墨赶酸仪于190 ℃下蒸发反应液至2 mL左右。冷却后将反应液倒入离心管内，用超纯水将反应液定容至15 mL。
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使用钾和钠的氯化物分别配制标准曲线。离子的质量浓度梯度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.2、1.6、2.0 mg·L−1。利用原子吸收光谱法测定K+和Na+的质量摩尔浓度。
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具体的计算公式如下：C = [(Cn –C′) × 0.015/(M×10−3)]/m。其中：C为1 g干物质样本中该离子的物质的量(μmol·g−1)；Cn为各样品消解液中该离子的质量浓度(mg·L−1)；C′为空白对照消解液中该离子的质量浓度(mg·L−1)；M为待测元素的相对分子量(g·mol−1)。m为样品的干物质质量(g)。
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采用Trizol法提取拟南芥根中总RNA，之后进行基因组DNA的去除、反转录，以反转录后的cDNA为模板进行实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测基因的相对表达量。从拟南芥信息资源库中查找以编码拟南芥肌动蛋白基因Actin2为内参基因，根据已知的AtVSP1、AtVSP2和AtHAK5基因(Gene ID: AT5G24780、AT5G24770和AT4G13420)序列，设计qRT-PCR引物(表2)。采取
$2^{-\Delta \Delta C _{{t}}} $ 法计算待测基因的相对表达量。表 2 相关引物序列
Table 2. Sequence of related primers
基因 上游引物(5′→3′) 下游引物(5′→3′) AtActin2 GTCGTACAACCGGTATTGTGCT TGTCTCTTACAATTTCCCGCTCT AtVSP1 TGGATCTTTGACCTAGACGACA GAGTTCCAAGAGGTTTTCGTA AtVSP2 TGACCTAGATGATACCCTCCTCTC CAATCCCGAGCTCTATGATGTT AtHAK5 TCTGCATCACTGGGACGGAG CAGTATAACGGATCAGGGATTGA -
在早期的基因功能研究中，常采用反向遗传学手段，构建基因突变体。因技术水平的限制，前人构建突变体的方法多为化学诱变法。然而，这种方式构建的突变体多只在目标基因发生点突变，使氨基酸残基发生变化，基因功能未必完全丧失。例如，有研究发现：使用甲基磺酸乙酯(EMS)诱变创建的ATS1基因突变体存在严重的基因渗透现象[36]。因此，本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建AtJAR1功能完全丧失型突变体。经多代筛选鉴定，从转基因后代中获得了2个纯合突变体，分别将其命名为jar1-3-5和jar1-6-2。对其靶位点附近序列进行测序分析，结果表明：jar1-3-5和jar1-6-2突变体在第2个靶位点，即第3个外显子处，分别发生了16和11 bp缺失的突变(图1)，导致编码序列(CDS)发生了相应变化，氨基酸序列发生移码突变。在转录后翻译过程中，jar1-3-5的第111位氨基酸残基由丝氨酸突变为异亮氨酸(I)，并在继续错误翻译12个氨基酸(SGTSQGRPKFIP-KAVQSLFLSLMN)后，引入终止密码子UAA，提前终止翻译；jar1-6-2的第113位氨基酸残基由甘氨酸突变为精氨酸，并在继续错误翻译8个氨基酸(TSQGRPKF-PSKVYSFH)后，引入终止密码子UGA，提前终止翻译。因此，构建的突变体可判断为功能完全丧失型突变体。
图 1 jar1-3-5和jar1-6-2突变序列信息
Figure 1. Sequence information of jar1-3-5 and jar1-6-2 mutants
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将筛选的突变体(jar1-3-5和jar1-6-2)和野生型种子进行播种，在生长前期观察并比较两者的表型差异。结果显示：前21 d时，突变体植株可以正常生长，甚至其地上部明显大于野生型。进一步对生长21 d的植株地上部生物量进行统计分析发现：突变体极显著(P＜0.001)高于野生型(图2A)。之后，野生型和突变体之间的生长差异逐渐减小，并且在生长32 d时突变体植株叶片开始出现萎蔫的现象。
图 2 AtJAR1基因突变体与野生型的表型差异
Figure 2. Phenotypic differences between AtJAR1 gene mutants and wild type
此外，AtJAR1可以催化JA形成JA-Ile，激活JA信号途径，AtJAR1基因突变会影响植物体内茉莉酸信号强度。因此，对茉莉酸信号标记基因AtVSP1和AtVSP2进行表达量分析显示：AtJAR1突变后，AtVSP1和AtVSP2基因在根中的表达量极显著(P＜0.0001)减少，其中AtVSP1表达量下降了60%左右(图2B)，AtVSP2表达量下降了80%左右(图2C)。表明获得的这2个突变体中茉莉酸信号强度明显减弱。
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种子萌发是植株个体发育的重要阶段。已有研究表明：盐胁迫能够抑制植物种子萌发，同时，JA作为重要的植物逆境激素在调控植物耐盐性方面发挥着重要的作用[37-38]。然而JA信号通路在盐胁迫下的种子萌发过程中发挥着何种作用尚不明确，因此，对盐胁迫下野生型和突变体的种子萌发率(图3)进行统计分析可知：在不含NaCl的条件下，第1天突变体种子的萌发率极显著(P＜0.01)高于野生型，第2天时各株系基本全部萌发，没有显著差别。在不同浓度NaCl处理时，虽然突变体和野生型最终都能达到或者接近于正常生长条件下的最大萌发率，但是达到最大萌发率的时间都随着NaCl处理浓度的增加而有所推迟，且突变体均早于野生型；在处理的前3 d中突变体的萌发率虽随着NaCl处理浓度的增加有所下降，但均高于野生型，并且随着NaCl处理浓度的增加，这种差别逐渐显著。表明AtJAR1突变加速了种子的萌发，降低了拟南芥在幼苗建成时对盐的敏感性。
图 3 不同盐浓度下拟南芥种子的发芽率
Figure 3. Germination rate of A. thaliana seeds under different salt concentrations
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幼苗建成是植株个体发育的另一个重要阶段。一直以来盐胁迫对幼苗的影响也是进行抗逆研究的重要方向之一，因此，本研究比较了在盐胁迫条件下野生型和突变体幼苗根的生长情况(图4)。将在正常培养基上生长5日龄的幼苗转移至含有不同浓度NaCl的竖直培养基上继续培养7 d后，发现在未用NaCl条件下，突变体的主根长与野生型相比无显著差异。随着NaCl浓度的增加，两者的主根长度都随之下降，但是，突变体的主根长度逐渐大于野生型，在100 mmol·L−1 NaCl处理时，突变体的主根长显著(P＜0.05)大于野生型，表明AtJAR1突变降低了拟南芥根对盐的敏感性。
图 4 盐胁迫对jar1突变体主根长的影响
Figure 4. Effect of salt stress on the main root length of jar1 mutant
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ABA作为重要的植物激素，常与其他激素一起协同调控植物对逆境胁迫的应答响应，但是，目前并不明确JA信号途径与ABA交互作用共同调控植物抗逆性的机制。本研究对jar1突变体在ABA胁迫下的种子萌发率进行了统计(图5)。结果表明：随着ABA浓度的增加，野生型和突变体种子的萌发时间都相应推迟，萌发率随之下降，但是突变体的萌发时间均要早于野生型，萌发率也均显著(P＜0.05)高于野生型，表明AtJAR1突变缓解了ABA对种子萌发的抑制作用。
图 5 不同ABA浓度下拟南芥种子的萌发率
Figure 5. Germination rate of A. thaliana seeds under different ABA concentrations
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ABA胁迫下野生型和突变体幼苗根的生长情况见图6。将正常培养基上的5日龄幼苗转移到含有不同浓度ABA的竖直培养基上继续培养7 d后发现：在未用ABA处理时突变体的主根长与野生型相比无显著差异，但是，当用各浓度ABA处理时，突变体的主根长均极显著(P＜0.01)大于野生型，表明AtJAR1突变降低了拟南芥根对ABA的敏感性。
图 6 ABA对jar1突变体主根长对的影响
Figure 6. Effect of ABA on the main root length of jar1 mutant
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盐胁迫下Na+不断的积累，导致细胞K+质量摩尔浓度降低。为避免高盐条件下植物细胞中离子紊乱，维持K+稳定吸收，植物细胞胞浆中的代谢酶必须保持低Na+、高K+的浓度水平[39]，因此，细胞中K+/Na+是盐胁迫下保证植物正常生长的关键。本研究利用原子吸收光谱法测定了正常和盐胁迫条件下突变体和野生型根中的Na+、K+质量摩尔浓度(图7)，发现在正常生长条件下，突变体根中的Na+、K+质量摩尔浓度较野生型都有所下降，特别是jar1-6-2下降显著，但是K+/Na+并没有发生显著变化。当用50 mmol·L−1NaCl处理后，突变体根中的K+质量摩尔浓度较未处理时提高约40%，且显著(P＜0.05)高于相同浓度NaCl处理下的野生型。NaCl处理后野生型和突变体根中的Na+质量摩尔浓度都急剧上升，但两者并没有显著差别。相应地，盐处理后野生型和突变体的K+/Na+都急剧下降，并且突变体比野生型高11%以上。表明AtJAR1突变，可能增加了盐胁迫下植物对K+的吸收和转运，影响了植物体内的钾钠平衡，从而增强了拟南芥的耐盐性。
图 7 野生型和AtJAR1基因突变体根K+和Na+变化
Figure 7. Determination of element contents in wild-type and mutants of AtJAR1 gene
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在植物获得K+与维持K+/Na+稳定的过程中钾转运蛋白发挥着重要作用，而KT/HAK/KUP转运体是植物中最重要的K+转运体家族之一，其中的HAK转运体可能在维持盐胁迫下的钾钠稳态过程中发挥重要的作用[39-42]。目前，拟南芥中，AtHAK5是研究最为广泛和深入的高亲和性K+吸收系统成员[43]，因此，本研究通过对盐胁迫下jar1突变体中AtHAK5的表达量进行分析，探究JA信号通路在植物耐盐性中的调节机制。图8显示：在正常条件下野生型和突变体根中的AtHAK5表达量无显著差异；而50 mmol·L−1NaCl处理24 h后，野生型AtHAK5表达量无显著变化，而突变体中AtHAK5表达量上升3倍左右，极显著(P＜0.01)高于野生型。表明盐胁迫下，AtJAR1突变影响了植物体内K+的吸收和转运。
图 8 盐胁迫下野生型和突变体中AtHAK5基因的相对表达量
Figure 8. Relative expression of AtHAK5 gene in wild-type and mutants under salt stress
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JA是植物生长发育和防御过程中的关键信号分子，JA合成后经AtJAR1催化形成JA-Ile，JA-Ile介导F-box蛋白与COI1-JAZ蛋白相互作用，释放MYC2和其他转录因子(TFs)从而诱导早期JA应答基因的表达。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑系统创制的2个jar1突变体，其JA信号标记基因AtVSP1和AtVSP2的表达量极显著下降，说明AtJAR1基因功能丧失，从而影响了JA信号传导通路。同时，创制的这2个jar1突变体植株还表现出前21 d地上部生物量极显著大于野生型，之后这种差异逐渐减小并出现叶片萎蔫的表型，这在早期的研究中并未提及[34]。此外，研究发现：通过基因编辑手段使AtJAR1基因突变可以缓解ABA对种子萌发的抑制作用，而这与早期的研究结果正好相反[34]。出现这些表型的差异极有可能是由于早期研究中的突变体jar1-1是通过EMS诱变的方法获得，其目的蛋白仅第101位的丝氨酸(Ser)残基突变为苯丙氨酸(Phe)[44]。在这种突变体中，AtJAR1基因功能可能未完全丧失，而本研究通过基因编辑手段构建的突变体发生了大片段基因序列的缺失，从而引起氨基酸序列发生移码突变以及翻译提前终止等情况，是基因功能完全丧失型突变体。因此，获得的这2个jar1突变体将有助于彻底研究AtJAR1基因的功能。同时，本研究也为利用CRISPR/Cas9基因编辑技术创制基因功能完全丧失型突变体，从而为进一步研究基因功能提供借鉴和参考。
植物对盐胁迫的耐受性与植物激素有着密切关联。JA作为一种植物内源激素，一方面能够参与根系的生长与再生、下胚轴的生长、种子萌发、气孔的开闭等多种生长发育过程，另一方面可以激活植物的防御机制，以应对盐害、低温、干旱和病虫害等逆境胁迫造成的伤害[45]。其中，在茉莉酸调控植物应对逆境胁迫的过程中，首先被位于细胞表面的受体所识别，合成JA-Ile，而JA-Ile又能与E3泛素连接酶SCFCOI1和26S蛋白酶体相互作用，加快JAZ蛋白降解，从而缓解了与JAZ相互作用的转录因子的抑制作用。而这些转录因子又参与调控各种胁迫耐受性的生理输出响应[46-47]。所以，本研究运用基因编辑手段使AtJAR1基因功能丧失，JA-Ile的合成受阻，对盐胁迫耐受性的生理输出响应受到影响，表现为盐胁迫对种子萌发和根系生长的抑制作用有所缓解。此外，许多研究表明：在植物响应盐胁迫的过程中，JA和ABA存在交互作用，而与JAZ蛋白相互作用的转录因子MYC2是JA和ABA交互作用的关键点[38]。ABE等[48]和LORENZO等[49]研究指出：MYC2过表达和突变体植株分别表现出对ABA敏感性的增加和降低。ABE等[48]和IWASAKI等[50]则指出：MYC2可以促进盐胁迫和ABA胁迫响应基因RD22的表达。因此，本研究中jar1突变体表现出对ABA敏感性的下降可能是由于MYC2激活受阻所导致的。
在盐胁迫下，Na+会争夺植物钾通道上K+结合位点，促进K+的外排，降低K+的吸收利用，植物表现出对高盐胁迫的敏感现象[51]。本研究中，jar1突变体根系在盐胁迫下K+质量摩尔浓度显著增加，K+/Na+较野生型有所提高，这可能就是突变体对盐胁迫的敏感性下降的原因之一。在植物获得K+与维持K+/Na+稳定的过程中钾转运蛋白发挥着重要作用，T-DNA插入突变体研究发现：拟南芥中AtHAK5是HAK家族中主要的K+转运体之一[52]。在盐胁迫下jar1突变体中的AtHAK5表达量极显著增加，表明AtJAR1突变可以促进AtHAK5的表达，从而增加植株根系对K+的吸收，提高K+/Na+。此外，AtHAK5还被证实参与植物对盐胁迫及ABA的响应[51]，说明突变体中AtHAK5表达的变化可能是通过JA信号转导途径与ABA的交互作用实现的。
综上所述，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术创建AtJAR1基因功能完全丧失型突变体不仅有助于完善对AtJAR1基因功能的认识，同时为进一步研究植物激素与植物盐胁迫提供研究材料和研究基础。此外，JA信号通路可能通过MYC2与ABA交互作用，影响下游HAK5的表达，从而改变植物根系对钾的吸收，使K+/Na+发生变化，最终影响植物对盐胁迫的耐受性。
Functional analysis of AtJAR1 gene in salt tolerance of Arabidopsis thaliana
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摘要:
目的 茉莉酰氨基酸结合物合成酶(jasmonoyl amino acid conjugate synthase，JAR1)可以催化茉莉酸(jasmonic acid，JA)形成茉莉酸的活性形式茉莉酸异亮氨基酸复合体(jasmonic acid-isoleucine，JA-Ile)，从而激活JA信号途径。JA信号途径在介导植物盐胁迫的响应中发挥重要作用，因此，探究AtJAR1在植物耐盐性中的功能对于研究JA信号途径影响植物耐盐性的机制具有重要作用。 方法 运用CRISPR/Cas9基因编辑技术，创建了2个不同的拟南芥Arabidopsis thaliana AtJAR1基因突变体，并对这2个突变体进行地上部生物量的统计分析和JA信号标记基因的表达分析，以确定AtJAR1基因功能缺失。之后，观察分析不同浓度氯化钠和脱落酸(ABA)处理对jar1突变体的种子萌发和幼苗建成的影响，明确AtJAR1基因对拟南芥耐盐性的影响。最后，通过比较分析盐处理前后野生型和突变体的钾离子(K+)和钠离子(Na+)质量摩尔浓度，以及高亲和力K+转运蛋白基因AtHAK5的表达变化情况，初步探究AtJAR1基因在拟南芥耐盐性中的功能。 结果 JA信号标记基因AtVSP1和AtVSP2的表达量大幅下调，表明AtJAR1基因功能丧失。与点突变产生的jar1-1突变体不同的是，这2个突变体表现为前3周生长加快，之后逐渐减缓并出现叶片萎蔫的表型。同时，AtJAR1突变可以缓解盐胁迫和ABA对种子萌发和根系生长产生的抑制作用。此外，盐胁迫下AtJAR1突变可以促进AtHAK5的表达和根系对K+的吸收转运。 结论 JA信号途径可能通过与ABA交互作用影响AtHAK5的表达量，以调节植物根系对K+的吸收转运，进而改变细胞内K+/Na+平衡，最终影响植物耐盐性。图8表2参52 -
关键词:
- 拟南芥 /
- CRISPR/Cas9 /
- 茉莉酰氨基酸结合物合成酶 /
- 耐盐性 /
- K+/Na+平衡
Abstract:Objective Jasmonal amino acid conjugate synthase (JAR1) can catalyze jasmonic acid (JA) to form jasmonic acid-soleucine (JA-Ile), an active form of jasmonic acid, and activate the JA signal pathway. JA signaling pathway plays an important role in mediating the response of plants to salt stress. This study aims to explore the function of AtJAR1 in plant salt tolerance, which plays an important role in studying the mechanism of JA signal pathway affecting plant salt tolerance. Method CRISPR/cas9 gene editing technology was used to create two different Arabidopsis thaliana AtJAR1 gene mutants. The aboveground biomass of the two mutants and the expression of JA signal marker gene were analyzed to determine the loss of AtJAR1 gene function. Then, the effects of different concentrations of NaCl and ABA treatment on seed germination and seedling establishment of jar1 mutants were observed and analyzed to clarify the effect of AtJAR1 gene on salt tolerance of A. thaliana. Finally, the role of AtJAR1 gene in salt tolerance of A. thaliana was investigated by comparing the content of potassium and sodium ions in wild type and mutants before and after salt treatment, as well as the expression of AtHAK5, a high affinity potassium ion transporter gene. Result The expression of JA signal marker genes AtVSP1 and AtVSP2 decreased significantly, indicating the loss of AtJAR1 gene function. Different from the jar1-1 mutant produced by point mutation, the growth of the two mutants accelerated in the first three weeks, then gradually slowed down and the leaves wilted. At the same time, AtJAR1 mutation can alleviate the inhibition of salt stress and ABA on seed germination and root growth. In addition, AtJAR1 mutation can promote the expression of AtHAK5 and the absorption and transport of potassium ions in roots under salt stress. Conclusion JA signaling pathway may affect the expression of AtHAK5 through interaction with ABA, so as to regulate the absorption and transport of K+ by plant roots, change the intracellular K+/Na+ balance, and finally affect plant salt tolerance. [Ch, 8 fig. 2 tab. 52 ref.] -
烟草Nicotiana tabacum是中国重要的经济作物之一。中国烟草种植面积高达100万hm2，烟叶产量达450~500万t·a-1，其中烟秆产量约为150万t·a-1[1]，由于管理比较粗犷，烟叶收获后大量烟秆被堆砌焚烧，不仅造成农林秸秆资源的巨大浪费，且焚烧产生的烟气对大气环境造成了严重影响。另一方面，有研究发现，中国部分烟草种植区土壤受到了不同程度的重金属污染，如贵阳和安顺镉的单项污染指数分别为1.581和1.103[2]，当烟叶中含有过量重金属时，抽吸过程中，重金属会以气溶胶或金属氧化物的形式通过主流烟气进入人体，造成潜在危害[3]；此外，连作会使重茬种植后的烟草生长迟缓、植株矮小、产量品质降低、土传病虫害加重等现象[4-5]，严重影响当地烟农的经济收益。因此，寻找一种既能解决烟秆有效利用，同时又能降低土壤重金属生物有效性，并能提高重金属污染烟田经济价值的方法尤为重要。生物质炭是富含碳的生物质在缺氧或者无氧的条件下通过高温裂解或者不完全燃烧，生成的一种含碳量大、孔隙结构复杂的固体物质[6-7]。近年来，有研究表明：生物质炭可以提高土壤肥力[8]，降低二氧化碳排放量[9]；其含有的高比表面积、孔隙结构、碱性阳离子和官能团，对重金属有良好的修复作用[10]；还可以改善土壤团聚体、降低土壤容重[11]，促进土壤微生物活性[12]，提高土壤酶活性[13]。因此，生物质炭化资源化利用不仅是低端农林废物如烟秆高值化利用的新技术途径，也是土壤学、环境科学、生态学等专业领域研究的一个重大热点。本研究利用贵州省毕节地区烟叶收获后的废弃烟秆制备成的烟秆炭改良重金属污染土壤，进行烟草种植试验，主要考察①烟秆炭对重金属污染土壤理化性质的影响；②烟秆炭对重金属污染土壤金属有效性的影响；③烟秆炭对烟叶生产及重金属质量分数的影响。希望通过本试验研究，为烟秆废弃物的炭化资源化再生使用及重金属污染土壤的修复利用提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
供试土壤采自浙江富阳朱家坞一块重金属复合污染水稻田。该采样点受到周边铜冶炼小作坊废水直排和大气沉降污染，因长期施用石灰，呈弱碱性。采样时取0~20 cm的表层土，带回实验室后剔除植物根系等杂物，风干后混匀、磨碎、过2 mm尼龙筛备用。实验用生物质炭是以贵州毕节地区烟叶收获后的废弃烟秆为原料在600 ℃下热裂解1 h制成，炭化后的产物过2 mm筛储备待用。土壤样品碱解氮、有效磷、有机质分别为132.67，13.31，63 600 mg·kg-1，pH值为pH 7.68，铜、铅、镉分别为296.66，5.91，291.39 mg·kg-1。烟秆炭的总氮、炭、氢、硫分别为20.1，597.5，32.6，3.6 g·kg-1，pH 10.51，铜、镉、铅分别为38.16，1.33，6.93 mg·kg-1，比表面积为368.92 m2·g-1，孔隙度为0.30 cm2·g-1，孔径大小为3.71 nm-1。
1.2 试验设计
盆栽试验在浙江农林大学温室大棚进行。用土4.0 kg·盆-1，烟秆炭用量按0(对照TB0), 20, 40, 80 g·kg-1[m(炭): m(土)]计算施入(分别以TB20，TB40，TB80计)，重复4次·处理-1。随机区组排列，并且隔15 d调换1次以保证每盆烟草苗生长受外界环境条件的影响基本一致。基肥选择硝酸铵、过磷酸钙和硫酸钾，用量分别为0.30, 0.80和0.30 g·盆-1，将基肥与土壤、烟秆炭充分混匀后装入塑料桶中(高32 cm，直径21 cm)。烟草种植采用直播方式，于2016年3月27日播种，苗高至10 cm时间苗，留长势一致的烟苗1株·盆-1。试验期间每天为每盆植物补充蒸馏水，使土壤含水量保持在田间最大持水量的65%左右。盆栽试验于8月6日结束。
1.3 样品采集
植物样的采集：先采收烟叶，然后将植株连根拔起，带回实验室区分根系和地上部，充分漂洗干净，待水珠自然风干后称量各部位鲜质量，然后装入牛皮纸袋105 ℃杀青30 min，60 ℃烘干至恒量，用植物粉碎机(CS-700，中国)粉碎后过0.125 mm筛，装入塑料封口袋中保存待测。
土壤样的采集：用环刀(长40 cm，直径1 cm)按梅花采样法采集盆栽土壤，采样约500 g·盆-1，充分混匀后带回实验室阴干，用行星式球磨机(QM-3SP04-1，中国)磨碎后过0.125 mm筛，转入塑料封口袋中保存待测。
1.4 样品分析
土壤pH值采用酸度计(FE20，中国)测定[m(土): m(水)= 1.0: 2.5]；有效磷测定采用Olsen法，经过0.5 mol·L-1碳酸氢钠(NaHCO3)浸提[m(土): m(水)=1: 20]，比色法测定；有机碳采用低温外热重铬酸钾氧化-比色法[14]。
土壤重金属有效态提取采用二乙三胺五乙酸(DTPA)浸提法[m(土): m(水)=1: 20)，重金属质量分数用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES，Prodigy 7，美国)测定[15]。烟叶中重金属质量分数采用硝酸(HNO3)消解，ICP-OES测定[15]。测定过程分别采用土壤(GBW07447)和植物标准物质(GBW10012)进行质量控制。
土壤脲酶的测定采用苯酚钠-次氯酸钠比色法；碱性磷酸酶采用磷酸苯二钠比色法，缓冲液选柠檬酸缓冲液(pH 7.0)；脱氢酶采用TTC分光光度法。为衡量土壤酶综合活性值，对土壤氧化还原酶活性求取集合平均数，计算公式为：$ {G_{{\rm{Mea}}}} = \sqrt[3]{{脲酶活性 \times 脱氢酶活性 \times 碱性磷酸酶活性}} $[16]。
烟秆炭碳、氮、氢和硫质量分数用元素自动分析仪(Vario EL Ⅲ，德国)测定。炭比表面积由比表面积及孔隙度分析仪(SI-MP-10，美国)测定。烟秆炭官能团由傅里叶变换近红外光谱仪(FT-IR，IR Prestige 21，日本)测定。
1.5 数据分析
应用SPSS 17.0进行数据统计分析，采用单因素方差分析和Duncan's多重比较评价不同处理对土壤pH值、有效磷、碱解氮质量分数和有效态重金属质量分数等指标影响的显著性。采用Person法分析重金属有效性与土壤理化性质之间的相关性。应用Origin 8.5和Excel软件作图。
2. 结果与分析
2.1 烟秆炭的基本性状
烟秆炭主要成分是碳(≈60%)，含有少量的氮、氢、硫，pH 10.51，呈碱性，比供试土壤高2.83个单位。烟秆炭比表面积(BET)高达368.92 m2·g-1，与稻草炭(500 ℃裂解30 min，比表面积为29.97 m2·g-1)[17]和死猪炭(800 ℃裂解1 h，比表面积为29.15 m2·g-1)[18]相比有较高的比表面积，能为金属离子提供更多的吸附点位。由图 1可知：生物质炭表面含有丰富的芳香族和脂肪族官能团[19]，这些含氧官能团决定了生物质炭具有亲水、疏水性，并增强其对酸碱的缓冲能力，也是土壤pH升高的关键因素。
2.2 不同烟秆炭施用量对土壤pH值及养分质量分数的影响
表 1显示：施用烟秆炭可以显著提高土壤pH值，且随着炭施加量的增加，土壤pH值显著提高。其中处理TB80效果最为显著，与对照相比土壤pH显著提高了0.38个单位。土壤有机质的变化趋势与pH值一致(表 1)，但土壤溶解性有机碳质量分数只有在烟秆炭施加量增加到80 g·kg-1时，才呈现显著性提高(23.4%)。
表 1 不同处理下土壤pH值和养分质量分数Table 1. Soil pH and nutrient contents under different treatments处理 pH值 ω有机质/(g·kg-1) ω水溶性碳/(mg·kg-1) ω有效磷/(mg·kg-1) ω碱解氮/(g·kg-1) TB0 7.76 ± 0.06 d 29.73 ± 2.74 d 222.76 ± 16.58 b 19.71 ± 3.38 c 0.10 ± 0.003 bc TB20 7.85 ± 0.03 c 39.38 ± 2.46 c 228.51 ± 22.21 b 27.10 ± 7.66 c 0.11 ± 0.006 c TB40 7.97 ± 0.04 b 47.43 ± 7.11 b 231.26 ± 24.88 b 42.80 ± 6.76 b 0.12 ± 0.005 ab TB80 8.14 ± 0.05 a 60.08 ± 4.97 a 274.96 ± 15.49 a 67.50 ± 8.74 a 0.12 ± 0.008 a 说明：TB0为对照，英文小写字母代表同列不同处理间的显著性差异水平(P＜0.05) 另外，施用一定数量的烟秆炭也能显著增加土壤碱解氮和有效磷质量分数(表 1)。与对照相比，施加20 g·kg-1烟秆炭对土壤碱解氮和有效磷质量分数提高不明显；当施加量增加到40 g·kg-1时，土壤有效磷质量分数显著提高，当增加到80 g·kg-1时，土壤有效磷比40 g·kg-1时又增加了约60.0%；但只有将烟秆炭施加量提高到80 g·kg-1时，与对照相比土壤碱解氮质量分数才显著增加(20.0%)。
2.3 不同烟秆炭施用量对土壤重金属有效态质量分数的影响
土壤重金属有效态主要指植物有效态，它与重金属形态关系密切[20]。中国现行土壤重金属有效态的提取采用二乙三胺五乙酸(DTPA)浸提法[NY/T 890-2004]。从图 2可见：施加烟秆炭能显著降低土壤中铜、镉和铅的有效态质量分数，但不同施用量对3种重金属的钝化效果表现不同。以土壤施加40 g·kg-1的烟秆炭为分界点，施用20 g·kg-1烟秆炭就能显著降低土壤有效态铜、铅和镉质量分数，与对照相比分别下降了16.6%，18.7%和19.6%；增加炭的施用量至40 g·kg-1，土壤中有效态镉质量分数并没有持续降低，而铜和铅又显著降低了20.5%和13.2%；再提高烟秆炭的施用量至80 g·kg-1，并不能继续降低土壤DTPA可提取态铜和铅的质量分数，但是镉质量分数却显著降低了26.7%。
图 2 不同处理下DTPA有效态土壤重金属Figure 2. Concentrations of the DTPA extractable heavy metals in soils under different treatments2.4 不同烟秆炭施用量对土壤酶活性的影响
土壤酶参与碳、氮、磷、硫等各类物质的循环，是土壤新陈代谢的重要物质。土壤酶活性是反映土壤肥力和质量的重要指标。从表 2可知：土壤中施加烟秆炭会显著降低脱氢酶的活性，而一定数量的烟秆炭能显著提高土壤脲酶和磷酸酶活性。
表 2 不同烟秆炭使用量对土壤酶活性的影响Table 2. Effects of tobacco stalk biochar on soil enzymes activities under different application rates处理 脲酶/(mg·g-1·h-1) 碱性磷酸酶/(mg·g-1·h-1) 脱氢酶/(mg·g-1·h-1 土壤酶综合活性值 TB0 13.83 ± 0.41 c 0.67 ± 0.52 b 0.36 ± 0.08 a 1.49 c TB20 16.54 ± 1.75 b 0.96 ± 0.72 ab 0.25 ± 0.12 b 1.58 b TB40 16.93 ± 3.81 b 0.97 ± 0.74 ab 0.23 ± 0.04 b 1.56 b TB80 20.49 ± 3.06 a 1.50 ± 1.12 a 0.21 ± 0.03 b 1.86 a 说明：英文小写字母表示同列不同处理间的显著性差异水平(P＜0.05) 具体讲，土壤施加20 g·kg-1烟秆炭，脲酶活性显著提高了19.6%，但将烟秆炭的施用量增加到40 g·kg-1，并没有继续提高土壤脲酶活性(表 2)，只有将施用量增加到80 g·kg-1时，土壤脲酶活性才显著又提高了21.0%，与对照相比约显著提高了50%。土壤施加20 g·kg-1或40 g·kg-1的烟秆炭，并不能显著提高土壤磷酸酶活性，但将炭的施用量提高到80 g·kg-1时，土壤磷酸酶活性与对照相比显著提高了2倍多。但是施加80 g·kg-1烟秆炭，土壤磷酸酶活性与施加20和40 g·kg-1烟秆炭的土壤磷酸酶活性对比没有显著性差异。烟秆炭的施用会降低土壤脱氢酶的活性，不同比例烟秆炭施用对土壤脱氢酶活性也没有显著性差异。
因此，不同烟秆炭施用量处理对土壤酶活性综合性指标的影响效果为TB80＞TB40=TB20＞TB0。综上所述，处理TB80对土壤酶活性影响最为显著。
2.5 土壤理化性质对土壤重金属有效态的影响
由于重金属本身的化学性质各异且在土壤中存在的形态也不同，土壤理化性质对重金属有效态质量分数影响各不相同。从表 3中可知：烟秆炭施用量与铜、铅有效态质量分数呈负相关关系，其中与镉呈显著负相关关系，说明烟秆炭施用量对降低有效态镉效果更好。土壤基本理化性质如pH值和有机质、水溶性碳、碱解氮和有效磷质量分数与土壤有效态重金属铜、镉、铅均呈负相关关系。土壤有机质质量分数与有效态镉呈极显著负相关关系，pH值、有效磷质量分数与有效态镉呈显著负相关性，表明土壤有机质对镉的钝化作用比土壤pH值、有效磷质量分数大。有效态铅与有效态铜呈显著正相关性，表明土壤中铜与铅具有伴生性关系[21]。
表 3 土壤重金属有效态与烟秆炭施用量及土壤理化性质的相关性分析Table 3. Correlation between soil DTPA-extractable heavy metals and soil physical and chemical properties炭施用量 有效磷 水溶性碳 有机质 pH值 碱解氮 镉 铅 铜 -0.88 -0.86 -0.66 -0.92 -0.90 -0.74 0.91 0.99* 镉 -0.98* -0.96* -0.89 -0.99** -0.98* -0.81 1.00 0.95 铅 -0.90 -0.871 -0.71 -0.94 -0.92 -0.71 0.95 1.00 说明: *表示P＜0.05(双尾检测)；**表示P＜0.01(双尾检测) 2.6 不同烟秆炭施用量对烟草生长及烟叶重金属质量分数的影响
由表 4可见：施用烟秆炭对烟草生长各农艺指标影响各异。土壤施加烟秆炭能显著增加烟草有效叶数和叶片的宽度，但不同比例炭施用量对烟草株高和叶片的长度并没有显著影响。不同的是，烟叶鲜质量随生物炭施用量的增加而显著增加。20，40和80 g·kg-1的烟秆炭施用量收获的烟叶鲜质量分别比对照显著提高了45.0%，47.1%和61.2%。
表 4 不同烟秆炭施用量对烟草农艺指标的影响Table 4. Effects of different tobacco biochar application rates on agronomic indexes of tobacco stems处理 茎高/cm 有效叶数/片 叶宽/cm 叶长/cm 鲜叶质量/g TB0 87.25 ± 3.20 a 15.00 ± 0.00 b 16.00 ± 1.41 b 36.25 ± 2.36 a 85.00 ± 10.98 c TB20 95.75 ± 5.56 a 16.25 ± 0.96 a 19.75 ± 2.22 a 41.00 ± 4.08 a 119.00 ± 11.05 b TB40 94.00 ± 8.37 a 16.25 ± 0.96 a 22.25 ± 3.77 a 40.00 ± 3.46 a 125.00 ± 10.07 ab TB80 95.75 ± 4.35 a 16.25 ± 0.50 a 20.38 ± 1.10 a 41.13 ± 1.93 a 137.00 ± 5.72 a 说明：同列数字后面英文小写字母表示不同处理间差异性水平(P＜0.05) 烟叶是烟草的重要经济部位，叶片中重金属质量分数是衡量烟叶品质的重要指标。从图 3可见：土壤添加一定量的烟秆炭可以显著降低烟叶中重金属质量分数，其中铜和镉的变化趋势相似。在土壤施加20 g·kg-1的烟秆炭时，叶片中铜和镉的质量分数比对照(无烟秆炭添加)显著降低了13.6%和18.4%；烟秆炭施用量增加到40 g·kg-1时，与20 g·kg-1相比，烟叶中铜、镉的质量分数没有显著变化；但当烟秆炭的施用量继续增加到80 g·kg-1时，与烟秆炭低施用量(20和40 g·kg-1)相比，叶片中铜和镉质量分数反而显著上升了。与对照相比，随着土壤施加烟秆炭的量的增加，烟叶中铅质量分数有下降趋势，但各处理间并没有显著差异。
图 3 不同处理对烟叶中重金属的影响Figure 3. Effects of different treatments on concentration of heavy matals in leaves on tobacco3. 讨论
3.1 烟秆炭对重金属污染土壤pH值及营养元素的影响
本研究中，施用烟秆炭可显著提高土壤pH值。原因可能归结为烟秆炭在高温裂解过程中，其灰分含有大量碱性盐基物质，当施入土壤后，盐基离子与氢离子(H+)及铝离子(Al3+)进行离子交换，生成中性盐，从而提高土壤pH值[21]。从表 1可知：使用烟秆炭可有效提高土壤养分质量分数。本研究结果表明：添加烟秆炭对提高土壤有机质质量分数有显著效果，且随着炭施用量的增加有机质显著增加。原因可能是烟秆炭本身炭质量分数高、氢/碳比小、芳香性强，化学稳定性较高，不易被微生物分解，从而有利于有机质的积累。
本研究结果显示：施入烟秆炭后，土壤有效磷、碱解氮和水溶性有机碳均比对照高。虽然土壤碱解氮质量分数显著提高，但是增幅不大。这可能是由于烟秆炭表面丰富的含氧官能团带有负电荷，吸附土壤铵(NH4+)，从而减少了氮素的损失[22]。有机质是作物所需氮、磷等必要营养元素的主要来源，土壤有效磷质量分数增加可能与有机质质量分数有关。刘方等[23]以生物质炭土壤改良剂为试材，研究了生物质炭对连作蔬菜地土壤有效养分影响的实验中发现，生物质炭能明显提高土壤有效氮和有效磷的质量分数。这与本研究结果相似。
3.2 烟秆炭对重金属污染土壤有效态重金属的影响
重金属的生物有效性大小决定着其在土壤中毒性的强弱，因此，降低重金属的生物有效性对于改善土壤质量至关重要[19]。生物质炭具有较大的比表面积和多孔的结构特征，具有良好的吸附特性，施入土壤后可以降低重金属有效性[24]。本研究结果表明：重金属有效态质量分数随着烟秆炭施加量的增加而显著减少。且烟秆炭对不同重金属的修复效果也不尽相同，处理TB40对铜、镉、铅的固定效果顺序为铜(33.7%)＞铅(29.5%)＞镉(26.4%)。JIANG等[25]采用水稻秸秆制成的生物质炭修复模拟铜、铅、镉污染老成土，结果发现：生物质炭使土壤pH值和阳离子交换量增大，使酸可提取态重金属含量降低，而氧化结合态和有机结合态含量增加，且生物质炭对铜和铅的固化效果优于镉，与本研究结果相似。这可能是生物质炭对铜离子(Cu2+)吸附机制不同于镉离子(Cd2+)和铅离子(Pb2+)的，还有可能是生物质炭表面的孔隙结构有利于铜的固定，具体机制还需进一步深入研究。YANG等[26]在使用烟秆炭修复镉、锌污染土壤的实验中发现，与对照相比，烟秆炭可以显著降低重金属镉、锌的有效态含量，且其固定效果随着烟秆炭施用量的增加而增强。有研究表明，有效磷在中性或碱性条件下易与土壤溶液中的重金属离子形成磷酸盐沉淀[27]。其次，pH值是影响土壤重金属有效性和迁移性的重要因素。土壤pH值随着炭施用量的增加可增加土壤及生物质炭表面的可变电荷，增强阳离子吸附能力和交换作用，降低重金属的解吸，还可促进重金属生成碳酸盐和磷酸盐沉淀[28]进而降低重金属的移动性。此外，有机质对重金属也表现出强烈的吸附固定能力，原因是有机质的主要成分是腐殖质，腐殖质是土壤重要的螯合或络合剂，其中羧基(—COOH)，羟基(—OH)和羰基(—C=O)等能与重金属发生络合或螯合作用，使重金属在土壤溶液中失去活性[29]。
3.3 烟秆炭对重金属污染土壤酶活性的影响
土壤酶活性可以反映土壤中生物化学反应的活跃程度以及养分物质循环状况，是衡量土壤质量的重要指标[30]。土壤有机质、pH值、养分及微生物种类等因素均可影响土壤酶活性。
脲酶是参与土壤氮素循环的重要的水解酶，主要功能是催化土壤中尿素的水解，其活性强度常被用来表征土壤氮素供应状况[30]。本研究中，土壤脲酶活性与烟秆炭施用量密切相关。随着烟秆炭施用量的增加，脲酶活性有升高的趋势，其中处理80 g·kg-1的脲酶活性最高(20.49 mg·g-1·h-1)。碱性磷酸酶参与土壤中磷的矿化和利用，主要功能是在碱性条件下将土壤中的有机磷水解成为磷酸盐，为植物和土壤中的生物提供养分[31]。本研究结果显示：施加烟秆炭可增强重金属污染土壤中碱性磷酸酶的活性。原因可能是烟秆炭施入土壤可以改善土壤理化环境，有利于土壤动物和微生物生长，从而加快了有机物质的分解，为土壤酶的产生提供了更多的底物[32]；还有可能是由于烟秆炭的施用增加了土壤活性有机碳质量分数(表 1)，从而为土壤微生物的生长提供了充足的碳源，促进了微生物繁殖，刺激了酶活性提高[33]。
生物质炭的吸附性使得生物质炭对土壤酶的作用比较复杂，一方面生物质炭对反应底物的吸附有助于酶促反应的进行而提高土壤酶活性，另一方面生物质炭对酶分子的吸附对酶促反应结合位点形成保护，而阻止酶促反应的进行[32]。脱氢酶活性能反映土壤有机质含量和微生物活性[34]。本研究结果显示：土壤脱氢酶活性随着烟秆炭的增加而显著减少。冯爱青等[35]研究表明：施用控释肥及添加生物炭可提高土壤脲酶活性，抑制土壤脱氢酶活性。原因可能是在强碱性条件下脱氢酶的蛋白构象遭到了破坏进而影响酶活性[36]。具体原因还需进一步深入研究。
3.4 烟秆炭对烟叶产量和重金属质量分数的影响
生物质炭施入重金属污染土壤中可以有效增加作物的产量。原因是生物质炭施入土壤后可以增加土壤有效养分[8]，促进微生物活性并改善土壤团聚体结构[11]，降低重金属的生物有效性[28]，从而为作物提供良好的生长环境。本研究结果表明，烟秆炭的施用可以提高烟叶产量，与众多研究结果相似[37-38]。
植物中重金属含量由土壤中重金属有效态含量及植物生理性质决定。植物体蛋白质、有机酸、有机碱及植物络合素、酶可以与植物体内的重金属形成螯合物，降低重金属的生物毒性[39]。在本研究中，适量添加烟秆炭可以降低叶片中重金属质量分数。原因可能是添加烟秆炭后降低了土壤中有效态重金属的质量分数。高瑞丽等[24]研究发现，在铅和镉复合污染土壤中添加生物质炭可显著减少有效态重金属的含量，与本实验研究结果相似。而处理TB80叶片中铜和镉质量分数却比处理TB20和TB40有所增加。原因可能是TB80的叶片生物量高，植物体中的蛋白质、有机物及植物络合素与重金属形成络合素，减轻了重金属对细胞的毒害作用，从而使烟草可以继续吸附重金属。此外，植物蒸腾作用和势能高于处理TB20和TB40，导致重金属质量分数升高。另有研究指出，不同重金属在植物不同器官的迁移能力不同[40]，这可能是铅在各处理间没有显著差异的原因，但具体的作用机制还需进一步研究。
4. 结论
综上所述，烟秆炭的施用可有效提高重金属污染土壤中pH值、有机质、碱解氮和有效磷质量分数；还可以显著提高土壤脲酶和碱性磷酸酶的活性，降低脱氢酶的活性，其中添加80 g·kg-1的烟秆炭对土壤肥力的改善及酶活性指数的提升最为显著。另外，土壤施加烟秆炭能显著增加烟草有效叶数和叶片的宽度，烟叶鲜质量随烟秆炭施用量的增加而显著增加。
烟秆炭的施用可以降低污染土壤中重金属的生物有效性，施加40 g·kg-1烟秆炭已使铜、铅的钝化效果达到最佳，但80 g·kg-1的烟秆炭使污染土壤中镉的有效性降至最低。但是，施用20 g·kg-1的烟秆炭即可显著降低烟叶中重金属铜和镉的质量分数。
本研究证明，烟秆炭作为土壤改良剂对重金属污染土壤有着良好的修复效果，且可提高重金属污染土壤中烟草的产量，提高污染农用地的经济价值，同时为因烟秆废弃而造成的环境污染等问题提供了一个合理的解决方案，也为烟秆炭在重金属污染农田中的修复提供了实践理论参考价值。
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图 1 jar1-3-5和jar1-6-2突变序列信息
Figure 1 Sequence information of jar1-3-5 and jar1-6-2 mutants
图 2 AtJAR1基因突变体与野生型的表型差异
Figure 2 Phenotypic differences between AtJAR1 gene mutants and wild type
图 3 不同盐浓度下拟南芥种子的发芽率
Figure 3 Germination rate of A. thaliana seeds under different salt concentrations
图 4 盐胁迫对jar1突变体主根长的影响
Figure 4 Effect of salt stress on the main root length of jar1 mutant
图 5 不同ABA浓度下拟南芥种子的萌发率
Figure 5 Germination rate of A. thaliana seeds under different ABA concentrations
图 7 野生型和AtJAR1基因突变体根K+和Na+变化
Figure 7 Determination of element contents in wild-type and mutants of AtJAR1 gene
图 8 盐胁迫下野生型和突变体中AtHAK5基因的相对表达量
Figure 8 Relative expression of AtHAK5 gene in wild-type and mutants under salt stress
表 1 1/5 Hoagland水培培养液配方
Table 1. 1/5 Hoagland formula for hydroponic culture solution
组成 母液浓度/
(mol·L−1)母液添加体
积/(mL·L−1)水培液中浓
度/(mmol·L−1)组成 母液浓度/
(mol·L−1)母液添加体
积/(mL·L−1)水培液中浓
度/(mmol·L−1)KNO3 1.0 1.25 1.25 KH2PO4 0.5 1.00 0.50 Ca(NO3)·4H2O 1.0 1.00 1.00 Fe盐① 1.00 MgSO4·7H2O 0.4 1.00 0.40 微量元素② 0.10 说明：①1 000倍铁盐母液的配置：称取5.56 g七水合硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)放入100 mL烧杯中，边加水边搅拌；将7.50 g 二水合乙 二胺四乙酸二钠(EDTA·2Na·2H2O)放入1 L烧杯中加水煮沸，缓慢加入FeSO4溶液，于微波炉中煮沸2 min；避光放入60 ℃烘 箱烘2 h以上；室温静置，冷却后定容至1 L，即为浓度为20 mmol·L−1的母液。使用时稀释1000倍。②10 000倍微量元素母液的 配置：称取H3BO3 6.18 g；MnCl2·4H2O 0.99 g；CuSO4·5H2O 1.25 g；ZnSO4·7H2O 1.44 g；H2MoO4 0.08 g；NaCl 0.20 g溶解 于水中，冷却后定容至1 L。使用时稀释10 000倍 
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表 2 相关引物序列
Table 2. Sequence of related primers
基因 上游引物(5′→3′) 下游引物(5′→3′) AtActin2 GTCGTACAACCGGTATTGTGCT TGTCTCTTACAATTTCCCGCTCT AtVSP1 TGGATCTTTGACCTAGACGACA GAGTTCCAAGAGGTTTTCGTA AtVSP2 TGACCTAGATGATACCCTCCTCTC CAATCCCGAGCTCTATGATGTT AtHAK5 TCTGCATCACTGGGACGGAG CAGTATAACGGATCAGGGATTGA
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