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磷脂酸(phosphatidic acid，PA)是一种常见的细胞甘油磷脂，也是最简单的膜脂之一[1]。几乎所有生物体内都会产生PA，包括酵母[2]、动物[3]和植物[4]等。在植物中PA的合成主要包括2种方式：第1种是从头合成途径，3-磷酸甘油先后在3-磷酸甘油酰基转移酶和溶血磷脂酸脂酰基转移酶的作用下发生连续2步酰化反应生成PA，这也是PA合成的主要途径[5]；第2种是磷脂的降解途径，磷脂降解又可分为2种，一种是磷脂酶D通过水解某些结构磷脂直接生成PA[6−9]，另一种是磷脂酶C通过水解磷脂酰肌醇生成二脂酰甘油[10]，继而经二脂酰甘油激酶磷酸化生成PA[11]。PA作为一种结构膜脂，磷酸基团头部能够以“静电/氢键开关模型”的方式与蛋白质结合[12]。在该模型中，PA结合蛋白中带正电荷的碱性氨基酸残基[13−17]，可以吸引磷脂双分子层上的负电荷，并通过静电作用影响膜环境，继而与PA头部的磷酸基团形成氢键，产生一个稳定的蛋白质结合位点。PA这种携带负电荷并且在生理条件下呈圆锥体的独特分子构型[18]，使得PA结合蛋白的结构域能够特异性的与其结合，保证了生物膜结构的稳定和功能的发挥。除了作为膜脂的一个结构成分以及甘油脂合成的前体物质，PA还是一个关键信号分子，在多种生物学过程中发挥重要作用。正常条件下，行使信号功能的PA含量甚微；在植物应答各种生物与非生物胁迫过程中PA水平则会迅速升高，但这种积累往往是短暂的。这说明生物体拥有一套严格控制信号分子PA含量的机制，这对调节PA信号传递强度、维持细胞物质与能量代谢的动态平衡至关重要[19−22]。
尽管PA拥有多种功能，但目前对于细胞内PA含量的动态变化仍知之甚少，这主要受PA检测手段的限制。过去主要采用诸如薄层层析、高效液相色谱和放射性同位素标记等理化手段对其含量进行测定[23]。近年来，质谱分析技术的应用使得对包括PA在内的各种脂质的测定更准确和高效[24−25]。然而，这些理化手段都只能对组织器官中PA总量与种类进行定量或定性分析，无法捕捉细胞内PA的动态与瞬时变化信息。通常认为，内质网上的PA含量相对较高，这有助于促进磷脂和三酰甘油的合成[26−27]；而质膜和细胞器中行使信号功能的PA含量甚微。显然，采用理化测定会掩盖胞内PA的真实变化。因此，亟需开发一种能可视化分析细胞内PA的工具。
大量研究表明：生物体中PA结合蛋白种类繁多，这些蛋白中的PA结合域(phosphatidic acid binding domains，PABD)结构亦存在差异。其中一些PABD因与PA结合专一性强，被用来开发多种PA探针 [28−33]。酵母蛋白Spo20p中的PA结合域已被证实具有极强的专一性[33]，只结合PA而不结合其他磷脂。目前基于这一PABD所开发的PA探针在医学研究中应用广泛，但在植物中的应用却有限[34]。因此，本研究旨在构建基于Spo20p中的PABD的植物PA荧光探针，为剖析植物早期应答逆境胁迫的细胞分子机制提供新工具。
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将拟南芥Arabidopsis thaliana种子置于含有湿润滤纸的培养皿中，4 ℃冰箱内避光放置3 d后将其点播在湿润的土壤基质上(V营养土∶V蛭石∶V珍珠岩=3∶1∶1)。将播种后的盆栽用透明塑料盖覆盖，置于24~25 ℃室温、50%~60%湿度、14 h光照/10 h黑暗的植物培养箱中培养，7 d后揭去塑料盖间苗。
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将拟南芥种子进行消毒，加入适量灭菌过的蒸馏水，在4 ℃冰箱内避光放置3 d，点播在1/2 MS培养基上，置于植物培养间中培养。
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酵母蛋白Spo20p中存在一个高度专一的PA结构域(PABD)，该PABD由40个氨基酸残基构成，只结合PA而不结合其他磷脂[33−34]，因此，本研究选择该PABD与荧光蛋白融合，构建PA荧光探针。根据PAPD核苷酸序列[33]设计引物(表1)进行PCR扩增，获得与该PABD相对应的DNA片段；同时PCR扩增获得GFP基因编码区序列。随后，利用无缝克隆试剂盒(生工)，将GFP和PABD片段克隆至植物表达载体pSY06的限制性内切酶位点Kpn I和Pst I之间，获得重组质粒pSY06-GFP-PABD。PABD连接至GFP基因编码区的3′端，构成GFP-PABD融合基因，该融合基因的表达由组成型启动子UBQ10驱动。重组质粒中的插入片段经菌落PCR、Kpn I和Pst I双酶切以及测序验证正确后，采用热激法将质粒转化至农杆菌Agrobacterium tumefaciens GV3101，用于后续拟南芥遗传转化。
表 1 相关引物序列
Table 1. Sequence of related primers
用途 引物名称 引物序列(5′→3′) PABD基因合成 ZYP301 CCTGCTAATTTCAAGGCTAATTCATTGCTGTTCGCTCGAGATCTGAGTCCGGACTGCAGGTTGGATCCGGTACCGAGCT ZYP302 GAAGACGTGATAGGCTACATGTGAAGCTTAAATCCTTGAGGAATAAAATCCACAAACAACTTCACCCAAA ZYP303 TGCTTCCTGAACAATTGTCCATTCTAGATTCTGTCTTGTTGATATCAAGACCTGCTAATTTCAAGGCTAA ZYP304 GTACCCAAGCTTCACATGTAGCCTATCACGTCTTCTGCTTCCTGAACAATTGTCC ZYP305 CACAAACAACTTCACCCAAACTGTCGGTTCGATGACGCCACTAAGACTAGTTAAGGTACCGGCGTAATCATGGTC PABD基因克隆 ZYP308 TCCGGACTCAGATCTCGAGC ZYP309 AGCTATAGTTCTAGATCTAGATTAACTAGTCTTAGTGGCGTC GFP基因克隆 ZYP306 TATCGATGGCGCCAGCTGAGGATGGTGAGCAAGGGCGA ZYP307 AGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCCATCCGGACTCAGATCTCGAGC 转基因拟南芥鉴定 MSY01 TGGTGTTAGTTTCTAGTTTGTGCG MSY02 TCATCATGACAGATCTGCGC 表达量分析 ZYP389 GACCACTACCAGCAGAACACC ZYP390 CTTGTACAGCTCGTCCATGC -
以哥伦比亚野生型拟南芥(WT)为植物材料，利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥。将获得的T1代拟南芥种子进行表面消毒，均匀铺在含有草铵膦(10 mg·L−1)和特美汀(50 mg·L−1)的1/2 MS筛选培养基上进行筛选。将具有除草剂抗性的阳性苗移栽到土壤中继续培养，3周后提取叶片DNA并设计引物(表1)进行PCR鉴定，对T2和T3代转基因株系进行除草剂抗性的遗传分析，最终筛选得到纯合单插入位点转基因株系。
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以在1/2 MS培养基中生长7 d的转基因拟南芥根系作为测定材料，使用高纯度RNA提取试剂盒(全式金)提取RNA并对其进行纯度检测和浓度测定。取等量RNA，使用反转录试剂盒(翌圣)进行单链cDNA的合成。选择拟南芥肌动蛋白基因Actin为内参基因，设计引物(表1)进行实时荧光定量PCR (RT-qPCR)，并对数据采用2−∆∆Ct法进行分析。
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将野生型和转基因株系种子点播在1/2 MS方形培养基上，竖直培养6 d后，挑选长势均匀一致的幼苗(每个基因型，20株)，分别转移至含有0和50 mmol·L−1 NaCl的1/2 MS固体培养基中继续竖直培养，7 d后观察表型。
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将在1/2 MS方形培养基上竖直培养6 d的幼苗分别浸泡在含有0、2和10 μmol·L−1 PA的1/2 MS液体培养基中，依次处理5、10、15和20 min后，利用荧光显微镜(ZEISS，Axio Imager 2)对拟南芥根尖分生区PA的分布进行观察并拍照。
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将含PA荧光探针的拟南芥转基因株系种子点播在1/2 MS方形培养基上，竖直培养6 d，选择均匀一致的幼苗分别浸泡在含有100 mmol·L−1 NaCl、10 mmol·L−1 NaHCO3和兼含两者的1/2 MS液体培养基中，处理5、10和15 min后用荧光显微镜观察根尖分生区PA的分布。
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如图1所示：该载体以pSY06为骨架，由35S 启动子驱动植物选择标记基因——草铵膦抗性基因(bar)的表达，而GFP-PABD融合基因的表达则由UBQ10启动子驱动。
图 1 pSY06-GFP-PABD载体图
Figure 1. Vector diagram of pSY06-GFP-PABD
采用农杆菌花序侵染法将GFP-PABD融合基因转入拟南芥，获得T1代转基因种子。对T1代幼苗进行草铵膦(10 mg·L−1)抗性筛选与PCR鉴定，获得56个含融合基因的独立转基因株系。随后，对相应株系的T2代幼苗(每个株系约300株)继续进行草铵膦除草剂抗性筛选。卡方测验显示：符合3(阳性苗数)∶1(阴性苗数)分离规律的株系共8个，这些株系为含单插入位点的转基因株系。再对T2代各个株系不同植株的自交后代(T3代)进行除草剂抗性筛选，最终获得7个纯合、单插入位点转基因拟南芥株系，分别为8-1、11-1、13-12、25-5、42-4、48-1和53-1。
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为了明确不同转基因株系PA荧光探针表达量的差异，对上述7个转基因株系进行了目的基因的表达量测定。RT-qPCR结果(图2)显示：当将转基因株系8-1中融合基因的相对表达量设为参考值“1”，其余6个株系(11-1、13-12、25-5、42-4、48-1和53-1)的相对表达量分别为1.74、15.91、0.72、1.06、1.69和1.52。株系13-12的PA探针的表达量最高，是其他株系的9~22倍，为PA探针高表达转基因株系；相应地，将株系48-1作为PA探针低表达材料。
图 2 不同转基因拟南芥株系中GFP-PABD融合基因的相对表达量
Figure 2. Relative expression level of the GFP-PABD fusion gene in transgenic A. thaliana lines
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为了明确PA荧光探针的表达是否会对植物生长发育产生影响，比较分析了野生型拟南芥和不同转基因株系在整个生长发育周期的表型差异。土培生长实验显示：野生型与转基因拟南芥株系的叶片生长无明显差异，高表达转基因株系(13-12)与低表达转基因株系(48-1)之间亦无可见表型差异(图3A)。另外，在含有0和50 mmol·L−1 NaCl的1/2 MS培养基中生长时，野生型与不同转基因株系之间也未表现出生长速率的差异(图3B)。这些结果说明：在一定范围内PA荧光探针的表达不会影响拟南芥的正常生长发育，这一特性有助于合理解释特定条件下胞内PA变化对植物生长发育产生的影响。
图 3 野生型拟南芥与3个PA荧光探针转基因株系的表型比较
Figure 3. Phenotypic comparison between wild type and three transgenic lines of A. thaliana bearing PA fluorescent probe
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随着荧光探针表达量的增加，细胞内的荧光强度也会增强，这会导致PA检测的信噪比下降；相反，荧光探针表达量过低则会影响PA检测的灵敏度。为了获得检测灵敏度和信噪比都较高的PA荧光探针，用不同浓度的外源PA处理荧光探针表达量存在差异的转基因株系，进而在荧光显微镜下观察根尖PA的积累情况。结果(图4~6)显示：野生型拟南芥在有、无外源PA处理下，根尖细胞自发荧光的强度无明显差别。另外，在不同浓度外源PA处理下，荧光探针低表达的转基因株系(48-1)的根尖分生区的PA含量变化未能被捕捉到。相反，对于荧光探针高表达的转基因株系(13-12)，2和10 μmol·L−1 PA分别处理10 和5 min后，其根尖分生区细胞的胞内或质膜上的PA积累清晰可见(图5)。当外源PA浓度低时，随着处理时间延长，细胞中PA积累减少(图5)，这很可能是因为作为甘油脂合成前体物质的PA已被转化为其他物质。而当外源PA浓度升至10 μmol·L−1时，处理10、20 min后依然可见细胞中的PA呈点状分布(图6)。这些结果说明：荧光探针表达量较高的转基因株系(13-12)可被用于监测细胞中PA含量的变化。
图 4 无外源PA处理下PA探针在野生型和2个转基因拟南芥株系根尖中荧光强度的差异分析
Figure 4. Analysis of discrepancy in fluorescent intensity of PA probe between wild type and two transgenic lines of A. thaliana
图 5 外源PA(2 μmol·L−1)处理下PA荧光探针对PA监测灵敏度的分析
Figure 5. Sensitivity analysis of PA fluorescent probe monitoring PA under treatment with 2 μmol·L−1 exogenous PA
图 6 外源PA (10 μmol·L−1)处理下PA荧光探针对PA监测灵敏度的分析
Figure 6. Sensitivity analysis of PA fluorescent probe monitoring PA under treatment with 10 μmol·L−1 exogenous PA
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为了进一步验证 PA荧光探针的实用性，利用荧光探针表达量较高的转基因株系(13-12)检测盐碱胁迫条件下根尖细胞中PA含量的变化。结果显示：盐、碱单独或混合处理转基因株系，5 min后即可在根尖分生区细胞中观察到PA的点状分布(图7)。因此推断，本研究构建的PA荧光探针可用于监测逆境条件下植物细胞中PA含量的变化。另外，盐碱胁迫可快速诱导PA积累这一现象表明在植物早期逆境响应中PA发挥某种重要作用。
图 7 单独或混合盐碱胁迫下PA在转基因拟南芥根尖分生组织中的分布
Figure 7. Distribution of PA in the root tip meristem of a transgenic A. thaliana line bearing PA sensor under saline and alkaline stresses, alone or in combination
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已知PA在植物生长发育与逆境响应过程中发挥重要作用，但由于缺乏PA的可视化分析工具，对细胞中PA含量动态变化的了解十分有限。这一方面限制了PA作用机制的研究，另一方面给评估基因工程手段操控植物细胞PA含量变化所产生的实际应用效果带来困难。因此，本研究将酵母蛋白Spo20p中对PA高度专一的结合域与荧光蛋白融合，成功构建了可对细胞内PA进行可视化检测的荧光探针。
为了使荧光探针适用于监测整个生长周期不同组织细胞中的PA水平，选择组成型表达启动子UBQ10驱动GFP-PABD融合基因的表达。研究发现：植物细胞中PA的检测灵敏度与PA荧光探针的表达量密切相关，表达量较高的荧光探针可有效检测到外源PA处理带来的胞内PA水平的变化，而表达量较低的探针检测效果则相反。如13-12株系中PA荧光探针的表达量高于其他株系，该株系经2 μmol·L−1外源PA处理10 min，其根尖细胞中PA的点状分布即可被观察到，这也说明外源PA能够被拟南芥根尖快速吸收，继而与PA荧光探针结合。鉴于已有研究中常用浓度高于10 μmol·L−1的外源PA检测PA探针的灵敏度[35]，本研究中构建的荧光探针可有效监测到2 μmol·L−1外源PA处理所带来的细胞内PA含量的变化，推测基于13-12转基因株系的PA荧光探针具有较高的PA检测灵敏度。
需要指出的是，PA荧光探针使用过程中，样品处理时间的延长和观察光源的增强均会使植物细胞造成某种损伤，导致细胞产生自发荧光，从而降低PA检测的信噪比。因此在实验过程中，需尽量缩短植物样本的制片时间及荧光观察的时间，以提高观察结果的真实性。
盐碱地中盐和碱是2种共存但不同的非生物胁迫，共同影响植物的正常生长发育。利用本研究构建的PA荧光探针发现：盐胁迫处理5 min就会造成PA在细胞中的积累，这与已有的研究结果一致[22, 36]。同时，碱胁迫和盐碱混合胁迫也会快速诱导PA的积累。因此，为了全面了解植物早期逆境响应机制，有必要监测早期细胞中PA含量的动态变化。本研究开发的PA荧光探针为这些方面的研究提供了重要技术支撑。
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本研究成功构建了一种基于酵母蛋白Spo20p中PA结合域的荧光探针，可有效监测植物细胞中PA含量变化。应用该探针发现盐碱胁迫可快速诱导拟南芥根尖细胞质膜上和胞内PA的积累，这一结果表明PA在植物对盐碱胁迫早期应答过程中发挥重要作用。
Generation and application of a fluorescent probe for phosphatidic acid in Arabidopsis thaliana
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摘要:
目的 磷脂酸(PA)是甘油脂生物合成的前体，又是参与植物生长发育调节和各种逆境响应的重要信使物质，然而目前对植物细胞中PA含量动态变化的了解十分有限。本研究试图构建一种能有效监测植物细胞PA含量变化的荧光探针，并用之测定盐碱胁迫过程中胞内PA含量的变化。 方法 将Spo20p蛋白中高度专一的PA结合域相对应的核苷酸序列与绿色荧光蛋白基因融合，经遗传转化获得携带该融合基因的转基因拟南芥Arabidopsis thaliana株系，其表达受组成型启动子UBQ10驱动，产生的融合蛋白成为专一结合PA的荧光探针。随后，运用该荧光探针监测盐碱胁迫下胞内PA含量的变化。 结果 构建获得7个不同的纯合、单插入位点转基因拟南芥株系。实时荧光定量PCR (RT-qPCR)分析显示：不同株系中融合基因的表达量存在差异。不同浓度外源PA处理试验显示：随着表达量的升高，PA探针可有效监测到2 μmol·L−1 PA处理根尖10 min后细胞中PA含量的变化；而当PA探针表达量较低时，对PA监测灵敏度显著下降，表明在一定程度上荧光探针对PA监测的灵敏度与其表达量相关联。运用PA荧光探针发现：盐碱胁迫处理根尖5 min即可诱导质膜上或胞内PA的积累，暗示PA在植物早期盐碱胁迫响应中可能产生重要作用。 结论 本研究构建了一种可对细胞内PA含量进行有效监测的荧光探针，该探针可用于监测植物盐碱胁迫早期响应过程中胞内PA水平的变化，从而为早期逆境响应研究提供新工具。图7表1参36 Abstract:Objective Phosphatidic acid (PA) serves as an important signal molecule involved in the regulation of plant growth and development and different responses to various stresses as well as a general precursor for glycerolipid biosynthesis. However, little is known thus far about the dynamic changes of PA in plant cells. This study attempted to construct a fluorescent probe that can effectively monitor the changes of PA in plant cells and use it to measure the changes of intracellular PA under saline-alkaline stresses. Method The corresponding nucleotide sequence for PA-specific binding domain within the Spo20p protein was fused to the green fluorescent protein gene. Transgenic Arabidopsis thaliana lines bearing the fusion gene under the control of the constitutive promoter UBQ10 was then generated via genetic transformation. The resulting fusion protein constituted a fluorescent probe specifically binding to PA. Subsequently, this probe was employed to monitor the changes of cellular PA under saline-alkaline stresses. Result Seven transgenic A. thaliana lines homozygous for single insertion of the fusion gene was generated. Real time quantitative PCR (RT-qPCR) analysis showed that expression levels of the fusion gene varied among different lines. Experiments with various exogeneous PA concentrations revealed that as the expression level of the PA probe increased, it could effectively monitor the changes of cellular PA in the root tips treated with 2 μmol·L−1 exogenous PA for 10 min, whereas this was not the case when the expression level of the probe was low, indicating that the sensitivity of the probe for PA detection is, to a certain degree, associated with its expression level. Based on this fluorescent PA probe, PA accumulation at the plasma membrane or in the intracellular space was evident in the root tips under saline-alkaline stresses for 5 min, implying that PA may play important roles in early plant responses to saline-alkaline stresses. Conclusion A fluorescence probe for effective monitoring of cellular PA was developed in this study. This probe can monitor the alterations in cellular PA level during early plant responses to saline-alkaline stresses, thereby providing a new tool to study early responses to various stresses. [Ch, 7 fig. 1 tab. 36 ref.] -
Key words:
- phosphatidic acid /
- fluorescent probe /
- transgene /
- saline-alkaline stress /
- Arabidopsis thaliana
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矿质元素的生物地球化学循环直接影响生态系统的生产力和稳定性。磷(P)作为碳、氮之外陆地生态系统最关键的营养元素，在植物体内的分配和代谢决定了植物的生长过程及生产力水平[1]。低磷环境在生态系统内普遍存在，土壤总磷库80%以上的磷不可移动[2]，植物难以吸收利用。同时，土壤有效磷(Pi)易被铝离子、铁离子、钙离子吸附固定，与氢氧化合物构成螯合物[3−5]，因此有效磷浓度随土壤发育而下降，导致世界范围内有效磷浓度低于10 µmol·L−1的土壤广泛存在[6]。
为满足农林业生产需求，集约施用磷肥成为生产经营的主要措施。然而，一般磷肥当季利用率仅为10%~25%，75%~90%的磷被转化固定成植物难以吸收的形态[7]，导致磷肥利用率低下。同时，随着经济增长和人口剧增，过度开采和不合理的磷肥经营管理造成磷矿资源储备耗竭、水体磷素增加，对生态环境造成严重威胁[8−10]。近年来，关于土壤磷素循环研究的不断深入，揭示了植物进化形成的一系列复杂适应性策略[11−12]，并发现土壤功能微生物对土壤磷库活化和植物营养健康有重要影响[13−14]。丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)和溶磷细菌(phosphate-solubilizing bacteria，PSB)在自然界土壤中普遍存在。研究发现，丛枝菌根真菌和溶磷细菌可以溶解难溶性无机磷、矿化有机磷，两者直接参与土壤磷素活化与植物磷素获取过程，与土壤、植物之间联系密切[15−16]，在维持土壤磷养分有效性和生态系统功能中发挥重要作用[16−18]。鉴于此，为开发可持续土壤磷素高效利用途径，围绕植物-丛枝菌根真菌-溶磷细菌共生关系，详述了丛枝菌根真菌与溶磷细菌在植物磷养分吸收中的作用，强调了植物-丛枝菌根真菌-溶磷细菌互作增效对土壤磷素调动的途径和机制。
1. 植物获取和利用磷的策略
维管植物在长期进化过程中形成了多样化的根功能属性以提高对土壤磷资源的获取，维持体内磷稳态，包括根形态和根构型属性的响应[11−12, 19−20]、根分泌物属性的调节[3, 12]、磷素分配与再利用的调控[21−23]以及与菌根形成紧密的共生关系[24]。其中，光合碳投入是植物根系功能属性变化以促进高效获取地下资源的重要驱动力[25]。低磷条件下，植物光合产物优先向根系分配，部分作用于根系生长及其生理活动，促进根冠比增加[20, 26−27]，改变根系特征性状，表现为根系比根长与侧根数量的增加[19, 28]、根系生长角度的调整[11, 19]及根毛长度与密度的改变[11, 29]，从而提高根系与土壤界面的接触面积。拟南芥Arabidopsis thaliana在低磷水平下通过抑制主根生长，增加根系分支数量，促进侧根伸长生长，形成在土壤浅层分布、高度分支的根系结构[19]。在4种不同根系表型的菜豆Phaseolus vulgaris中根毛与根系生长角度协同影响植物的磷素吸收，低磷胁迫下根系表现为长且密的根毛形态与浅根型结构，可显著促进植株生物量的积累与磷素的吸收[29]。WEN等[28]对16种不同作物分析发现：根系直径与物种的磷养分获取策略关系密切，低磷环境中根系直径较细的物种通过促进根系分支、增加根系比根长和一级根系长度获取磷素，而粗根物种主要依靠丛枝菌根真菌的高定殖率来弥补低磷环境下根系形态表现的缺陷。因此，不同物种、基因型以及根系功能性状类型对磷胁迫的响应表现出不同的可塑性。
植物光合产物的另一流向则是以根系分泌物的形式释放到根际环境中，包括高分子量化合物酸性磷酸酶(APase)和低分子量化合物酚类、羧酸盐以及糖类等多种物质[12, 30−35]。WANG等[30]对拟南芥的研究表明：磷饥饿诱导根系分泌的APases可以释放到根际环境或滞留在根表面，通过水解有机磷，提高有效磷浓度。JUSZCZUK等[31]研究了长期磷酸盐饥饿对豆科Leguminosae植物根系酚类物质分泌量的影响，结果表明：缺磷植株根系酚类物质的分泌量是对照植株根系的5倍。HU等[32]也发现：儿茶酚、原儿茶酸、咖啡酸等酚类物质能够影响土壤磷有效性。与有机磷的矿化不同，根系释放的酚类物质主要通过与土壤中含磷矿物(如闭蓄态磷，O-P)结合，促进磷的解吸[35]。根系低分子量羧酸盐的分泌是植物磷吸收的重要策略，羧酸盐通过络合金属阳离子，并与磷竞争吸附位点的方式，从磷酸铁盐(Fe-P)、磷酸铝盐(Al-P)、闭蓄态磷素(O-P)等难溶性磷酸盐中释放有效磷[35]。ALMEIDA等[34]对3种禾本科Gramineae植物进行研究发现：磷饥饿均会诱导根系柠檬酸盐、异柠檬酸盐和苹果酸盐分泌的增加。TOUHAMI等[12]在禾本科和豆科植物的分泌物中则鉴定到更多种类，包括柠檬酸盐、苹果酸盐、丙二酸盐、乙酸盐、丙酮酸盐、乳酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐和莽草酸盐。伴随着羧酸阴离子分泌的同时，根系也会释放氢离子(H+)对根际进行酸化[3]，与羧酸阴离子协同作用于土壤难溶性磷酸盐[35]，最终促进植物对磷素的吸收利用。此外，低磷导致植物体内APase、RNA酶(RNase)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、β-葡萄糖苷酶、ADPG焦磷酸化酶(AGPase)等内源酶促反应加剧[36−39]，改变植物磷养分和碳同化物质的“库—源—流”格局[20, 22, 39−40]，调控胁迫条件下根系系统发育[41]。根系主动或被动释放物质进入根际改变了根际土壤的物理、化学和生物学性质，使根际成为植物-微生物、微生物-微生物互作最活跃的热点区域[42]，但根系分泌物的种类、分泌量与物种、基因型及植物的营养状况密切相关[34]。
2. 植物磷素吸收的丛枝菌根真菌协调途径
菌根是自然界最重要的生物互作体系之一，丛枝菌根真菌占整个菌根群体的72%以上[43]。目前已经报道发现的丛枝菌根真菌接近300种[44]，其中球囊霉科Glomeraceae为优势丛枝菌根真菌[45]。丛枝菌根真菌通过增加根圈范围[46]、表达高亲和力磷转运蛋白[47]、提高土壤磷酸酶活性[48]、分泌有机酸和糖类物质[49−51]等多种方式直接或间接作用于土壤特征及微生物类群，与植物养分吸收利用关系密切。
从资源经济角度看，宿主植物为共生关系的主导者，向丛枝菌根真菌提供满足生存、生长的碳水化合物，作为交换，丛枝菌根真菌向寄主植物提供矿质养分(如磷)[14]，其资源交换强度随各自资源分配状态而调整[52]，从而实现共生关系的双向控制。同时，丛枝菌根真菌、宿主植物的遗传背景以及土壤磷有效性影响植物-丛枝菌根真菌相互作用的成本与收益[53−56]。
2.1 丛枝菌根真菌促进植物获取磷素的作用机制
菌根植物可以通过2种途径从土壤中获取磷素，即通过根表皮细胞和根毛进行吸收的直接途径以及通过丛枝菌根真菌菌丝进行吸收的菌丝途径，同时养分吸收的内部分工更加“社会化”[55−58]。由于植物体内外磷酸盐浓度差巨大，直接途径的养分吸收速度慢、碳资源投入大[55−59]，而丛枝菌根真菌菌丝体存在高亲和力磷酸盐转运系统，并具有诱导植物体内产生高亲和力磷转运蛋白的能力[47, 55−56]，是磷胁迫条件下植物磷素供应的主要途径[56, 60−61]。因此，菌丝途径的低碳成本以及吸收、转运的高效率使其成为植物获取和利用磷素的优势途径。
菌丝途径中，丛枝菌根真菌通过纤细的菌丝和广泛的分支网络改善宿主植物磷养分状态。外生菌丝在土壤中广泛生长，可延伸到离根表11.7 cm处，进入比根毛更小的土壤孔隙，增加吸收面积[46]。在扩大吸收范围的同时，丛枝菌根真菌菌丝体向菌丝际环境分泌多种有机物。TOLJANDER等[49]通过核磁共振光谱法分析了菌丝分泌液的组成物质，发现菌丝分泌物主要为甲酸、乙酸、葡萄糖和淀粉类似物；而LUTHFIANA等[62]在2种磷水平下收集了明根孢囊霉Rhizophagus clarus和异形根孢囊霉Rhizophagus irregularis的菌丝分泌液，发现除碳水化合物和大量有机酸外，还包括氨基酸、核酸、脂肪酸、植物激素等物质。外生菌丝的H+分泌在体外培养条件下被证实[63]，当H+分泌时，菌丝际土壤发生酸化，菌丝际环境pH降低。此外，接种丛枝菌根真菌能够显著提高土壤磷酸酶活性[48, 64−65]，与有机酸和其他菌丝分泌物共同作用影响菌根际、菌丝际过程，促进土壤有机磷矿化和难溶性磷酸盐(如Fe-P、Al-P、O-P)溶解，并表现出其他促进植物生长的作用[48−49, 65]。
菌根植物磷养分吸收的直接途径和菌丝途径相互作用[66]，形成了菌根植物的综合磷吸收系统[55]。目前，采用磷的放射性同位素示踪方法[56, 60]解释植物在菌丝途径和直接途径间的平衡选择。磷养分供应充足条件下，丛枝菌根真菌的定殖和生长发育程度较低，直接途径在菌根植物的磷素获取途径中占据优势；磷养分匮乏条件下，丛枝菌根真菌的定殖和生长发育被促进，菌根植物偏好于通过菌丝途径从土壤中获取磷素，但菌丝途径的磷素贡献受到丛枝菌根真菌发育程度、土壤有效磷条件以及物种差异性等因素的影响[55−57]。SAWERS等[15]发现：根外菌丝长度与植物磷摄取量相关，并影响菌丝途径的磷素贡献；ZHANG等[55]的研究发现：土壤无机磷供给水平显著影响菌丝途径对植物磷素吸收的贡献率，而地上部磷需求可能决定了植物对2种吸收途径的权衡选择。此外，也有研究表明：植物种类、基因型和丛枝菌根真菌种类的差异也会影响菌丝途径的磷素贡献率[56−57, 67]，导致不同丛枝菌根真菌-植物组合在植物磷吸收、生长方面的响应具有功能上的差异。
2.2 丛枝菌根真菌-植物共生体的养分交流
菌丝途径的磷养分吸收是以公平公正、互惠互利为原则的“贸易交换”过程[25, 68]。丛枝菌根真菌在宿主皮层细胞形成丛枝结构(丛枝周膜-真菌细胞壁-真菌细胞膜)的养分交换场所[57]，外生菌丝则以H+-ATP酶为驱动力在土壤界面吸收磷酸盐，经体内转化为多聚磷酸盐后，通过细胞质流动运输至共生界面并释放[24, 57, 69]。作为交换，宿主植物以糖、脂肪酸等形式向真菌提供植株4%~20%的净光合产量[54, 70]。
高共生质量的丛枝菌根真菌-植物共生关系会发生频繁的养分交换行为。丛枝菌根真菌与宿主植物的资源交换由宿主主导，植物通过选择性分配碳资源，主动选择合作伙伴，并以减少根系碳分配的方式对表现不佳的丛枝菌根真菌进行制裁[71−72]，而丛枝菌根真菌也会选择向提供更多碳水化合物的根系增加养分转移，进而实现稳定的合作关系[52]。
植物-丛枝菌根真菌共生关系的形成是共生体间养分交流的基础，在菌根植物系统性磷响应中，植物信号的释放影响植物-丛枝菌根真菌的合作关系，调控丛枝菌根真菌的发育。研究表明：独脚金内酯在磷缺乏下受到显著诱导，调控地上部生长发育过程的同时，作为根际信号，刺激丛枝菌根真菌的菌丝分支[73−75]。SHI等[76]发现：植物-丛枝菌根真菌共生关系的形成需要植物磷饥饿响应转录因子(PHRs)的参与，PHRs通过P1BS元件介导丛枝菌根真菌共生相关基因的表达，进而影响植物-丛枝菌根真菌的共生质量。此外，miR399在菌根植物叶片的表达增加，也被提出作为植物调节丛枝菌根真菌共生的信号分子，但高磷水平下过表达miR399无法恢复丛枝菌根真菌定殖[77]，可能还涉及其他机制[57]。
3. 植物磷素吸收的溶磷细菌协调途径
溶磷细菌作为土壤微生物的重要群体，约占土壤细菌总体的1%~50%[17]，多属于芽孢杆菌属Bacillus、假单胞菌属Pseudomonas和欧文氏菌属Erwinia，在土壤磷素的生物循环中发挥重要作用[13]。多数研究表明：溶磷细菌对磷酸铁盐(Fe-P)、磷酸铝盐(Al-P)或磷酸钙盐(Ca-P)和磷酸铅盐(Pb-P)等难溶性磷酸盐[78−81]具有良好的活化作用。由于其分布状态与群落结构存在显著的区域特异性、时空变异性和根际效应性[18, 82−85]，不同类群溶磷细菌的溶磷效能、种群分布及其在土壤磷素活化过程中的微生物互作机制可能因环境、宿主变化产生显著差异[85−89]。
3.1 溶磷细菌促进植物磷素获取的作用机制
酸解是难溶性磷酸盐(包括Fe-P、Al-P、Ca-P、Pb-P、O-P等)在土壤中溶解的主要方式。类似于植物和丛枝菌根真菌，细菌也能够分泌释放低分子量有机酸或伴随呼吸、铵根离子(NH4 +)同化释放H+，影响土壤pH[90−93]，而分泌物的种类、分泌量可能受到菌株类型、基因型的影响。SONG等[94]发现：洋葱伯克霍尔德菌株Burkholderia cepacia DA23释放的有机酸主要为葡萄糖酸；而吕俊等[95]发现：在马尾松Pinus massoniana根际土中分离得到的洋葱伯克霍尔德菌株则大量分泌柠檬酸、丙二酸等有机酸，表明细菌外分泌性有机酸种类存在差异，但有机酸的解离和H+的释放最终均会改变土壤磷素的有效性。
土壤有机磷的矿化与溶磷细菌外分泌性植酸酶、磷酸酶活性密切相关[96−99]，大约30%~40%的可培养土壤微生物产生植酸酶并利用植酸(如酵母菌将植酸作为唯一的利用磷源)[97−98]。不可培养的微生物中虽然也存在大量植酸酶，但受限于技术手段，目前研究较少[24]。溶磷细菌普遍具有分泌磷酸酶矿化土壤有机磷的能力。HNAMTE等[99]对休耕和耕种2种土壤分离鉴定得到的44株溶磷细菌，庄馥璐等[89]在苹果Malus pumila根际土壤中分离纯化得到的10株溶磷细菌，均能产生磷酸酶，但不同菌株生产磷酸酶能力呈现差异。此外，LIU等 [100]在水稻Oryza sativa根际土壤中分离得到的3种巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium均能合成铁载体，螯合Fe3+，表现出解磷能力。因此，溶磷细菌在土壤磷素资源的活化过程中具有相当贡献，而不同菌株种类和基因型差异可能导致溶磷细菌的解磷机制存在差异。
3.2 溶磷细菌-植物互作过程
溶磷细菌作为土壤与植物根系间磷养分转化和转运的调节因子，受土壤环境因素影响的同时，与植物生长和生理代谢之间具有显著交互作用。包括植物根系在内的植物组织器官为土壤微生物提供能量，刺激其生长和代谢活动[101]，释放碳水化合物、有机酸以及酶等化合物，为土壤微生物群体提供碳源[102]。相反，溶磷细菌通过合成植物激素[99−100, 103]，刺激根系生长，增加根系与磷素的接触面积以及细菌与植物根际的接触几率[103−105]。KUDOYAROVA等[103]研究表明：溶磷菌株Paenibacillus illinoisensis IB 1087 和 Pseudomonas extremaustralis IB-Ki-13-1A可合成生长素(IAA)，刺激根系生长；LIU等[100]发现：溶磷细菌Bacillus megaterium DD-2、Bacillus aryabhattai DD-3和Bacillus subtilis DD-4 均能产生IAA与赤霉素(GA)，对植物的根系生长产生积极作用。溶磷细菌合成植物激素刺激根系生长的同时也会刺激根系分泌物的产生，从而为细菌的生长、生存提供更多碳源[104]。
接种溶磷细菌可显著改善植株光合作用，增加碳固定。PANHWAR等[106]发现：水稻接种Bacillus sp.可显著促进水稻光合作用；谯天敏等[107]在核桃Juglans sigllata上接种温哥华假单胞菌Pseudomonas vancouverensis PAN4，发现植株净光合速率和叶绿素含量均会增加，增幅随接种浓度增高而增大。此外，溶磷细菌能够抑制植株病原菌生长，降低病害发生。MENDES等[108]在甘蔗Saccharum officinarum中分离得到的洋葱伯克霍尔德菌株可以产生抗真菌的代谢物。ETMINANI等[109]发现：防御假单胞菌Pseudomonas protegens Pb78对植物病原菌Pseudomonas syringae pv. syringae Pss20 和 Pseudomonas tolaasii Pt18具有强烈的抑制作用。然而，植物与根际微生物的互作过程可能影响根部扩散屏障的形成，作用于根内生细菌群落和根际微生物群落组成[110]，从而影响植物中矿质养分的平衡[111]以及胁迫的耐受性[83]。
4. 植物-丛枝菌根真菌-溶磷细菌的协同作用
4.1 丛枝菌根真菌外生菌丝与溶磷细菌的相互作用
虽然溶磷细菌和丛枝菌根真菌协调植物养分获取的过程存在一定差异，但溶磷细菌和丛枝菌根真菌在调控植物对土壤磷素的吸收和利用过程中并不孤立[17]，存在积极的相互作用。丛枝菌根真菌缺少有机磷矿化相关基因，依赖溶磷细菌从有机复合物中释放磷素[112−113]，而溶磷细菌的种类及丰度影响土壤有机磷库的矿化进程，可能决定了丛枝菌根真菌对土壤有机磷库的磷素获取能力[24, 113−114]。与根际微生物群落不同，丛枝菌根真菌可能具有高效溶磷菌株筛选的潜力，菌丝际菌群更具独特性、功能性[51]。NUCCIO等[115]通过根室和菌丝室分隔的双室培养系统发现：厚壁菌门Firmicutes类群对何氏球囊霉Glomus hoi有积极响应，而放线菌门Actinobacteria和丛毛单胞菌科Comamonadaceae类群对何氏球囊霉呈消极反应；ANDRADE等[116]对球囊霉属Glomus丛枝菌根真菌的菌丝际菌群鉴定发现：菌丝际菌群以芽孢杆菌属和节杆菌属Arthrobacter为主，根际以假单胞菌属为主，且不同丛枝菌根真菌处理菌丝际群落的多样性和丰度也存在差异；而WANG等[117]发现：在异形根孢囊霉Rhizophagus irregularis菌丝定殖的产碱假单胞菌Pseudomonas alcaligenes能够表现出溶磷功能，可能反映了丛枝菌根真菌菌丝对土壤微生物类群招募的选择性和对资源获取的需求性。
丛枝菌根真菌为细菌的移动提供物理结构和生存资源。丛枝菌根真菌外生菌丝在土壤中形成广泛的菌丝网络，溶磷细菌可以沿着菌丝表面水膜游动[118]到达根系表面和不同土壤空间，进而改变根际细菌群落[119]。然而由于土壤空间资源有效性时空斑块的存在，细菌群落的建立往往受到资源限制。丛枝菌根真菌通过外生菌丝体分泌植物光合产物，吸引和富集有益微生物[117]。ZHANG等[120]发现：丛枝菌根真菌可以分泌果糖吸引溶磷细菌富集，刺激细菌生长。JIANG等[118]也发现：菌丝分泌物刺激溶磷细菌数目的增加，但也有研究[121]认为：低磷条件下，溶磷细菌活性不受丛枝菌根真菌分泌物的刺激，同时存在磷养分竞争关系。
4.2 丛枝菌根真菌与溶磷细菌对植物的影响
丛枝菌根真菌与溶磷细菌间的协同作用介导植物的生长表现[122−123]。在南方红豆杉Taxus chinensis var. mairei根系同时接种草木樨中华根瘤菌Sinorhizobium meliloti CHW10B与缩球囊霉Glomus constrictum可以改变根际微生物组的群落结构及丰度，促进南方红豆杉的生长[124]；在玉米Zea mays根系接种链霉菌Streptomyces sp. W94和异形根孢囊霉时，异形根孢囊霉根外菌丝体的发育被促进，从而促进植株的根系生长和磷的吸收[125]；同时，也有研究表明：在红三叶草Trifolium pratense 根系同时接种摩西斗管囊霉Funneliformis mosseae和假单胞菌Pseudomonas sp.时，两者的协同作用不仅对红三叶草的生长和养分吸收无积极影响，而且不利于丛枝菌根真菌侵染植物根系[126]。因此，丛枝菌根真菌与溶磷细菌间的协同作用对植物生长表现的影响具有高度的物种特异性，其中菌根的形成及其作用的发挥可能是影响植物生长表现的主要因素之一。
菌根辅助菌即对丛枝菌根真菌孢子萌发或菌丝生长发挥积极作用的菌丝际细菌[51, 127]，主要包括假单胞菌属、芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属 Paenibacillus、红球菌属Rhodococcus和链霉菌属Streptomyces[123, 125, 127−130]，能够通过促进丛枝菌根真菌的定殖与发育影响植物性能表现，帮助丛枝菌根真菌与植物建立共生关系并将根际转变为菌根际。丛枝菌根真菌定殖过程中菌根辅助菌产生的IAA及其诱导的基因表达有助于菌根定殖期间的表型变化，进而促进定殖[131]，而丛枝菌根真菌的成功定殖也会诱导植物激素水平[132]和根系分泌物化学成分[128]的改变，从而引起根系形态、结构的改变，同时在分泌物的数量和质量上影响根际微生物种群，使植物可以通过调节不同过程，灵活地做出响应。
4.3 植物-丛枝菌根真菌-溶磷细菌间的信号交流
植物-丛枝菌根真菌-溶磷细菌协同互作进行物质交流以适应养分胁迫环境的同时，也产生一系列信号交流，调控植物和微生物相关基因的表达[74, 133]，进而可能推动微生物群落与植物的协同进化。植物、丛枝菌根真菌和溶磷细菌之间以丛枝菌根真菌为连接媒介，通过丛枝界面和菌丝际界面进行微调通信，菌丝际溶磷细菌影响植物-丛枝菌根真菌共生界面丛枝结构上碳-磷交换相关基因(MtPT4、MtHA1、STR)的表达水平[134]，菌丝际界面溶磷细菌分泌磷酸酶和葡萄糖酸，矿化有机磷，溶解难溶性无机磷[121, 135]，增加丛枝菌根真菌对有效磷的吸收和运输，进一步增强丛枝菌根真菌流向植物的磷通量以及植物向丛枝菌根真菌提供的碳通量。丛枝菌根真菌获得的碳，一部分用于丛枝菌根真菌自身生长发育，另一部分被丛枝菌根真菌外生菌丝转移到菌丝际环境招募溶磷细菌[117]，同时形成特定的菌丝际菌群[113]。WANG等[136]在不同气候区实地采样，并利用受控盆栽实验证明了菌丝际微生物组虽然受到环境因素的显著影响，但存在以α变形菌纲Alphaproteobacteria、放线菌门Actinobacteria和γ变形菌纲Gammaproteobacteria为主的核心成员，且相对丰度与磷酸酶活性显著相关。因此，菌丝分泌物因其独特性可能极大地塑造了特定菌丝际细菌的定殖和功能，可能是驱动溶磷细菌与丛枝菌根真菌之间选择的有效信号。同时，丛枝菌根真菌通过提供不稳定碳源增加细菌的数量和活性，其中果糖可能是丛枝菌根真菌-溶磷细菌界面的一种信号分子[121, 135]。溶磷细菌可以通过响应丛枝菌根真菌分泌的果糖调节蛋白质分泌系统，刺激磷酸酶基因的表达以及磷酸酶释放到生长介质中的速率[136]。也有研究表明[137]：溶磷细菌在响应丛枝菌根真菌分泌物的同时也会刺激菌丝表面磷转运蛋白基因的表达，进而促进磷的转运。
细菌利用自身的信号转导系统响应菌丝分泌物信号。双元信号系统(TCS)是细菌普遍存在且非常保守的感知和响应外界刺激的调节组分，也是重要的代谢调节系统[138]。DUAN等[139]分析了水拉恩氏菌Rahnella aquatilis TCS中参与碳传感和营养传感的16个基因以及参与调控无机、有机磷活化的8个基因的表达水平，发现TCS在识别菌丝分泌物和菌丝际营养信号中起关键作用，有效地调控菌丝际磷素活性。此外，ZHANG等[140]发现：丛枝菌根真菌可能通过刺激参与细菌三羧酸(TCA)循环中柠檬酸合成酶基因(glt A)的表达，影响溶磷细菌三磷酸腺苷的生成水平，进而影响溶磷细菌的代谢。然而，由于基因的遗传冗余、共生体系培养方式及原位分析技术手段的限制，植物-丛枝菌根真菌-溶磷细菌共生体系间的信号交流在很大程度上仍然未知。
5. 总结与展望
高效的磷养分循环是土壤、植物、微生物多界面互作的系统过程，磷养分胁迫下丛枝菌根真菌与溶磷细菌增强植物磷素获取能力的作用对植物生长和生产至关重要。根系作为植物吸收养分的主要器官，将地上和地下连为一体，控制着植物-土壤-微生物系统间的碳物质流动以在胁迫环境中招募丛枝菌根真菌、溶磷细菌定殖，并在土壤中形成以丛枝菌根真菌为纽带的“植物-根系-根际-丛枝菌根真菌-菌丝际-溶磷细菌”高度动态的根际生命共同体。菌丝际界面内丛枝菌根真菌与溶磷细菌的相互作用，提高了溶磷细菌矿化土壤有机磷和溶解难溶性无机磷的能力，促进了丛枝菌根真菌对土壤有效磷的吸收与转运，进而调控了植物对磷养分的获取、利用过程。现有研究探讨了受控条件下丛枝菌根真菌、溶磷细菌接种对植物生长发育表现的改善，多数研究局限于植物-丛枝菌根真菌、丛枝菌根真菌-溶磷细菌等单一性组合的作用结果，通常忽略了依赖于物种差异性、区域特异性以及时空变异性对植物-丛枝菌根真菌-溶磷细菌相互作用的功能产生的影响。
未来可以在以下几个方面进行深度研究：①丛枝菌根真菌在植物-丛枝菌根真菌-溶磷细菌互作体系中发挥关键作用，菌根属性是预测和理解生态系统磷养分循环的关键因素[141]。为深入了解菌根属性在植物-丛枝菌根真菌-溶磷细菌互作体系中的作用，破译互作体系作用机制，未来研究应在三者共生体系的基础上关注菌根形态、生理或物候特征与其功能属性的联系。②植物碳投入与收益间的平衡策略对深入理解植物-丛枝菌根真菌-溶磷细菌物质交换机制及其调控途径尤为重要，关注碳驱动下植物-根系-根际-丛枝菌根真菌-菌丝际-溶磷细菌体系的能量流动，分析、鉴定互作体系下植物、丛枝菌根真菌、溶磷细菌代谢物的组成及其潜在功能，对于丰富植物-根系-根际-土壤-微生物多界面互作增效，提高养分效率的相关理论基础具有重要意义。③在自然生态系统中大量的生物或非生物胁迫作用于植物-丛枝菌根真菌-溶磷细菌互作体系，进而影响其功能属性，使得田间条件下植物-丛枝菌根真菌-溶磷细菌互作增效作用机制持续成为一个重大的挑战。未来可深化土壤环境因素、土壤微生物竞争关系、生物菌剂施用对土壤微生物群落构建及其功能组装的影响研究，深入探讨人工合成菌群互作机制等途径，系统剖析可持续农林业生产的根际工程。
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图 2 不同转基因拟南芥株系中GFP-PABD融合基因的相对表达量
Figure 2 Relative expression level of the GFP-PABD fusion gene in transgenic A. thaliana lines
图 3 野生型拟南芥与3个PA荧光探针转基因株系的表型比较
Figure 3 Phenotypic comparison between wild type and three transgenic lines of A. thaliana bearing PA fluorescent probe
图 4 无外源PA处理下PA探针在野生型和2个转基因拟南芥株系根尖中荧光强度的差异分析
Figure 4 Analysis of discrepancy in fluorescent intensity of PA probe between wild type and two transgenic lines of A. thaliana
图 5 外源PA(2 μmol·L−1)处理下PA荧光探针对PA监测灵敏度的分析
Figure 5 Sensitivity analysis of PA fluorescent probe monitoring PA under treatment with 2 μmol·L−1 exogenous PA
图 6 外源PA (10 μmol·L−1)处理下PA荧光探针对PA监测灵敏度的分析
Figure 6 Sensitivity analysis of PA fluorescent probe monitoring PA under treatment with 10 μmol·L−1 exogenous PA
图 7 单独或混合盐碱胁迫下PA在转基因拟南芥根尖分生组织中的分布
Figure 7 Distribution of PA in the root tip meristem of a transgenic A. thaliana line bearing PA sensor under saline and alkaline stresses, alone or in combination
表 1 相关引物序列
Table 1. Sequence of related primers
用途 引物名称 引物序列(5′→3′) PABD基因合成 ZYP301 CCTGCTAATTTCAAGGCTAATTCATTGCTGTTCGCTCGAGATCTGAGTCCGGACTGCAGGTTGGATCCGGTACCGAGCT ZYP302 GAAGACGTGATAGGCTACATGTGAAGCTTAAATCCTTGAGGAATAAAATCCACAAACAACTTCACCCAAA ZYP303 TGCTTCCTGAACAATTGTCCATTCTAGATTCTGTCTTGTTGATATCAAGACCTGCTAATTTCAAGGCTAA ZYP304 GTACCCAAGCTTCACATGTAGCCTATCACGTCTTCTGCTTCCTGAACAATTGTCC ZYP305 CACAAACAACTTCACCCAAACTGTCGGTTCGATGACGCCACTAAGACTAGTTAAGGTACCGGCGTAATCATGGTC PABD基因克隆 ZYP308 TCCGGACTCAGATCTCGAGC ZYP309 AGCTATAGTTCTAGATCTAGATTAACTAGTCTTAGTGGCGTC GFP基因克隆 ZYP306 TATCGATGGCGCCAGCTGAGGATGGTGAGCAAGGGCGA ZYP307 AGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCCATCCGGACTCAGATCTCGAGC 转基因拟南芥鉴定 MSY01 TGGTGTTAGTTTCTAGTTTGTGCG MSY02 TCATCATGACAGATCTGCGC 表达量分析 ZYP389 GACCACTACCAGCAGAACACC ZYP390 CTTGTACAGCTCGTCCATGC 
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