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拟南芥磷脂酸荧光探针的构建及应用

马疏言 郑月萍 郑志富

庄家尧, 葛波, 杜妍, 等. 南京城郊麻栎林林内外温湿度变化特征[J]. 浙江农林大学学报, 2019, 36(1): 62-69. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.2019.01.009
引用本文: 马疏言, 郑月萍, 郑志富. 拟南芥磷脂酸荧光探针的构建及应用[J]. 浙江农林大学学报, 2024, 41(1): 104-112. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.20230355
ZHUANG Jiayao, GE Bo, DU Yan, et al. Variation characteristics of temperture and humidity inside and outside the Quercus acutissima forest in Nanjing outskirts[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2019, 36(1): 62-69. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.2019.01.009
Citation: MA Shuyan, ZHENG Yueping, ZHENG Zhifu. Generation and application of a fluorescent probe for phosphatidic acid in Arabidopsis thaliana[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2024, 41(1): 104-112. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.20230355

拟南芥磷脂酸荧光探针的构建及应用

DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.20230355
基金项目: 国家自然科学基金青年基金资助项目(32100209);浙江省自然科学基金青年基金资助项目(Q21C020003);国家自然科学基金面上基金资助项目(31871660)
详细信息
    作者简介: 马疏言(ORCID: 0009-0007-5802-6691),从事植物生理生化与代谢调控研究。E-mail: 1531861619@qq.com
    通信作者: 郑志富(ORCID: 0000-0002-8247-5629),教授,从事植物生化和代谢研究。E-mail: zzheng@zafu.edu.cn
  • 中图分类号: Q946.5

Generation and application of a fluorescent probe for phosphatidic acid in Arabidopsis thaliana

  • 摘要:   目的  磷脂酸(PA)是甘油脂生物合成的前体,又是参与植物生长发育调节和各种逆境响应的重要信使物质,然而目前对植物细胞中PA含量动态变化的了解十分有限。本研究试图构建一种能有效监测植物细胞PA含量变化的荧光探针,并用之测定盐碱胁迫过程中胞内PA含量的变化。  方法  将Spo20p蛋白中高度专一的PA结合域相对应的核苷酸序列与绿色荧光蛋白基因融合,经遗传转化获得携带该融合基因的转基因拟南芥Arabidopsis thaliana株系,其表达受组成型启动子UBQ10驱动,产生的融合蛋白成为专一结合PA的荧光探针。随后,运用该荧光探针监测盐碱胁迫下胞内PA含量的变化。  结果  构建获得7个不同的纯合、单插入位点转基因拟南芥株系。实时荧光定量PCR (RT-qPCR)分析显示:不同株系中融合基因的表达量存在差异。不同浓度外源PA处理试验显示:随着表达量的升高,PA探针可有效监测到2 μmol·L−1 PA处理根尖10 min后细胞中PA含量的变化;而当PA探针表达量较低时,对PA监测灵敏度显著下降,表明在一定程度上荧光探针对PA监测的灵敏度与其表达量相关联。运用PA荧光探针发现:盐碱胁迫处理根尖5 min即可诱导质膜上或胞内PA的积累,暗示PA在植物早期盐碱胁迫响应中可能产生重要作用。  结论  本研究构建了一种可对细胞内PA含量进行有效监测的荧光探针,该探针可用于监测植物盐碱胁迫早期响应过程中胞内PA水平的变化,从而为早期逆境响应研究提供新工具。图7表1参36
  • 城市周边森林蒸腾作用显著,可以有效降低城市周边气温,补充空气湿度,因绿化面积集中,其降温增湿作用远优于城市内部小面积绿地,是城市居民健康生活必不可少的一部分。研究城郊树种的温湿度变化特征具有现实意义[1]。吴力立[2]通过研究城郊和市区日空气相对湿度,得出了城市森林能有效地对邻近空间“补湿”。THANI等[3]调查不同城市景观形态的室外气温变化,观察到不同的城市地区小气候分布有着显著的差别,城市景观形态和小气候变动关系紧密。欧阳学军等[4]通过分析鼎湖山4种不同海拔高度森林温湿度差异,认为正确评价不同森林类型的小气候功能时,应准确区分开海拔高度、地形、植被类型等各个因素的影响,才能得出具有科学结论。邵永昌等[5]通过对上海地区17种绿化树种的蒸腾特性对比分析,筛选出了降温增湿效应较好的城市绿化树种。麻栎Quercus acutissima为落叶乔木,广泛分布在长江三角洲地区,是南京地区典型的优势树种。目前,关于麻栎林对小气候温湿度变化影响特征的研究较少。本研究以南京市城郊麻栎林为研究对象,以裸地作为对照,分析麻栎林林内外温湿度变化规律,探讨其降温增湿能力,旨在为南京市城郊植被恢复、人工林营造提供科学依据,为麻栎林的合理经营以及选择社会效益、经济效益、降温增湿效益相结合的城市绿化树种提供理论基础。

    试验区位于长江三角洲区西部南京市国有东善桥林场铜山分场(31°35′~31°39′N,118°50′~118°52′E),属北亚热带季风气候区,年平均气温为15.1 ℃,无霜期为229.0 d,年日照时间为2 199.0 h。区内气候温和湿润,四季分明,水热资源比较丰富,生长季长。年平均降水量为1 100.0 mm,地形为苏南丘陵,土壤类型为黄棕壤,坡向均为东北向(NE),土壤厚度为60 cm,60 cm以下为砂岩风化母质层,海拔26.0 m,地下水位位于10.0 m以下。选择不受林缘和林窗影响的麻栎Quercus acutissima林与裸地为测量试验地点,试验样地均为100 m × 100 m,麻栎林地平均坡度为18°;林木平均胸径为24.3 cm,平均冠幅为5.7 m,平均树龄为45 a,平均树高为16.8 m;林分密度为425株·hm-2,郁闭度为0.89。

    1.2.1   温湿度的测定

    在麻栎林、裸地样地中选择光照条件、土壤状况一致的试验点设置2个Decagon自动气象站,间隔15 min记录1次数据,气象站距离地面1.2 m。麻栎林试验点位置距离样地中心5 m,裸地试验点距离样地中心0.8 m。于2012年1月1日至2012年12月25日连续监测麻栎林地与裸地气温和相对湿度。以麻栎林温湿度作为林内温湿度数据,裸地温湿度作为林外温湿度数据。采用气候学统计法进行四季划分,以公历3-5月为春季,6-8月为夏季,9-11月为秋季,12至次年2月为冬季。为消除降雨对林内外气温的影响,选择前3 d无降雨的3月16日、6月1日、9月4日、12月23日代表春、夏、秋、冬各季林内外气温的日变化。取8月15日、8月18日、8月20日数据分别代表晴天、雨天、阴天林内外相对湿度的日变化;取2012年1-12月每月瞬时数据的平均值作为该月温湿度值,进行林内外温湿度季节变化分析;取2012年1-12月每日瞬时数据的平均值作为日温湿度,计算季节积温和相对湿度。

    1.2.2   降雨量的测定

    为减少林缘的影响,在距离麻栎林林外10 m处采用雨量筒和RG3-M翻斗式自记雨量计测定降雨量和降雨历时,记录间隔5 min。

    1.2.3   数据处理及方法

    ① 湿润度的计算。伊万诺夫湿润度综合考虑了气温、降雨量、相对湿度对干旱程度的影响,可以更好地分析林分的干旱趋势[6]。本研究采用伊万诺夫湿润度K说明麻栎林林内外湿润状况,其表达式为:

    $ K = \frac{R}{{0.0018 \times {{\left( {25 + T} \right)}^2} \times \left( {100 - F} \right)}}。 $

    其中:K为湿润度,R为降雨量,T为平均气温,F为平均相对湿度。K>1.0为湿润,0.6~1.0为半湿润,0.3~0.59为半干旱,0.13~0.29为干旱,<0.13为极干旱。②数据处理。使用Excel 2013进行数据处理和表格制作,Origin 8.5绘制图件,SPSS 19.0进行方差齐性检验、均值t检验和相关性分析。

    2.1.1   气温日变化特征

    经调查,四季林内外气温变化趋势基本一致(图 1):气温日变化均表现为林外大于林内。整体变化呈抛物线型,6:00-14:00呈上升趋势,并在14:00达最高值。上升阶段气温除夏季外均为林外高于林内,其中夏季林内外的气温变化幅度最大,因为夏季是麻栎林生长旺季,白天植物蒸腾作用、夜晚的呼吸作用均较强,微生物活动较为频繁,使夏季林内外气温日变化波动较大[7]。春季林内外气温日变化幅度最小,温度差保持在1~2 ℃内。随着时间的推移,8:00-16:00气温均为林外高于林内,这可能是由于麻栎林的林冠反射和吸收作用消弱了太阳辐射到达林内的能量,大大降低了白天林内气温[8]。18:00-24:00林内外温度基本保持一致,因为夜晚辐射冷却,麻栎林对气温的调节作用降到最低。

    图  1  不同季节林内外气温日变化
    Figure  1.  Diurnal variation of temperature inside and outside the forest in different seasons
    2.1.2   气温日较差变化特征

    各月气温日较差均值结果显示(表 1图 2):各月气温日较差均为林内小于林外,除9月林内最高气温大于林外,各月份日较差均为正值,除6,9,10,11月林内最低气温大于林外,各月份日较差均为正值,林内气温最大日较差出现在9(13.2 ℃),林外气温最大日较差出现在4月(14.8 ℃),说明麻栎林林分具有降低高温、提高低温的调节作用。9月南京铜山地区出现极热天气,林分阻止了林内外热量的交互,随着林内蒸发增多,负反馈大于正反馈,出现了林内最高温、最低温高于林外的现象。6和9月麻栎林林内微生物活动较为频繁,10和11月麻栎林枯枝落叶物增多,致使林内夜晚保温作用较为明显,白天林冠的遮荫和林分的摩擦阻挡,林内风速较林外小,热量交互作用减少,使得林内白天保温作用较好[9]

    表  1  林内外气温日较差
    Table  1.  Diurnal temperature range of inside and outside the forest
    月份 平均最高气温/℃ 平均最低气温/℃
    林外 林内 差值 林外 林内 差值
    1 4.0 2.6 1.5 -5.3 -5.6 0.3
    2 10.9 9.0 1.9 0.1 -0.2 0.3
    3 15.7 14.0 1.7 2.7 2.3 0.4
    4 23.8 21.5 2.4 9.3 9.0 0.2
    5 28.4 25.6 2.8 14.9 14.8 0.1
    6 29.2 27.2 2.1 19.7 19.8 -0.1
    7 32.4 30.2 2.3 23.8 23.7 0.1
    8 31.5 29.3 2.3 23.1 23.1 0.1
    9 27.7 31.6 -3.9 18.3 18.4 -0.1
    10 22.7 20.4 2.3 12.2 12.4 -0.2
    11 20.0 17.9 2.2 9.5 9.6 -0.1
    12 8.3 7.1 1.2 -1.3 -1.3 0
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    图  2  各月林内外气温日较差平均值
    Figure  2.  Average temperature daily range each month
    2.1.3   气温月变化特征

    图 3所示:各个月份平均气温均为林内低于林外,各月份林内气温分别降低了0.6,0.7,0.3,0.5,1.5,0.5,0.6,0.6,0.3,0.4,0.4,0.2 ℃。林内外平均气温均为7月最高(林内26.6 ℃,林外27.3 ℃)。5-8月林内气温降幅最大,此时正处于麻栎林生长旺季,说明麻栎林在生长旺季能有效降低林内气温。9-12月林内外温差均小于0.5 ℃,由于麻栎是落叶乔木,在冬季落叶后,随着枯枝落叶的腐烂,土壤呼吸作用随之增加,使林内降低气温的作用减弱。

    图  3  各月林内外气温平均值
    Figure  3.  Average temperature inside and outside the forest each month
    2.1.4   气温月较差

    图 4所示:各月份气温月较差均为林内小于林外,林内气温月较差平均值为22.6 ℃,林外气温月较差平均值为25.7 ℃。林内外气温月较差从大到小均依次为春季、夏季、秋季、冬季。这主要是是因为苏南丘陵区地处北亚热带季风气候区,春暖秋凉,夏热冬寒,四季分明,春夏季气温昼夜变化较大,使土壤呼吸作用速率增加,有利于麻栎林的生长复绿。

    图  4  各月林内外气温月较差平均值
    Figure  4.  Monthly range of temperature each month
    2.1.5   麻栎林的降温效应

    全年四季的积温(为所有气温瞬时数据的总和)结果显示(图 5):春季、夏季、秋季、冬季均为林内积温低于林外积温,其中林内外积温差,夏季最多(5 167.4 ℃),春季次之,秋季最少(186.2 ℃)。总结林内外气温日、月、季节分析发现,麻栎林林内气温较林外气温低,对气温有一定的调节作用,降温作用较明显。

    图  5  各季节林内外气温积温
    Figure  5.  Accumulated temperature each season
    2.2.1   晴天

    晴天林内外相对湿度的日变化曲线显示(图 6),无论是林内还是林外,温湿度变化均呈现对称规律,且在7:00-18:00,林内气温低于林外气温,林内相对湿度高于林外相对湿度。林内外相对湿度在0:00-7:00处于相对稳定阶段,在7:00-18:00,林内外相对湿度出现明显变化,在14:00相对湿度达最低点。林内外相对湿度最小值差值为13.4%。主要是因为林内麻栎冠层的存在,使林内的乱流强度变弱,减少了林内水汽的上升扩散,林内气温低和林内地表植被的作用使锁湿能力变强,当林内气温高时,蒸腾作用使林内相对湿度减少以保证林下植被的生长,所以增湿作用的峰点和降温作用的峰点相对应[10]

    图  6  晴天林内外相对温湿度日变化
    Figure  6.  Temperature and related humidity diurnal changes on sunny days
    2.2.2   雨天

    雨天林内外温湿度变化曲线和晴天相似,温湿度变化曲线呈对称特征,林内气温高时相对湿度低(图 7)。麻栎林在7:00相对湿度开始呈减少趋势,裸地在8:00相对湿度呈减少趋势,说明了麻栎林在白天会提前减少林内相对湿度,且麻栎林相对湿度减少和增加的速度小于裸地,麻栎林的呼吸作用和林冠层起到了保湿的作用。0:00-16:00林内外相对湿度变化曲线呈U型,在11:00达到谷底,最大差值为10.5%,16:00-24:00林内外相对湿度变化曲线呈现第2个U型,在15:00达到谷底。

    图  7  雨天林内外相对温湿度日变化
    Figure  7.  Temperature and related humidity diurnal changes on rainy days
    2.2.3   阴天

    阴天林内外空气温湿度变化规律较雨天和晴天弱(图 8),林外相对湿度变化和林内气温变化规律性较差,林内变化在4:00-7:00,10:00-16:00,19:00-21:00较平稳,相对湿度和气温的变化规律晴雨天一致,呈现对称现象。白天林内相对湿度小于林外,林内气温小于林外。

    图  8  阴天林内外相对温湿度日变化
    Figure  8.  Temperature and related humidity diurnal changes on overcast days
    2.2.4   月相对湿度变化特征

    各月份林内外相对湿度平均值结果显示(图 9):林内外相对湿度均为8月最大(92.3%,90.7%),7月次之(90.4%,88.8%)。3月林内相对湿度最小,为65.6%;4月林外相对湿度最小,为65.7%。林内外差值幅度最大出现在5月,为2.6%。夏秋两季均为林内相对湿度大于林外,平均高幅为1.4%,表明在枝繁叶茂的夏秋季节麻栎林的增湿效应较明显。1,2,3,12月林内相对湿度小于林外,出现这种现象的原因是春、冬两季麻栎林季节型落叶,林内蒸发强度增强,林冠遮光保湿作用减弱,同时春季植物生长消耗大量林内水分,冬季凋落物腐化吸收大量地表水分,使得林内相对湿度较林外低。夏、秋季节林分郁闭度高,降雨截留和林内蒸发的水分得以长时间存在林内,使林内相对湿度较林外高[11]

    图  9  不同月份林内外相对湿度平均值
    Figure  9.  Average value of related humidity of different months
    2.2.5   麻栎林的增湿效应

    统计各个季节林内外相对湿度积累量(春、夏、秋、冬四季所有湿度瞬时数据的总和)显示(图 10):春、夏、秋、冬季均为林内高于林外。夏季相对湿度积累量最多,秋季林内外相对湿度积累量次之,春季相对湿度积累量最少。林内外相对湿度积累量差值夏季最大,林内外相对湿度积累量差值为18 048.99%,最小的为冬季4 464.27%。

    10  各个季节林内外相对湿度积累量
    10.  Accumulation of related humidity inside and outside of each season

    由麻栎林各月降雨量计算得出林内外湿润表(表 2)。由表 2可知:全年无干旱天气,林内湿润指数均高于林外。林内外湿润度有较强的同步性。2,7,8,9,10,11,12月林内外湿润度表现为湿润;1,3,4,5月林内外湿润度为半湿润;1,3,4,5月林下植物生长繁茂,呼吸作用下消耗大量林内水分。2月降雨补充较多,所以表现为湿润。全年林内湿润度为1.54,为苏南地区麻栎林的生长提供湿润的生长环境。

    表  2  麻栎林各月份降雨量及林内外湿润表
    Table  2.  Rainfall each month and degree of wetness inside and outside the forest
    月份 降雨量/mm 湿润度
    林内 林外
    1 20.8 0.74 0.68
    2 75.3 2.15 2.01
    3 61.2 0.90 0.88
    4 67.1 0.69 0.64
    5 80.3 0.81 0.72
    6 37.8 0.83 0.69
    7 178.2 3.88 3.25
    8 206.0 5.79 4.65
    9 73.3 1.35 1.21
    10 58.3 1.28 1.18
    11 45.7 1.26 1.01
    12 45.2 1.63 1.62
    全年 949.2 1.54 1.39
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    2.3.1   线性分析

    根据全年的观测数据,对林内外温湿度进行统计分析和曲线模拟得到表 3,发现林内外气温和林内外相对湿度均有较强的相关性,林内外气温相关系数除9月外,均在0.98以上,具有显著的线性关系,经检验相关性显著(P<0.001)。9月林内气温波动较大,9月16-17日出现日平均气温达30.8和28.3 ℃,均明显高于本月其他日平均气温。林内外相对湿度变化相关性和气温变化相关性基本一致,在9月气温波动剧烈时,相对湿度相关性显著程度最差,其余各月相关性均在0.95以上。夏季林内外温湿度相关性最差,可能是因为夏季树冠遮荫和林内植物蒸腾作用达到最高[12],林内温湿度主要受林内植物自身活动影响。其他季节,林内外温湿度变化走势趋于一致。

    表  3  林内外温湿度回归方程
    Table  3.  Temperature and related humidity regression equation inside and outside the forest
    月份 气温(林内y,林外x 相对湿度(林内y,林外x 样本数
    回归方程 相关系数 回归方程 相关系数
    1 y=0.984 9x-0.576 2 0.992 3 y=0.972 9x+0.031 6 0.996 4 2 976
    2 y=0.967 4x-0.506 3 0.989 0 y=0.968 1x+0.030 5 0.996 2 2 688
    3 y=1.024 0x-0.536 0 0.995 6 y=1.002 3x-0.000 5 0.996 7 2 976
    4 y=0.973 2x-0.037 6 0.996 5 y=0.944 0x+0.051 4 0.979 6 2 880
    5 y=0.964 5x+0.086 3 0.996 0 y=0.929 4x+0.075 8 0.983 0 2 975
    6 y=0.914 6x+1.479 9 0.988 6 y=0.828 4x+0.168 7 0.960 3 2 880
    7 y=0.881 7x+2.582 9 0.991 3 y=0.674 3x+0.305 3 0.954 8 2 976
    8 y=0.907 6x+1.855 4 0.992 5 y=0.651 8x+0.332 4 0.936 1 2 976
    9 y=1.109 1x-2.645 8 0.921 9 y=0.888 3x+0.113 9 0.873 1 2 880
    10 y=0.953 9x+0.370 9 0.986 1 y=0.863 9x+0.123 3 0.966 1 2 976
    11 y=1.013 6x-0.549 2 0.997 6 y=0.963 0x+0.034 6 0.978 1 2 880
    12 y=0.720 2x+0.607 4 0.997 9 y=0.941 1x+0.045 7 0.962 7 2 360
    全年 y=0.886 6x+1.207 6 0.972 3 y=0.961 8x+0.042 3 0.978 0
    说明:差异显著性水平为P<0.001
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    2.3.2   全年温湿度相关性分析

    根据全年观测数据对麻栎林林内外气温、相对湿度进行独立样本t检验。结果显示:显著性P气温=0.582>0.05,P相对湿度=0.229>0.05,林内外温湿度全年差异性不显著。这说明:从全年看麻栎林降温保湿作用较弱。夏季P相对湿度=0.004<0.05,春季P气温>全年P气温>秋季P气温>0.05,冬季P湿度>秋季P湿度>春季P湿度>0.05。夏季增湿作用较显著,降温显著性较差,春季麻栎林调节气温的作用最差,冬季麻栎林调节湿度的作用最差。麻栎林是落叶乔木,夏季林分枝繁叶茂,林内微生物活动频繁,林冠遮盖作用和林内蒸发蒸腾作用下保湿作用优于其他季节,冬季落叶后降温保湿作用得不到体现,春季为麻栎林次年生长初期,林冠盖度小且林内植被生长需水量大,林内气温受林缘自然风影响严重,降温效果为全年最差。

    2.3.3   夏季温湿度相关性分析

    对全年相关性分析发现夏季气温变化不显著。张昌顺等[13]在北京城市绿地对热岛效应的缓解作用中指出:林分对气温的调节作用在白天和夜晚有较大的差异。根据夏季收集数据将8:00,14:00和20:00时的数据整合进行SPSS分析,结果显示:8:00时夏季P气温=0.798>0.05,夏季P相对湿度=0.789>0.05,14:00时夏季P气温=0.005<0.05,夏季P相对湿度=0.003<0.05,20:00时夏季P气温=0.86>0.05,夏季P相对湿度=0.776>0.05,表明在中午时分麻栎林降温增湿作用均较强,植物主要通过自身蒸腾作用消耗周围的热量来达到降温效应[14],麻栎林夏季中午时分林内蒸腾作用最强,所以夏季中午林分降温作用较其他时段显著。

    通过2012年1月1日至12月25日的观测,研究了麻栎林林内外温湿度年际变化特征,主要结论为:①本研究中林内外气温日变化幅度从大到小排列为:夏季、秋季、冬季、春季,林内最大日较差出现在9月,林外最大日较差出现在4月,林内气温振幅均小于林外气温振幅,林内由于林冠遮荫减少了林内外热量的交互,以及枯枝落叶的覆盖,使林内气温振幅较林外裸地小,表明麻栎林在生长旺季由于林内微生物活动、蒸腾作用最高,麻栎林夜晚保温,白天降温的作用较明显。②5-8月麻栎林降低气温幅度最大,9-12月林内外温差均小于0.5 ℃,林内外气温月较差从大到小均依次为春季、夏季、秋季、冬季。全年积温均为林内低于林外,季节积温从大到小依次为夏季、春季、冬季、秋季。表明麻栎林的存在可以有效降低全年林内气温总和,在生长旺季麻栎林能有效降低林内气温,季节性落叶后降低温作用越来越弱。③晴天、雨天、阴天林内外相对湿度日变化曲线为U型,温湿度变化曲线相互对称。林内外相对湿度均为8月最大,夏秋两季相对湿度均为林内高于林外,表明麻栎林林冠的遮盖作用,使林内的风速较林外小,有效减少了林内外乱流交换,林内蒸发作用和植被蒸腾产生的水蒸气可以长时滞留在林内近地面,使得林内湿度较林外湿度高,麻栎林具有显著的增湿作用,春、冬两季麻栎林落叶后林内蒸发速度较快,林冠遮荫保湿作用减弱,春季植物生长消耗大量林内水分,冬季枯落物腐化吸收大量水分。夏、秋季节林分郁闭度高,降雨截留和林内蒸发的水分得以长时间存在林内,使林内相对湿度较林外高。④麻栎林可以改良土壤的湿润程度,可以有效保持林分的湿润度,为林下生物活动提供良好的生长环境。通过整合全年降雨量数据,计算出麻栎林林内外全年的湿润度,全年无干旱,林内湿润指数和林内温湿度关系密切,2,7,8,9,10,11,12月林内外湿润度为湿润,1,3,4,5月林内外湿润度为半湿润,全年林内外湿润度林内(1.54)大于林外(1.39),为湿润。⑤林内外温湿度具有显著线性关系,全年气温线性回归方程为y = 0.886 6x + 1.207 6,R2 = 0.972 3,全年相对湿度线性回归方程为y = 0.961 8x + 0.042 3,R2 = 0.978 0。根据全年观测数据对麻栎林林内外气温、相对湿度进行均值检验,林内外温湿度全年差异性不显著,但是夏季湿度P<0.05,14:00温湿度P<0.05,说明了在生长旺季的夏季麻栎林的降温增湿作用显著,优于其他季节,且在中午时分降温增湿作用较显著,春季麻栎林生长复绿后林分起到的降温作用最弱,冬季麻栎林落叶后林分起到的增湿作用最弱。

  • 图  1  pSY06-GFP-PABD载体图

    Figure  1  Vector diagram of pSY06-GFP-PABD

    图  2  不同转基因拟南芥株系中GFP-PABD融合基因的相对表达量

    Figure  2  Relative expression level of the GFP-PABD fusion gene in transgenic A. thaliana lines

    图  3  野生型拟南芥与3个PA荧光探针转基因株系的表型比较

    Figure  3  Phenotypic comparison between wild type and three transgenic lines of A. thaliana bearing PA fluorescent probe

    图  4  无外源PA处理下PA探针在野生型和2个转基因拟南芥株系根尖中荧光强度的差异分析

    Figure  4  Analysis of discrepancy in fluorescent intensity of PA probe between wild type and two transgenic lines of A. thaliana

    图  5  外源PA(2 μmol·L−1)处理下PA荧光探针对PA监测灵敏度的分析

    Figure  5  Sensitivity analysis of PA fluorescent probe monitoring PA under treatment with 2 μmol·L−1 exogenous PA

    图  6  外源PA (10 μmol·L−1)处理下PA荧光探针对PA监测灵敏度的分析

    Figure  6  Sensitivity analysis of PA fluorescent probe monitoring PA under treatment with 10 μmol·L−1 exogenous PA

    图  7  单独或混合盐碱胁迫下PA在转基因拟南芥根尖分生组织中的分布

    Figure  7  Distribution of PA in the root tip meristem of a transgenic A. thaliana line bearing PA sensor under saline and alkaline stresses, alone or in combination

    表  1  相关引物序列

    Table  1.   Sequence of related primers

    用途引物名称引物序列(5′→3′)
    PABD基因合成 ZYP301 CCTGCTAATTTCAAGGCTAATTCATTGCTGTTCGCTCGAGATCTGAGTCCGGACTGCAGGTTGGATCCGGTACCGAGCT
    ZYP302 GAAGACGTGATAGGCTACATGTGAAGCTTAAATCCTTGAGGAATAAAATCCACAAACAACTTCACCCAAA
    ZYP303 TGCTTCCTGAACAATTGTCCATTCTAGATTCTGTCTTGTTGATATCAAGACCTGCTAATTTCAAGGCTAA
    ZYP304 GTACCCAAGCTTCACATGTAGCCTATCACGTCTTCTGCTTCCTGAACAATTGTCC
    ZYP305 CACAAACAACTTCACCCAAACTGTCGGTTCGATGACGCCACTAAGACTAGTTAAGGTACCGGCGTAATCATGGTC
    PABD基因克隆 ZYP308 TCCGGACTCAGATCTCGAGC
    ZYP309 AGCTATAGTTCTAGATCTAGATTAACTAGTCTTAGTGGCGTC
    GFP基因克隆 ZYP306 TATCGATGGCGCCAGCTGAGGATGGTGAGCAAGGGCGA
    ZYP307 AGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCCATCCGGACTCAGATCTCGAGC
    转基因拟南芥鉴定 MSY01 TGGTGTTAGTTTCTAGTTTGTGCG
    MSY02 TCATCATGACAGATCTGCGC
    表达量分析 ZYP389 GACCACTACCAGCAGAACACC
    ZYP390 CTTGTACAGCTCGTCCATGC
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出版历程
  • 收稿日期:  2023-06-08
  • 修回日期:  2023-07-27
  • 录用日期:  2023-07-28
  • 网络出版日期:  2024-01-19
  • 刊出日期:  2024-02-20

拟南芥磷脂酸荧光探针的构建及应用

doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20230355
    基金项目:  国家自然科学基金青年基金资助项目(32100209);浙江省自然科学基金青年基金资助项目(Q21C020003);国家自然科学基金面上基金资助项目(31871660)
    作者简介:

    马疏言(ORCID: 0009-0007-5802-6691),从事植物生理生化与代谢调控研究。E-mail: 1531861619@qq.com

    通信作者: 郑志富(ORCID: 0000-0002-8247-5629),教授,从事植物生化和代谢研究。E-mail: zzheng@zafu.edu.cn
  • 中图分类号: Q946.5

摘要:   目的  磷脂酸(PA)是甘油脂生物合成的前体,又是参与植物生长发育调节和各种逆境响应的重要信使物质,然而目前对植物细胞中PA含量动态变化的了解十分有限。本研究试图构建一种能有效监测植物细胞PA含量变化的荧光探针,并用之测定盐碱胁迫过程中胞内PA含量的变化。  方法  将Spo20p蛋白中高度专一的PA结合域相对应的核苷酸序列与绿色荧光蛋白基因融合,经遗传转化获得携带该融合基因的转基因拟南芥Arabidopsis thaliana株系,其表达受组成型启动子UBQ10驱动,产生的融合蛋白成为专一结合PA的荧光探针。随后,运用该荧光探针监测盐碱胁迫下胞内PA含量的变化。  结果  构建获得7个不同的纯合、单插入位点转基因拟南芥株系。实时荧光定量PCR (RT-qPCR)分析显示:不同株系中融合基因的表达量存在差异。不同浓度外源PA处理试验显示:随着表达量的升高,PA探针可有效监测到2 μmol·L−1 PA处理根尖10 min后细胞中PA含量的变化;而当PA探针表达量较低时,对PA监测灵敏度显著下降,表明在一定程度上荧光探针对PA监测的灵敏度与其表达量相关联。运用PA荧光探针发现:盐碱胁迫处理根尖5 min即可诱导质膜上或胞内PA的积累,暗示PA在植物早期盐碱胁迫响应中可能产生重要作用。  结论  本研究构建了一种可对细胞内PA含量进行有效监测的荧光探针,该探针可用于监测植物盐碱胁迫早期响应过程中胞内PA水平的变化,从而为早期逆境响应研究提供新工具。图7表1参36

English Abstract

庄家尧, 葛波, 杜妍, 等. 南京城郊麻栎林林内外温湿度变化特征[J]. 浙江农林大学学报, 2019, 36(1): 62-69. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.2019.01.009
引用本文: 马疏言, 郑月萍, 郑志富. 拟南芥磷脂酸荧光探针的构建及应用[J]. 浙江农林大学学报, 2024, 41(1): 104-112. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.20230355
ZHUANG Jiayao, GE Bo, DU Yan, et al. Variation characteristics of temperture and humidity inside and outside the Quercus acutissima forest in Nanjing outskirts[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2019, 36(1): 62-69. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.2019.01.009
Citation: MA Shuyan, ZHENG Yueping, ZHENG Zhifu. Generation and application of a fluorescent probe for phosphatidic acid in Arabidopsis thaliana[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2024, 41(1): 104-112. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.20230355
  • 磷脂酸(phosphatidic acid,PA)是一种常见的细胞甘油磷脂,也是最简单的膜脂之一[1]。几乎所有生物体内都会产生PA,包括酵母[2]、动物[3]和植物[4]等。在植物中PA的合成主要包括2种方式:第1种是从头合成途径,3-磷酸甘油先后在3-磷酸甘油酰基转移酶和溶血磷脂酸脂酰基转移酶的作用下发生连续2步酰化反应生成PA,这也是PA合成的主要途径[5];第2种是磷脂的降解途径,磷脂降解又可分为2种,一种是磷脂酶D通过水解某些结构磷脂直接生成PA[69],另一种是磷脂酶C通过水解磷脂酰肌醇生成二脂酰甘油[10],继而经二脂酰甘油激酶磷酸化生成PA[11]。PA作为一种结构膜脂,磷酸基团头部能够以“静电/氢键开关模型”的方式与蛋白质结合[12]。在该模型中,PA结合蛋白中带正电荷的碱性氨基酸残基[1317],可以吸引磷脂双分子层上的负电荷,并通过静电作用影响膜环境,继而与PA头部的磷酸基团形成氢键,产生一个稳定的蛋白质结合位点。PA这种携带负电荷并且在生理条件下呈圆锥体的独特分子构型[18],使得PA结合蛋白的结构域能够特异性的与其结合,保证了生物膜结构的稳定和功能的发挥。除了作为膜脂的一个结构成分以及甘油脂合成的前体物质,PA还是一个关键信号分子,在多种生物学过程中发挥重要作用。正常条件下,行使信号功能的PA含量甚微;在植物应答各种生物与非生物胁迫过程中PA水平则会迅速升高,但这种积累往往是短暂的。这说明生物体拥有一套严格控制信号分子PA含量的机制,这对调节PA信号传递强度、维持细胞物质与能量代谢的动态平衡至关重要[1922]

    尽管PA拥有多种功能,但目前对于细胞内PA含量的动态变化仍知之甚少,这主要受PA检测手段的限制。过去主要采用诸如薄层层析、高效液相色谱和放射性同位素标记等理化手段对其含量进行测定[23]。近年来,质谱分析技术的应用使得对包括PA在内的各种脂质的测定更准确和高效[2425]。然而,这些理化手段都只能对组织器官中PA总量与种类进行定量或定性分析,无法捕捉细胞内PA的动态与瞬时变化信息。通常认为,内质网上的PA含量相对较高,这有助于促进磷脂和三酰甘油的合成[2627];而质膜和细胞器中行使信号功能的PA含量甚微。显然,采用理化测定会掩盖胞内PA的真实变化。因此,亟需开发一种能可视化分析细胞内PA的工具。

    大量研究表明:生物体中PA结合蛋白种类繁多,这些蛋白中的PA结合域(phosphatidic acid binding domains,PABD)结构亦存在差异。其中一些PABD因与PA结合专一性强,被用来开发多种PA探针 [2833]。酵母蛋白Spo20p中的PA结合域已被证实具有极强的专一性[33],只结合PA而不结合其他磷脂。目前基于这一PABD所开发的PA探针在医学研究中应用广泛,但在植物中的应用却有限[34]。因此,本研究旨在构建基于Spo20p中的PABD的植物PA荧光探针,为剖析植物早期应答逆境胁迫的细胞分子机制提供新工具。

    • 将拟南芥Arabidopsis thaliana种子置于含有湿润滤纸的培养皿中,4 ℃冰箱内避光放置3 d后将其点播在湿润的土壤基质上(V营养土V蛭石V珍珠岩=3∶1∶1)。将播种后的盆栽用透明塑料盖覆盖,置于24~25 ℃室温、50%~60%湿度、14 h光照/10 h黑暗的植物培养箱中培养,7 d后揭去塑料盖间苗。

    • 将拟南芥种子进行消毒,加入适量灭菌过的蒸馏水,在4 ℃冰箱内避光放置3 d,点播在1/2 MS培养基上,置于植物培养间中培养。

    • 酵母蛋白Spo20p中存在一个高度专一的PA结构域(PABD),该PABD由40个氨基酸残基构成,只结合PA而不结合其他磷脂[3334],因此,本研究选择该PABD与荧光蛋白融合,构建PA荧光探针。根据PAPD核苷酸序列[33]设计引物(表1)进行PCR扩增,获得与该PABD相对应的DNA片段;同时PCR扩增获得GFP基因编码区序列。随后,利用无缝克隆试剂盒(生工),将GFPPABD片段克隆至植物表达载体pSY06的限制性内切酶位点Kpn I和Pst I之间,获得重组质粒pSY06-GFP-PABDPABD连接至GFP基因编码区的3′端,构成GFP-PABD融合基因,该融合基因的表达由组成型启动子UBQ10驱动。重组质粒中的插入片段经菌落PCR、Kpn I和Pst I双酶切以及测序验证正确后,采用热激法将质粒转化至农杆菌Agrobacterium tumefaciens GV3101,用于后续拟南芥遗传转化。

      表 1  相关引物序列

      Table 1.  Sequence of related primers

      用途引物名称引物序列(5′→3′)
      PABD基因合成 ZYP301 CCTGCTAATTTCAAGGCTAATTCATTGCTGTTCGCTCGAGATCTGAGTCCGGACTGCAGGTTGGATCCGGTACCGAGCT
      ZYP302 GAAGACGTGATAGGCTACATGTGAAGCTTAAATCCTTGAGGAATAAAATCCACAAACAACTTCACCCAAA
      ZYP303 TGCTTCCTGAACAATTGTCCATTCTAGATTCTGTCTTGTTGATATCAAGACCTGCTAATTTCAAGGCTAA
      ZYP304 GTACCCAAGCTTCACATGTAGCCTATCACGTCTTCTGCTTCCTGAACAATTGTCC
      ZYP305 CACAAACAACTTCACCCAAACTGTCGGTTCGATGACGCCACTAAGACTAGTTAAGGTACCGGCGTAATCATGGTC
      PABD基因克隆 ZYP308 TCCGGACTCAGATCTCGAGC
      ZYP309 AGCTATAGTTCTAGATCTAGATTAACTAGTCTTAGTGGCGTC
      GFP基因克隆 ZYP306 TATCGATGGCGCCAGCTGAGGATGGTGAGCAAGGGCGA
      ZYP307 AGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCCATCCGGACTCAGATCTCGAGC
      转基因拟南芥鉴定 MSY01 TGGTGTTAGTTTCTAGTTTGTGCG
      MSY02 TCATCATGACAGATCTGCGC
      表达量分析 ZYP389 GACCACTACCAGCAGAACACC
      ZYP390 CTTGTACAGCTCGTCCATGC
    • 以哥伦比亚野生型拟南芥(WT)为植物材料,利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥。将获得的T1代拟南芥种子进行表面消毒,均匀铺在含有草铵膦(10 mg·L−1)和特美汀(50 mg·L−1)的1/2 MS筛选培养基上进行筛选。将具有除草剂抗性的阳性苗移栽到土壤中继续培养,3周后提取叶片DNA并设计引物(表1)进行PCR鉴定,对T2和T3代转基因株系进行除草剂抗性的遗传分析,最终筛选得到纯合单插入位点转基因株系。

    • 以在1/2 MS培养基中生长7 d的转基因拟南芥根系作为测定材料,使用高纯度RNA提取试剂盒(全式金)提取RNA并对其进行纯度检测和浓度测定。取等量RNA,使用反转录试剂盒(翌圣)进行单链cDNA的合成。选择拟南芥肌动蛋白基因Actin为内参基因,设计引物(表1)进行实时荧光定量PCR (RT-qPCR),并对数据采用2−∆∆Ct法进行分析。

    • 将野生型和转基因株系种子点播在1/2 MS方形培养基上,竖直培养6 d后,挑选长势均匀一致的幼苗(每个基因型,20株),分别转移至含有0和50 mmol·L−1 NaCl的1/2 MS固体培养基中继续竖直培养,7 d后观察表型。

    • 将在1/2 MS方形培养基上竖直培养6 d的幼苗分别浸泡在含有0、2和10 μmol·L−1 PA的1/2 MS液体培养基中,依次处理5、10、15和20 min后,利用荧光显微镜(ZEISS,Axio Imager 2)对拟南芥根尖分生区PA的分布进行观察并拍照。

    • 将含PA荧光探针的拟南芥转基因株系种子点播在1/2 MS方形培养基上,竖直培养6 d,选择均匀一致的幼苗分别浸泡在含有100 mmol·L−1 NaCl、10 mmol·L−1 NaHCO3和兼含两者的1/2 MS液体培养基中,处理5、10和15 min后用荧光显微镜观察根尖分生区PA的分布。

    • 图1所示:该载体以pSY06为骨架,由35S 启动子驱动植物选择标记基因——草铵膦抗性基因(bar)的表达,而GFP-PABD融合基因的表达则由UBQ10启动子驱动。

      图  1  pSY06-GFP-PABD载体图

      Figure 1.  Vector diagram of pSY06-GFP-PABD

      采用农杆菌花序侵染法将GFP-PABD融合基因转入拟南芥,获得T1代转基因种子。对T1代幼苗进行草铵膦(10 mg·L−1)抗性筛选与PCR鉴定,获得56个含融合基因的独立转基因株系。随后,对相应株系的T2代幼苗(每个株系约300株)继续进行草铵膦除草剂抗性筛选。卡方测验显示:符合3(阳性苗数)∶1(阴性苗数)分离规律的株系共8个,这些株系为含单插入位点的转基因株系。再对T2代各个株系不同植株的自交后代(T3代)进行除草剂抗性筛选,最终获得7个纯合、单插入位点转基因拟南芥株系,分别为8-1、11-1、13-12、25-5、42-4、48-1和53-1。

    • 为了明确不同转基因株系PA荧光探针表达量的差异,对上述7个转基因株系进行了目的基因的表达量测定。RT-qPCR结果(图2)显示:当将转基因株系8-1中融合基因的相对表达量设为参考值“1”,其余6个株系(11-1、13-12、25-5、42-4、48-1和53-1)的相对表达量分别为1.74、15.91、0.72、1.06、1.69和1.52。株系13-12的PA探针的表达量最高,是其他株系的9~22倍,为PA探针高表达转基因株系;相应地,将株系48-1作为PA探针低表达材料。

      图  2  不同转基因拟南芥株系中GFP-PABD融合基因的相对表达量

      Figure 2.  Relative expression level of the GFP-PABD fusion gene in transgenic A. thaliana lines

    • 为了明确PA荧光探针的表达是否会对植物生长发育产生影响,比较分析了野生型拟南芥和不同转基因株系在整个生长发育周期的表型差异。土培生长实验显示:野生型与转基因拟南芥株系的叶片生长无明显差异,高表达转基因株系(13-12)与低表达转基因株系(48-1)之间亦无可见表型差异(图3A)。另外,在含有0和50 mmol·L−1 NaCl的1/2 MS培养基中生长时,野生型与不同转基因株系之间也未表现出生长速率的差异(图3B)。这些结果说明:在一定范围内PA荧光探针的表达不会影响拟南芥的正常生长发育,这一特性有助于合理解释特定条件下胞内PA变化对植物生长发育产生的影响。

      图  3  野生型拟南芥与3个PA荧光探针转基因株系的表型比较

      Figure 3.  Phenotypic comparison between wild type and three transgenic lines of A. thaliana bearing PA fluorescent probe

    • 随着荧光探针表达量的增加,细胞内的荧光强度也会增强,这会导致PA检测的信噪比下降;相反,荧光探针表达量过低则会影响PA检测的灵敏度。为了获得检测灵敏度和信噪比都较高的PA荧光探针,用不同浓度的外源PA处理荧光探针表达量存在差异的转基因株系,进而在荧光显微镜下观察根尖PA的积累情况。结果(图4~6)显示:野生型拟南芥在有、无外源PA处理下,根尖细胞自发荧光的强度无明显差别。另外,在不同浓度外源PA处理下,荧光探针低表达的转基因株系(48-1)的根尖分生区的PA含量变化未能被捕捉到。相反,对于荧光探针高表达的转基因株系(13-12),2和10 μmol·L−1 PA分别处理10 和5 min后,其根尖分生区细胞的胞内或质膜上的PA积累清晰可见(图5)。当外源PA浓度低时,随着处理时间延长,细胞中PA积累减少(图5),这很可能是因为作为甘油脂合成前体物质的PA已被转化为其他物质。而当外源PA浓度升至10 μmol·L−1时,处理10、20 min后依然可见细胞中的PA呈点状分布(图6)。这些结果说明:荧光探针表达量较高的转基因株系(13-12)可被用于监测细胞中PA含量的变化。

      图  4  无外源PA处理下PA探针在野生型和2个转基因拟南芥株系根尖中荧光强度的差异分析

      Figure 4.  Analysis of discrepancy in fluorescent intensity of PA probe between wild type and two transgenic lines of A. thaliana

      图  5  外源PA(2 μmol·L−1)处理下PA荧光探针对PA监测灵敏度的分析

      Figure 5.  Sensitivity analysis of PA fluorescent probe monitoring PA under treatment with 2 μmol·L−1 exogenous PA

      图  6  外源PA (10 μmol·L−1)处理下PA荧光探针对PA监测灵敏度的分析

      Figure 6.  Sensitivity analysis of PA fluorescent probe monitoring PA under treatment with 10 μmol·L−1 exogenous PA

    • 为了进一步验证 PA荧光探针的实用性,利用荧光探针表达量较高的转基因株系(13-12)检测盐碱胁迫条件下根尖细胞中PA含量的变化。结果显示:盐、碱单独或混合处理转基因株系,5 min后即可在根尖分生区细胞中观察到PA的点状分布(图7)。因此推断,本研究构建的PA荧光探针可用于监测逆境条件下植物细胞中PA含量的变化。另外,盐碱胁迫可快速诱导PA积累这一现象表明在植物早期逆境响应中PA发挥某种重要作用。

      图  7  单独或混合盐碱胁迫下PA在转基因拟南芥根尖分生组织中的分布

      Figure 7.  Distribution of PA in the root tip meristem of a transgenic A. thaliana line bearing PA sensor under saline and alkaline stresses, alone or in combination

    • 已知PA在植物生长发育与逆境响应过程中发挥重要作用,但由于缺乏PA的可视化分析工具,对细胞中PA含量动态变化的了解十分有限。这一方面限制了PA作用机制的研究,另一方面给评估基因工程手段操控植物细胞PA含量变化所产生的实际应用效果带来困难。因此,本研究将酵母蛋白Spo20p中对PA高度专一的结合域与荧光蛋白融合,成功构建了可对细胞内PA进行可视化检测的荧光探针。

      为了使荧光探针适用于监测整个生长周期不同组织细胞中的PA水平,选择组成型表达启动子UBQ10驱动GFP-PABD融合基因的表达。研究发现:植物细胞中PA的检测灵敏度与PA荧光探针的表达量密切相关,表达量较高的荧光探针可有效检测到外源PA处理带来的胞内PA水平的变化,而表达量较低的探针检测效果则相反。如13-12株系中PA荧光探针的表达量高于其他株系,该株系经2 μmol·L−1外源PA处理10 min,其根尖细胞中PA的点状分布即可被观察到,这也说明外源PA能够被拟南芥根尖快速吸收,继而与PA荧光探针结合。鉴于已有研究中常用浓度高于10 μmol·L−1的外源PA检测PA探针的灵敏度[35],本研究中构建的荧光探针可有效监测到2 μmol·L−1外源PA处理所带来的细胞内PA含量的变化,推测基于13-12转基因株系的PA荧光探针具有较高的PA检测灵敏度。

      需要指出的是,PA荧光探针使用过程中,样品处理时间的延长和观察光源的增强均会使植物细胞造成某种损伤,导致细胞产生自发荧光,从而降低PA检测的信噪比。因此在实验过程中,需尽量缩短植物样本的制片时间及荧光观察的时间,以提高观察结果的真实性。

      盐碱地中盐和碱是2种共存但不同的非生物胁迫,共同影响植物的正常生长发育。利用本研究构建的PA荧光探针发现:盐胁迫处理5 min就会造成PA在细胞中的积累,这与已有的研究结果一致[22, 36]。同时,碱胁迫和盐碱混合胁迫也会快速诱导PA的积累。因此,为了全面了解植物早期逆境响应机制,有必要监测早期细胞中PA含量的动态变化。本研究开发的PA荧光探针为这些方面的研究提供了重要技术支撑。

    • 本研究成功构建了一种基于酵母蛋白Spo20p中PA结合域的荧光探针,可有效监测植物细胞中PA含量变化。应用该探针发现盐碱胁迫可快速诱导拟南芥根尖细胞质膜上和胞内PA的积累,这一结果表明PA在植物对盐碱胁迫早期应答过程中发挥重要作用。

参考文献 (36)

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