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磷脂酸(phosphatidic acid，PA)是一种常见的细胞甘油磷脂，也是最简单的膜脂之一[1]。几乎所有生物体内都会产生PA，包括酵母[2]、动物[3]和植物[4]等。在植物中PA的合成主要包括2种方式：第1种是从头合成途径，3-磷酸甘油先后在3-磷酸甘油酰基转移酶和溶血磷脂酸脂酰基转移酶的作用下发生连续2步酰化反应生成PA，这也是PA合成的主要途径[5]；第2种是磷脂的降解途径，磷脂降解又可分为2种，一种是磷脂酶D通过水解某些结构磷脂直接生成PA[6−9]，另一种是磷脂酶C通过水解磷脂酰肌醇生成二脂酰甘油[10]，继而经二脂酰甘油激酶磷酸化生成PA[11]。PA作为一种结构膜脂，磷酸基团头部能够以“静电/氢键开关模型”的方式与蛋白质结合[12]。在该模型中，PA结合蛋白中带正电荷的碱性氨基酸残基[13−17]，可以吸引磷脂双分子层上的负电荷，并通过静电作用影响膜环境，继而与PA头部的磷酸基团形成氢键，产生一个稳定的蛋白质结合位点。PA这种携带负电荷并且在生理条件下呈圆锥体的独特分子构型[18]，使得PA结合蛋白的结构域能够特异性的与其结合，保证了生物膜结构的稳定和功能的发挥。除了作为膜脂的一个结构成分以及甘油脂合成的前体物质，PA还是一个关键信号分子，在多种生物学过程中发挥重要作用。正常条件下，行使信号功能的PA含量甚微；在植物应答各种生物与非生物胁迫过程中PA水平则会迅速升高，但这种积累往往是短暂的。这说明生物体拥有一套严格控制信号分子PA含量的机制，这对调节PA信号传递强度、维持细胞物质与能量代谢的动态平衡至关重要[19−22]。
尽管PA拥有多种功能，但目前对于细胞内PA含量的动态变化仍知之甚少，这主要受PA检测手段的限制。过去主要采用诸如薄层层析、高效液相色谱和放射性同位素标记等理化手段对其含量进行测定[23]。近年来，质谱分析技术的应用使得对包括PA在内的各种脂质的测定更准确和高效[24−25]。然而，这些理化手段都只能对组织器官中PA总量与种类进行定量或定性分析，无法捕捉细胞内PA的动态与瞬时变化信息。通常认为，内质网上的PA含量相对较高，这有助于促进磷脂和三酰甘油的合成[26−27]；而质膜和细胞器中行使信号功能的PA含量甚微。显然，采用理化测定会掩盖胞内PA的真实变化。因此，亟需开发一种能可视化分析细胞内PA的工具。
大量研究表明：生物体中PA结合蛋白种类繁多，这些蛋白中的PA结合域(phosphatidic acid binding domains，PABD)结构亦存在差异。其中一些PABD因与PA结合专一性强，被用来开发多种PA探针 [28−33]。酵母蛋白Spo20p中的PA结合域已被证实具有极强的专一性[33]，只结合PA而不结合其他磷脂。目前基于这一PABD所开发的PA探针在医学研究中应用广泛，但在植物中的应用却有限[34]。因此，本研究旨在构建基于Spo20p中的PABD的植物PA荧光探针，为剖析植物早期应答逆境胁迫的细胞分子机制提供新工具。
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将拟南芥Arabidopsis thaliana种子置于含有湿润滤纸的培养皿中，4 ℃冰箱内避光放置3 d后将其点播在湿润的土壤基质上(V营养土∶V蛭石∶V珍珠岩=3∶1∶1)。将播种后的盆栽用透明塑料盖覆盖，置于24~25 ℃室温、50%~60%湿度、14 h光照/10 h黑暗的植物培养箱中培养，7 d后揭去塑料盖间苗。
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将拟南芥种子进行消毒，加入适量灭菌过的蒸馏水，在4 ℃冰箱内避光放置3 d，点播在1/2 MS培养基上，置于植物培养间中培养。
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酵母蛋白Spo20p中存在一个高度专一的PA结构域(PABD)，该PABD由40个氨基酸残基构成，只结合PA而不结合其他磷脂[33−34]，因此，本研究选择该PABD与荧光蛋白融合，构建PA荧光探针。根据PAPD核苷酸序列[33]设计引物(表1)进行PCR扩增，获得与该PABD相对应的DNA片段；同时PCR扩增获得GFP基因编码区序列。随后，利用无缝克隆试剂盒(生工)，将GFP和PABD片段克隆至植物表达载体pSY06的限制性内切酶位点Kpn I和Pst I之间，获得重组质粒pSY06-GFP-PABD。PABD连接至GFP基因编码区的3′端，构成GFP-PABD融合基因，该融合基因的表达由组成型启动子UBQ10驱动。重组质粒中的插入片段经菌落PCR、Kpn I和Pst I双酶切以及测序验证正确后，采用热激法将质粒转化至农杆菌Agrobacterium tumefaciens GV3101，用于后续拟南芥遗传转化。
表 1 相关引物序列
Table 1. Sequence of related primers
用途 引物名称 引物序列(5′→3′) PABD基因合成 ZYP301 CCTGCTAATTTCAAGGCTAATTCATTGCTGTTCGCTCGAGATCTGAGTCCGGACTGCAGGTTGGATCCGGTACCGAGCT ZYP302 GAAGACGTGATAGGCTACATGTGAAGCTTAAATCCTTGAGGAATAAAATCCACAAACAACTTCACCCAAA ZYP303 TGCTTCCTGAACAATTGTCCATTCTAGATTCTGTCTTGTTGATATCAAGACCTGCTAATTTCAAGGCTAA ZYP304 GTACCCAAGCTTCACATGTAGCCTATCACGTCTTCTGCTTCCTGAACAATTGTCC ZYP305 CACAAACAACTTCACCCAAACTGTCGGTTCGATGACGCCACTAAGACTAGTTAAGGTACCGGCGTAATCATGGTC PABD基因克隆 ZYP308 TCCGGACTCAGATCTCGAGC ZYP309 AGCTATAGTTCTAGATCTAGATTAACTAGTCTTAGTGGCGTC GFP基因克隆 ZYP306 TATCGATGGCGCCAGCTGAGGATGGTGAGCAAGGGCGA ZYP307 AGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCCATCCGGACTCAGATCTCGAGC 转基因拟南芥鉴定 MSY01 TGGTGTTAGTTTCTAGTTTGTGCG MSY02 TCATCATGACAGATCTGCGC 表达量分析 ZYP389 GACCACTACCAGCAGAACACC ZYP390 CTTGTACAGCTCGTCCATGC -
以哥伦比亚野生型拟南芥(WT)为植物材料，利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥。将获得的T1代拟南芥种子进行表面消毒，均匀铺在含有草铵膦(10 mg·L−1)和特美汀(50 mg·L−1)的1/2 MS筛选培养基上进行筛选。将具有除草剂抗性的阳性苗移栽到土壤中继续培养，3周后提取叶片DNA并设计引物(表1)进行PCR鉴定，对T2和T3代转基因株系进行除草剂抗性的遗传分析，最终筛选得到纯合单插入位点转基因株系。
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以在1/2 MS培养基中生长7 d的转基因拟南芥根系作为测定材料，使用高纯度RNA提取试剂盒(全式金)提取RNA并对其进行纯度检测和浓度测定。取等量RNA，使用反转录试剂盒(翌圣)进行单链cDNA的合成。选择拟南芥肌动蛋白基因Actin为内参基因，设计引物(表1)进行实时荧光定量PCR (RT-qPCR)，并对数据采用2−∆∆Ct法进行分析。
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将野生型和转基因株系种子点播在1/2 MS方形培养基上，竖直培养6 d后，挑选长势均匀一致的幼苗(每个基因型，20株)，分别转移至含有0和50 mmol·L−1 NaCl的1/2 MS固体培养基中继续竖直培养，7 d后观察表型。
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将在1/2 MS方形培养基上竖直培养6 d的幼苗分别浸泡在含有0、2和10 μmol·L−1 PA的1/2 MS液体培养基中，依次处理5、10、15和20 min后，利用荧光显微镜(ZEISS，Axio Imager 2)对拟南芥根尖分生区PA的分布进行观察并拍照。
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将含PA荧光探针的拟南芥转基因株系种子点播在1/2 MS方形培养基上，竖直培养6 d，选择均匀一致的幼苗分别浸泡在含有100 mmol·L−1 NaCl、10 mmol·L−1 NaHCO3和兼含两者的1/2 MS液体培养基中，处理5、10和15 min后用荧光显微镜观察根尖分生区PA的分布。
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如图1所示：该载体以pSY06为骨架，由35S 启动子驱动植物选择标记基因——草铵膦抗性基因(bar)的表达，而GFP-PABD融合基因的表达则由UBQ10启动子驱动。
图 1 pSY06-GFP-PABD载体图
Figure 1. Vector diagram of pSY06-GFP-PABD
采用农杆菌花序侵染法将GFP-PABD融合基因转入拟南芥，获得T1代转基因种子。对T1代幼苗进行草铵膦(10 mg·L−1)抗性筛选与PCR鉴定，获得56个含融合基因的独立转基因株系。随后，对相应株系的T2代幼苗(每个株系约300株)继续进行草铵膦除草剂抗性筛选。卡方测验显示：符合3(阳性苗数)∶1(阴性苗数)分离规律的株系共8个，这些株系为含单插入位点的转基因株系。再对T2代各个株系不同植株的自交后代(T3代)进行除草剂抗性筛选，最终获得7个纯合、单插入位点转基因拟南芥株系，分别为8-1、11-1、13-12、25-5、42-4、48-1和53-1。
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为了明确不同转基因株系PA荧光探针表达量的差异，对上述7个转基因株系进行了目的基因的表达量测定。RT-qPCR结果(图2)显示：当将转基因株系8-1中融合基因的相对表达量设为参考值“1”，其余6个株系(11-1、13-12、25-5、42-4、48-1和53-1)的相对表达量分别为1.74、15.91、0.72、1.06、1.69和1.52。株系13-12的PA探针的表达量最高，是其他株系的9~22倍，为PA探针高表达转基因株系；相应地，将株系48-1作为PA探针低表达材料。
图 2 不同转基因拟南芥株系中GFP-PABD融合基因的相对表达量
Figure 2. Relative expression level of the GFP-PABD fusion gene in transgenic A. thaliana lines
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为了明确PA荧光探针的表达是否会对植物生长发育产生影响，比较分析了野生型拟南芥和不同转基因株系在整个生长发育周期的表型差异。土培生长实验显示：野生型与转基因拟南芥株系的叶片生长无明显差异，高表达转基因株系(13-12)与低表达转基因株系(48-1)之间亦无可见表型差异(图3A)。另外，在含有0和50 mmol·L−1 NaCl的1/2 MS培养基中生长时，野生型与不同转基因株系之间也未表现出生长速率的差异(图3B)。这些结果说明：在一定范围内PA荧光探针的表达不会影响拟南芥的正常生长发育，这一特性有助于合理解释特定条件下胞内PA变化对植物生长发育产生的影响。
图 3 野生型拟南芥与3个PA荧光探针转基因株系的表型比较
Figure 3. Phenotypic comparison between wild type and three transgenic lines of A. thaliana bearing PA fluorescent probe
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随着荧光探针表达量的增加，细胞内的荧光强度也会增强，这会导致PA检测的信噪比下降；相反，荧光探针表达量过低则会影响PA检测的灵敏度。为了获得检测灵敏度和信噪比都较高的PA荧光探针，用不同浓度的外源PA处理荧光探针表达量存在差异的转基因株系，进而在荧光显微镜下观察根尖PA的积累情况。结果(图4~6)显示：野生型拟南芥在有、无外源PA处理下，根尖细胞自发荧光的强度无明显差别。另外，在不同浓度外源PA处理下，荧光探针低表达的转基因株系(48-1)的根尖分生区的PA含量变化未能被捕捉到。相反，对于荧光探针高表达的转基因株系(13-12)，2和10 μmol·L−1 PA分别处理10 和5 min后，其根尖分生区细胞的胞内或质膜上的PA积累清晰可见(图5)。当外源PA浓度低时，随着处理时间延长，细胞中PA积累减少(图5)，这很可能是因为作为甘油脂合成前体物质的PA已被转化为其他物质。而当外源PA浓度升至10 μmol·L−1时，处理10、20 min后依然可见细胞中的PA呈点状分布(图6)。这些结果说明：荧光探针表达量较高的转基因株系(13-12)可被用于监测细胞中PA含量的变化。
图 4 无外源PA处理下PA探针在野生型和2个转基因拟南芥株系根尖中荧光强度的差异分析
Figure 4. Analysis of discrepancy in fluorescent intensity of PA probe between wild type and two transgenic lines of A. thaliana
图 5 外源PA(2 μmol·L−1)处理下PA荧光探针对PA监测灵敏度的分析
Figure 5. Sensitivity analysis of PA fluorescent probe monitoring PA under treatment with 2 μmol·L−1 exogenous PA
图 6 外源PA (10 μmol·L−1)处理下PA荧光探针对PA监测灵敏度的分析
Figure 6. Sensitivity analysis of PA fluorescent probe monitoring PA under treatment with 10 μmol·L−1 exogenous PA
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为了进一步验证 PA荧光探针的实用性，利用荧光探针表达量较高的转基因株系(13-12)检测盐碱胁迫条件下根尖细胞中PA含量的变化。结果显示：盐、碱单独或混合处理转基因株系，5 min后即可在根尖分生区细胞中观察到PA的点状分布(图7)。因此推断，本研究构建的PA荧光探针可用于监测逆境条件下植物细胞中PA含量的变化。另外，盐碱胁迫可快速诱导PA积累这一现象表明在植物早期逆境响应中PA发挥某种重要作用。
图 7 单独或混合盐碱胁迫下PA在转基因拟南芥根尖分生组织中的分布
Figure 7. Distribution of PA in the root tip meristem of a transgenic A. thaliana line bearing PA sensor under saline and alkaline stresses, alone or in combination
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已知PA在植物生长发育与逆境响应过程中发挥重要作用，但由于缺乏PA的可视化分析工具，对细胞中PA含量动态变化的了解十分有限。这一方面限制了PA作用机制的研究，另一方面给评估基因工程手段操控植物细胞PA含量变化所产生的实际应用效果带来困难。因此，本研究将酵母蛋白Spo20p中对PA高度专一的结合域与荧光蛋白融合，成功构建了可对细胞内PA进行可视化检测的荧光探针。
为了使荧光探针适用于监测整个生长周期不同组织细胞中的PA水平，选择组成型表达启动子UBQ10驱动GFP-PABD融合基因的表达。研究发现：植物细胞中PA的检测灵敏度与PA荧光探针的表达量密切相关，表达量较高的荧光探针可有效检测到外源PA处理带来的胞内PA水平的变化，而表达量较低的探针检测效果则相反。如13-12株系中PA荧光探针的表达量高于其他株系，该株系经2 μmol·L−1外源PA处理10 min，其根尖细胞中PA的点状分布即可被观察到，这也说明外源PA能够被拟南芥根尖快速吸收，继而与PA荧光探针结合。鉴于已有研究中常用浓度高于10 μmol·L−1的外源PA检测PA探针的灵敏度[35]，本研究中构建的荧光探针可有效监测到2 μmol·L−1外源PA处理所带来的细胞内PA含量的变化，推测基于13-12转基因株系的PA荧光探针具有较高的PA检测灵敏度。
需要指出的是，PA荧光探针使用过程中，样品处理时间的延长和观察光源的增强均会使植物细胞造成某种损伤，导致细胞产生自发荧光，从而降低PA检测的信噪比。因此在实验过程中，需尽量缩短植物样本的制片时间及荧光观察的时间，以提高观察结果的真实性。
盐碱地中盐和碱是2种共存但不同的非生物胁迫，共同影响植物的正常生长发育。利用本研究构建的PA荧光探针发现：盐胁迫处理5 min就会造成PA在细胞中的积累，这与已有的研究结果一致[22, 36]。同时，碱胁迫和盐碱混合胁迫也会快速诱导PA的积累。因此，为了全面了解植物早期逆境响应机制，有必要监测早期细胞中PA含量的动态变化。本研究开发的PA荧光探针为这些方面的研究提供了重要技术支撑。
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本研究成功构建了一种基于酵母蛋白Spo20p中PA结合域的荧光探针，可有效监测植物细胞中PA含量变化。应用该探针发现盐碱胁迫可快速诱导拟南芥根尖细胞质膜上和胞内PA的积累，这一结果表明PA在植物对盐碱胁迫早期应答过程中发挥重要作用。
Generation and application of a fluorescent probe for phosphatidic acid in Arabidopsis thaliana
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摘要:
目的 磷脂酸(PA)是甘油脂生物合成的前体，又是参与植物生长发育调节和各种逆境响应的重要信使物质，然而目前对植物细胞中PA含量动态变化的了解十分有限。本研究试图构建一种能有效监测植物细胞PA含量变化的荧光探针，并用之测定盐碱胁迫过程中胞内PA含量的变化。 方法 将Spo20p蛋白中高度专一的PA结合域相对应的核苷酸序列与绿色荧光蛋白基因融合，经遗传转化获得携带该融合基因的转基因拟南芥Arabidopsis thaliana株系，其表达受组成型启动子UBQ10驱动，产生的融合蛋白成为专一结合PA的荧光探针。随后，运用该荧光探针监测盐碱胁迫下胞内PA含量的变化。 结果 构建获得7个不同的纯合、单插入位点转基因拟南芥株系。实时荧光定量PCR (RT-qPCR)分析显示：不同株系中融合基因的表达量存在差异。不同浓度外源PA处理试验显示：随着表达量的升高，PA探针可有效监测到2 μmol·L−1 PA处理根尖10 min后细胞中PA含量的变化；而当PA探针表达量较低时，对PA监测灵敏度显著下降，表明在一定程度上荧光探针对PA监测的灵敏度与其表达量相关联。运用PA荧光探针发现：盐碱胁迫处理根尖5 min即可诱导质膜上或胞内PA的积累，暗示PA在植物早期盐碱胁迫响应中可能产生重要作用。 结论 本研究构建了一种可对细胞内PA含量进行有效监测的荧光探针，该探针可用于监测植物盐碱胁迫早期响应过程中胞内PA水平的变化，从而为早期逆境响应研究提供新工具。图7表1参36 Abstract:Objective Phosphatidic acid (PA) serves as an important signal molecule involved in the regulation of plant growth and development and different responses to various stresses as well as a general precursor for glycerolipid biosynthesis. However, little is known thus far about the dynamic changes of PA in plant cells. This study attempted to construct a fluorescent probe that can effectively monitor the changes of PA in plant cells and use it to measure the changes of intracellular PA under saline-alkaline stresses. Method The corresponding nucleotide sequence for PA-specific binding domain within the Spo20p protein was fused to the green fluorescent protein gene. Transgenic Arabidopsis thaliana lines bearing the fusion gene under the control of the constitutive promoter UBQ10 was then generated via genetic transformation. The resulting fusion protein constituted a fluorescent probe specifically binding to PA. Subsequently, this probe was employed to monitor the changes of cellular PA under saline-alkaline stresses. Result Seven transgenic A. thaliana lines homozygous for single insertion of the fusion gene was generated. Real time quantitative PCR (RT-qPCR) analysis showed that expression levels of the fusion gene varied among different lines. Experiments with various exogeneous PA concentrations revealed that as the expression level of the PA probe increased, it could effectively monitor the changes of cellular PA in the root tips treated with 2 μmol·L−1 exogenous PA for 10 min, whereas this was not the case when the expression level of the probe was low, indicating that the sensitivity of the probe for PA detection is, to a certain degree, associated with its expression level. Based on this fluorescent PA probe, PA accumulation at the plasma membrane or in the intracellular space was evident in the root tips under saline-alkaline stresses for 5 min, implying that PA may play important roles in early plant responses to saline-alkaline stresses. Conclusion A fluorescence probe for effective monitoring of cellular PA was developed in this study. This probe can monitor the alterations in cellular PA level during early plant responses to saline-alkaline stresses, thereby providing a new tool to study early responses to various stresses. [Ch, 7 fig. 1 tab. 36 ref.] -
Key words:
- phosphatidic acid /
- fluorescent probe /
- transgene /
- saline-alkaline stress /
- Arabidopsis thaliana
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榧树Torreya grandis四季常绿，是红豆杉科Taxaceae植物中少有的集果用、油用、药用、材用、观赏于一体的植物，雌雄异株，生命周期可达上千年。榧树种子含油量高，主要含油酸和亚油酸，不饱和脂肪酸含量远超饱和脂肪酸[1]。饱和脂肪酸中主要是山俞酸和棕榈酸[2]。榧树自然分布于浙江、安徽南部、福建北部、江西东北部，零星分布于贵州松桃、江苏南部、湖南西南部等地，其中以浙江最多，近年来人类活动的干扰加剧了榧树资源的破坏，威胁到部分种群的生存[3−4]。
遗传多样性是生物多样性的重要组成部分。一个物种的稳定性和进化潜力依赖其遗传多样性，物种的经济和生态价值依赖其特有的基因组成。因此，保护生物多样性的最终目标就是保护遗传多样性[5−7]。DNA分子标记的数量极多，多态性高，受限制少，检测方法简单易掌握，结果稳定可靠，已被广泛应用于植物多样性研究[8−9]。简单重复序列标记(SSR)技术是以特异引物PCR为基础的分子标记技术，其特点是标记在整个基因组DNA中随机分布，多态性较高，操作简单，可通过PCR直接扩增来检测，重复性好，成本低[10]。
香榧T. grandis‘Merrillii’是榧树优良的变异类型，具有较高的经济价值[11]。自然环境中榧树结种迟，一般作为香榧嫁接的砧木，雄株因不结种被大量砍伐，使榧树遗传多样性受到影响，但榧树具有丰富的遗传多样性，产生了丰富的变异类型，形成了物种生存与进化的基础，也为资源的开发利用提供了可供选择的物质基础[12]。因此，本研究利用多重比较、方差分析等对不同种群雌性榧树叶片、种实表型、种实营养成分及遗传多样性指标的变异进行分析，以期为榧树的利用提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料
基于天然榧树的分布情况以及前人的研究成果[13]，于2019年10—11月榧树种实成熟期，从浙江省杭州市富阳区洞桥村(富阳)、杭州市临安区洪岭村(临安)、杭州市建德市大库村(建德)、绍兴市嵊州市榆树村(嵊州)及安徽省黄山市呈坎村(黄山)5个海拔在250~600 m的雌性榧树种群中，分别采集叶片和种实用于表型及种实营养成分的探究。基于詹利云等[14]的研究，选择富阳、临安、嵊州、黄山以及杭州市淳安县半夏村(淳安)的雌性榧树种群，分别采集叶片对榧树种群遗传多样性进行研究。样株间距大于50 m，生长状况良好。每株采集相同位置的新鲜叶片，采集至少100颗自然脱落的成熟种实，样品装入带有硅胶的塑封袋中，并利用全球卫星定位系统(GPS)定位采样点。叶片测量表型后置于−40 ℃冰箱保存，种实测完表型后置于阴凉通风处，等待假种皮自然开裂，用于后续研究。
1.2 表型测定
从各单株选取2个小枝相同部位的叶片共20片，用卡尺测量叶长、叶宽，并计算叶形指数(叶宽/叶长)，用天平称取单片叶的质量。从各单株随机选取30颗种实，用卡尺测量单颗种实和种核的横径、纵径、假种皮厚、种壳厚，并计算种形指数(种实横径/种实纵径)、核形指数(种核横径/种核纵径)，用天平称取单颗种实质量和种核质量。
1.3 营养成分测定
脂肪相对含量参照GB/T 14772—2008《食品中粗脂肪的测定》索氏抽提法测定。脂肪酸组成参照GB/T 17376—2008《食品脂肪酸含量的测定》测定。可溶性糖质量分数参照蒽酮比色法[15]测定。
1.4 DNA提取及SSR标记分析
采用改良的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法[16]提取雌性榧树叶片的DNA。参照郑刘辉等[17]的SSR反应体系，合成引物序列，进行PCR扩增。
1.5 数据分析
采用SPSS 23.0进行数据统计、方差分析、多重比较、主成分分析；用Genemaker软件准确读取SSR位点信息。用Popgene 1.32计算平均等位基因数、观察杂合度、多态信息含量等遗传多样性指标。使用Structure 2.3.4分析种群的遗传结构，并绘制遗传结构图，用Q值表示一种遗传组成的比率，即同一颜色所占比率最大的种群聚类为同一亚群。通过NTSYS2.10e计算Nei’s遗传相似矩阵，使用非加权组平均聚类分析法(UPGMA)分析样品的亲缘关系，并进行聚类分析。
2. 结果与分析
2.1 叶与种实性状的变异研究
从表1可见：在叶质量和叶形指数上，临安种群的变异系数最大。在种实质量上，嵊州种群的变异系数最大。种形指数和种核质量富阳种群的变异系数最大。核形指数的变异系数在富阳种群中最大，但仅为10.2%。种壳厚和假种皮厚的变异系数在嵊州种群中最大。方差分析(表2)表明：叶质量、叶形指数、种实质量、种形指数、种核质量、核形指数、假种皮厚、种壳厚8个指标在种群间和种群内个体间差异极显著(P＜0.01)。
表 1 雌性榧树种群叶片与种实表型Table 1 Leaf and seed phenotypes of female quince populations in T. grandis种群 叶质量 叶形指数 种实质量 种形指数 假种皮厚 种核质量 核形指数 种壳厚 数值/g CV/% 数值 CV/% 数值/g CV/% 数值 CV/% 数值/mm CV/% 数值/g CV/% 数值 CV/% 数值/mm CV/% 富阳 0.02±0.01 31.1 0.15±0.02 10.8 10.70±2.42 22.6 0.78±0.07 9.0 3.53±0.36 10.2 4.77±1.27 26.5 0.66±0.07 10.2 0.54±0.11 19.7 嵊州 0.02±0.01 29.9 0.16±0.02 11.2 11.85±3.36 28.3 0.79±0.05 6.5 3.67±0.78 21.3 4.92±1.18 23.9 0.68±0.06 8.9 0.72±0.25 34.6 黄山 0.02±0.01 19.2 0.16±0.02 11.6 9.50±2.27 22.9 0.81±0.07 5.5 2.94±0.53 17.8 4.51±0.93 19.0 0.71±0.07 5.8 0.91±0.17 21.1 临安 0.02±0.01 33.9 0.16±0.02 15.3 9.50±2.27 23.9 0.81±0.07 8.2 2.94±0.53 18.1 4.51±0.93 20.6 0.71±0.07 9.5 0.91±0.17 19.1 建德 0.02±0.01 33.8 0.17±0.02 9.5 11.19±2.41 21.5 0.83±0.05 6.1 3.63±0.46 12.8 4.58±0.97 21.1 0.70±0.05 7.8 0.85±0.13 14.7 说明：数值为均值±标准差；CV为变异系数。 表 2 榧树叶片与种实表型的方差分析Table 2 Variance analysis of phenotypic parameters of the leaf and seeds in T. grandis指标 变异来源 平方和 自由度 均方 F 指标 变异来源 平方和 自由度 均方 F 叶质量 种群间 0.220 4 0.005 121.000 种核质量 种群间 358.014 4 89.503 112.981 个体间 0.028 29 0.001 21.158 个体间 355.326 29 12.253 15.467 叶形指数 种群间 0.181 4 0.045 50.937 核形指数 种群间 0.600 4 0.150 64.909 个体间 0.252 29 0.009 9.779 个体间 1.256 29 0.043 18.755 种实质量 种群间 2 530.950 4 632.737 191.245 假种皮厚 种群间 796.646 4 199.162 91.175 个体间 1 612.471 29 55.602 16.806 个体间 484.026 29 16.691 7.641 种形指数 种群间 0.408 4 0.102 46.454 种壳厚 种群间 16.018 4 4.005 116.324 个体间 1.194 29 0.041 18.764 个体间 10.813 29 0.373 10.831 说明：所有指标P=0.000。 2.2 种仁营养成分分析
2.2.1 脂肪相对含量和组成
由表3可见：5个种群的脂肪相对含量从大到小依次为嵊州、黄山、临安、建德、富阳，变异系数为7.7%~21.6%。多重分析发现各种群间脂肪相对含量差异显著(P＜0.05)。
表 3 5个榧树种群种仁的脂肪相对含量Table 3 Lipid content of the kernel among 5 T. grandis populations种群 脂肪相对含量/% CV/% 最大值 最小值 平均值±标准差 富阳 47.79 18.25 29.36±6.34 d 21.6 嵊州 48.14 30.62 42.35±3.77 a 8.9 黄山 46.81 33.61 40.93±3.19 ab 7.8 临安 44.90 32.19 39.82±3.07 b 7.7 建德 40.52 16.19 33.96±4.66 c 13.7 说明：不同字母表示不同种群间差异显著(P＜0.05)。CV为变异系数。 榧树种子脂肪酸组成(表4)分析发现：不饱和脂肪酸的相对含量远远高于饱和脂肪酸，且前者是后者的2倍多；脂肪酸中亚油酸的相对含量最高，其次是油酸、金松酸、棕榈酸，亚麻酸相对含量最低。可见，榧树种子中主要的不饱和脂肪酸是亚油酸和油酸。5个种群间的脂肪酸组成存在不同程度的变异，其中多不饱和脂肪酸相对含量最高的是临安种群，随后依次是嵊州、建德、黄山、富阳种群；单不饱和脂肪酸相对平均含量富阳种群最高，为(29.20±6.34)%，建德种群最低，为(24.14±2.59)%；变异系数不饱和脂肪酸远小于饱和脂肪酸。从脂肪酸种类上看，变异系数最大的为花生一烯酸(13.0%~40.0%)，其次是硬脂酸(18.0%~38.0%)、花生二烯酸(15.0%~27.0%)。
表 4 5个榧树种群脂肪酸组成的变异Table 4 Variation in fatty acid composition among 5 T. grandis populations种群 棕榈酸/% 硬脂酸/% 油酸/% 亚油酸/% 亚麻酸/% 花生一烯酸/% 相对含量 CV 相对含量 CV 相对含量 CV 相对含量 CV 相对含量 CV 相对含量 CV 富阳 10.70±2.59 24.0 2.97±1.14 38.0 28.29±6.06 21.0 41.82±8.01 19.0 0.52±0.17 32.0 0.91±0.37 40.0 嵊州 8.52±1.22 14.0 2.18±0.47 21.0 23.78±4.26 18.0 47.85±2.88 6.0 0.50±0.06 12.0 0.67±0.09 14.0 黄山 8.06±0.98 12.0 2.97±0.54 18.0 26.21±2.87 11.0 46.81±2.35 5.0 0.47±0.05 11.0 0.65±0.08 13.0 临安 8.47±0.88 10.0 2.15±0.46 22.0 23.63±2.40 11.0 49.00±2.45 5.0 0.57±0.00 14.0 0.59±0.09 16.0 建德 9.58±1.83 19.0 2.80±0.92 33.0 23.47±2.63 11.0 46.49±3.67 8.0 0.48±0.07 14.0 0.67±0.10 15.0 种群 花生二烯酸/% 金松酸/% 饱和脂肪酸/% 不饱和脂肪酸/% 单不饱和脂肪酸/% 多不饱和脂肪酸/% 相对含量 CV 相对含量 CV 相对含量 CV 相对含量 CV 相对含量 CV 相对含量 CV 富阳 2.42±0.63 26.0 10.76±2.14 20.0 13.68±3.45 25.0 84.71±4.39 5.0 29.20±6.34 22.0 55.52±10.16 18.0 嵊州 2.80±0.75 27.0 12.61±2.02 16.0 10.70±1.32 12.0 88.22±2.04 2.0 24.45±4.30 18.0 63.77±4.36 7.0 黄山 2.64±0.41 15.0 11.11±1.25 11.0 11.03±0.88 8.0 87.89±0.97 1.0 26.86±2.89 11.0 61.03±2.97 5.0 临安 2.60±0.53 20.0 12.00±0.98 8.0 10.63±1.06 10.0 88.39±1.14 1.0 24.22±2.52 10.0 64.18±2.92 5.0 建德 2.49±0.40 16.0 11.98±1.56 13.0 12.38±2.16 17.0 85.58±2.95 3.0 24.14±2.59 11.0 61.44±4.63 8.0 说明：数值为平均值±标准差。CV为变异系数。 2.2.2 可溶性糖
从表5可见：平均可溶性糖质量分数建德种群最高，为(50.49±9.26) mg·g−1，随后依次是黄山、嵊州、临安种群，富阳种群最低，为(40.23±4.80) mg·g−1。不同种群的变异系数为8.8%~19.3%。多重比较发现：嵊州、黄山种群间无显著差异，但与其他种群间差异显著(P＜0.05)。
表 5 5个榧树种群种仁的可溶性糖质量分数Table 5 Soluble sugar content of the kernel among 5 T. grandis populations种群 可溶性糖质量分数/(mg·g−1) 最大值 最小值 平均值±标准差 CV/% 富阳 47.91 32.10 40.23±4.80 c 11.9 嵊州 65.56 29.35 45.35±8.77 b 19.3 黄山 60.02 31.80 44.38±7.56 b 17.0 临安 54.34 37.24 47.75±4.18 ab 8.8 建德 68.68 34.36 50.49±9.26 a 18.3 说明：不同字母表示不同种群间差异显示(P＜0.05)。CV为变异系数。 2.2.3 主成分分析
20个指标通过主成分分析提取出6个指标，发现特征值均大于1.000的前6个主成分累计贡献率为75.38%，可以全面反映各个指标的信息(表6)。第1主成分贡献率为30.76%，特征值较高的为亚油酸、饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸；第2主成分贡献率为13.09%，特征值较高的为种实质量、种核质量；第3主成分贡献率为10.92%，其大小主要由核形指数、种形指数决定；第4主成分贡献率为7.98%，特征值较高的为叶形指数、叶片质量、种皮厚度；第5主成分贡献率为6.93%，特征值较高的为叶片质量、种形指数、叶形指数；第6主成分贡献率为5.70%，其大小主要由含油率、金松酸、叶形指数决定。
表 6 5个榧树种群叶片和种实表型、品质的主成分分析Table 6 Principal components of leaf and plant phenotypes among 5 T. grandis populations指标 主成分 指标 主成分 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 种实质量 0.074 0.856 −0.082 0.387 −0.007 0.263 硬脂酸 0.724 −0.236 −0.217 0.248 0.062 −0.061 种核质量 0.116 0.819 0.091 0.132 −0.187 0.305 油酸 0.731 −0.431 −0.251 0.157 0.132 0.269 种形指数 0.010 −0.131 0.741 0.370 0.466 −0.085 亚油酸 −0.946 0.142 0.046 −0.106 −0.011 0.009 核形指数 −0.099 −0.097 0.834 0.194 0.370 0.003 亚麻酸 0.239 −0.047 0.295 −0.204 −0.314 0.120 种皮厚度 0.105 0.498 −0.321 0.529 0.259 0.054 花生一烯酸 0.804 −0.046 0.027 −0.047 0.076 −0.017 种壳厚度 −0.367 −0.243 0.340 0.082 −0.333 0.327 花生二烯酸 −0.372 0.114 −0.178 0.152 0.369 −0.310 叶片质量 0.202 0.289 0.049 −0.533 0.496 0.190 金松酸 −0.649 0.424 0.186 −0.152 −0.176 −0.397 叶形指数 −0.116 −0.179 0.056 0.614 −0.416 −0.391 饱和脂肪酸 0.943 0.093 0.160 0.000 −0.124 −0.106 含油率 −0.459 −0.485 −0.195 0.319 0.018 0.426 不饱和脂肪酸 −0.927 −0.113 −0.194 −0.025 0.131 0.114 可溶性糖 −0.199 0.010 0.497 0.044 −0.207 0.330 特征值 6.153 2.618 2.184 1.595 1.387 1.138 棕榈酸 0.843 0.221 0.296 −0.111 −0.181 −0.105 累计贡献率/% 30.76 43.85 54.77 62.75 69.68 75.38 2.3 雌性榧树SSR标记分析
2.3.1 SSR位点分析
13对引物在146个雌性榧树中共获得37个等位基因，每对引物可扩增2~5个等位基因，平均每对引物扩增出2.85个等位基因，TG55平均等位基因数最多，ZAFU-3和TG19最少；每对引物的平均有效等位基因数为1.899个；平均观测杂合度(0.429)略高于平均期望杂合度(0.404)；Nei’s遗传多样性指数平均为0.400，其中GR98 (0.688)最高，TG19 (0.015)最低；Shannon’s指数为0.039~1.252，有11对引物的Shannon’s信息指数高于0.500，其中GR98 (1.252)最高，TG19 (0.039)最低，平均为0.650，说明榧树遗传多样性丰富(表7)。
表 7 榧树13个SSR位点的遗传参数Table 7 Genetic parameters of 13 SSR loci in T. grandis引物
编号平均等位
基因数/个有效等位
基因数/个观测
杂合度期望
杂合度Nei’s遗传
多样性指数Shannon’s
指数引物
编号平均等位
基因数/个有效等位
基因数/个观测
杂合度期望
杂合度Nei’s遗传
多样性指数Shannon’s
指数ZAFU-1 3.750 1.604 0.225 0.366 0.362 0.661 GR98 4.375 3.230 0.697 0.695 0.688 1.252 ZAFU-3 1.625 1.120 0.030 0.091 0.090 0.164 TG19 1.625 1.016 0.000 0.015 0.015 0.039 ZAFU-5 2.500 2.004 0.550 0.506 0.501 0.709 TG55 5.375 2.706 0.584 0.622 0.616 1.112 ZAFU-6 2.000 1.495 0.289 0.329 0.325 0.504 TG70 2.500 1.986 0.912 0.502 0.496 0.698 ZAFU-8 2.000 2.000 0.997 0.505 0.500 0.693 TG81 2.000 1.014 0.000 0.014 0.014 0.041 ZAFU-11 2.625 1.961 0.462 0.491 0.486 0.713 TG88 3.750 2.453 0.492 0.593 0.587 1.022 GR12 3.000 2.095 0.341 0.525 0.519 0.839 平均 2.856 1.899 0.429 0.404 0.400 0.650 2.3.2 种群遗传多样性分析
在种群水平上，Nei’s遗传多样性指数(H)与Shannon’s指数(I)在5个雌性种群间的变化趋势相似。Nei’s遗传多样性指数平均为0.390，从大到小依次为淳安、临安、黄山、富阳、嵊州；Shannon’s指数平均为0.621，从大到小依次为淳安、临安、富阳、黄山、嵊州；多态位点百分比平均为81.54%，其中富阳、黄山、嵊州3个种群的多态位点百分比相等，临安和淳安种群相等。淳安(H=0.410，I=0.658)的遗传多样性最高，嵊州(H=0.369，I=0.565)的遗传多样性最低(表8)。
表 8 5个榧树亲本种群的遗传多样性Table 8 Genetic diversity among 5 T. grandis populations种群 平均等位基因数/个 有效等位基因数/个 观测杂合度 期望杂合度 Nei’s遗传多样性指数 Shannon’s指数 多态位点百分比/% 富阳 2.692 1.848 0.431 0.387 0.381 0.625 84.62 嵊州 2.154 1.791 0.377 0.376 0.369 0.565 84.62 黄山 2.231 1.811 0.451 0.399 0.392 0.611 84.62 临安 2.462 1.917 0.464 0.406 0.399 0.648 76.92 淳安 2.462 1.954 0.423 0.418 0.410 0.658 76.92 种群水平 2.400 1.864 0.429 0.397 0.390 0.621 81.54 物种水平 3.231 1.925 0.429 0.406 0.405 0.671 92.31 说明：种群水平指5个种群平均值；物种水平指5个种群中所有物种平均值。 在物种水平上，5个种群榧树的平均等位基因数为3.231个，平均有效等位基因数为1.925个，期望杂合度(0.406)略小于观测杂合度(0.429)，Nei’s遗传多样性指数为0.405，Shannon’s指数为0.671，多态位点百分比为92.31%(表8)。各种群在种群水平上的多态位点百分比及Shannon’s指数均低于物种水平，仅淳安种群在种群水平上的Nei’s遗传多样性指数高于物种水平。
2.3.3 遗传分化与遗传结构
5个雌性榧树种群间的总遗传多样性平均为0.497；群体内近交系数均为负值，说明群体内杂合子过剩，纯合子缺失[18]，这与榧树雌雄异株的特性相吻合，且这些供试雌株都是杂交后代；种群间近交系数变幅为0.054~0.207，平均为0.129；遗传分化指数变幅为0.153~0.218，平均为0.199，表明5个雌性榧树种群间存在的遗传分化程度不大，这与榧树风媒、花粉流动性大的特性相吻合；基因流的变幅为0.898~1.381，平均为1.029，表明种群间存在基因交流，每代交流约1个基因，基因流动相对来说不是很频繁(表9)。
表 9 5个榧树种群的遗传分化Table 9 Genetic differentiation among 5 T. grandis populations种群 总遗传
多样性种群内
近交系数种群间
近交系数遗传分
化指数基因流 富阳 0.457 −0.113 0.058 0.153 1.381 嵊州 0.475 −0.003 0.206 0.209 0.946 黄山 0.491 −0.132 0.054 0.188 1.082 临安 0.527 −0.143 0.120 0.230 0.838 淳安 0.534 −0.013 0.207 0.218 0.898 平均值 0.497 −0.081 0.129 0.199 1.029 方差分析结果(表10)表明：榧树的遗传变异集中在种群内，种群内(92%)的遗传变异远大于种群间(8%)。
表 10 5个榧树种群的分子方差分析Table 10 Molecular variance among 5 T. grandis populations来源 自由度 平方和 均方 方差分量 变异百
分比/%P 种群间 4 67.427 16.857 0.416 8 0.081 种群内 141 664.251 4.711 4.711 92 总数 145 731.678 5.127 100 对亚群归属分析发现：每个种群的样本基本上都有3个亚群的痕迹，只是比例不同而已(图1)。这说明榧树天然异交导致高度杂合的特性。
图 1 基于Structure分析的5个榧树种群的遗传结构图Figure 1 Genetic structure of 5 T. grandis populations based on structure analysis2.3.4 种群间的遗传距离和遗传相似度
5个榧树种群的遗传相似系数平均为0.969，说明各种群间的遗传相似度很高，亲缘关系较近，存在一定程度的遗传变异(表11)。遗传距离平均为0.032，黄山与淳安种群的遗传距离最大(0.055)，遗传相似度最小(0.946)，富阳与黄山、临安种群的遗传距离最小(0.022)，遗传相似度最大(0.977)。表明雌性榧树群体遗传相似度高，但因雌雄异株天然杂交的特性，使物种内又存在一定的变异。
表 11 5个榧树种群的遗传距离和遗传相似度Table 11 Genetic distance and genetic identity among 5 T. grandis populations种群 富阳 嵊州 黄山 临安 淳安 富阳 0.976 0.977 0.977 0.962 嵊州 0.024 0.970 0.971 0.957 黄山 0.023 0.031 0.973 0.946 临安 0.023 0.030 0.027 0.977 淳安 0.038 0.045 0.055 0.024 说明：对角线下方为遗传距离，对角线上方为遗传相似度。 UPGMA聚类分析发现：富阳与黄山种群相聚之后再与嵊州种群聚在一起，随后上述3个种群与临安种群聚在一起，富阳、黄山、嵊州、临安4个种群与淳安种群之间存在差异 (图2)。
3. 讨论
本研究表明：5个雌性榧树种群叶与种实指标在种群间及个体间均存在显著差异，这与其本身雌雄异株风媒花天然杂交的特性相符。詹利云等[14]对富阳、嵊州、黄山、临安种群雄性榧树的叶片、种实表型指标进行了研究，而本研究则对上述相同种群雌株的叶片、种实表型指标进行探究。比较发现：在种群间，雄株仅叶长这一指标存在显著差异，雌株则各指标均有差异，但种群内雌雄榧树间各指标都有显著差异；黄山种群雌株叶质量的均值要小于雄株，且变异系数雌株种群比雄株种群大；叶形指数雌雄榧树均值接近，变异系数仅嵊州(13.97%)和临安(18.27%)种群的雄株比雌株(分别为11.20%、15.30%)大。
与沈登锋等[19]的研究结果相比，本研究的种实和种核质量与其接近，但变异系数较低，而种实相对脂肪含量两者相近。究其原因，沈登锋等[19]的研究是从种子可食性的角度收集种质，而本研究在各种群的取样则是随机的，数据更能反映自然条件下榧树种群的状况。董雷鸣等[20]对榧树黄山种群的种实进行了分析，发现与本研究在种实质量、种核质量、种形指数、核形指数上接近，而脂肪相对含量本研究的结果要高近7%。尽管研究材料取自同一种群，但榧树雌雄异株天然风媒杂交的特性决定了雄株花粉在其中所起的作用，加之研究的年份不同，气候气象条件也不同，因此研究结果有出入。本研究表明：榧树种实与种核的表型指标中，变异系数大于10%的包括种实质量、假种皮厚、种核质量及种壳厚，这些指标与种实产量有关，而各种群间相差10%以上的指标包括假种皮厚、种壳厚。
本研究的榧树种实可食性较差，其脂肪相对含量不及香榧。金松酸作为一种特殊的不饱和脂肪酸，目前已知来源较少，得率低[21]。本研究各种群金松酸的平均相对含量为10.76%~12.61%，接近或高于香榧及日本榧Torreya nucifera的平均值，且有的单株相对含量更高，进一步说明榧树种子的利用价值。本研究发现：榧树种实脂肪相对含量的变异系数为7.70%~21.80%，而不饱和脂肪酸的变异系数较小，低于5%，脂肪中各脂肪酸组分种群间差异显著，金松酸的变异系数为8.00%~20.00%，因此不仅具有优株选择的潜力，且基于脂肪、金松酸相对含量的高低来进行优株选择理论上是可行的。
本研究表明：天然雌性榧树的遗传变异集中在种群内，种群内(92%)的遗传变异远大于种群间(8%)，这与异交风媒植物90%以上的遗传变异存在于种群内的结果相符[22]，且说明榧树单株间的遗传变异更丰富，选育要基于单株性状表现来进行。以遗传多样性指标来看，仅淳安种群(H=0.410，I=0.658)的遗传多样性大于雌性榧树物种水平(H=0.405，I=0.671)，而雌性物种水平的多态位点百分比(92.31%)均大于5个天然雌性榧树种群。这与刘浩凯[12]用相关系列扩增多态性(SRAP)分析天然雌性榧树种群的结果相似。
天然榧树种群内近交系数均为负值，杂合子过剩而纯合子缺失，这也与该物种风媒传粉天然杂交的特性相吻合，说明天然雌性榧树种群没有近交衰退的现象[10]。WRIGHT[23]研究表明：遗传分化指数(Fst)可反映群体间遗传分化程度，当0＜Fst≤0.05、0.05＜Fst≤0.15、0.15＜Fst≤0.25、Fst＞0.25时，遗传分化程度分别为很弱、中等、较大分化、极大。基因流越大，遗传分化越小[24]。当基因流大于1时，说明种群间存在一定的基因交流，种群间的遗传分化不会太大[25]。在本研究中，5个雌性榧树种群的遗传分化指数为0.199，但基因流为1.029，说明种群间的遗传分化较大。
从榧树染色体水平参考基因组，可获得更加详细和精确的基因组信息[26]。这些信息不仅包括基因的序列，还包括基因的结构、功能和调控网络等。通过深入分析这些信息，可以更准确地识别和定位SSR标记，从而提高其全面性和多态性。
4. 结论
不同雌性榧树种群叶与种实表型指标在种群间及个体间存在显著差异。脂肪相对含量、脂肪酸相对含量及可溶性糖质量分数在种群间差异极显著，榧树种实表型和种仁品质变异丰富。基于遗传多样性指标，发现雌性榧树种群表现出一定程度的变异，淳安种群的遗传多样性最大，且雌性榧树的遗传变异种群内远大于种群间。
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图 2 不同转基因拟南芥株系中GFP-PABD融合基因的相对表达量
Figure 2 Relative expression level of the GFP-PABD fusion gene in transgenic A. thaliana lines
图 3 野生型拟南芥与3个PA荧光探针转基因株系的表型比较
Figure 3 Phenotypic comparison between wild type and three transgenic lines of A. thaliana bearing PA fluorescent probe
图 4 无外源PA处理下PA探针在野生型和2个转基因拟南芥株系根尖中荧光强度的差异分析
Figure 4 Analysis of discrepancy in fluorescent intensity of PA probe between wild type and two transgenic lines of A. thaliana
图 5 外源PA(2 μmol·L−1)处理下PA荧光探针对PA监测灵敏度的分析
Figure 5 Sensitivity analysis of PA fluorescent probe monitoring PA under treatment with 2 μmol·L−1 exogenous PA
图 6 外源PA (10 μmol·L−1)处理下PA荧光探针对PA监测灵敏度的分析
Figure 6 Sensitivity analysis of PA fluorescent probe monitoring PA under treatment with 10 μmol·L−1 exogenous PA
图 7 单独或混合盐碱胁迫下PA在转基因拟南芥根尖分生组织中的分布
Figure 7 Distribution of PA in the root tip meristem of a transgenic A. thaliana line bearing PA sensor under saline and alkaline stresses, alone or in combination
表 1 相关引物序列
Table 1. Sequence of related primers
用途 引物名称 引物序列(5′→3′) PABD基因合成 ZYP301 CCTGCTAATTTCAAGGCTAATTCATTGCTGTTCGCTCGAGATCTGAGTCCGGACTGCAGGTTGGATCCGGTACCGAGCT ZYP302 GAAGACGTGATAGGCTACATGTGAAGCTTAAATCCTTGAGGAATAAAATCCACAAACAACTTCACCCAAA ZYP303 TGCTTCCTGAACAATTGTCCATTCTAGATTCTGTCTTGTTGATATCAAGACCTGCTAATTTCAAGGCTAA ZYP304 GTACCCAAGCTTCACATGTAGCCTATCACGTCTTCTGCTTCCTGAACAATTGTCC ZYP305 CACAAACAACTTCACCCAAACTGTCGGTTCGATGACGCCACTAAGACTAGTTAAGGTACCGGCGTAATCATGGTC PABD基因克隆 ZYP308 TCCGGACTCAGATCTCGAGC ZYP309 AGCTATAGTTCTAGATCTAGATTAACTAGTCTTAGTGGCGTC GFP基因克隆 ZYP306 TATCGATGGCGCCAGCTGAGGATGGTGAGCAAGGGCGA ZYP307 AGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCCATCCGGACTCAGATCTCGAGC 转基因拟南芥鉴定 MSY01 TGGTGTTAGTTTCTAGTTTGTGCG MSY02 TCATCATGACAGATCTGCGC 表达量分析 ZYP389 GACCACTACCAGCAGAACACC ZYP390 CTTGTACAGCTCGTCCATGC 
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链接本文:
https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20230355
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