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竹林金针虫是取食竹笋的叩甲幼虫的总称，虫害发生时竹笋产量显著减少，严重时竹种无法成竹，制约了竹林的自然更新[1-2]。筛胸梳爪叩甲Melanotus cribricollis隶属于鞘翅目Coleoptera叩甲科 Elateridae梳爪叩甲属Melanotus，其幼虫为中国南方早园竹Phyllostachys propinqua竹林的优势种。化学药剂防治竹林金针虫易造成环境污染、抗药性和食品安全等问题，阻碍以“生态、健康、有机”为标签的林产品产业发展，因此近年来逐渐采用生物技术防治该虫害。绿僵菌Metarhizium sp.是常见的昆虫致病真菌[3-4]，对鞘翅目和鳞翅目Lepidoptera等害虫均有一定防效[5-6]。研究竹林金针虫抗绿僵菌相关基因的表达有利于深入了解害虫免疫抗性机制和虫菌互作机制，也有利于生防菌菌株改造等研究，提高其对农林害虫防治的效果。实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)是研究基因表达分析的关键技术，省时、高效、应用广泛；为保证目的基因定量表达结果的准确性，需引入表达稳定的内参基因作为参照[7]。内参基因又称看家基因，理想的内参基因其表达水平应在各条件下保持稳定，而实际上不同条件下许多内参基因的表达并不稳定[8-9]。因此，即使是同一物种，不同试验条件下的内参基因也不能一概而用，qRT-PCR试验之前应对所选内参基因的表达稳定性进行评估。常用的qRT-PCR内参基因包括ACT (肌动蛋白)、TUB (微管蛋白)、GAPDH (甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、UBC (泛素结合酶)、18S rRNA (核糖体蛋白S18)、28S rRNA (核糖体蛋白S28)、EF1 (延伸因子1)、SYN1 (突触融合蛋白1)、SYN6 (突触融合蛋白6)、RPS3 (核糖体蛋白S3)、PRS20 (泛素-核糖体蛋白S20)、PRS27a (泛素-核糖体蛋白S27a)、RPL10 (核糖体蛋白L10)、RPL13α (核糖体蛋白S13α)、AK (精氨酸激酶)和V-ATPase (液泡型ATP合酶)等。符伟等[10]分析了小菜蛾Plutella xylostella候选内参基因在Bt毒素诱导时的表达稳定性，最终筛选出由PRS13、RPL32和 EF1α组成的最佳内参基因组合。冯波等[11] 筛选出最适合校正松墨天牛Monochamus alternatus化学感受组织基因表达的GAPDH和TUB内参基因组合。刘金泊[12]评价了赤拟谷盗Tribolium castaneum的候选内参基因在磷化氢诱导条件下的表达稳定性，筛选出RPS18和 RPL13α最佳内参基因组合。杨苓等[13]筛选出了适合桃蛀螟Conogethes punctiferalis不同发育时期和不同组织的基因表达研究的2组最佳内参组合(RP49和GAPDH，RPL13和RP49)。陶蓉等[14]则分别筛选出了美国白蛾Hyphantria cunea不同发育阶段、不同温度和不同组织的3组最佳内参基因(RPL12和EF1β，EF1α和GAPDH，ACT和RPS16)。目前，关于筛胸梳爪叩甲幼虫内参基因的筛选评估尚未见报道。本研究对平沙绿僵菌Metarhizium pingshaense侵染不同时期的筛胸梳爪叩甲幼虫qRT-PCR内参基因进行了筛选和评估，以期选出最佳的内参基因，为今后开展竹林金针虫等昆虫的基因表达研究提供参考。
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供试筛胸梳爪叩甲幼虫于2020年3月下旬至4月中旬采自浙江省湖州市德清县的早园竹林地，带回室内置于塑料养虫箱中，箱内装满约3/4的土壤(湿度为10% ± 1%)，定期喂以鲜笋。供试平沙绿僵菌WP08菌株由中国林业科学研究院亚热带林业研究所森林保护团队提供，该菌株最初从僵死的筛胸梳爪叩甲幼虫虫体上分离获得[15]。WP08菌株接种于PDA培养基，产孢3周左右收集分生孢子。供试土壤采自德清早园竹园区，40 目的网筛过筛，高温灭菌(121 ℃、1 h)，烘干备用。
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取一定量的平沙绿僵菌WP08分生孢子与供试土壤，混匀后调节土壤水分为(10 ± 1)%，土壤孢子密度为1.1×107个·g−1。挑选活力强且个体大小一致的幼虫置于处理样品中，培养至7、12和17 d时取样，以未经绿僵菌侵染处理的幼虫作为对照组(0 d)，随机取样5头·份−1。试验在人工气候培养箱中进行，温度设定为(25 ± 1) ℃，空气相对湿度为(80 ± 10)%，黑暗条件，设置3个生物学重复。所有样品用无菌水清洗数遍，用体积分数75%的乙醇表面消毒后，再用无菌水清洗1遍；无菌滤纸吸干虫体体表水分，液氮速冻，存放于−80 ℃备用。
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利用景新微量动物组织总RNA提取试剂盒(SIMGEN，杭州)提取不同样品的RNA，具体操作参照试剂盒说明书。利用质量浓度1.0%的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计(美国Thermo Scientific)检测所提取总RNA的质量和质量浓度。利用无菌双蒸水(ddH2O)将所有样品RNA稀释到125 mg·L−1备用。按照PrimeScriptTM Reagent kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)反转录试剂盒(Takara)说明书合成样品cDNA，每个样品取7.0 μL RNA。
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参考昆虫常用内参基因，根据筛胸梳爪叩甲幼虫的转录组测序注释结果[16]，筛选不同内参基因(β-actin、α-tubulin、GAPDH、AK、SYN6、RPS3、RPL13α、RPL10、RPS27a、RPL32、RPS20和EF-1α)的同源序列，同时筛选昆虫免疫应答相关基因的6个同源序列[PGRP、Prx、SDR(1)、SDR(2)、SDR(3)和SDR(4)]，并利用在线网站http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/针对基因开放阅读框(ORF)区设计qRT-PCR扩增引物。所有引物均由北京擎科新业生物技术有限公司合成。
以cDNA(0 d)为模板进行普通PCR扩增，并根据电泳结果筛选出扩增条带单一的特异性引物对。PCR扩增反应体系为：2×TSINGKE Master Mix 10.0 μL，上下游引物(10 μmol·L−1)各1.5 μL，模板cDNA 3.0 μL，ddH2O补足至20.0 μL。扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，退火55 ℃，72 ℃延伸2 min，共35个循环；最后于72 ℃补平7 min，终止温度为4 ℃。PCR扩增反应在LifeECO基因扩增仪(杭州博日)上进行。取PCR扩增产物3.0 μL，点样于质量浓度为1.5%的琼脂糖凝胶上，TS-GelRed核酸染料染色，1×TAE缓冲液中电泳30~40 min(120 V)，利用Bio-Rad凝胶成像分析仪(美国伯乐)摄取扩增图谱。
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标准曲线构建。将反转录获得的cDNA(0 d)稀释2倍后，再依次稀释5个梯度，各梯度依次稀释5倍。以梯度稀释的cDNA为模板进行qRT-PCR，反应在Line Gene 9600 Plus实时荧光定量PCR仪(杭州博日)上进行，使用Gene-9660 software采集数据。PCR扩增反应体系为：2×SYBR Green Mix 5.0 μL，上下游引物(5 μmol·L−1)各0.2 μL，模板cDNA 1.0 μL，ddH2O补足至10.0 μL。qRT-PCR扩增程序：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火和延伸1 min，共40个循环，60 ℃采集荧光信号。扩增结束后做熔解曲线分析以检测扩增产物的特异性。熔解曲线程序：95 ℃，15 s；65 ℃，1 min；95 ℃，20 s，隔20 s步进0.2 ℃；30 ℃，1 min。各样品进行3次技术重复，取循环阈值(cycle threshold，Ct)的平均值。判断每对引物是否具有特异性以及是否有引物二聚体，熔解曲线为单峰时用于后续分析。
扩增效率分析。利用SPSS 19.0软件分析cDNA模板质量浓度(对数值)和Ct值的线性关系，获得相关系数(R2)和斜率(S)，利用公式E=(10−1/S−1)×100%计算引物的扩增效率[17]。
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以0(ck)、7、12和17 d取样的cDNA为模板，利用1.4节筛选出的引物对进行qRT-PCR，具体程序同1.4节所述。利用Excel 2003，GeNorm[18]、Normfinder[19]和Bestkeeper[20]软件根据Ct平均值分析候选内参基因的表达稳定性。GeNorm根据表达稳定度(M值)大小对候选内参基因进行排序，M值越小表示基因表达越稳定；根据标准化因子的配对差异分析(Vn/n+1)判定最佳的内参基因数组，Vn/n+1＜0.15代表该条件下内参基因最佳数目为n个。Bestkeeper软件通过标准差(SD)和概率值(P)直接分析Ct值，SD＞1或者P＞0.05时，判定该基因不适合作为内参基因。具体操作方法参考文献[21]。
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选择免疫应答相关基因的6个同源序列作为目的基因，分析1.6节选出的内参基因在不同处理间(0、7、12和17 d)的相对表达量变化，以验证其表达稳定性。目的基因相对表达量的计算采用
${2^{{\rm{ - }}\Delta \Delta {C_{\rm{t}}}}} $ 法。其中：ΔΔCt=ΔCt-实验−ΔCt-对照，△Ct=Ct-目的基因−Ct-内参基因。采用统计学单因素方差分析及最小显著性差异法(LSD)多重比较分析差异显著性。 -
由图1可见：所有样品D(260)/D(280)均为1.8~2.1，凝胶电泳结果可见2条清晰条带(28S和18S rRNA)，说明总RNA较为完整，未出现明显降解。
图 1 总RNA电泳图
Figure 1. Electrophoretogram of total RNA
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根据筛胸梳爪叩甲幼虫的转录组测序数据，筛选出24条候选内参基因和6条目的基因的同源序列，根据普通PCR扩增结果选出条带单一的22对特异性引物，再根据qRT-PCR的引物熔解曲线、R2和扩增效率进一步筛选出6对内参基因(β-actin、GAPDH、α-tubulin、RPL13α、RPS27a和RPS3)和6对目的基因的引物。12对引物的熔解曲线均为单峰，R2为0.989~0.998，扩增效率为88.69%~112.48%，表明引物具有特异性，cDNA的质量浓度和Ct值存在明确的线性关系，引物扩增效率符合荧光定量要求(表1)。
表 1 qRT-PCR引物信息
Table 1. Informations of qRT-PCR primers
基因 引物序列 产物长度/bp 扩增效率/% R2 β-actin F：GGATACCTCTTTTGCTCTGGG，R：ATCAGGGTGTCATGGTTGG 75 112.48 0.993 GAPDH F：CTACTCATGGTCGTTACAAGGG，R：TTCTACAACGTATTCAGCTCCAG 140 101.79 0.993 α-tubulin F：GAAGCTCGTGAAGATTTGGC，R：ACCTTCGCCTTCTCCTTCTC 137 100.63 0.996 RPL13α F：CTGAGGAAGAGCGTAAGGTG，R：TCAGCACGAGCCTTTCTTAAG 145 106.97 0.990 RPS27a F：CTTGTCCTGAATCTTTGCCTTG，R：GTTCTTTTGGTAGCGTGTCATG 146 96.20 0.998 RPS3 F：CAATAGCGCACAAACCACG，R：TGTATTGGGTGAAAAGGGAAGG 128 111.93 0.992 PGRP F：TGTCGTACTTCTGGCTATCATTG，R：TGTGATGGAGGGTTTACTTGC 123 88.69 0.989 Prx F：CTATCCCTTAGACTTCACCTTCG，R：ATTTCTCCCAAACCTCCCTG 171 106.67 0.996 SDR(1) F：CGGCATTGACGGAAACTTTAC，R：GGTTTCCACAGACTTTTGCG 126 109.16 0.995 SDR(2) F：AGGTGCTAGTTCGGGAATTG，R：CGTGTAATTTGCCAGGTTTTCC 140 99.49 0.997 SDR(3) F：GGATTACGAGCATAAGTCCTGG，R：CGGCGATGTCTTCAGATTTTAAC 126 106.58 0.996 SDR(4) F：TTAGGGTTTCAGTCAAGGCAG，R：GAAGCCGTCCAAGATATGAAAG 148 93.34 0.994 -
不同平沙绿僵菌侵染处理时长(0、7、12和17 d)下，筛胸梳爪叩甲幼虫6个候选内参基因的Ct值为11.110~15.463(图2)，表明本试验条件下所选内参基因表达水平较高。但不同基因的Ct值存在差异，其中β-actin最低，平均Ct值为11.622；α-tubulin最高，平均Ct值为14.712；GAPDH的Ct值跨度最小(13.273~13.873)；RPS3跨度最大(13.720~14.970)。
图 2 筛胸梳爪叩甲幼虫候选内参基因的Ct值分析
Figure 2. Ct value analysis of candidate reference genes of Melanotus cribricollis larvae
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GeNorm软件计算基因的表达稳定度(M值)，M＞1.5的内参基因不可用，M越小，内参基因的表达越稳定。该软件分析结果显示：6个候选内参基因的M值均＜1.5，PRS27a和RPS3的表达最稳定，其后依次是α-tubulin、RPL13α和β-actin，GAPDH的表达最不稳定。NormFinder通过比较样本的组内变异和组间变异来评估基因的稳定值。该软件分析结果显示：RPL13α的表达最稳定，其后依次是α-tubulin、RPS3、RPS27a和β-actin，GAPDH的表达最不稳定。BestKeeper是以标准差和P来判断内参基因是否可用。该软件分析结果显示：所有候选内参基因的标准差均＜1，但β-actin和GAPDH P＞0.05，不适合作为本试验条件下的内参，其余4个内参基因可用。综合3个软件的评价结果发现：RPS3、PRS27a、RPL13α和α-tubulin这4个内参的表达稳定性排名稍有差异，RPS3的表达最稳定，PRS27a和RPL13α次之，随后是α-tubulin(表2)。GeNorm软件通过判断配对变异值(＜0.15)来确定内参基因最佳数目。由表3可知：V2/3=0.084＜0.15，表明该条件下最佳内参基因的数目n=2(表3)。
表 2 利用BestKeeper软件评价候选内参基因的表达稳定性
Table 2. Stability of candidate reference genes based on BestKeeper analysis
基因 GeNorm NormFinder BestKeeper 稳定值 排名 稳定值 排名 标准差 P 排名 β-actin 0.391 4 0.244 5 0.27 0.313 6 GAPDH 0.426 5 0.293 6 0.16 0.261 5 α-tubulin 0.242 2 0.177 2 0.24 0.042 4 RPL13α 0.319 3 0.164 1 0.32 0.024 3 RPS27a 0.197 1 0.206 4 0.35 0.012 2 RPS3 0.197 1 0.202 3 0.39 0.002 1 表 3 内参基因的最佳数量评估
Table 3. Determination of the optimal number of reference genes for normalization
Vn/n+1 配对变异值 Vn/n+1 配对变异值 V2/3 0.084 V4/5 0.092 V3/4 0.092 V5/6 0.074 说明：n表示内参基因数目 -
综合3款软件的内参基因表达稳定性排名和最佳组合数目分析结果，本研究选择PRS27a和RPS3为内参基因。由图3可知：以PRS27a和RPS3为内参基因时，6个目的基因在平沙绿僵菌不同处理时间(0、7、12和17 d)的筛胸梳爪叩甲幼虫中的表达变化趋势相同；其中，PGRP基因相对表达量在7 d时都较对照(0 d)显著提高(P＜0.05)，随后下降，12 和17 d时无显著差异；Prx基因相对表达量整体呈上升趋势，在12 和17 d时均显著高于对照(P＜0.05)；SDR(1)相对表达量则呈下降趋势；SDR(2)在17 d 时相对表达量显著升高(P＜0.05)；SDR(3)和SDR(4)相对表达量均先升高后下降，并在12 d时表达量最高，较其他处理时间存在显著性差异(P＜0.05)。
图 3 以PRS27a和RPS3为内参时6个目的基因不同处理时间下的相对表达量
Figure 3. Expression analysis of six target genes under different processing times calibrated by PRS27a and RPS3 as reference genes
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实时荧光定量PCR具有快速、准确和灵敏的特性，在基因表达分析研究中应用广泛，然而表达稳定的内参基因选择是获得目的基因准确表达结果的前提条件。同一内参基因在不同物种、组织、发育阶段和处理条件下的表达稳定性也存在差异[8-9]。目前尚未见有关筛胸梳爪叩甲幼虫内参基因的研究报道。本研究首次对该虫在平沙绿僵菌侵染条件下的候选内参基因进行了筛选评估。GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件对候选内参基因的分析结果表明：PRS27a和RPS3的表达稳定。本研究以PGRP、Prx、SDR(1)、SDR(2)、SDR(3)和 SDR(4)为目的基因对PRS27a和RPS3内参基因进行了验证，结果显示：分别以这2个基因为内参时，6个目的基因的表达趋势一致，证明了这2个基因作为内参的可靠性。PGRP隶属于模式识别受体蛋白(pattern recognition receptor proteins，PRRs)家族，可与革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的肽聚糖结合，激活Toll和Imd信号转导通路，诱导免疫防御相关的水解级联反应，发生吞噬作用[22-23]。以PRS27a和RPS3为内参时，目的基因PGRP在筛胸梳爪叩甲幼虫体内被平沙绿僵菌诱导表达，7 d时较对照组显著升高，该现象与赤拟谷盗和油菜花露尾甲Meligethes aeneus PGRP基因被寄生物或病原菌诱导后表达上调相似[24-25]。Prx基因编码过氧化物还原酶(peroxiredoxin)，是抗氧化家族中的一员，能够通过消除细胞内的活性氧(ROS)以维持氧化还原平衡[26]。以PRS27a和RPS3为内参时，目的基因Prx整体表达呈上升趋势，推测其可能在病程后期发挥作用。SDR蛋白(short-chain dehydrogenases/reductases，短链脱氢还原酶)是一个超级家族，由多种酶编码基因家族组成，在多种生物合成途径、细胞信号通路和病理途径中都扮演重要角色[27]。本研究发现：筛胸梳爪叩甲幼虫4个SDR基因[SDR(1)、SDR(2)、SDR(3)和 SDR(4)]对绿僵菌侵染的响应机制不同，可能是因为参与过程不同。由上可见，以PRS27a和RPS3为内参时，筛胸梳爪叩甲幼虫PGRP、Prx和SDR这3类基因的表达模式符合赤拟谷盗和油菜花露尾甲等昆虫对病原菌的响应机制，进一步证实了该内参组合适用于绿僵菌侵染条件下的目的基因表达水平研究。
本研究首次报道了在平沙绿僵菌侵染条件下筛胸梳爪叩甲幼虫可用的内参基因(PRS27a和RPS3)，为后续研究绿僵菌和竹林金针虫互作相关基因的表达奠定基础，也对其他昆虫基因表达以及虫菌互作相关研究提供参考。
Screening and application of reference genes for qRT-PCR in bamboo wireworm
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摘要:
目的 筛选平沙绿僵菌Metarhizium pingshaense侵染条件下筛胸梳爪叩甲Melanotus cribricollis幼虫稳定表达的内参基因，为该竹林金针虫相关基因的表达研究奠定基础。 方法 基于筛胸梳爪叩甲幼虫的转录组数据，利用实时荧光定量PCR扩增特异性引物，分析相关性和扩增效率；利用GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件评估筛选出6个候选内参基因(β-actin、GAPDH、α-tubulin、RPL13α、RPS3、RPS27a)，并验证其表达稳定性。 结果 GeNorm分析结果显示：PRS27a和RPS3的表达最稳定，随后依次是α-tubulin、RPL13α、β-actin和GAPDH；最适合的内参基因数目为2。NormFinder分析结果显示：RPL13α的表达最稳定，随后依次是α-tubulin、RPS3、RPS27a、β-actin和GAPDH。BestKeeper分析结果显示：β-actin和GAPDH的P＞0.5，不适合作为本试验条件下的内参基因。不同软件分析得出的候选内参排序存在一定差异。综合分析和表达稳定性验证表明PRS27a或RPS3是最佳内参基因，6个目的基因的表达水平变化趋势均基本一致。 结论 PRS27a和RPS3是研究平沙绿僵菌侵染的竹林金针虫相关基因表达的最佳内参基因。图3表3参27 Abstract:Objective The objective of this study was to screen the stable expression of internal reference genes of Melanotus cribricollis larvae infected by Metarhizium pingshaense, so as to lay a foundation for the research on related gene expression in this bamboo wireworm. Method Based on the transcriptome data of M. cribricollis larvae, the correlation (R2) and amplification efficiency were analyzed by qRT-PCR with specific primers. The 6 candidate reference genes including β-actin, GAPDH, α-tubulin, RPL13α, RPS3 and RPS27a were evaluated by GeNorm, NormFinder and BestKeeper softwares. The stabilities of selected candidate reference genes including PRS27a and RPS3 were further validated by analyzing the expression of 6 target genes. Result GeNorm analysis showed that the expression of PRS27a and RPS3 were the most stable, followed by α-tubulin, RPL13α, β-actin and GAPDH. The most suitable number of internal reference genes was 2. NormFinder analysis showed that the expression of RPL13α was the most stable, followed by α-tubulin, RPS3, RPS27a, β-actin, and GAPDH. BestKeeper analysis showed that the P values of β-actin and GAPDH were ＞0.5, which were not suitable for reference genes under the condition of this experiment. There were some differences in the ranking of candidate internal parameters obtained by different software analysis. Comprehensive analysis and expression stability verification showed that PRS27a or RPS3 were the best internal reference genes, and the expression levels of 6 target genes were basically the same. Conclusion PRS27a and RPS3 were the most appropriate reference genes for qRT-PCR analysis in bamboo wireworm infected by M. pingshaense. [Ch, 3 fig. 3 tab. 27 ref.] -
密码子承担着生物体内遗传信息传递的重要功能，是DNA转录与翻译、蛋白质合成与表达过程中的关键单元。在生物体共用的一套密码子中，终止密码子不编码氨基酸，甲硫氨酸(Met)和色氨酸(Trp)分别由1种密码子编码。其余59个密码子具有简并性，即1种氨基酸可由2~6个密码子对应编码，编码相同氨基酸的密码子即为同义密码子[1]。基因并非完全随机地使用同义密码子，而是存在一定的偏好性。特定的密码子偏好性是生物体长期适应性进化的结果，能够反映生物对环境的分子适应机制[2]。分析密码子偏好性及其影响因素，对生物遗传育种、进化基因组学以及系统发育学研究具有深远的意义。1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶(Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase, Rubisco酶)是植物叶绿体基质中参与光合作用的关键酶，约占可溶性蛋白质总量的50%[3]。Rubisco酶具有催化1,5-二磷酸核酮糖(Ribulose-1,5-disphosphate, RuBP)与二氧化碳(CO2)羧化反应和光呼吸中RuBP与氧气(O2)加氧反应的双重活性，对净光合率有决定性影响[4]。Rubisco酶由8个大亚基(催化亚基)和8个小亚基(调节亚基)组成，前者是固定CO2的活性位点和催化位点，由叶绿体基因组大单拷贝区的rbcL基因编码[5-6]。环境的变化会导致rbcL基因产生适应性进化，从而影响植物光合效率[7]。因此，研究rbcL基因的密码子使用模式有利于理解高等植物对环境的适应机制。千屈菜科Lythraceae包括许多重要的园林植物，具有重要的观赏价值和经济价值[8]。目前，rbcL基因在千屈菜科中的研究应用仅局限于系统发育[9-10]，对于该科密码子使用偏好性的相关研究尚未见报道。本研究选取了千屈菜科具有代表性的10属20种植物，分析rbcL基因的碱基组成、密码子使用偏好性及其影响因素，并与模式物种进行比较，为该科物种rbcL基因异源高效表达提供理论基础。
1. 材料与方法
1.1 基因序列和密码子使用频率数据获取
20条rbcL基因全长编码区序列(CDS)数据来源于美国国家生物技术信息中心(NCBI)的GenBank数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，详见表1。
表 1 20种千屈菜科植物rbcL基因信息Table 1 Information of rbcL genes from 20 Lythraceae species物种 GenBank登录号 CDS位置 物种 GenBank登录号 CDS位置 萼距花 Cuphea hyssopifolia MN833211 58955~60382 南洋紫薇 Lagerstroemia siamica MK881628 55129~56556 八宝树 Duabanga grandiflora MK881638 56823~58250 绒毛紫薇 Lagerstroemia tomentosa MK881632 54873~56300 黄薇 Heimia myrtifolia MG921615 58612~60039 西双紫薇 Lagerstroemia venusta MK881630 55159~56586 副萼紫薇 Lagerstroemia calyculata MK881636 54873~56300 散沫花 Lawsonia inermis MK881631 58836~60263 川黔紫薇 Lagerstroemia excelsa MK881635 54910~56337 千屈菜 Lythrum salicaria MK881629 59099~60526 屋久岛紫薇 Lagerstroemia fauriei NC_029808 54810~56237 石榴 Punica granatum NC_035240 59017~60444 多花紫薇 Lagerstroemia floribunda NC_031825 54776~56203 圆叶节节菜 Rotala rotundifolia MK881626 58835~60262 桂林紫薇 Lagerstroemia guilinensis NC_029885 54697~56124 细果野菱 Trapa maximowiczii NC_037023 58322~59770 云南紫薇 Lagerstroemia intermedia NC_034662 54948~56375 欧菱 Trapa natans MK881634 58387~59814 福建紫薇 Lagerstroemia limii MK881627 54830~56257 虾子花 Woodfordia fruticosa MK881637 59444~60871 1.2 CDS碱基组成和密码子使用偏好性参数统计
通过CodonW 1.4.4软件和在线工具EMBOSS explorer(http://emboss.toulouse.inra.fr./)中的CUSP和CHIPS程序，统计rbcL基因密码子末端各类型碱基含量(A3s、T3s、C3s和T3s)、GC总含量(GC)、密码子各位点GC含量(GC1s、GC2s和GC3s)、有效密码子数(ENC)和密码子适应指数(CAI)。利用SPSS 22.0软件，选用皮尔森相关系数评估碱基组成和密码子偏好性相关显著水平[11]。
1.3 同义密码子相对使用度统计与分析
同义密码子相对使用度(RSCU)是同义密码子的实际使用频次与无使用偏好性时期望频次的比率，去除了碱基成分对密码子使用产生的影响。RSCU＞1，表示该密码子在同义密码子中使用相对较多；RSCU=1，表示该密码子在同义密码子中使用无偏好性；RSCU＜1表示该密码子在同义密码子中使用相对较少[12]。通过CodonW 1.4.4软件计算千屈菜科植物的RSCU，并利用TBtools 0.6软件绘图。
1.4 ENC绘图分析
以GC3s和ENC为横、纵坐标，通过Origin 9.1绘制ENC-GC3s散点图。标准曲线为ENC期望值，即NENC=2+MGC3s+29/[MGC3s2+(1−MGC3s)2]，其中NENC表示有效密码子数，MGC3s表示密码子第3位碱基平均GC含量，该公式的成立表示密码子的偏好性仅受突变压力约束[13]，此条件下，散点应位于标准曲线上部或紧贴标准曲线下部；当散点分布于曲线下方较远距离的区域时，表明除突变压力作用外，选择压力对偏好性产生主要影响。
1.5 中性绘图分析
以GC3s为横坐标，密码子第1、2位点GC含量平均值(GC12)为纵坐标，利用Origin 9.1绘制散点图并做线性回归分析，分析密码子不同位点碱基组成差异性[14]。当回归曲线斜率趋近1时，密码子各位点碱基成分差异不大，偏好性主要受到突变的影响；当斜率趋近0时，密码子第3位点和第1、2位点碱基变异模式差异较大，偏好性主要受到选择压力影响。
1.6 奇偶偏差(PR2)分析
奇偶偏差分析可评估密码子第3位点嘌呤和嘧啶组成偏差对密码子使用偏好性的影响[15]。以G3s/(G3s+C3s)和A3s/(A3s+T3s)为横、纵坐标，利用Origin 9.1绘制奇偶偏差图，交点(0.50, 0.50)表示无碱基突变和选择压力下，A=T且G=C。
1.7 基于RSCU和CDS的聚类分析
参照巫伟峰等[16]方法，以59个密码子(去除AUG、UGG和3个终止密码子UAA、UAG、UGA)的RSCU为变量，20条CDS为个体，通过SPSS进行系统聚类，类间距离为组内联接法，基因间距离为平方欧式距离。分别利用DAMBE 5.2.73和MEGA-X软件对CDS进行碱基替换饱和度检测和总体平均距离(d)计算，同时满足替换饱和度指数(Iss)小于饱和度标准指数(Iss.c)，即Iss＜Iss.c，表明碱基替换未饱和，且P=0.000和0＜d＜1后，通过MEGA-X软件邻接法(NJ)构建系统发生树，重复1 000次。
1.8 密码子使用频率比较分析
密码子相对使用频率比值是评估不同生物密码子使用偏好性差异程度的重要参数。当比值为0.5~2.0时，认为物种密码子偏好性差异较小[17]。拟南芥Arabidopsis thaliana、烟草Nicotiana tabacum、番茄Solanum lycopersicum、大肠埃希菌Escherichia coli和酵母Saccharomyces cerevisiae的基因组密码子使用频率来源于密码子使用数据库(http://www.kazusa.or.jp/codon/)。千屈菜科物种整体密码子平均使用频率通过EMBOSS explorer中CUSP计算获得[18]。利用Origin 9.1进行绘图。
2. 结果与分析
2.1 rbcL基因碱基组成和密码子使用偏好性
从表2可见：GC含量为0.425~0.437，平均为0.431。结合密码子各位点GC含量(GC1s为0.567~0.582，平均0.573；GC2s为0.429~0.437，平均0.432；GC3s为0.275~0.300，平均0.288)，表明rbcL基因CDS在组成上更倾向于使用A/T碱基。第3位点各类型碱基含量从大到小依次为T3s、A3s、C3s、G3s，表明rbcL基因更偏向于使用A/T碱基结尾的密码子。
表 2 20种千屈菜科植物rbcL基因碱基组成和密码子使用特性Table 2 Base composition and codon usage characteristics of rbcL genes from 20 Lythraceae species物种 A3s T3s G3s C3s GC GC1s GC2s GC3s CAI ENC 萼距花 0.376 0.531 0.157 0.173 0.435 0.582 0.437 0.286 0.276 45.392 八宝树 0.380 0.526 0.152 0.180 0.431 0.571 0.433 0.288 0.278 45.942 黄薇 0.390 0.508 0.145 0.194 0.434 0.571 0.433 0.296 0.283 46.540 副萼紫薇 0.377 0.525 0.148 0.186 0.432 0.576 0.429 0.292 0.277 45.635 川黔紫薇 0.376 0.526 0.149 0.187 0.432 0.571 0.431 0.294 0.275 45.743 屋久岛紫薇 0.379 0.529 0.146 0.184 0.431 0.571 0.431 0.290 0.272 45.659 多花紫薇 0.378 0.526 0.148 0.184 0.432 0.576 0.429 0.292 0.276 45.625 桂林紫薇 0.376 0.526 0.149 0.187 0.432 0.571 0.431 0.294 0.275 45.743 云南紫薇 0.379 0.526 0.140 0.191 0.431 0.571 0.431 0.290 0.275 45.340 福建紫薇 0.379 0.531 0.142 0.184 0.430 0.571 0.431 0.288 0.274 45.564 南洋紫薇 0.379 0.526 0.140 0.191 0.431 0.571 0.431 0.290 0.275 45.340 绒毛紫薇 0.377 0.525 0.148 0.186 0.432 0.576 0.429 0.292 0.277 45.635 西双紫薇 0.379 0.526 0.140 0.191 0.431 0.571 0.431 0.290 0.275 45.340 散沫花 0.379 0.536 0.151 0.171 0.429 0.569 0.435 0.282 0.276 45.264 千屈菜 0.389 0.535 0.138 0.173 0.428 0.576 0.433 0.275 0.285 45.007 石榴 0.381 0.518 0.153 0.184 0.436 0.578 0.437 0.294 0.275 46.153 圆叶节节菜 0.379 0.536 0.151 0.171 0.429 0.569 0.435 0.282 0.276 45.264 细果野菱 0.387 0.532 0.154 0.165 0.425 0.567 0.431 0.277 0.274 44.181 欧菱 0.387 0.532 0.154 0.165 0.426 0.569 0.431 0.277 0.274 44.029 虾子花 0.376 0.516 0.163 0.184 0.437 0.576 0.435 0.300 0.270 46.458 ENC和CAI是衡量密码子使用偏好性程度的主要指标。ENC从20(氨基酸只由1种同义密码子编码)至61(同义密码子的使用没有偏好性)，越接近20偏好性越强。一般认为，ENC＜35表示密码子的使用偏好性较强[19]。20种千屈菜科植物ENC为44.029~46.540，平均45.493，分布范围较小且均远大于35，表明rbcL基因整体偏好性不强。CAI取值0~1，越接近1密码子偏好性越强[20]。20种植物CAI为0.270~0.285，平均0.276，同样说明偏好性强度不大。一般情况下，基因的密码子使用偏好性越强，在生物体内的表达水平越高[21]，可推测rbcL基因在千屈菜科植物中表达水平较低。
2.2 rbcL基因同义密码子相对使用度分析
图1显示：在25个高频密码子(RSCU＞1)中，23个以A/U结尾，仅2个由C(AUC和AGC)结尾。其中RSCU最高的5个密码子(RSCU＞2)末尾均为U碱基，表明rbcL基因CDS对于末端A/U(T)密码子具有的使用偏好性。
2.3 密码子碱基组成和使用偏好相关分析
相关分析(表3)表明：ENC和GC、GC3s在0.01水平上显著相关(Pearson相关系数分别为0.855和0.856)，表明碱基组成，尤其是密码子第3位点碱基类型对千屈菜科rbcL基因的密码子偏好性有明显影响。GC3s和GC12相关不显著，说明不同位点组成上关联不大，碱基变异模式存在差异，rbcL基因较保守，突变偏性较小。
表 3 碱基组成与密码子使用偏好相关性Table 3 Correlation between base composition and codon usage bias参数 CAI ENC GC GC1s GC2s GC3s ENC 0.062 GC − 0.136 0.855** GC1s 0.138 0.403 0.712** GC2s 0.029 0.229 0.348 0.314 GC3s − 0.264 0.856** 0.846** 0.324 − 0.074 GC12 0.112 0.403 0.684** 0.869** 0.743** 0.190 说明：**表示在0.01水平上显著相关(双尾) 2.4 ENC绘图分析
图2显示了rbcL基因ENC和GC3s的关系。所有散点分布在标准曲线下方一定距离处，表明千屈菜科植物rbcL基因的密码子偏好性除了受到碱基突变压力外，更主要受自然选择压力的约束；散点集中分布在较小范围内说明自然选择压力强度相近。
2.5 中性绘图分析
中性分析结果(图3)显示：所有散点均落在直线y=x(GC12)上方。GC3s与GC12的回归曲线(斜率为0.069 4，R2=0.036 1)近似平行于X轴，表明千屈菜科植物rbcL基因密码子第1、2位点与第3位点碱基类型相差较大。结合表3，GC3s与GC12相关性较低(Pearson相关系数为0.190)，说明碱基突变对于密码子第3位点的作用比第1、2位点弱，密码子偏好性主要受自然选择压力的作用，受突变压力的影响则较小。
2.6 奇偶偏差(PR2)分析
图4显示：当密码子偏好性只受碱基突变影响时，密码子第3位点上嘌呤和嘧啶含量应相同，即A3s=T3s或C3s=G3s[22]。所有散点均明显偏离交点(0.50, 0.50)，且都分布在左下象限[G3s/(G3s+C3s)＜0.5，A3s/(A3s+T3s)＜0.5]，密码子第3位点上嘧啶含量高于嘌呤[(A3s+G3s)＜(T3s+C3s)]。4种碱基在密码子第3位点上分布不均匀，说明相较于碱基突变压力，自然选择压力对rbcL密码子偏好性有更强的影响。
2.7 基于RSCU和CDS的聚类分析
20条CDS碱基替换未饱和(Iss=0.025 3，Iss.c=0.785 2，P=0.000)，总体平均遗传距离为0.2。系统聚类树状图和邻接树均将20种千屈菜科植物聚成了4~5个支系(图5)，说明不同支系的植物密码子使用特性存在一定区别。虽然两者在部分支系的内部结构上存在较大矛盾，但在支系水平(属)上，两者对10个紫薇属Lagerstroemia植物、散沫花和圆叶节节菜以及2个菱属Trapa植物之间的聚类结果相对一致，说明基于密码子RSCU的系统聚类能在某种程度上反映千屈菜科植物属间水平的亲缘关系，即不同植物密码子的使用偏好性与亲缘关系存在局部对应。
图 5 基于rbcL基因CDS的邻接树(左)和基于59个密码子RSCU的聚类树状图(右)Figure 5 NJ tree based on CDS of rbcL genes (left) and cluster dendrogram based on RSCU of 59 codons (right)2.8 千屈菜科植物与模式物种密码子使用频率比较分析
从图6可以看出：与千屈菜科植物rbcL基因密码子平均使用频率相比，大肠埃希菌有28个密码子相差较大，最大值5.76(AGA)；酵母有26个密码子相差较大，最大值4.33(CGU)，说明酵母更适合作为千屈菜科植物rbcL基因异源表达的受体。拟南芥、烟草和番茄分别存在20、19和17个使用频率相差较大的密码子，且最大值均出现在CGU，初步说明相较于拟南芥和烟草，番茄更适合作为千屈菜科植物rbcL基因遗传转化的受体。
图 6 千屈菜科植物与模式生物密码子使用频率比值Figure 6 Ratios of codon usage frequency of Lythraceae species to model organisms3. 结论与讨论
特定的密码子使用偏好性是生物对环境变化适应性的体现，不同物种、不同功能基因的密码子偏好性存在明显差异。大部分双子叶植物密码子偏好A/T碱基结尾，单子叶植物则偏好G/C结尾[23]，与本研究中千屈菜科植物rbcL基因密码子A3s+T3s远远大于G3s+C3s的偏好性结果一致。李国灵等[13]对红藻门Rhodophyta植物rbcL基因密码子偏好性研究也得到了类似结果，虽然红藻科和千屈菜科植物生活型、生理特性等相差较大，但千屈菜科也包括许多水生或湿生植物。两者研究结果显示：植物从水生向陆生过渡过程中，rbcL基因密码子使用偏好性的变化可能较为稳定，这也许是rbcL基因受到强烈自然选择作用的结果。生物体内高表达的基因，其密码子偏好性也相对较强，反之亦然[24]。千屈菜科植物rbcL基因ENC较高，CAI较低，说明千屈菜科植物rbcL基因整体的密码子使用偏好性不强，在植物体内表达水平也不高。但仍存在CGU、CCU、ACU等13个偏好性相对较强的密码子(RSCU＞1.5)，其在氨基酸中残基含量也相对丰富。
密码子使用偏好性的影响因素包括碱基组成、突变、自然选择、漂变、基因长度、tRNA丰度以及基因表达水平的高低等，但最主要的压力来自于突变和自然选择[25]。本研究中，千屈菜科植物rbcL基因GC3s和GC、ENC的相关性显著，表明密码子偏好性在一定程度上受到了碱基组成的影响，之前的研究也证明GC3s和GC含量之间存在明显的线性关系[26]。但GC3s与GC12相关程度较低，且GC3s集中分布在0.275~0.300内，KAWABE等[23]研究表明：密码子使用偏好性主要受自然选择的影响，而碱基突变的影响则较小，ENC分析、中性分析、奇偶偏差分析也得出相同的结论。这可能是由于rbcL基因本身为叶绿体基因，分子进化速率相较于核基因更慢，且编码的二磷酸核酮糖羧化酶是参与光合作用的关键蛋白，相对比较保守，所以突变压力对其密码子使用偏好性的作用相对较弱；而正选择、协同进化等作用在陆生植物的rbcL基因中被证明广泛存在，也表明rbcL基因密码子使用偏好性可能广泛受到选择约束[27-28]。
与RSCU聚类分析结果相比，基于CDS的邻接树在理论上更接近真实的物种系统发育关系。两者相对一致的部分说明千屈菜科植物rbcL基因密码子使用特性与属间亲缘关系存在一定程度的对应；两者之间较为矛盾的分支可能是系统聚类仅选取单一RSCU数据分析导致的，结合密码子偏好性的其他参数，或许能获得更加一致的结果。由于单基因建树也可能会受到旁系同源基因干扰、水平基因转移等多种因素影响产生误差[29]，因此基于密码子偏好性的聚类分析也可对系统发生的研究内容进行一定补充。
转基因过程中，选择密码子使用偏好性相近的物种作为异源表达受体，有利于外源基因的高效表达[30]。千屈菜科植物多数都是木本植物，遗传转化体系尚未成熟，由于受限于同源物种生活史长、生长速度慢等因素，其基因功能研究十分依赖模式物种。通过与模式物种密码子使用频率的初步比较，酵母更适合作为千屈菜科植物rbcL基因的异源表达受体；与拟南芥、烟草相比，番茄的密码子使用频率与千屈菜科植物rbcL基因差异性最小，更适合作为rbcL基因功能验证的理想受体材料。但相对于番茄，拟南芥和烟草遗传转化体系建立相对较早，发展较为完善，已实现了多种木本植物叶绿体基因的遗传转化，积累的技术经验较多，遗传转化的难度也相对较小[31]。在观赏植物研究中，番茄更多作为植物呈色相关基因的遗传转化受体，验证其在色素积累与代谢中的调控作用[32]。因此，密码子使用频率的比较结果仅能为千屈菜科植物rbcL基因异源表达受体选择提供初步的预测，受限于该科木本植物当前采样难度较大，且遗传转化体系尚未成熟建立等因素，最适的异源表达受体仍须在进一步的实验中进行深入研究和严格筛选。
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图 2 筛胸梳爪叩甲幼虫候选内参基因的Ct值分析
Figure 2 Ct value analysis of candidate reference genes of Melanotus cribricollis larvae
图 3 以PRS27a和RPS3为内参时6个目的基因不同处理时间下的相对表达量
对照组的相对表达量设定为1 。不同小写字母表示以RPL27a为内参时差异显著(P＜0.05)，不同大写字母表示以PRS3为内参时差异显著(P＜0.05)
Figure 3 Expression analysis of six target genes under different processing times calibrated by PRS27a and RPS3 as reference genes
表 1 qRT-PCR引物信息
Table 1. Informations of qRT-PCR primers
基因 引物序列 产物长度/bp 扩增效率/% R2 β-actin F：GGATACCTCTTTTGCTCTGGG，R：ATCAGGGTGTCATGGTTGG 75 112.48 0.993 GAPDH F：CTACTCATGGTCGTTACAAGGG，R：TTCTACAACGTATTCAGCTCCAG 140 101.79 0.993 α-tubulin F：GAAGCTCGTGAAGATTTGGC，R：ACCTTCGCCTTCTCCTTCTC 137 100.63 0.996 RPL13α F：CTGAGGAAGAGCGTAAGGTG，R：TCAGCACGAGCCTTTCTTAAG 145 106.97 0.990 RPS27a F：CTTGTCCTGAATCTTTGCCTTG，R：GTTCTTTTGGTAGCGTGTCATG 146 96.20 0.998 RPS3 F：CAATAGCGCACAAACCACG，R：TGTATTGGGTGAAAAGGGAAGG 128 111.93 0.992 PGRP F：TGTCGTACTTCTGGCTATCATTG，R：TGTGATGGAGGGTTTACTTGC 123 88.69 0.989 Prx F：CTATCCCTTAGACTTCACCTTCG，R：ATTTCTCCCAAACCTCCCTG 171 106.67 0.996 SDR(1) F：CGGCATTGACGGAAACTTTAC，R：GGTTTCCACAGACTTTTGCG 126 109.16 0.995 SDR(2) F：AGGTGCTAGTTCGGGAATTG，R：CGTGTAATTTGCCAGGTTTTCC 140 99.49 0.997 SDR(3) F：GGATTACGAGCATAAGTCCTGG，R：CGGCGATGTCTTCAGATTTTAAC 126 106.58 0.996 SDR(4) F：TTAGGGTTTCAGTCAAGGCAG，R：GAAGCCGTCCAAGATATGAAAG 148 93.34 0.994 
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表 2 利用BestKeeper软件评价候选内参基因的表达稳定性
Table 2. Stability of candidate reference genes based on BestKeeper analysis
基因 GeNorm NormFinder BestKeeper 稳定值 排名 稳定值 排名 标准差 P 排名 β-actin 0.391 4 0.244 5 0.27 0.313 6 GAPDH 0.426 5 0.293 6 0.16 0.261 5 α-tubulin 0.242 2 0.177 2 0.24 0.042 4 RPL13α 0.319 3 0.164 1 0.32 0.024 3 RPS27a 0.197 1 0.206 4 0.35 0.012 2 RPS3 0.197 1 0.202 3 0.39 0.002 1
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表 3 内参基因的最佳数量评估
Table 3. Determination of the optimal number of reference genes for normalization
Vn/n+1 配对变异值 Vn/n+1 配对变异值 V2/3 0.084 V4/5 0.092 V3/4 0.092 V5/6 0.074 说明：n表示内参基因数目
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