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实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real time fluorescence polymerase chain reaction，qRT-PCR）因具有灵敏度高、特异性强、精准性高、检测范围广等优点[1]，已被广泛应用于植物基因表达的相关研究中。利用qRT-PCR分析基因相对定量表达时，为了消除不同组织细胞间初始模板量、核糖核酸（RNA）制备和反转录过程中的偏差，需要引入内参基因（reference gene）对表达结果进行校正[2-3]。实际研究中常选择的内参基因[4-8]只能在一定的试验范围内相对稳定表达，不能保证在所有试验条件下均能稳定表达[9-11]。如果盲目以一种看家基因作为任何试验条件下的内参基因，容易得到精确度低甚至错误的结果[12]，因此，在利用qRT-PCR进行基因表达分析时，根据试验处理及不同实验材料的特点，优化和选择合适的内参基因就显得极其重要。桂花Osmanthus fragrans是中国十大名花之一，随着桂花分子生物学研究的不断深入和发展，基因表达分析已经广泛应用于揭示其观赏性状形成机制的研究中，因此，筛选稳定的内参基因在桂花重要基因表达分析中起着关键的作用。已有研究筛选出桂花不同品种、不同发育状态花序和不同温度处理条件中合适的内参基因[13]，却未对不同组织中适合的内参基因进行筛选。本研究将以桂花‘堰虹桂’O. fragrans‘Yanhong Gui’不同组织（花蕾、盛开花序、嫩叶、成熟叶、1年生茎）为材料，利用qRT-PCR检测7个候选内参基因的表达水平，并利用软件geNorm[3]，NormFinder[2]和BestKeeper[14]对各候选内参基因的表达稳定性进行评价，筛选出最稳定表达的内参基因，并研究桂花类胡萝卜素异构酶（OfCRTISO1）在不同组织中的表达模式，验证筛选得到的内参基因的可靠性，希冀为后续研究不同组织重要基因的定量表达提供依据。
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浙江农林大学桂花资源圃10 a树龄地栽桂花‘堰虹桂’为试验材料，对其花蕾、盛开花序、嫩叶、成熟叶、1年生茎进行取样，液氮速冻后，于-80 ℃储藏备用。
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采用RNAprep pure Plant Kit（天根，北京）按照说明书步骤提取各样品的总RNA。紫外分光光度计和10.0 g·L-1琼脂糖凝胶电泳检测总RNA浓度和质量。采用Reverse Transcriptase M-MLV（Takara，大连）按照说明书合成cDNA的第1链后，于-20 ℃储存备用。
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本研究从前期构建的桂花转录组数据库中取肌动蛋白基因（OfACT），延伸因子1α蛋白基因（OfEF1α），NADP-异柠檬酸脱氢酶基因（OfIDH），GTP结合蛋白RAN1基因（OfRAN1），β微管蛋白基因（OfTUB），泛素结合酶E2基因（OfUBC2）和18S核糖体RNA基因（Of18S）等7种看家基因作为候选的内参基因。根据qRT-PCR引物设计原则，利用Primer Premier 5等软件设计各候选内参基因的qRT-PCR引物（引物序列见表 1），其中Of18S引物引自文献[5]。
表 1 qRT-PCR检测中7个候选内参基因的引物序列
Table 1. Primer sequences of seven candidate reference genes in qRT-PCR analysis
基因名 上游引物序列（5'→3') 下游引物序列（5'→3') OfACT CCCAAGGCAAACAGAGAAAAAAT ACCCCATCACCAGAATCAAGAA OfEF1α CGTTTGCCACTTCAGGATGTCTA GTACCAGGTTTCAGGACTCCAGTTT OfIDH CTTGAAGCAGATGTGGAAGAGTC CTTTGTC CATC CTGGGAC CAGTC OfRAN1 AGAACCGACAGGTGAAGGCAA TGGCAAGGTACAGAAAGGGCT OfTUB AGAAGGGATGGATGGAATGGA GTCTTCTTCGTCCTCGGCAGT OfUBC2 TGTTGACAAAACCGATGGAAGGA GTGGAGTGTGGAGGATAAGGGTG Of18S AGCCTGAGAAACGGCTACCAC ATACGCTATTGGAGCTGGAA -
利用两步法来进行qRT-PCR分析，在7300实时PCR仪（Applied Biosystems）运行。基于SYBR Green染料的qRT-PCR来检测内参基因的循环阈值Ct值，所用反应体系和程序参考Takara公司的SYB® Premix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）试剂盒的说明书。PCR反应体系为20.0 μL，其中2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RNaseH Plus）10.0 μL，上下游定量引物10.0 μmol·L-1各0.8 μL，模板cDNA 2.0 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，用灭菌双蒸水补齐至20.0 μL。qRT-PCR扩增采用两步法，即在95 ℃预变性30 s之后，先运行40个循环的95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，再运行溶解曲线阶段的95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s。通过观察ABI 7300实时PCR仪在PCR反应后生成的溶解曲线为单一峰判定所用引物无非特异扩增；实验得到定量Ct值用于后期内参基因稳定性分析。
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本研究采用geNorm[3]，NormFinder[2]和BestKeeper[14]软件对7种候选内参基因在桂花不同组织中的表达稳定性进行统计学分析，从而筛选桂花组织基因表达中最合适的内参基因。
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利用桂花不同组织中OfCRTISO1基因表达模式验证筛选的内参基因的稳定性，其表达上游引物为5′-GAAAAACAAGGGATTCTCGGA-3′，下游引物为5′-GCAGATAGTAGGCAAGGGTCAA-3′。
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以桂花嫩叶的cDNA为模板，利用7对引物均能扩增出与各候选内参基因预期大小一致的单一条带（结果未显示），说明这7对引物均能特异性地扩增相应片段，可以用于qRT-PCR分析。qRT-PCR溶解曲线分析表明：这7对引物的扩增产物单一，可用于下一步分析。将反转录的嫩叶cDNA样品以5倍浓度梯度稀释，以此为模板进行qRT-PCR扩增后制作7种内参基因的标准曲线，结果（表 2）显示：各内参基因的线性相关系数R2≥0.990 0，引物的扩增效率为97.7%~109.6%，符合qRT-PCR对扩增效率的要求。
表 2 7个候选内参基因扩增特性
Table 2. Amplicon characteristics of seven candidate reference genes
基因名 扩增长度/bp PCR扩增效率/% 线性相关系数 OfACT 143 109.6 0.998 4 OfEF1α 89 97.7 0.997 4 OfIDH 118 101.8 0.995 2 OfRAN1 117 100.4 0.990 3 OfTUB 106 103.8 0.998 1 OfUBC2 75 97.7 0.994 8 Of18S 208 104.7 0.992 6 -
7个候选内参基因在不同组织中的Ct值平均为13.395~26.259（图 1），其中Of18S在所有样品中的转录水平最高，Ct值最小（13.395）；而OfTUB基因的表达水平最低，Ct值最大（26.259）。从表达量变异系数看，OfRAN1最小，然后是OfUBC2，而OfIDH最大。
图 1 不同组织中7个候选内参基因的平均Ct值
Figure 1. Mean Ct values of seven candidate reference genes in different tissues
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本研究首先采用geNorm软件对7个候选内参基因的表达稳定性进行分析（图 2），结果显示：在不同组织中，OfRAN1和OfUBC2基因的基因表达稳定值（M）最小（M＝0.014 8），表示这2个基因表达最为稳定，其次是OfACT（M＝0.038 4）和OfEF1α（M＝0.045 3）。OfIDH，OfTUB和Of18S是稳定性排序靠后的3个候选内参基因，其中Of18S的M值最大（M＝0.158 1），是最不稳定内参基因。
图 2 geNorm软件分析7个候选内参基因的表达稳定值(M)
Figure 2. Expression stability values (M) of seven candidate reference genes as calculated by geNorm
利用geNorm程序对内参基因的配对差异值Vn/n+1进行分析（图 3），发现所检测的V2/3低于程序默认取舍值0.15，说明无需引入第3个基因进行校正，因此选择表达最为稳定的2个内参基因即OfRAN1和OfUBC2，以两者的几何平均值作为参照可更为准确地校正目的基因的表达。
图 3 geNorm软件分析7个候选内参基因的配对差异值（VPV)
Figure 3. Pairwise variation (VPV) of seven candidate reference genes as calculated by geNorm
此外，为保证结果分析的准确性，本研究还利用NormFinder和BestKeeper分析7个候选内参基因的表达稳定性（表 3），结果显示：NormFinder和BestKeeper的分析结果与geNorm分析的结果整体上一致。通过3个软件评价得到的稳定性排序中，OfRAN1和OfUBC2均是表达稳定性最高的2个基因，其次是OfACT和OfEF1α，表明这2个基因在不同组织中的表达较为稳定。而根据3个软件的分析，OfIDH，OfTUB和Of18S是表达稳定性最差的3个候选内参基因。综合3个软件对最佳内参基因和最差内参基因的评价（表 4），得到不同组织中最佳内参基因为OfRAN1和OfUBC2，而Of18S是最差内参基因。
表 3 NormFinder和BestKeeper分析7个候选内参基因的表达稳定性
Table 3. Gene expression stability of seven candidate reference genes by NormFinder and BestKeeper
基因名 NormFinder分析 BestKeeper分析 稳定值 排序 稳定值 排序 OfACT 0.010 2 1.678 4 OfEF1α 0.010 2 1.546 3 OfIDH 0.096 4 2.651 7 OfRAN1 0.005 1 1.168 1 OfTUB 0.084 3 2.080 5 OfUBC2 0.005 1 1.381 2 Of18S 0.227 5 2.272 6 表 4 最佳内参基因和最差内参基因综合结果
Table 4. Aggregated result of the optimal and worst
分析软件 最佳内参基因 最差内参基因 geNorm OFRAN1和OFUBC2 Of18S NormFinder OFRAN1和OFUBC2 Of18S BestKeeper OFRAN1 OfIDH 综合结果 OFRAN1和OFUBC2 Of18S -
为了验证筛选的最佳内参基因稳定性是否准确，我们利用不同内参基因或组合校正桂花不同组织中OfCRTISO1基因的相对表达（图 4）。选择OfRAN1，OfUBC2，OfRAN1和OfUBC2基因组合进行校正的OfCRTISO1基因表达模式相同，均在盛开花序中表达量显著高于其他组织，在花蕾、嫩叶和成熟叶中的表达量相同，而在1年生茎中表达量最低。以稳定性较差的其他内参基因进行校正时，OfCRTISO1基因表达模式产生变化。上述结果表明：3个软件对内参基因表达稳定性的排序结果可靠，证实OfRAN1和OfUBC2为不同组织中最佳内参基因。
图 4 不同内参基因或组合校正桂花不同组织中OfCRTISO1基因的相对表达
Figure 4. Relative expression levels of OfCRTISO1 in different tissues using different reference genes or reference gene combination for normalization
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理想的内参基因应在不同的基因型、不同发育阶段、不同组织器官、不同胁迫条件下均恒定表达，但事实上，并没有一个基因在所有试验条件下能稳定表达[15]，因此，需要根据不同试验材料和不同试验处理条件下筛选合适的内参基因。本研究通过对7个候选内参基因在5个不同组织中的表达稳定性进行研究，筛选得到桂花不同组织中最佳内参基因为OfRAN1和OfUBC2，为后续桂花不同组织中目标基因表达规律的研究奠定了基础。
目前，3个统计分析软件geNorm，NormFinder和BestKeeper常用于确定不同植物材料或试验条件下最佳的内参基因[6, 13, 16-17]。然而，3个软件在许多物种中的分析结果存在差异，如芝麻Sesamum indicum[6]，黄花蒿Artemisia annua[18]和牛奶子Elaeagnus umbellata[19]。在本研究中，3个软件的分析结果整体排序一致（图 2和表 3）。OfRAN1和OfUBC2基因在geNorm和NormFinder的稳定性排序中并列第一，而BestKeeper软件评价OfRAN1为表达最为稳定的内参基因，OfUBC2基因以微弱差距排列第二。综合3个软件分析结果确定OfRAN1和OfUBC2基因为桂花不同组织中最佳内参基因。有研究证实：选择2个或2个以上的内参基因作参照，可以减弱单一内参变化的影响，不同内参表达的相似性有助于增加结果的可靠度及精确度[3, 20-21]，因此确定OfRAN1和OfUBC2基因组合为桂花不同组织中表达分析的内参基因可更为准确地校正桂花不同组织中目的基因的表达结果。
RAN（ras-related nuclear protein）是小G蛋白家族的一类，在真核生物进化过程中比较保守，在许多细胞生理进程过程中发挥着重要的作用[22-24]。RAN同源基因RAN3，是金鱼草Antirrhinum majus中qRT-PCR分析常用的内参基因[25-26]。通过对矮牵牛Petunia hybrida开花过程中相关候选内参基因的筛选，证实RAN1是矮牵牛中稳定表达的内参基因之一[27]。与ACT，EF1α和TUB等其他传统内参基因相比，将RAN基因作为内参基因进行研究和应用的报道较少。本研究证实RAN1在桂花不同组织中稳定表达，是最佳内参基因之一。此外，RAN1被证实是桂花不同品种中表达量最为稳定的内参基因[13]。与RAN基因相同，OfUBC2在桂花不同组织中也稳定表达，是另一个最佳内参基因。作为一个传统内参基因，UBC基因在拟南芥Arabidopsis thaliana[28-30]，月季Rosa hybrida[31]，侧柏Platycladus orientalis[32]等物种的内参基因筛选中均表现最佳。
本研究发现Of18S在桂花不同组织中表达最不稳定，不适合作为内参基因在桂花中应用。同样，在丹参Salvia miltiorrhiza[33]，牡丹Paeonia suffruticosa[34]，大白菜Brassica rapa ssp. pekinensis[8]和西瓜Citrullus lanatus[16]中，Of18S基因也被证实是表达最不稳定的内参基因。这可能与18S基因在样品中高丰度表达有关。
Reference gene selection for quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) normalization in the gene expression of sweet osmanthus tissues
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摘要: 为了筛选桂花Osmanthus fragrans不同组织基因表达分析中适合的内参基因，以桂花‘堰虹桂’O. fragrans‘Yanhong Gui’花蕾、盛开花序、嫩叶、成熟叶和1年生茎等5个不同组织为材料，利用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测7个候选内参基因的表达水平，并利用geNorm，NormFinder和BestKeeper软件对各候选内参基因的表达稳定性进行评价，最后利用桂花不同组织中OfCRTISO1基因相对表达水平验证筛选的内参基因的可靠性。结果表明：综合3个软件的评价排序，确定不同组织中最佳内参基因为OfRAN1和OfUBC2，而Of18S是最差内参基因。OfCRTISO1基因相对表达水平分析证实，不同组织中qRT-PCR分析使用OfRAN1和OfUBC2等2个表达最稳定的基因组合，即可获得更为精确的基因表达结果。旨在为桂花组织间重要基因的定量表达分析提供科学依据。
图 4 表 4 参34 -
关键词:
- 植物学 /
- 桂花 /
- 内参基因 /
- geNorm /
- NormFinder /
- BestKeeper
Abstract: To select the suitable reference gene(s) for gene expression analysis in different tissues of Osmanthus fragrans, five tissues: buds, fully-opened inflorescences, young leaves, adult leaves, and one-year-old stems, from O. fragrans 'Yanhong Gui' were used as materials to detect the expression levels of seven candidate reference genes by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). Then, an aggregated analysis of gene expression stability for these candidates was conducted using three software programs: geNorm, NormFinder, and BestKeeper. Finally, the relative expression level of OfCRTISO1 in different tissues was analyzed to verify the reference genes selected in this study. Results of the aggregated analysis showed that OfRAN1 and OfUBC2 were the best reference genes from the different tissues, and Of18S was the worst reference gene. In addition, analysis of the relative expression level for OfCRTISO1 confirmed that OfRAN1 and OfUBC2 were the two most stable reference genes in the qRT-PCR analysis of the tissues, and the application of OfRAN1 and OfUBC2 was enough to achieve more accurate and reliable results in these tissues. Thus, the present study has provided an important reference for analyzing the expression of key genes in different tissues of O. fragrans.[Ch,4 fig. 4 tab. 34 ref. ]-
Key words:
- botany /
- Osmanthus fragrans /
- reference gene /
- geNorm /
- NormFinder /
- BestKeeper
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竹材适应性强、生长期短、分布广，相比木材等其他农林生物质材料，竹材纤维长径比高，硬度和韧性更好，在家具、包装、建筑、人造板等行业占据越来越重要的市场地位[1−3]。生物质材料的处理、运输、存储和应用依赖于适当的加工设备，而准确的接触参数是实现生物质材料机械化加工的关键，也是相关设备研发和加工参数优化的需要[4−6]。但生物质材料的物理、力学和化学性质受与颗粒特性相关的形状、弹性、黏性、纤维性等影响，传统的研究方法难以准确获得加工设备与生物质材料粉末之间的接触参数[4−5]。离散元法(discrete element method，DEM)是设计、建模和研究颗粒系统常用的方法，能有效模拟生物质材料采集、筛选、搅拌、粉碎和运输等过程中的颗粒行为[7−9]。接触参数标定是颗粒系统离散元仿真计算研究的前提，国内外学者对接触参数的离散元研究主要涉及土壤、肥料、秸秆等材料。ADAJAR等[10]根据环剪实验和直接剪切测量结果对不同作物秸秆摩擦系数、颗粒的法向刚度和剪切刚度进行了标定。ZHAO等[11]以物理实验测定的椰糠实际堆积角为响应值，采用离散元方法获得了椰糠接触参数的最佳组合。XIA等[12]提出了一种层析成像的DEM方法，并建立了碾磨松木颗粒的近似模型，证明了DEM模型适用颗粒状林业生物质材料的可行性。 PACHON-MORALES等[13]分别用多球体法和Hertz-Mindlin with JKR接触模型模拟了杨木粉末颗粒的细长形状和内聚行为。但尚未发现竹材接触参数离散元研究的相关报道。
本研究对竹粉颗粒的接触参数进行标定，以毛竹Phyllostachys edulis为研究对象，基于离散元模拟仿真和实验设计(design of experiment，DOE)方法，通过Plackett-Burman (P-BD)实验、爬坡实验和响应面实验建立了毛竹粉末接触参数与堆积角的回归模型，并预测最优接触参数组合，最后验证了模拟接触参数的可靠性和准确性，以期为竹粉加工过程的模拟实验研究和相关设备的研发优化提供有效的接触参数。
1. 材料与方法
1.1 材料与装置
1.1.1 材料
毛竹采自安徽宣城，竹龄4~5年生，胸径为10.2 cm，密度为680 kg·m−3，静曲强度为156.97 MPa，抗压强度为66.24 MPa，取竹中部位，包含竹青和竹黄。将样品研磨成粉，干燥后，采用不同规格标准筛分得到100目竹粉样品。
1.1.2 堆积角测定装置
采用漏斗法测定竹粉颗粒堆积角，参照相关标准和文献[5, 14−16]，自制堆积角测定装置如图1所示，短颈漏斗颈口内径10 mm，底盘培养皿直径100 mm，漏斗颈口距底盘培养皿90 mm。测量时将竹粉缓慢倒入并轻微搅动，避免颗粒在漏斗壁上积聚；待料堆高度不再增加时停止添加竹粉。在相同位置使用相机拍摄料堆的正视图像，重复10次并记录。
1.2 仿真模型
采用离散元软件EDEM模拟毛竹粉末料堆形成过程，建立毛竹粉末颗粒模型和堆积角模型，并选择适当的接触模型：①颗粒模型。竹粉实际为纤维状，且不同竹粉颗粒长宽比差异较大，测定物理堆积角时采用统一粒径的竹粉是为了降低颗粒模型的复杂程度；在对比实际粒径和放大粒径形成的堆积角后，将竹粉颗粒的粒径(宽)放大至1 mm [17]。建立的竹粉颗粒模型如图2A所示，此颗粒模型的长宽比为2∶1，粒径分布设置为fixed。②堆积角模型。依照物理堆积角测定装置建立几何模型并导入EDEM软件，在漏斗上方建立总数为25 000的颗粒工厂，生成速率1 250个·s−1，静置4 s，总仿真时间设为24 s。待竹粉颗粒自由落下形成稳定的颗粒堆时，截取+X、−X、+Y、−Y共4个方向的料堆图像。建立的竹粉颗粒堆积角模型如图2B所示。③接触模型。毛竹粉末与加工设备之间的颗粒运动特征是密集和缓慢的，加上生物质材料的纤维性和联锁效应，干燥后的样品仍具有轻微的黏附性[18−19]。选用EDEM软件提供的JKR Cohesion接触模型，该模型考虑了范德华力在接触区内的影响，也允许构建强黏合系统[16, 18]。
图 2 竹粉颗粒模型(A)和堆积角模型(B)Figure 2 Bamboo powder particle model (A) and powder stacking angle model (B)1.3 堆积角图像处理
利用图像处理软件对物理实验和仿真实验获得的堆积角图像进行处理，调用灰度函数rgb2gray、二值函数im2bw、形态学运算函数strel (square和disk)得到内部填充、边缘柔和的堆积角图像；在GUI界面利用canny算子提取料堆边缘，并利用最小二乘法进行一阶线性拟合得到斜率(精确到0.001)；最后将斜率(正切值)转换为角度，堆积角处理过程如图3所示。实测物理堆积角为49.29°。
1.4 参数标定
进行离散元模拟研究所需的仿真参数主要有颗粒密度、泊松比、恢复系数、剪切模量、静摩擦系数、动摩擦系数和表面能等[7, 20]。壁面材料采用不锈钢板，其密度为7 850 kg·m−3、泊松比为0.3、剪切模量为7×1010 Pa，而竹粉的接触参数难以通过物理实验测量，需通过模拟实验进行标定[7, 14]。结合预模拟实验、相关农林生物质材料参数标定文献[6, 11, 21−24]，本研究中竹粉和壁面材料设置仿真参数见表1。影响堆积效果的因素很多，先进行Plackett-Burman (P-BD)实验筛选显著因素，再进行爬坡实验缩小显著因素的参数范围，然后进行响应面实验获得堆积角和DEM参数之间的二次多项式回归模型，最后使用预测得到标定参数的最优组合进行验证。
表 1 竹粉堆积角测定仿真参数Table 1 Simulation parameters for measuring the stacking angle of bamboo powder参数符号 参数名称 取值范围 参数水平 −1 1 μ 竹粉泊松比 0.20~0.50 0.20 0.40 E 竹粉剪切模量/GPa 1~15 2 4 X1 竹粉-竹粉恢复系数 0.15~0.30 0.25 0.50 X2 竹粉-竹粉静摩擦系数 0.20~0.80 0.30 0.60 X3 竹粉-竹粉滚动摩擦系数 0~0.40 0.15 0.30 X4 竹粉-不锈钢板恢复系数 0.10~0.80 0.25 0.50 X5 竹粉-不锈钢板静摩擦系数 0.30~0.70 0.30 0.60 X6 竹粉-不锈钢板滚动摩擦系数 0~0.40 0.15 0.30 J 表面能 /(J·m−2) 0.01~0.10 0.04 0.08 ① P-BD实验。采用Minitab软件9因子表进行P-BD实验设计，总计13组(包括1个中心点)，实验方案及结果见表2。
表 2 竹粉堆积角P-BD实验设计及结果Table 2 Plackett-Burman test design and results of bamboo powder stacking angle实验号 μ E X1 X2 X3 X4 X5 X6 J 模拟堆积角/(°) 1 −1 −1 1 1 1 −1 1 1 −1 51.54 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 47.17 3 −1 −1 −1 1 1 1 −1 1 1 54.48 4 −1 −1 −1 −1 −1 −1 −1 −1 −1 42.63 5 1 −1 1 −1 −1 −1 1 1 1 41.68 6 −1 1 1 −1 1 −1 −1 −1 1 46.47 7 1 1 1 −1 1 1 −1 1 −1 37.22 8 −1 1 −1 −1 −1 1 1 1 −1 40.56 9 1 1 −1 1 1 −1 1 −1 −1 57.91 10 1 −1 1 1 −1 1 −1 −1 −1 23.71 11 −1 1 1 1 −1 1 1 −1 1 39.00 12 1 1 −1 1 −1 −1 −1 1 1 37.79 13 1 −1 −1 −1 1 1 1 −1 1 61.32 说明：符号所表示参数名称见表1。 ② 爬坡实验。根据P-BD实验分析结果设计爬坡实验。显著因素效应值为正，则水平逐次增加；效应值为负，则水平逐渐减少[11, 25−26]。一次爬坡实验设置步长为0.1，二次爬坡实验设置步长为0.05，分别进行5组实验，爬坡实验方案及结果见表3。
表 3 竹粉堆积角爬坡实验设计及结果Table 3 Climbing test design and results of bamboo powder stacking angle实验号 一次爬坡 二次爬坡 X1 X3 X5 模拟堆积角/(°) 相对误差/% X1 X3 X5 模拟堆积角/(°) 相对误差/% 1 0.50 0.15 0.30 38.92 21.04 0.50 0.15 0.30 39.67 19.52 2 0.40 0.25 0.40 48.49 4.50 0.45 0.20 0.35 41.53 15.75 3 0.30 0.35 0.50 57.95 17.57 0.40 0.25 0.40 49.32 5.20 4 0.20 0.45 0.60 − − 0.35 0.30 0.45 52.82 7.17 5 0.10 0.55 0.70 − − 0.30 0.35 0.50 57.27 16.19 说明：−表示数据无效。符号所表示参数名称见表1。 ③ 响应面实验。采用Design Expert软件中的Box-Behnken方法(B-BD)进行响应面实验。选择与实际堆积角误差最小的一组参数作为响应面实验设计的水平值，根据参数个数在Design Expert软件中生成响应面实验顺序表(加3个中心点)，响应面实验方案及结果见表4。
表 4 竹粉堆积角响应面实验设计及结果Table 4 Box-Behnken test design and results of bamboo powder stacking angle序号 X1 X3 X5 模拟堆积角/(°) 1 0(0.40) 1(0.30) −1(0.35) 48.69 2 0 0(0.25) 0(0.40) 48.89 3 1(0.45) 0 1(0.45) 52.17 4 1 0 −1 43.18 5 −1(0.35) 0 −1 48.71 6 0 0 0 48.51 7 −1 1 0 54.98 8 0 −1(0.20) −1 41.53 9 −1 0 1 54.97 10 0 −1 1 48.85 11 1 −1 0 41.20 12 0 0 0 50.54 13 1 1 0 51.69 14 0 1 1 55.27 15 −1 −1 0 48.11 说明：括号内数值为参数值。参数X1、X3、X5所表示名称见表1。 2. 结果与分析
2.1 P-BD实验结果分析
如表5所示：模型的决定系数(R2)为0.989 3，表明该模型可用于解释因素对响应值的影响。X1、X3、X5对竹粉的堆积角有显著影响(P＜0.05)，影响堆积角的显著因素从大到小依次为X3、 X1、 X5，其他因素影响较小。原因为干燥后的竹粉黏附性较低，因此竹粉与竹粉之间运动状态主要取决于运动方式和碰撞力度，采用多球体方法构建的颗粒模型之间多为滚动；非球形颗粒的不规则形状减小了其流动性，因此影响竹粉与不锈钢板之间运动状态的主要原因是静摩擦。
表 5 竹粉堆积角P-BD实验参数显著性分析Table 5 Significance parameters analysis of bamboo powder stacking angle Plackett-Burman test参数 效应 系数 P 显著性排序 μ −2.506 −1.253 0.230 7 E −2.735 −1.368 0.203 6 X1 −9.179 −4.589 0.025 2 X2 −0.904 −0.452 0.601 9 X3 13.927 6.963 0.011 1 X4 −3.623 −1.811 0.132 5 X5 8.286 4.143 0.030 3 X6 −1.297 −0.649 0.470 8 J 4.527 2.264 0.091 4 说明：参数所表示名称见表1。 2.2 爬坡实验结果分析
从表3可以看出：一次爬坡实验前3组堆积角相对误差分别为21.04%、4.50%、17.57%，呈先减小后增大的趋势；后2组实验的堆积图像无效。原因为恢复系数过小，静摩擦系数过大，颗粒不易运动，造成无效堆叠，堆积效果如图4。缩短步长后二次爬坡实验5组实验堆积角均有效，且根据相对误差可知最优区间在3组附近，2、4组之间，则选择2、3、4组实验的参数值作为响应面实验的各水平值。
2.3 响应面实验结果分析及回归模型
根据表4的数据，建立了竹粉堆积角和显著因素的二次回归模型：$ {\theta }_{1} $ =50.54−2.19 X1+3.69 X3+3.59 X5+1.17 X1X3+0.68 X1X5−0.087 X3X5−0.37 X12−1.44 X32−0.42 X52。从表6可以看出：模型P＜0.000 1，表明该模型用于描述参数与响应值之间的关系极显著，可以根据模型预测堆积角；变异系数(CV)为1.18%，表明该测试具有很高的可靠性；R2为0.993 6，修正决定系数($R_{{\rm{adj}}}^2 $)为0.982 2，这些数值表明回归方程的拟合度较好(一般认为2个系数需大于80%)，回归方程可以用来代替实际测试来分析结果；精度(AP)为30.541，表明该模型具有良好的精度。
表 6 Box-Behnken实验回归模型方差分析Table 6 ANOVA of modified model of Box-Behnken方差来源 均方 自由度 平方和 F P 模型 265.87 9 29.54 86.60 ＜0.000 1 X1 38.22 1 38.22 112.04 ＜0.000 1 X3 108.81 1 108.81 318.97 ＜0.000 1 X5 103.35 1 103.35 302.96 ＜0.000 1 X1X3 5.44 1 5.44 15.93 0.010 4 X1X5 1.86 1 1.86 5.45 0.066 9 X3X5 0.03 1 0.03 0.09 0.776 9 X1X1 0.49 1 0.49 1.44 0.283 2 X3X3 7.63 1 7.63 22.36 0.005 2 X5X5 0.64 1 0.64 1.88 0.228 4 残差 1.71 5 0.34 纯误差 0.015 2 0.007 合计 267.58 14 R2=0.9936，Radj2=0.9822，CV=1.18，AP=30.541 说明：参数X1、X3、X5所表示名称见表1。 从表6可以看出：线性项X1、X3、X5的P均小于0.000 1，与P-BD实验结果完全一致，在模拟实验参考范围内对堆积角影响极显著；交互项X1X3的P为0.010 4，对堆积角有显著影响，其余交互项X1X5、X3X5对堆积角影响很小(P＜0.05)；二次项X3X3的P为0.005 2，对堆积角有显著影响，X1X1、X5X5对堆积角影响很小(P＜0.05)。
当 X5为0.40时，利用Design-Expert软件得到X1X3的响应曲面，如图5所示。在X1X3作用下竹粉堆积角整体表现为增大趋势，原因为竹粉-竹粉滚动摩擦系数的增大增加了竹粉颗粒间接触的摩擦阻力，使颗粒堆不易滑散、趋于稳定；而竹粉-竹粉恢复系数的增大增加了颗粒间的碰撞反弹程度，使颗粒堆易飞散，不易成形。但竹粉-竹粉滚动摩擦系数的响应曲面曲线较竹粉-竹粉恢复系数的响应曲面曲线更陡峭，这表明竹粉-竹粉滚动摩擦系数对堆积角的影响比竹粉-竹粉恢复系数的影响更大，这也与P-BD实验得到的结论一致。
2.4 参数优化和模型验证
利用Design-Expert软件的预测模块，以物理堆积角49.29°作为目标值，选择一组与实际物理堆积角度数据相近的最优解，即竹粉-竹粉恢复系数X1=0.44，竹粉-竹粉滚动摩擦系数X3=0.22，竹粉-不锈钢板静摩擦系数X5=0.45，其余非显著参数取值与爬坡实验相同，即泊松比μ=0.33，剪切模量E=0.033 GPa，竹粉-竹粉静摩擦系数X2=0.4，竹粉-不锈钢板恢复系数X4=0.3，竹粉-不锈钢板滚动摩擦系数X6=0.1，表面能J=0.01 J·m−2。
采用上述标定的竹粉最优参数组合进行验证，测得堆积角为48.06°，相对误差为2.50%，误差在可接受的范围内；再选择2组测定实验目标值(47.95°和48.52°)，预测得到最优解后进行验证，分别测得堆积角为46.58°和46.65°，相对误差分别为2.86％和3.85％，进一步证明了该模型在竹粉颗粒参数标定中的有效性。
3. 讨论
农林生物质材料的含水率影响其微观结构和物理性质，进而影响材料的生产、运输、存储和应用[24]。含水率受样品年龄、采样部位等多因素的影响，但在含水率较低的情况下，木材散碎物料的堆积特性变化不大[27]。本研究采用竹中部位的竹段，磨粉干燥后控制含水率低于2％，所以本研究未设计含水率对模拟堆积角的影响实验。
模拟不同比例、不同粒径、不同长宽比的竹粉纤维会增加模拟实验的复杂性，因此构建4球面、长宽比2∶1的颗粒模型，并选择fixed平均分布，与物理堆积角采用统一粒径竹粉对应；当粒径＞1.5 mm时会堵塞漏斗下端出口，而真实粒径0.15 mm需要的颗粒总量会按量级增加，相应的计算时间也会增加。当表面能超过0.12 J·m−2时，颗粒会黏附在漏斗下端出口造成堵塞；当摩擦系数超过0.85时，颗粒落到料堆上运动状态阻碍太大造成不规则团块堆叠。根据实际情况合理简化颗粒形状和缩放粒径，在正式实验前需要做预实验选择接触模型和参数范围。
剪切模量量级、颗粒生成速率和计算机硬件配置都会影响仿真时间。在P-BD实验得出剪切模量对堆积角的影响很小的结论后，将剪切模量降低量级到107。在不同配置的中央处理器(CPU)和图像处理器(GPU)上仿真，并试验颗粒生成速率5 000、2 500、1 250个·s−1时的仿真时间，发现GPU比CPU的速度稳定，例如12核CPU仿真时间约46 h，而6核GPU仿真时间约22 h；减小颗粒生成速率初期仿真较慢，但是为了降低颗粒生成位置的计算时间，会缩短后期仿真时间。在颗粒数量更大时，选择GPU是更高效的。
4. 结论
本研究所得主要结论如下：①通过P-BD、爬坡和B-BD响应面等方法，建立了检验因素与堆积角的回归模型，该模型能够准确描述堆积角与各参数的关系。证明了竹粉-竹粉滚动摩擦系数、竹粉-竹粉恢复系数、竹粉-不锈钢板静摩擦系数的线性项，竹粉-竹粉滚动摩擦系数的二次项，竹粉-竹粉滚动摩擦系数和竹粉-竹粉恢复系数的交互项对堆积角有显著影响。②以竹粉物理堆积角为目标，通过求解回归模型获得了最优因素组合，即竹粉-竹粉恢复系数0.44，竹粉-竹粉滚动摩擦系数0.22，竹粉-不锈钢板静摩擦系数0.45。将回归模型的最优解作为DEM参数进行验证，测得堆积角的相对误差在允许范围内。③本研究在41.20°~55.27°堆积角范围内建立的回归多项式方程可以对显著因素进行快速预测，结果具有较高的可靠性。当具体的工作环境和接触模型发生变化时，线性项和二次项的相互作用会增加标定接触参数的难度，最优解需要根据生物质物料的堆积角、料堆形状和动态行为确定。
本研究得到的回归模型证明了离散元法应用于竹材粉末研究的可行性，生物质材料特性、不同响应指标检验方法、颗粒模型的准确性等是下一步的研究方向。
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图 1 不同组织中7个候选内参基因的平均Ct值
Figure 1 Mean Ct values of seven candidate reference genes in different tissues
图 2 geNorm软件分析7个候选内参基因的表达稳定值(M)
Figure 2 Expression stability values (M) of seven candidate reference genes as calculated by geNorm
图 3 geNorm软件分析7个候选内参基因的配对差异值（VPV)
Figure 3 Pairwise variation (VPV) of seven candidate reference genes as calculated by geNorm
图 4 不同内参基因或组合校正桂花不同组织中OfCRTISO1基因的相对表达
Figure 4 Relative expression levels of OfCRTISO1 in different tissues using different reference genes or reference gene combination for normalization
表 1 qRT-PCR检测中7个候选内参基因的引物序列
Table 1. Primer sequences of seven candidate reference genes in qRT-PCR analysis
基因名 上游引物序列（5'→3') 下游引物序列（5'→3') OfACT CCCAAGGCAAACAGAGAAAAAAT ACCCCATCACCAGAATCAAGAA OfEF1α CGTTTGCCACTTCAGGATGTCTA GTACCAGGTTTCAGGACTCCAGTTT OfIDH CTTGAAGCAGATGTGGAAGAGTC CTTTGTC CATC CTGGGAC CAGTC OfRAN1 AGAACCGACAGGTGAAGGCAA TGGCAAGGTACAGAAAGGGCT OfTUB AGAAGGGATGGATGGAATGGA GTCTTCTTCGTCCTCGGCAGT OfUBC2 TGTTGACAAAACCGATGGAAGGA GTGGAGTGTGGAGGATAAGGGTG Of18S AGCCTGAGAAACGGCTACCAC ATACGCTATTGGAGCTGGAA 
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表 2 7个候选内参基因扩增特性
Table 2. Amplicon characteristics of seven candidate reference genes
基因名 扩增长度/bp PCR扩增效率/% 线性相关系数 OfACT 143 109.6 0.998 4 OfEF1α 89 97.7 0.997 4 OfIDH 118 101.8 0.995 2 OfRAN1 117 100.4 0.990 3 OfTUB 106 103.8 0.998 1 OfUBC2 75 97.7 0.994 8 Of18S 208 104.7 0.992 6
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表 3 NormFinder和BestKeeper分析7个候选内参基因的表达稳定性
Table 3. Gene expression stability of seven candidate reference genes by NormFinder and BestKeeper
基因名 NormFinder分析 BestKeeper分析 稳定值 排序 稳定值 排序 OfACT 0.010 2 1.678 4 OfEF1α 0.010 2 1.546 3 OfIDH 0.096 4 2.651 7 OfRAN1 0.005 1 1.168 1 OfTUB 0.084 3 2.080 5 OfUBC2 0.005 1 1.381 2 Of18S 0.227 5 2.272 6
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表 4 最佳内参基因和最差内参基因综合结果
Table 4. Aggregated result of the optimal and worst
分析软件 最佳内参基因 最差内参基因 geNorm OFRAN1和OFUBC2 Of18S NormFinder OFRAN1和OFUBC2 Of18S BestKeeper OFRAN1 OfIDH 综合结果 OFRAN1和OFUBC2 Of18S
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