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实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real time fluorescence polymerase chain reaction，qRT-PCR）因具有灵敏度高、特异性强、精准性高、检测范围广等优点[1]，已被广泛应用于植物基因表达的相关研究中。利用qRT-PCR分析基因相对定量表达时，为了消除不同组织细胞间初始模板量、核糖核酸（RNA）制备和反转录过程中的偏差，需要引入内参基因（reference gene）对表达结果进行校正[2-3]。实际研究中常选择的内参基因[4-8]只能在一定的试验范围内相对稳定表达，不能保证在所有试验条件下均能稳定表达[9-11]。如果盲目以一种看家基因作为任何试验条件下的内参基因，容易得到精确度低甚至错误的结果[12]，因此，在利用qRT-PCR进行基因表达分析时，根据试验处理及不同实验材料的特点，优化和选择合适的内参基因就显得极其重要。桂花Osmanthus fragrans是中国十大名花之一，随着桂花分子生物学研究的不断深入和发展，基因表达分析已经广泛应用于揭示其观赏性状形成机制的研究中，因此，筛选稳定的内参基因在桂花重要基因表达分析中起着关键的作用。已有研究筛选出桂花不同品种、不同发育状态花序和不同温度处理条件中合适的内参基因[13]，却未对不同组织中适合的内参基因进行筛选。本研究将以桂花‘堰虹桂’O. fragrans‘Yanhong Gui’不同组织（花蕾、盛开花序、嫩叶、成熟叶、1年生茎）为材料，利用qRT-PCR检测7个候选内参基因的表达水平，并利用软件geNorm[3]，NormFinder[2]和BestKeeper[14]对各候选内参基因的表达稳定性进行评价，筛选出最稳定表达的内参基因，并研究桂花类胡萝卜素异构酶（OfCRTISO1）在不同组织中的表达模式，验证筛选得到的内参基因的可靠性，希冀为后续研究不同组织重要基因的定量表达提供依据。
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浙江农林大学桂花资源圃10 a树龄地栽桂花‘堰虹桂’为试验材料，对其花蕾、盛开花序、嫩叶、成熟叶、1年生茎进行取样，液氮速冻后，于-80 ℃储藏备用。
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采用RNAprep pure Plant Kit（天根，北京）按照说明书步骤提取各样品的总RNA。紫外分光光度计和10.0 g·L-1琼脂糖凝胶电泳检测总RNA浓度和质量。采用Reverse Transcriptase M-MLV（Takara，大连）按照说明书合成cDNA的第1链后，于-20 ℃储存备用。
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本研究从前期构建的桂花转录组数据库中取肌动蛋白基因（OfACT），延伸因子1α蛋白基因（OfEF1α），NADP-异柠檬酸脱氢酶基因（OfIDH），GTP结合蛋白RAN1基因（OfRAN1），β微管蛋白基因（OfTUB），泛素结合酶E2基因（OfUBC2）和18S核糖体RNA基因（Of18S）等7种看家基因作为候选的内参基因。根据qRT-PCR引物设计原则，利用Primer Premier 5等软件设计各候选内参基因的qRT-PCR引物（引物序列见表 1），其中Of18S引物引自文献[5]。
表 1 qRT-PCR检测中7个候选内参基因的引物序列
Table 1. Primer sequences of seven candidate reference genes in qRT-PCR analysis
基因名 上游引物序列（5'→3') 下游引物序列（5'→3') OfACT CCCAAGGCAAACAGAGAAAAAAT ACCCCATCACCAGAATCAAGAA OfEF1α CGTTTGCCACTTCAGGATGTCTA GTACCAGGTTTCAGGACTCCAGTTT OfIDH CTTGAAGCAGATGTGGAAGAGTC CTTTGTC CATC CTGGGAC CAGTC OfRAN1 AGAACCGACAGGTGAAGGCAA TGGCAAGGTACAGAAAGGGCT OfTUB AGAAGGGATGGATGGAATGGA GTCTTCTTCGTCCTCGGCAGT OfUBC2 TGTTGACAAAACCGATGGAAGGA GTGGAGTGTGGAGGATAAGGGTG Of18S AGCCTGAGAAACGGCTACCAC ATACGCTATTGGAGCTGGAA -
利用两步法来进行qRT-PCR分析，在7300实时PCR仪（Applied Biosystems）运行。基于SYBR Green染料的qRT-PCR来检测内参基因的循环阈值Ct值，所用反应体系和程序参考Takara公司的SYB® Premix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）试剂盒的说明书。PCR反应体系为20.0 μL，其中2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RNaseH Plus）10.0 μL，上下游定量引物10.0 μmol·L-1各0.8 μL，模板cDNA 2.0 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，用灭菌双蒸水补齐至20.0 μL。qRT-PCR扩增采用两步法，即在95 ℃预变性30 s之后，先运行40个循环的95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，再运行溶解曲线阶段的95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s。通过观察ABI 7300实时PCR仪在PCR反应后生成的溶解曲线为单一峰判定所用引物无非特异扩增；实验得到定量Ct值用于后期内参基因稳定性分析。
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本研究采用geNorm[3]，NormFinder[2]和BestKeeper[14]软件对7种候选内参基因在桂花不同组织中的表达稳定性进行统计学分析，从而筛选桂花组织基因表达中最合适的内参基因。
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利用桂花不同组织中OfCRTISO1基因表达模式验证筛选的内参基因的稳定性，其表达上游引物为5′-GAAAAACAAGGGATTCTCGGA-3′，下游引物为5′-GCAGATAGTAGGCAAGGGTCAA-3′。
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以桂花嫩叶的cDNA为模板，利用7对引物均能扩增出与各候选内参基因预期大小一致的单一条带（结果未显示），说明这7对引物均能特异性地扩增相应片段，可以用于qRT-PCR分析。qRT-PCR溶解曲线分析表明：这7对引物的扩增产物单一，可用于下一步分析。将反转录的嫩叶cDNA样品以5倍浓度梯度稀释，以此为模板进行qRT-PCR扩增后制作7种内参基因的标准曲线，结果（表 2）显示：各内参基因的线性相关系数R2≥0.990 0，引物的扩增效率为97.7%~109.6%，符合qRT-PCR对扩增效率的要求。
表 2 7个候选内参基因扩增特性
Table 2. Amplicon characteristics of seven candidate reference genes
基因名 扩增长度/bp PCR扩增效率/% 线性相关系数 OfACT 143 109.6 0.998 4 OfEF1α 89 97.7 0.997 4 OfIDH 118 101.8 0.995 2 OfRAN1 117 100.4 0.990 3 OfTUB 106 103.8 0.998 1 OfUBC2 75 97.7 0.994 8 Of18S 208 104.7 0.992 6 -
7个候选内参基因在不同组织中的Ct值平均为13.395~26.259（图 1），其中Of18S在所有样品中的转录水平最高，Ct值最小（13.395）；而OfTUB基因的表达水平最低，Ct值最大（26.259）。从表达量变异系数看，OfRAN1最小，然后是OfUBC2，而OfIDH最大。
图 1 不同组织中7个候选内参基因的平均Ct值
Figure 1. Mean Ct values of seven candidate reference genes in different tissues
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本研究首先采用geNorm软件对7个候选内参基因的表达稳定性进行分析（图 2），结果显示：在不同组织中，OfRAN1和OfUBC2基因的基因表达稳定值（M）最小（M＝0.014 8），表示这2个基因表达最为稳定，其次是OfACT（M＝0.038 4）和OfEF1α（M＝0.045 3）。OfIDH，OfTUB和Of18S是稳定性排序靠后的3个候选内参基因，其中Of18S的M值最大（M＝0.158 1），是最不稳定内参基因。
图 2 geNorm软件分析7个候选内参基因的表达稳定值(M)
Figure 2. Expression stability values (M) of seven candidate reference genes as calculated by geNorm
利用geNorm程序对内参基因的配对差异值Vn/n+1进行分析（图 3），发现所检测的V2/3低于程序默认取舍值0.15，说明无需引入第3个基因进行校正，因此选择表达最为稳定的2个内参基因即OfRAN1和OfUBC2，以两者的几何平均值作为参照可更为准确地校正目的基因的表达。
图 3 geNorm软件分析7个候选内参基因的配对差异值（VPV)
Figure 3. Pairwise variation (VPV) of seven candidate reference genes as calculated by geNorm
此外，为保证结果分析的准确性，本研究还利用NormFinder和BestKeeper分析7个候选内参基因的表达稳定性（表 3），结果显示：NormFinder和BestKeeper的分析结果与geNorm分析的结果整体上一致。通过3个软件评价得到的稳定性排序中，OfRAN1和OfUBC2均是表达稳定性最高的2个基因，其次是OfACT和OfEF1α，表明这2个基因在不同组织中的表达较为稳定。而根据3个软件的分析，OfIDH，OfTUB和Of18S是表达稳定性最差的3个候选内参基因。综合3个软件对最佳内参基因和最差内参基因的评价（表 4），得到不同组织中最佳内参基因为OfRAN1和OfUBC2，而Of18S是最差内参基因。
表 3 NormFinder和BestKeeper分析7个候选内参基因的表达稳定性
Table 3. Gene expression stability of seven candidate reference genes by NormFinder and BestKeeper
基因名 NormFinder分析 BestKeeper分析 稳定值 排序 稳定值 排序 OfACT 0.010 2 1.678 4 OfEF1α 0.010 2 1.546 3 OfIDH 0.096 4 2.651 7 OfRAN1 0.005 1 1.168 1 OfTUB 0.084 3 2.080 5 OfUBC2 0.005 1 1.381 2 Of18S 0.227 5 2.272 6 表 4 最佳内参基因和最差内参基因综合结果
Table 4. Aggregated result of the optimal and worst
分析软件 最佳内参基因 最差内参基因 geNorm OFRAN1和OFUBC2 Of18S NormFinder OFRAN1和OFUBC2 Of18S BestKeeper OFRAN1 OfIDH 综合结果 OFRAN1和OFUBC2 Of18S -
为了验证筛选的最佳内参基因稳定性是否准确，我们利用不同内参基因或组合校正桂花不同组织中OfCRTISO1基因的相对表达（图 4）。选择OfRAN1，OfUBC2，OfRAN1和OfUBC2基因组合进行校正的OfCRTISO1基因表达模式相同，均在盛开花序中表达量显著高于其他组织，在花蕾、嫩叶和成熟叶中的表达量相同，而在1年生茎中表达量最低。以稳定性较差的其他内参基因进行校正时，OfCRTISO1基因表达模式产生变化。上述结果表明：3个软件对内参基因表达稳定性的排序结果可靠，证实OfRAN1和OfUBC2为不同组织中最佳内参基因。
图 4 不同内参基因或组合校正桂花不同组织中OfCRTISO1基因的相对表达
Figure 4. Relative expression levels of OfCRTISO1 in different tissues using different reference genes or reference gene combination for normalization
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理想的内参基因应在不同的基因型、不同发育阶段、不同组织器官、不同胁迫条件下均恒定表达，但事实上，并没有一个基因在所有试验条件下能稳定表达[15]，因此，需要根据不同试验材料和不同试验处理条件下筛选合适的内参基因。本研究通过对7个候选内参基因在5个不同组织中的表达稳定性进行研究，筛选得到桂花不同组织中最佳内参基因为OfRAN1和OfUBC2，为后续桂花不同组织中目标基因表达规律的研究奠定了基础。
目前，3个统计分析软件geNorm，NormFinder和BestKeeper常用于确定不同植物材料或试验条件下最佳的内参基因[6, 13, 16-17]。然而，3个软件在许多物种中的分析结果存在差异，如芝麻Sesamum indicum[6]，黄花蒿Artemisia annua[18]和牛奶子Elaeagnus umbellata[19]。在本研究中，3个软件的分析结果整体排序一致（图 2和表 3）。OfRAN1和OfUBC2基因在geNorm和NormFinder的稳定性排序中并列第一，而BestKeeper软件评价OfRAN1为表达最为稳定的内参基因，OfUBC2基因以微弱差距排列第二。综合3个软件分析结果确定OfRAN1和OfUBC2基因为桂花不同组织中最佳内参基因。有研究证实：选择2个或2个以上的内参基因作参照，可以减弱单一内参变化的影响，不同内参表达的相似性有助于增加结果的可靠度及精确度[3, 20-21]，因此确定OfRAN1和OfUBC2基因组合为桂花不同组织中表达分析的内参基因可更为准确地校正桂花不同组织中目的基因的表达结果。
RAN（ras-related nuclear protein）是小G蛋白家族的一类，在真核生物进化过程中比较保守，在许多细胞生理进程过程中发挥着重要的作用[22-24]。RAN同源基因RAN3，是金鱼草Antirrhinum majus中qRT-PCR分析常用的内参基因[25-26]。通过对矮牵牛Petunia hybrida开花过程中相关候选内参基因的筛选，证实RAN1是矮牵牛中稳定表达的内参基因之一[27]。与ACT，EF1α和TUB等其他传统内参基因相比，将RAN基因作为内参基因进行研究和应用的报道较少。本研究证实RAN1在桂花不同组织中稳定表达，是最佳内参基因之一。此外，RAN1被证实是桂花不同品种中表达量最为稳定的内参基因[13]。与RAN基因相同，OfUBC2在桂花不同组织中也稳定表达，是另一个最佳内参基因。作为一个传统内参基因，UBC基因在拟南芥Arabidopsis thaliana[28-30]，月季Rosa hybrida[31]，侧柏Platycladus orientalis[32]等物种的内参基因筛选中均表现最佳。
本研究发现Of18S在桂花不同组织中表达最不稳定，不适合作为内参基因在桂花中应用。同样，在丹参Salvia miltiorrhiza[33]，牡丹Paeonia suffruticosa[34]，大白菜Brassica rapa ssp. pekinensis[8]和西瓜Citrullus lanatus[16]中，Of18S基因也被证实是表达最不稳定的内参基因。这可能与18S基因在样品中高丰度表达有关。
Reference gene selection for quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) normalization in the gene expression of sweet osmanthus tissues
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摘要: 为了筛选桂花Osmanthus fragrans不同组织基因表达分析中适合的内参基因，以桂花‘堰虹桂’O. fragrans‘Yanhong Gui’花蕾、盛开花序、嫩叶、成熟叶和1年生茎等5个不同组织为材料，利用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测7个候选内参基因的表达水平，并利用geNorm，NormFinder和BestKeeper软件对各候选内参基因的表达稳定性进行评价，最后利用桂花不同组织中OfCRTISO1基因相对表达水平验证筛选的内参基因的可靠性。结果表明：综合3个软件的评价排序，确定不同组织中最佳内参基因为OfRAN1和OfUBC2，而Of18S是最差内参基因。OfCRTISO1基因相对表达水平分析证实，不同组织中qRT-PCR分析使用OfRAN1和OfUBC2等2个表达最稳定的基因组合，即可获得更为精确的基因表达结果。旨在为桂花组织间重要基因的定量表达分析提供科学依据。
图 4 表 4 参34 -
关键词:
- 植物学 /
- 桂花 /
- 内参基因 /
- geNorm /
- NormFinder /
- BestKeeper
Abstract: To select the suitable reference gene(s) for gene expression analysis in different tissues of Osmanthus fragrans, five tissues: buds, fully-opened inflorescences, young leaves, adult leaves, and one-year-old stems, from O. fragrans 'Yanhong Gui' were used as materials to detect the expression levels of seven candidate reference genes by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). Then, an aggregated analysis of gene expression stability for these candidates was conducted using three software programs: geNorm, NormFinder, and BestKeeper. Finally, the relative expression level of OfCRTISO1 in different tissues was analyzed to verify the reference genes selected in this study. Results of the aggregated analysis showed that OfRAN1 and OfUBC2 were the best reference genes from the different tissues, and Of18S was the worst reference gene. In addition, analysis of the relative expression level for OfCRTISO1 confirmed that OfRAN1 and OfUBC2 were the two most stable reference genes in the qRT-PCR analysis of the tissues, and the application of OfRAN1 and OfUBC2 was enough to achieve more accurate and reliable results in these tissues. Thus, the present study has provided an important reference for analyzing the expression of key genes in different tissues of O. fragrans.[Ch,4 fig. 4 tab. 34 ref. ]-
Key words:
- botany /
- Osmanthus fragrans /
- reference gene /
- geNorm /
- NormFinder /
- BestKeeper
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森林是陆地生态系统的主体，起着调节大气、涵养水源、为人类提供生产资料等作用。截至2009年，中国人工林栽植面积已达5 300万hm2，约占全世界人工林面积的40%[1]，但受人为因素或诱导自然因素所致[2]，中国人工林普遍存在地力衰退、生物多样性差、水土流失严重等问题，对林地生态安全造成了一定的隐患[3]，因此，恢复和重建退化人工林生态系统势在必行。健康的森林生态系统功能，能够提高林地土壤肥力以及水土保持能力[4]。植被的存在能有效减少地表径流量，同时不同林地类型的减滞能力也不尽相同[5-6]。因此，降雨与径流及植被、土壤等因子之间的关系是目前研究的热点及难点问题[7-8]。近年来国内针对南方红壤区[9]和黄土高原[10]等区域坡地不同经营、利用方式下水土流失研究较多，针对川南地区的研究则鲜见报道。马尾松Pinus massoniana是广泛分布于中国南方的先锋树种，它具有耐贫瘠、速生、适应性强、经济价值高等特点，然而受不合理经营方式及人为活动的影响，长江流域低山丘陵区马尾松人工林普遍生长较差，生物多样性低，生态功能不强，已成为中国南方森林面积最大的退化类型之一。笔者针对长江上游低山丘陵区存在的生态安全以及生态工程建设中遇到的科学技术等问题，在前期研究工作的基础上，以川南低山丘陵区马尾松低效人工林为示范区，引入珍贵乡土树种，改造马尾松低效人工林，提升森林生态及经济功能，减少水土流失。本研究根据设立于四川省宜宾市高县来复镇的5个人工径流小区，分析马尾松低效人工林改造初期自然降雨与产流特征的关系及随植被恢复的演变规律，以期为川南马尾松低效人工林改造及经营管理提供参考。
1. 试验研究方法
1.1 研究区概况
研究区位于四川省宜宾市高县来复镇毛颠坳（28°11′~28°47′N, 104°21′~104°48′E）。该地区地处四川盆地与云贵高原的过渡地带，宜宾市中南部，属乌蒙山余脉。地貌以平坝、丘陵、低山为主。土壤多为山地黄壤，间断分布有少量紫色土。全年平均日照时数为1 107.7 h，大于等于10 ℃以上年积温为6 523.1 ℃，年平均气温为18.0 ℃，1月平均气温为8.0 ℃，7月平均气温为27.0 ℃。年平均降水量为1 037.9 mm，年平均无霜期为346.2 d。
1.2 研究方法
2012年初在试验区选择坡度约22°，东西走向并栽植有马尾松纯林的坡地，建立5个相邻规格为20 m × 5 m的标准径流小区，各径流小区出口处均设有一个径流收集室。5个径流小区采用不同的改造更新方式，分别用Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ标识。Ⅰ号径流小区为马尾松低效人工林下植被自然生长恢复，Ⅱ号径流小区为马尾松低效人工林下空隙更新樟树Cinnamomum camphora，Ⅲ和Ⅳ号径流小区为马尾松低效人工林皆伐后当年更新樟树，Ⅴ号径流小区为马尾松低效人工林皆伐后第2年更新樟树（由于有时会出现因为工期或者苗木原因不能当年更新造林的情况，因此，将Ⅴ号径流小区设计为皆伐后第2年更新樟树）。小区内樟树为当年生幼苗，株高约30 cm，按1.5 m × 1.5 m间距种植。2012年3月对Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ号径流小区进行皆伐，随即在Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ号内更新樟树；Ⅴ号径流小区则自然恢复后于2013年3月更新樟树。试验开始前5个径流小区内地表灌草及凋落物均清理完毕。试验分为3个时段，分别为2012年7-12月、2013年1-12月、2014年1-12月。在每次自然降雨后收集降水、计算24 h降雨量，并量取径流桶内径流水深，换算成径流量。雨量级别根据气象学上对于降雨量的定义判定，即24 h降雨量小于10 mm为小雨，10.1~24.9 mm为中雨，25.0~49.9 mm为大雨，50.0~99.9 mm为暴雨。
1.3 数据处理
径流系数是地表径流量与降雨量的比值，表示有比例的降水变成了径流，它能够一定程度反映该区域植被和土壤的水源涵养能力以及水土流失状况。可利用公式r=Rn/P×10-3An计算径流系数。其中：r为径流系数，Rn为径流量（m3），P为降雨量（mm），An为径流小区面积（m2）[11]。
利用Excel 2007和SPSS 19.0软件进行数据处理及统计学分析。
2. 结果与分析
2.1 川南马尾松低效人工林改造初期降雨特征
试验期年平均降雨总量约1 000 mm（表 1），与当地多年平均降雨量数据基本吻合。试验区降雨明显呈现夏季多、冬季少的特点。2013年和2014年全年多集中于每年6-9月，分别占全年降雨总量的73.23%和69.50%；1月、2月、11月、12月降雨极少，分别占全年降雨总量的3.72%和6.19%。
表 1 马尾松低效人工林改造初期降雨量及分布特征Table 1. Characteristics of rainfall capacity and distribution under the early of transformation on low eificiency Pinus massoniana forests年份 各月份降雨量 合计/mm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 2012 250.3 114.0 277.2 49.4 14.1 7.6 712.6 2013 3.2 8.1 23.0 85.9 92.1 130.8 279.4 231.7 137.8 44.4 12.7 15.6 1 064.7 2014 5.3 14.5 88.2 17.7 45.9 137.9 104.2 236.3 168.9 74.6 20.8 17.0 931.3 2012-2014年24 h最小降雨量分别为1.8，1.5和1.2 mm（表 2），最大降雨量分别为83.6，88.7和93.8 mm。2012年7-12月期间共出现5次暴雨天气，24 h最大降雨量为83.6 mm，累计降雨341.6 mm；大雨仅出现2次。2013年累计降雨73次，其中小雨47次，中雨16次，大雨6次，暴雨4次。2014年累计降雨78次，其中小雨47次，与2013年相同，降雨量减少28.8 mm；暴雨次数比2013年少2次，降雨量减少133.4 mm。纵观整个试验期，降雨次数以小雨和中雨居多，占85.56%，但雨量仅占49.05%；大雨和暴雨次数占14.44%，降雨量占比却达到50.95%。表明在1年中大到暴雨的次数比例虽然很低，但降雨量大且集中，是导致夏季地表产流较多的主要原因。
表 2 马尾松低效人工林改造初期雨量特征Table 2. Characteristics of rainfall under the early of transformation on low efficiency Pinus massoniana forests年份 总降雨量/mm 总降雨次数/次 小雨 中雨 大雨 暴雨 取大降雨量/mm 最小降雨量/mm 雨量/mm 占总降雨量比例/% 次数/次 占总降雨次数比例/% 雨量/mm 占总降雨量比例/% 次数/次 占总降雨次数比例/% 雨量/mm 占总降雨量比例/% 次数/次 占总降雨次数比例/% 雨量/mm 占总降雨量比例/% 次数/次 占总降雨次数比例/% 2012下半年 712.6 36 97.4 13.67 17 47.22 199.7 28.02 12 33.33 73.9 10.37 2 5.56 341.6 47.94 5 13.89 83.6 1.8 2013年 1 064.7 73 238.2 22.37 47 64.38 275.0 25.83 16 21.92 240.7 22.61 6 8.22 310.8 29.19 4 5.48 88.7 1.5 2014年 931.3 78 209.4 22.48 47 60.26 309.0 33.18 21 26.92 262.8 28.22 8 10.26 150.1 16.12 2 2.26 93.8 1.2 合计 2 708.6 187 545.0 20.12 111 59.36 783.7 28.93 49 26.20 577.4 21.32 16 8.56 802.5 29.63 11 5.88 266.1 4.5 2.2 川南马尾松低效人工林改造初期降雨与产流关系分析
从表 3可以看出：并非每次降雨都能引起地表径流。一般情况下，在达到最小产流降雨量后，才能产生地表径流。2012年下半年降雨36次，产流20次，产流次数占降雨次数比例为55.60%；2013年下半年与2014年下半年降雨次数相同，均为42次，产流次数占降雨次数比例分别为33.33%和45.24%，可见下半年产流降雨比例在不同年份间有较大变化。从全年看，2013年和2014年分别降雨73次和78次，产流25次和29次，产流次数占降雨次数比例为34.25%和37.18%，比较接近。对比表 2和表 3可以看出，2013年和2014年小雨都是47次，仅有1次产流，可见24 h降雨量小于10 mm时一般不会产生地表径流。而24 h降雨量达到中雨时，产流几率达到了85.00%以上，下半年甚至可能高于90.00%；在大雨及暴雨状态下，每次均有产流。
表 3 马尾松低效人工林改造初期降雨及产流次数Table 3. Times of rainfall and runoif under the early of transformation on low efficiency Pinus massoniana forests年份 降雨次数/次 产流次数/次 产流降雨比例/% 降雨量/mm 最小产流降雨量 小雨及产流次数/次 中雨及产流次数/次 大到暴雨及产流次数/次 2012下半年 26 20 55.56 712.6 6.9 2(17) 11(12) 7(7) 2012下半年 42 14 22.22 721.6 14.0 0(26) 7(8) 7(7) 2014下半年 42 19 45.24 621.8 8.2 1(22) 11(12) 7(7) 2012年 72 25 24.25 1 064.7 12.8 0(47) 15(16) 10(10) 2014年 78 29 27.18 921.2 8.2 1(47) 18(21) 10(10) 说明：表中括号内数字表示降雨次数，括号外表示产流次数。 同时可以看出，观测时期内，24 h最小产流降雨量为6.9~14.0 mm。造成这种差异的原因可能为该次小雨前有降雨发生，地表凋落物及土壤持水能力趋近于饱和，小雨过后就能形成蓄满产流；若前期降雨较少，凋落物和表层土壤含水率低，在中雨条件下雨水填洼、入渗等较多，降雨过后土壤仍未达到饱和，因此，无地表径流产生。当24 h降雨量达到大雨或暴雨条件时，5个径流小区皆有地表径流产生。
2.3 川南马尾松低效人工林不同模式改造初期产流特征
由表 4看出：Ⅰ~Ⅴ号小区最大径流量均出现在下半年，2013年最大径流量比2012年分别增加18.21%，35.62%，15.42%，13.66%和33.13%。鉴于2013年和2012年下半年降雨量仅相差9 mm，说明改造初期地表径流量差异主要由植被恢复状况及地被物覆盖变化等因素导致。其原因在于进行不同模式低效人工林改造后，植被生长、更替和人为干扰直接影响林冠层和地表层，影响了雨水拦截、入渗能力，更多的降雨转变为地表径流。说明在低效人工林改造开始阶段，林地水土保持功能体现并不明显，水土流失现象反而有可能加剧，因此，该时期应是水土流失重点监测、保护期。该结果与廖承彬等[12]研究结论相似。5个径流小区2014年最大量与2013年同期相比分别降低32.25%，26.49%，22.26%，25.08%和25.22%；其中Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ号小区最大径流量低于2012年同期水平，呈波状变化。造成这一现象的原因主要有：一是2014年7-12月降雨量比2013年同期减少近100 mm，更少降雨导致更少径流；二是改造后随着人为扰动减少，乔?鄄灌?鄄草体系逐渐恢复，凋落物增加，凋落物和土壤持水能力进一步增强。各径流小区间最小产流量差异不大，当降雨量为大雨到暴雨时，前期短时间内降水经过林冠截留、凋落物截留、地表填洼等阶段后，易形成超渗产流，这时降雨强度成为影响产流量大小的主导因子。
表 4 马尾松低效人工林不同模式改造初期产流量特征Table 4. Characteristics of runoff under different transformation patterns of low efficiency Pinus massoniana forests径流小区 产流量/m3 2012年下半年最小 2012年下半年最大 2012年下半年最小 2012年下半年最大 2013年最小 2013年最大 2014年下半年最小 2014年下半年最大 2014年最小 2014年最大 Ⅰ 0.010 2.202 0.098 2.603 0.018 2.603 0.022 2.185 0.008 2.185 Ⅱ 0.008 2.125 0.102 2.882 0.004 2.882 0.003 2.200 0.003 2.200 Ⅲ 0.012 2.601 0.086 3.002 0.006 3.002 0.006 2.006 0.006 2.006 Ⅳ 0.005 2.547 0.075 2.895 0.012 2.895 0.005 2.102 0.005 2.102 Ⅴ 0.010 2.092 0.070 2.785 0.012 2.785 0.018 1.956 0.018 1.956 表 5显示了2.5 a内5个径流小区累计产流量状况。由于Ⅲ号和Ⅳ号径流小区改造模式相同，其累计产流量十分接近，分别为36.339 m3和36.369 m3；而Ⅰ号由于郁闭度较高，林冠截留作用好于其他径流小区，且受人为扰动最小，因此，累计产流量最低，为31.315 m3，试验期内变化幅度最小。而平均单次产流量大小排序为Ⅲ＞Ⅳ＞Ⅴ＞Ⅱ＞Ⅰ，排序规律与径流小区所受扰动强度一致。
表 5 马尾松低效人工林不同模式改造初期累计产流量特征Table 5. Characteristics of cumulative runoff under different transformation patterns of low efficiency Pinus massoniana forests径流小区 不同年份产流量/m3 累计产流次数/次 累计产流量/m3 平均单次产流量/m3 2012年下半年 2013年 2014年 Ⅰ 10.077 13.166 8.072 69 31.315 0.453 8 Ⅱ 10.165 14.355 8.562 72 33.082 0.459 5 Ⅲ 13.341 15.068 7.930 72 36.339 0.504 7 Ⅳ 13.045 14.768 8.556 74 36.369 0.491 5 Ⅴ 11.662 13.675 7.299 69 32.636 0.473 0 2.4 川南马尾松低效人工林不同模式改造初期径流系数分析
对2012-2014年下半年各径流小区径流系数进行比较。由表 6可看出：除Ⅱ号径流小区呈现先增大后减小的变化以外，其他径流小区径流系数均呈逐年减小趋势。与2012年下半年相比，各径流小区2014年下半年径流系数分别减少29.36%，26.30%，47.37%，41.54%和43.97%。2012年，5个径流小区径流系数大小排序为Ⅲ＞Ⅳ＞Ⅴ＞Ⅱ＞Ⅰ，2014年则变化为Ⅳ＞Ⅱ＞Ⅰ＞Ⅲ＞Ⅴ。2014年与2013年相比，5个径流小区径流系数都有明显下降，均在25%以上，特别是Ⅲ和Ⅴ小区，径流系数下降更为明显，达36%，超出Ⅰ号小区10%。随着时间推移，效果会更加明显。从径流系数来看，Ⅰ号径流小区虽然在改造初期郁闭度最高，林冠截留能力最强，但由于林下缺乏凋落物，导致对于林内降雨的拦滞能力较弱；其他径流小区由于拥有更好的光照、水热条件，植被生长较快，生物多样性更为丰富，因此，随着改造进行Ⅰ号小区的径流系数可能会逐渐高于其他径流小区。而Ⅴ号径流小区由于在2012年未更新樟树，有1 a自然更新时间，土体扰动少于Ⅲ和Ⅳ号径流小区，因此，其径流系数在3个皆伐小区最小。
表 6 马尾松低效人工林不同模式改造初期径流系数Table 6. Runoff coefficient under different transformation patterns of low eificiency Pinus massoniana forests时间 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ 2012年下半年(r1) 0.139 3 0.140 7 0.1841 0.180 3 0.161 7 2011年下半年 0.136 9 0.148 4 0.152 4 0.150 6 0.142 2 2014年下半年(r2) 0.098 4 0.103 7 0.096 9 0.105 4 0.090 6 2013年(r3) 0.117 1 0.127 7 0.1347 0.131 9 0.122 9 2014年(r4) 0.086 7 0.091 9 0.085 2 0.091 9 0.078 4 r1/r2/% 29.36 26.30 47.37 41.54 43.97 r4/r3/% 25.99 28.03 36.75 30.33 36.21 2.5 川南马尾松低效人工林不同模式改造初期降雨量与径流量相关性分析
利用SPSS 19.0软件进行降雨量与各径流小区径流量相关性分析。由表 7可以看出：降雨量与径流量之间相关系数均大于0.905，径流量大小随降雨量变化而变化。与刘芝芹等[13]对30场降雨观测中得出的研究结论相吻合，说明降雨量是影响地表径流大小的重要因子。
表 7 马尾松低效人工林改造初期降雨量与各径流小区径流量相关性分析Table 7. Correlation coefficients of rainfall and runoff under different transformation patterns of low efficiency Pinus massoniana forests年份 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ 2012 0.971** 0.971** 0.988** 0.988** 0.986** 2013 0.916** 0.909** 0.905** 0.913** 0.906** 2014 0.947** 0.957** 0.959** 0.960** 0.951** 说明：**表示在0.01水平（双侧）上极显著相关。 3. 结论
试验区年均降水量约为1 000 mm，集中于6-9月，季节性分布不均。2013年与2014年6-9月降雨量分别占全年降雨总量的73.23%和69.50%；1，2，11，12月降雨量则仅占3.72%和6.19%。
试验期内24 h最小降雨量为1.2 mm，最小产流降雨量为6.9 mm，最大降雨量为93.8 mm。全年产流次数约占降雨次数的30%~40%，雨量以中到暴雨为主，偶有小雨下产流和中雨下无产流状况发生。各径流小区最大径流量均呈现先增大后减小的情况，说明在低效人工林改造初期有水土流失加剧现象，是水土流失监测、治理的关键期。
径流系数反映了降雨转变为地表径流的比例。改造后第1年下半年Ⅰ号和Ⅱ号径流小区由于较好的植被覆盖以及相对较少的人为干扰，径流系数低于Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ号径流小区；但2013年和2014年Ⅰ号和Ⅱ号径流小区径流系数降低均超过30%，而Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ号径流小区降低50%左右，基本与Ⅰ号和Ⅱ号径流小区持平或更低。表明各径流场水土保持功能均在恢复中。2012年与2013年Ⅰ号径流小区径流系数均为最小，2014年则逐渐接近甚至高于皆伐小区；Ⅲ，Ⅳ与Ⅴ号径流小区在试验期内产流变化过程相似。目前来看，皆伐径流小区水源涵养功能恢复速度快于Ⅰ号和Ⅱ号径流小区，减滞径流效果更佳。
对降雨量和各径流小区径流量进行相关性分析发现，其相关系数均大于0.905。因此，减少林内降雨以及增强林地水源涵养能力是减少坡面径流的关键。由于试验尚处于改造初期，时间较短，相信随着改造的深入以及林地生态系统的恢复，樟树等阔叶林的水源涵养能力会显著优于马尾松低效纯林。
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图 1 不同组织中7个候选内参基因的平均Ct值
Figure 1 Mean Ct values of seven candidate reference genes in different tissues
图 2 geNorm软件分析7个候选内参基因的表达稳定值(M)
Figure 2 Expression stability values (M) of seven candidate reference genes as calculated by geNorm
图 3 geNorm软件分析7个候选内参基因的配对差异值（VPV)
Figure 3 Pairwise variation (VPV) of seven candidate reference genes as calculated by geNorm
图 4 不同内参基因或组合校正桂花不同组织中OfCRTISO1基因的相对表达
Figure 4 Relative expression levels of OfCRTISO1 in different tissues using different reference genes or reference gene combination for normalization
表 1 qRT-PCR检测中7个候选内参基因的引物序列
Table 1. Primer sequences of seven candidate reference genes in qRT-PCR analysis
基因名 上游引物序列（5'→3') 下游引物序列（5'→3') OfACT CCCAAGGCAAACAGAGAAAAAAT ACCCCATCACCAGAATCAAGAA OfEF1α CGTTTGCCACTTCAGGATGTCTA GTACCAGGTTTCAGGACTCCAGTTT OfIDH CTTGAAGCAGATGTGGAAGAGTC CTTTGTC CATC CTGGGAC CAGTC OfRAN1 AGAACCGACAGGTGAAGGCAA TGGCAAGGTACAGAAAGGGCT OfTUB AGAAGGGATGGATGGAATGGA GTCTTCTTCGTCCTCGGCAGT OfUBC2 TGTTGACAAAACCGATGGAAGGA GTGGAGTGTGGAGGATAAGGGTG Of18S AGCCTGAGAAACGGCTACCAC ATACGCTATTGGAGCTGGAA 
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表 2 7个候选内参基因扩增特性
Table 2. Amplicon characteristics of seven candidate reference genes
基因名 扩增长度/bp PCR扩增效率/% 线性相关系数 OfACT 143 109.6 0.998 4 OfEF1α 89 97.7 0.997 4 OfIDH 118 101.8 0.995 2 OfRAN1 117 100.4 0.990 3 OfTUB 106 103.8 0.998 1 OfUBC2 75 97.7 0.994 8 Of18S 208 104.7 0.992 6
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表 3 NormFinder和BestKeeper分析7个候选内参基因的表达稳定性
Table 3. Gene expression stability of seven candidate reference genes by NormFinder and BestKeeper
基因名 NormFinder分析 BestKeeper分析 稳定值 排序 稳定值 排序 OfACT 0.010 2 1.678 4 OfEF1α 0.010 2 1.546 3 OfIDH 0.096 4 2.651 7 OfRAN1 0.005 1 1.168 1 OfTUB 0.084 3 2.080 5 OfUBC2 0.005 1 1.381 2 Of18S 0.227 5 2.272 6
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表 4 最佳内参基因和最差内参基因综合结果
Table 4. Aggregated result of the optimal and worst
分析软件 最佳内参基因 最差内参基因 geNorm OFRAN1和OFUBC2 Of18S NormFinder OFRAN1和OFUBC2 Of18S BestKeeper OFRAN1 OfIDH 综合结果 OFRAN1和OFUBC2 Of18S
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