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桂花OfABFs基因克隆和表达分析

洪方蕾 陆瑶 俞世姣 胡芷诺 缪云锋 钟诗蔚 赵宏波

洪方蕾, 陆瑶, 俞世姣, 胡芷诺, 缪云锋, 钟诗蔚, 赵宏波. 桂花OfABFs基因克隆和表达分析[J]. 浙江农林大学学报, 2023, 40(3): 481-491. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20220264
引用本文: 洪方蕾, 陆瑶, 俞世姣, 胡芷诺, 缪云锋, 钟诗蔚, 赵宏波. 桂花OfABFs基因克隆和表达分析[J]. 浙江农林大学学报, 2023, 40(3): 481-491. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20220264
HONG Fanglei, LU Yao, YU Shijiao, HU Zhinuo, MIAO Yunfeng, ZHONG Shiwei, ZHAO Hongbo. Cloning and expression analysis of OfABFs gene in Osmanthus fragrans[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2023, 40(3): 481-491. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20220264
Citation: HONG Fanglei, LU Yao, YU Shijiao, HU Zhinuo, MIAO Yunfeng, ZHONG Shiwei, ZHAO Hongbo. Cloning and expression analysis of OfABFs gene in Osmanthus fragrans[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2023, 40(3): 481-491. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20220264

桂花OfABFs基因克隆和表达分析

doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20220264
基金项目: 国家自然科学基金资助项目(32072615);浙江省农业新品种选育重大专项(2021C02071-1);国家级大学生创新创业训练计划项目(202010341024)
详细信息
    作者简介: 洪方蕾(ORCID: 0000-0001-7393-9324),从事观赏植物遗传育种等研究。E-mail: 944479051@qq.com
    通信作者: 赵宏波(ORCID: 0000-0003-4714-8240),教授,博士,从事观赏植物遗传育种等研究。E-mail: zhaohb@zafu.edu.cn
  • 中图分类号: S722.3

Cloning and expression analysis of OfABFs gene in Osmanthus fragrans

  • 摘要:   目的  研究OfABFs基因家族成员在桂花‘堰虹桂’Osmanthus fragrans ‘Yanhonggui’不同组织和花开放进程中的表达模式,筛选参与调控花开放的关键成员。  方法  在桂花基因组数据库中筛选出相关OfABFs基因序列,克隆序列全长并对其进行生物信息学分析,通过荧光定量PCR分析OfABFs基因在‘堰虹桂’不同组织及花开放进程中的时空表达模式。  结果  筛选得到5条OfABFs基因序列。生物信息学分析得出:桂花OfABFs蛋白具有亲水性,较不稳定,无信号肽段;预测其蛋白二、三级结构具有相似的特性,无规则卷曲和α-螺旋为其结构组成的主要元件;5条OfABFs转录因子均含有bZIP转录因子家族保守结构域。亚细胞定位预测表明:5条OfABFs编码蛋白均定位在细胞核。荧光定量PCR结果表明:OfABF1、OfABF2、OfABF3、OfABF4和OfABF6在桂花中的表达具有组织特异性,其中OfABF1、OfABF4和OfABF6在花中有较高表达。OfABF1在顶壳期被转录激活,表达显著升高;铃梗期后表达水平虽呈下降趋势,但仍保持较高水平。OfABF2的表达在顶壳期到达峰值,且相对表达水平明显高于其他时期。OfABF3、OfABF4和OfABF6在花朵衰老期的相对表达量最高。  结论  OfABF1、OfABF2可能与桂花花开放进程有关,而OfABF3、OfABF4和OfABF6参与调控桂花花朵衰老的可能性较大。图10表4参32
  • 图  1  桂花花开放各时期表型图

    Figure  1  Phenotypic of O. fragrans in different periods

    图  2  桂花OfABFs基因片段PCR扩增

    Figure  2  PCR amplification of OfABFs of O. fragrans

    图  3  桂花OfABFs基因家族染色体定位分析

    Figure  3  Chromosome location analysis of OfABFs genes in O. fragrans       

    图  4  桂花OfABFs功能结构域分析

    Figure  4  Functional domains of OfABFs in O. fragrans

    图  5  桂花OfABFs转录因子氨基酸序列比对

    Figure  5  Sequence alignment of OfABFs transcription factor in O. fragrans

    图  6  桂花OfABFs蛋白质保守结构域

    Figure  6  Conserved motifs OfABFs proteins in O. fragrans

    图  7  桂花OfABFs蛋白三级结构预测

    Figure  7  Prediction of tertiary structure of the OfABFs protein in O. fragrans

    图  8  桂花OfABFs与各物种ABFs转录因子进化分析

    Figure  8  Studies on the relationship between O. fragrans OfABFs and the evolution of ABFs transcription factors in different species

    图  9  5个OfABFs基因在不同组织的表达结果

    Figure  9  Expression results of 5 OfABFs genes in different tissues

    图  10  5个OfABFs基因在花开放时期的表达结果

    Figure  10  Express an results of 5 OfABFs genes in different flower opening periods

    表  1  桂花OfABFs简单克隆引物

    Table  1.   Primers for Cloning of OfABFs in O. fragrans

    基因名称引物序列(5′→3′)产物长度/bp引物温度/℃
    OfABF1 F: ATGGGGAGTAATTTGAACTTCAAGAATCCG
    R: TTACCATGGACCTGTCTGAGTTCGTCTCA
    1 557 54
    OfABF2 F: ATGGGGTCATACATGAACTTCAAG
    R: CTACCAAGGTCCCGTCAGCA
    1 353 58
    OfABF3 F: ATGGGGAGTAATTTTAACTTCAAGAATTTTGG
    R: TTACCATGGCCCTGTCTGTGTACGTC
    1 455 56
    OfABF4 F: ATGTGGAGTAATTTTAACTTCAAGAATGT
    R: TCACCATGGCCCCGTTTG
    1 572 56
    OfABF6 F: ATGAACTTTGGGCCGGACACATCA
    R: CTACCAAGGTCCTGTCAGCGTCCTTCT
    1 329 45
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    表  2  桂花OfABFs转录因子RT-qPCR特异性引物

    Table  2.   Specific primers for RT-qPCR of OfABFs in O. fragrans

    基因名称用于荧光定量的引物序列(5′→3′)
    OfABF1F: GGAAGGATGGGAGTGGTAGTGR: TTAGGCTTTCCAGCCAACTGA
    OfABF2F: TGGTGCAAAAGATGGAAGTGCR: ATTTGCTGTCCAAGAGGGCTG
    OfABF3F: GAGTATGGTGGCGGGAAGAATR: GGTAGGCTTTCCAGCAAACTG
    OfABF4F: TCTGGAGAGAGAGGTGGAATGAR: CAAACTGGGCATCTTCCCTTAC
    OfABF6F: GAAGGGGTAGTGGAGGATCAAR: ACCACCATAAATTCCACCAGC
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    表  3  桂花OfABFs蛋白二级结构分析

    Table  3.   Secondary structure analysis of protein OfABFs in O. fragrans

    基因名称α-螺旋/%β-折叠/%延伸/%无规则卷曲/%基因名称α-螺旋/%β-折叠/%延伸/%无规则卷曲/%
    OfABF127.804.0513.3254.83OfABF428.494.7811.8554.88
    OfABF228.671.7812.2257.33OfABF631.673.1710.8654.30
    OfABF330.993.1011.1654.75
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    表  4  桂花OfABFs蛋白理化性质分析

    Table  4.   Physicochemical properties of OfABFs proteins of O. fragrans

    基因名称序列名称氨基酸
    长度/个
    相对分
    子量/kDa
    等电点酸性氨
    基酸/个
    碱性氨
    基酸/个
    不稳定
    系数
    脂溶性
    系数
    亲水性平
    均系数
    亚细胞定
    位预测
    信号肽
    OfABF1gui0017720.151855.69.24495646.7678.07−0.482细胞核
    OfABF2gui0167370.145025.74.77251646.9571.04−0.536细胞核
    OfABF3gui0180650.148451.99.35435052.8067.77−0.615细胞核
    OfABF4gui0305040.152356.25.38605250.6168.66−0.659细胞核
    OfABF6gui0100630.144246.810.03355054.4365.29−0.593细胞核
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出版历程
  • 收稿日期:  2022-03-31
  • 修回日期:  2022-07-27
  • 录用日期:  2022-07-27
  • 刊出日期:  2023-05-20

桂花OfABFs基因克隆和表达分析

doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20220264
    基金项目:  国家自然科学基金资助项目(32072615);浙江省农业新品种选育重大专项(2021C02071-1);国家级大学生创新创业训练计划项目(202010341024)
    作者简介:

    洪方蕾(ORCID: 0000-0001-7393-9324),从事观赏植物遗传育种等研究。E-mail: 944479051@qq.com

    通信作者: 赵宏波(ORCID: 0000-0003-4714-8240),教授,博士,从事观赏植物遗传育种等研究。E-mail: zhaohb@zafu.edu.cn
  • 中图分类号: S722.3

摘要:   目的  研究OfABFs基因家族成员在桂花‘堰虹桂’Osmanthus fragrans ‘Yanhonggui’不同组织和花开放进程中的表达模式,筛选参与调控花开放的关键成员。  方法  在桂花基因组数据库中筛选出相关OfABFs基因序列,克隆序列全长并对其进行生物信息学分析,通过荧光定量PCR分析OfABFs基因在‘堰虹桂’不同组织及花开放进程中的时空表达模式。  结果  筛选得到5条OfABFs基因序列。生物信息学分析得出:桂花OfABFs蛋白具有亲水性,较不稳定,无信号肽段;预测其蛋白二、三级结构具有相似的特性,无规则卷曲和α-螺旋为其结构组成的主要元件;5条OfABFs转录因子均含有bZIP转录因子家族保守结构域。亚细胞定位预测表明:5条OfABFs编码蛋白均定位在细胞核。荧光定量PCR结果表明:OfABF1、OfABF2、OfABF3、OfABF4和OfABF6在桂花中的表达具有组织特异性,其中OfABF1、OfABF4和OfABF6在花中有较高表达。OfABF1在顶壳期被转录激活,表达显著升高;铃梗期后表达水平虽呈下降趋势,但仍保持较高水平。OfABF2的表达在顶壳期到达峰值,且相对表达水平明显高于其他时期。OfABF3、OfABF4和OfABF6在花朵衰老期的相对表达量最高。  结论  OfABF1、OfABF2可能与桂花花开放进程有关,而OfABF3、OfABF4和OfABF6参与调控桂花花朵衰老的可能性较大。图10表4参32

English Abstract

洪方蕾, 陆瑶, 俞世姣, 胡芷诺, 缪云锋, 钟诗蔚, 赵宏波. 桂花OfABFs基因克隆和表达分析[J]. 浙江农林大学学报, 2023, 40(3): 481-491. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20220264
引用本文: 洪方蕾, 陆瑶, 俞世姣, 胡芷诺, 缪云锋, 钟诗蔚, 赵宏波. 桂花OfABFs基因克隆和表达分析[J]. 浙江农林大学学报, 2023, 40(3): 481-491. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20220264
HONG Fanglei, LU Yao, YU Shijiao, HU Zhinuo, MIAO Yunfeng, ZHONG Shiwei, ZHAO Hongbo. Cloning and expression analysis of OfABFs gene in Osmanthus fragrans[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2023, 40(3): 481-491. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20220264
Citation: HONG Fanglei, LU Yao, YU Shijiao, HU Zhinuo, MIAO Yunfeng, ZHONG Shiwei, ZHAO Hongbo. Cloning and expression analysis of OfABFs gene in Osmanthus fragrans[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2023, 40(3): 481-491. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20220264
  • bZIP转录因子家族是植物中最大、最保守且功能最多样的基因家族之一,广泛参与调节多种生物学过程[1-2]。ABF (ABRE binding factor)转录因子属于bZIP基因家族的A亚族[3],特异存在于植物中,ABFs是ABA信号转导途径的关键基因,能够特异识别ABA响应元件(ABA-responsive element,AREB),并通过与AREB结合参与下游响应ABA信号靶基因的调控[4]。月季Rosa chinensisRhABF2基因能够与含有ABRE元件的RhFer1启动子结合,共同调节铁平衡参与调控花瓣衰老过程[5];睡莲Nymphaea colorata bZIP家族A亚组的11个成员的启动子区域有大量ABA响应元件,在ABA信号转导中具有重要作用[6];菊花Chrysanthemum×morifolium中锌指蛋白BBX19和ABF3互作,通过诱导ABA响应基因表达来调控菊花的耐旱性[7]。桂花Osmanthus fragrans属于木犀科Oleaceae木犀属Osmanthus常绿乔木,是中国传统十大名花之一。温度、湿度是影响桂花花开放的重要因素。为了解ABFs转录因子在桂花中的作用,本研究以秋桂品种‘堰虹桂’O. fragrans‘Yanhonggui’为材料,在桂花基因组中筛选出相关OfABFs基因序列,通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析OfABFs基因在‘堰虹桂’不同组织和花开放进程中的时空表达模式,为后续阐明ABFs基因家族各成员的生物学功能提供理论支持。

    • 以浙江农林大学桂花资源圃的桂花品种‘堰虹桂’盆栽植物为材料,选取株龄相同、长势一致的健康植株,分别于起始1期(圆珠期前3 d,B1),起始2期(圆珠期前2 d,B2),起始3期(圆珠期前1 d,B3),圆珠期(S1),顶壳期(S2),铃梗期(S3),初开期(S4),盛开期(S5),盛开末期(S6),衰老期(S7)共10个时期进行取样(图1)[8]。同样,取桂花不同组织的样品,包括根、新叶、新枝、老叶、老枝、盛开期的花朵,每个时期样品采集3份,液氮速冻后储藏于−80 ℃冰箱。

      图  1  桂花花开放各时期表型图

      Figure 1.  Phenotypic of O. fragrans in different periods

    • 桂花核苷酸序列来源于桂花基因组数据库[9],从拟南芥Arabidopsis thaliana信息资源(TAIR)数据库(http://www.arabidopsis.org/)和PlantTFDB (http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/blast.php)数据库中获得拟南芥的ABFs氨基酸序列,以此作为查询对象,使用NCBI-Blast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在桂花基因组蛋白数据库中进行同源比对,确定桂花中的ABFs基因序列。利用NCBI-CDD (https://www.ncbi. nlm.nih.gov/cdd/)对OfABFs进行保守功能域预测。使用SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)分析OfABFs蛋白结构域。

      RNA的提取使用RNA prep Pure Plant Plus Kit提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司],使用核酸分析仪(赛默飞世尔科技公司)对RNA的纯度与浓度进行检测,并用质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。使用HiScriptⅡ Q Select RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)试剂盒(南京诺维赞生物科技股份公司),对花开放不同时期的cDNA进行合成。

      运用Primer 5.0进行简单克隆引物设计(表1),以花开放时期的花芽cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系(20 μL):上下游引物(10 μmol·L−1)各1 μL、cDNA模板1 μL、GreenTaqMix10 μL和ddH2O 7 μL。PCR扩增程序:预变性95 ℃,3 min;变性95 ℃,15 s,退火温度以各自引物最佳温度为准,15 s,延伸72 ℃,3 min,35个循环;72 ℃延伸5 min。将PCR反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测,目的片段回收纯化后与pMD-18T载体连接,连接产物转化大肠埃希菌Escherichia coli DH5α感受态细胞,PCR初步鉴定阳性克隆后送杭州有康生物科技有限公司测序,经比对后确定序列。

      表 1  桂花OfABFs简单克隆引物

      Table 1.  Primers for Cloning of OfABFs in O. fragrans

      基因名称引物序列(5′→3′)产物长度/bp引物温度/℃
      OfABF1 F: ATGGGGAGTAATTTGAACTTCAAGAATCCG
      R: TTACCATGGACCTGTCTGAGTTCGTCTCA
      1 557 54
      OfABF2 F: ATGGGGTCATACATGAACTTCAAG
      R: CTACCAAGGTCCCGTCAGCA
      1 353 58
      OfABF3 F: ATGGGGAGTAATTTTAACTTCAAGAATTTTGG
      R: TTACCATGGCCCTGTCTGTGTACGTC
      1 455 56
      OfABF4 F: ATGTGGAGTAATTTTAACTTCAAGAATGT
      R: TCACCATGGCCCCGTTTG
      1 572 56
      OfABF6 F: ATGAACTTTGGGCCGGACACATCA
      R: CTACCAAGGTCCTGTCAGCGTCCTTCT
      1 329 45
    • 利用TBtools[10]从桂花基因组Gff文件中提取桂花OfABFs基因的染色体位置信息,通过在线分析工具TBtools进行绘图可视化。

    • 用DNAMAN对已筛选的桂花OfABFs转录因子进行氨基酸序列比对,分析其保守结构域和氨基酸序列同源性;通过在线分析软件MEME 5.1.0分析ABFs的保守基序(http://meme-suite.org/tools/meme),并用TBtools对其进行绘图和可视化。对桂花OfABFs二级结构特征采用在线软件SOPMA (https://npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa-sopma.html)进行预测分析;使用在线网站Swiss-Model (https://swissmodel.expasy.org/)构建OfABFs蛋白的三级结构模型。

    • 运用ExPASy在线软件(http://web.expasy.org/protparam/)对OfABFs进行蛋白质、分子量、理论电点、酸碱性等预测分析和编码;利用SignalP 4.1 Server分析桂花OfABFs蛋白有无信号肽。亚细胞定位预测通过在线工具wolfpsort (https:// wolfpsort.hgc.jp/)完成。

    • 从美国国家生物信息中心(NCBI) (www.ncbi.nlm.nih.gov)中获取拟南芥、烟草Nicotiana tabacum、水稻Oryza sativa、大麦Hordeum vulgare、小麦Triticum aestivum、番茄Solanum lycopersicum、油橄榄Olea europaea的ABFs氨基酸序列,使用MEGA 11.0软件进行同源聚类,建立系统发育树并选择Bootstrap (1 000次)评估检测系统进化树。

    • 利用Primer Premier 5.0对5个OfABFs基因进行荧光定量特异性引物设计(表2),桂花OfACT作为内参基因[11],以‘堰虹桂’不同组织及不同花开放时期的花芽cDNA为模板进行RT-qPCR扩增。反应体系为20 μL:cDNA模板2 μL,2×Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL,上下游引物(10 μmol·L−1)各0.4 μL,ddH2O 7.2 μL。RT-qPCR程序:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,共40个循环;然后以95 ℃持续15 s,60 ℃持续1 min,95 ℃持续15 s作为熔解曲线分析程序。每个样品设置3次重复。

      表 2  桂花OfABFs转录因子RT-qPCR特异性引物

      Table 2.  Specific primers for RT-qPCR of OfABFs in O. fragrans

      基因名称用于荧光定量的引物序列(5′→3′)
      OfABF1F: GGAAGGATGGGAGTGGTAGTGR: TTAGGCTTTCCAGCCAACTGA
      OfABF2F: TGGTGCAAAAGATGGAAGTGCR: ATTTGCTGTCCAAGAGGGCTG
      OfABF3F: GAGTATGGTGGCGGGAAGAATR: GGTAGGCTTTCCAGCAAACTG
      OfABF4F: TCTGGAGAGAGAGGTGGAATGAR: CAAACTGGGCATCTTCCCTTAC
      OfABF6F: GAAGGGGTAGTGGAGGATCAAR: ACCACCATAAATTCCACCAGC
    • 通过对桂花基因组数据分析,得到5条OfABFs基因序列,依次命名为OfABF1、OfABF2OfABF3、OfABF4、OfABF6。用‘堰虹桂’花开放时期的花芽(混样) cDNA为模板进行PCR扩增(图2)。结果显示:OfABFs的开放阅读框(ORF)长度为1329~1572 bp,编码442~523个氨基酸;其中基因OfABF4氨基酸序列最长,编码523个氨基酸;基因OfABF6的氨基酸序列最短,编码442个氨基酸。

      图  2  桂花OfABFs基因片段PCR扩增

      Figure 2.  PCR amplification of OfABFs of O. fragrans

    • 根据‘堰虹桂’基因组Gff文件定位5个OfABFs基因。结果显示:5个桂花OfABFs基因分布在5条染色体上,且各个基因在染色体上分布的数量相等,1号、6号、11号、12号和22号染色体上各分布1个OfABF基因(图3)。

      图  3  桂花OfABFs基因家族染色体定位分析

      Figure 3.  Chromosome location analysis of OfABFs genes in O. fragrans       

    • 利用SMART在线分析软件对桂花OfABFs进行功能结构域预测。结果显示:5个桂花ABFs均含有BRLZ结构域(图4)。BRLZ结构域是bZIP家族特有的保守域,由碱性区和亮氨酸拉链区组成,能够识别特定的DNA序列,以二聚体形式发挥功能[12]。通过DNAMAN软件,将OfABFs氨基酸序列进行比对(图5)。结果显示:OfABF3和OfABF4同源性最高,OfABF1和OfABF6同源性最低;5个C端均含有能被激酶识别的保守序列RXXS/T。

      图  4  桂花OfABFs功能结构域分析

      Figure 4.  Functional domains of OfABFs in O. fragrans

      图  5  桂花OfABFs转录因子氨基酸序列比对

      Figure 5.  Sequence alignment of OfABFs transcription factor in O. fragrans

      对桂花ABFs氨基酸序列进行保守基序分析发现(图6):OfABFs蛋白结构域中含有10个蛋白基序(Motif 1~Motif 10),其中Motif 7在除OfABF4外的4个蛋白中均被鉴定到,Motif 8在除OfABF6外的4个蛋白中均被鉴定到,其余8个Motif高度保守,是OfABFs核心结构域的组成部分。

      图  6  桂花OfABFs蛋白质保守结构域

      Figure 6.  Conserved motifs OfABFs proteins in O. fragrans

      桂花OfABFs蛋白的二级结构预测表明:桂花OfABFs蛋白的二级结构均含有α-螺旋、β-折叠、延伸链、无规则卷曲,不同结构占比从大到小依次为无规则卷曲、α-螺旋、延伸链、β-折叠。其中,β-折叠占比最小,均在5%以下;延伸链占比为10%~13%;α-螺旋和无规则卷曲占二级结构总量的83%,为OfABFs蛋白二级结构的主要构成元件(表3)。

      表 3  桂花OfABFs蛋白二级结构分析

      Table 3.  Secondary structure analysis of protein OfABFs in O. fragrans

      基因名称α-螺旋/%β-折叠/%延伸/%无规则卷曲/%基因名称α-螺旋/%β-折叠/%延伸/%无规则卷曲/%
      OfABF127.804.0513.3254.83OfABF428.494.7811.8554.88
      OfABF228.671.7812.2257.33OfABF631.673.1710.8654.30
      OfABF330.993.1011.1654.75

      桂花OfABFs蛋白三级结构分析显示(图7):OfABFs蛋白三级结构均含丰富的α-螺旋和无规则卷曲,这与其二级结构预测结果一致。含无规则卷曲较多的蛋白稳定性要低于含α-螺旋、β-折叠多的蛋白,在OfABFs蛋白中无规则卷曲比例均高于50%,为不稳定蛋白,这与其理化性质分析预测结果一致(表3)。

      图  7  桂花OfABFs蛋白三级结构预测

      Figure 7.  Prediction of tertiary structure of the OfABFs protein in O. fragrans

    • 对桂花ABFs家族蛋白理化性质的分析结果表明:桂花氨基酸长度为450~523 个,相对分子质量为25.7~56.2 kDa,理论等电点为4.77~10.03,编码氨基酸序列最长的的是OfABF4,其相对分子质量最大,为56.2 kDa;编码氨基酸序列最短的是OfABF2,其相对分子质量也最小,为25.6 kDa。5个OfABFs基因成员的不稳定系数为46.76~54.43。如果将不稳定系数>40的蛋白判断为不稳定蛋白,那么5个基因的蛋白不稳定系数均高于40,均为不稳定蛋白。桂花ABFs蛋白脂溶性系数为65.29~78.07,亲水性总平均系数为−0.659~−0.482,均小于0,为亲水性蛋白。信号肽分析结果显示:桂花ABFs编码蛋白均不含有信号肽,表明桂花ABFs家族蛋白均非分泌蛋白。亚细胞定位预测发现(表4):5个编码蛋白均定位在细胞核,这与其作为转录因子的生物学功能相吻合。

      表 4  桂花OfABFs蛋白理化性质分析

      Table 4.  Physicochemical properties of OfABFs proteins of O. fragrans

      基因名称序列名称氨基酸
      长度/个
      相对分
      子量/kDa
      等电点酸性氨
      基酸/个
      碱性氨
      基酸/个
      不稳定
      系数
      脂溶性
      系数
      亲水性平
      均系数
      亚细胞定
      位预测
      信号肽
      OfABF1gui0017720.151855.69.24495646.7678.07−0.482细胞核
      OfABF2gui0167370.145025.74.77251646.9571.04−0.536细胞核
      OfABF3gui0180650.148451.99.35435052.8067.77−0.615细胞核
      OfABF4gui0305040.152356.25.38605250.6168.66−0.659细胞核
      OfABF6gui0100630.144246.810.03355054.4365.29−0.593细胞核
    • 构建系统进化树进一步研究OfABFs的进化关系,结果表明(图8):8个物种的25条氨基酸序列可分为5个分支(分支Ⅰ~Ⅴ),其中OfABFs分布在2个分支中。OfABF1、OfABF3和OfABF4均分布在分支Ⅰ,该分支包括油橄榄OeTRAB1、烟草NtABF2、马铃薯Solanum tuberosum StABF、马铃薯StABF1、番茄SlAREB1和拟南芥AtABF2,说明OfABF1、OfABF3和OfABF4在进化过程中与这些物种亲缘关系较近;OfABF2和OfABF6与番茄SlABF4聚为分支Ⅱ。

      图  8  桂花OfABFs与各物种ABFs转录因子进化分析

      Figure 8.  Studies on the relationship between O. fragrans OfABFs and the evolution of ABFs transcription factors in different species

    • 利用荧光定量分析5个基因在根、嫩枝、老枝、新叶、老叶等不同组织中的表达情况。定量结果(图9)显示:OfABF1在花中表达量最高,在老叶和新叶中表达没有显著差异,在新枝和老枝中相对表达量最低;OfABF2在老叶中表达最高,其次为新叶,在花中表达略高于枝;OfABF3在叶中表达水平相对其他组织高,在花和枝中表达较低。OfABF4在花中相对表达量最高,其次是新叶和老叶,老枝中表达量最低,OfABF6的相对表达量在花中最高,在其他组织中的表达量均较低。OfABF1、OfABF4、OfABF6在所有组织中均有表达,但在花中的相对表达水平最高,尤其是OfABF6。

      图  9  5个OfABFs基因在不同组织的表达结果

      Figure 9.  Expression results of 5 OfABFs genes in different tissues

      图10可见:起始1期(B1)到起始3期(B3)花芽芽体肥大并延伸。圆珠期(S1)到盛开末期(S6)为花开放时期,OfABF1在顶壳期(S2)被转录激活,表达显著升高,铃梗期(S3)后表达水平虽呈下降趋势,但仍保持较高水平;OfABF2在起始1期(B1)到圆珠期(S1)时期几乎不表达,在顶壳期(S2)的表达量到达峰值,且相对表达水平显著高于其他时期;OfABF3和OfABF4在花朵衰老期(S7)的相对表达量最高,在盛开末期(S6)的表达量其次,圆珠期(S1)至盛开期(S5)表达趋势变化不显著;OfABF6的相对表达量在花朵衰老期(S7)最高。由此说明:OfABF1和OfABF2可能与桂花花开放进程有关,OfABF3、OfABF4和OfABF6可能参与桂花花衰老的调控。

      图  10  5个OfABFs基因在花开放时期的表达结果

      Figure 10.  Express an results of 5 OfABFs genes in different flower opening periods

    • ABF转录因子在模式植物拟南芥、烟草以及园艺作物中的研究较多。ABFs已在拟南芥、烟草、杨树Populus中被鉴定[12-15]。LI等[16]对29种陆地植物中的95种ABFs蛋白长度、分子量进行分析,发现ABF的氨基酸长度为254~485 个;分子量为27.81~52.95 kDa。目前,关于桂花OfABFs的研究较少,通过鉴定与分析桂花OfABF转录因子,可进一步了解桂花OfABFs的生物学功能及其表达分析。

      OfABFs蛋白的二级结构组成与烟草、睡莲、野菊Chrysanthemum indicum、蓝莓Vaccinium corymbosum、大豆Glycine max[6, 17-20]等其他物种中的结构相类似,均以α-螺旋和无规则卷曲为主要构成元件,少量β-折叠和延伸链散布于整个多肽链中。说明在基因变异和进化时,虽然基因外显子的数量上发生变化,但仍具有其保守性,这与杨颖等[2]的研究结果基本一致。基于蛋白行使特定功能依赖其三维结构,本研究使用蛋白三级结构预测软件SWISS-MODEL同源模拟桂花OfABFs蛋白三级结构,结果显示:OfABF2与烟草[17]中的同源蛋白质NtABF1NtABF2三级结构类似,除OfABF2蛋白外,其余成员蛋白三级结构在空间结构上相似度较高,进一步说明ABF蛋白在进化上较保守,具有对植物生长发育的重要功能。序列比对结果显示:5个OfABFs的C端均具有bZIP转录因子特有的BRLZ结构域,且含有保守序列RXXS/T,推测OfABFs转录因子可通过被磷酸化激活,从而结合下游基因启动子区域的ABRE元件,调控相关下游胁迫响应基因[20-21]

      系统发育结果显示:桂花ABFs基因家族成员全部分布在以双子叶植物油橄榄、番茄、马铃薯、烟草为主的分支Ⅰ和分支Ⅱ中,无家族成员分布在以单子叶植物小麦、大麦、水稻等为主的分支Ⅲ、分支Ⅳ和分支Ⅴ中。由此推测,桂花ABFs与双子叶植物亲缘关系较近,与单子叶植物的亲缘关系较远。表明在进化过程中,ABF在种属间是高度保守的。

      根据亲缘关系推测桂花OfABFs基因功能,如在分支Ⅰ中,OfABF1、OfABF3、OfABF4与马铃薯StABF、番茄SlAREB1烟草NtABF2、拟南芥AtAREB1亲缘性较高。在对环境的胁迫应答过程中,番茄SlAREB1的过表达可增加物种干旱和盐胁迫耐受性[22],诱导有机酸积累的变化并参与其合成的基因编码酶的表达[23];烟草NtABF2与拟南芥AtAREB1响应非生物胁迫,前者通过与胁迫响应基因启动子区的ABRE元件结合相关基因的转录[16, 23-24],后者受ABA含量等渗透胁迫诱导,作为关键基因参与ABA信号调控通路以增强物种抗旱性[25],显著提高ABA依赖性逆境响应基因的表达水平[25-28];在分支Ⅱ中,OfABF2、OfABF6与番茄SlABF4同源性较高,且SlABF4作为ABA响应因子,ABA通过其对SICOL4产生负调控作用,使其与下游乙烯通路相关的基因互作[29],调控乙烯的合成和信号转导进而调控番茄果实的成熟进程[29-30]。由此推测:桂花OfABFs可以作为ABA响应因子,参与ABA信号转导,影响植物整个生长发育过程[31]。牡丹Paeonia suffruticosa切花保鲜的研究发现:ABA以诱导乙烯大量合成的方式间接加速牡丹切花的衰老[32]。还有研究发现:在月季花瓣衰老过程中内源ABA含量迅速上升,促进RhABF2的表达量上调,从而推测RhABF2在月季花瓣衰老过程中发挥调节作用[7]。在桂花中OfABF3、OfABF4和OfABF5的相对表达量在衰老期急剧上升,推测在桂花花瓣衰老过程中内源ABA含量上升,OfABF3、OfABF4和OfABF5可能参与调节桂花花瓣的衰老。推测OfABFs基因响应内源ABA,参与桂花衰老的可能性较大。5个OfABFs基因在桂花中的功能值得进一步探讨。

    • 以桂花品种‘堰虹桂’为材料,在基因组数据库中筛选出相关5条OfABFs基因序列。生物信息学分析得出:桂花ABFs蛋白具有亲水性,较不稳定,无信号肽段。其蛋白二、三级结构预测具有相似特性,无规则卷曲和α-螺旋为其结构组成的主要元件;5条OfABFs基因序列均含有bZIP转录因子家族保守结构域;亚细胞定位预测表明:5条OfABFs编码蛋白均定位在细胞核。荧光定量PCR结果表明:OfABF1、OfABF2、OfABF3、OfABF4和OfABF6在桂花中的表达具有组织特异性,其中OfABF1、OfABF4和OfABF6在花中表达较高。OfABF1在顶壳期(S2)被转录激活,表达显著升高,铃梗期(S3)后表达水平虽呈下降趋势,但仍保持较高水平;OfABF2在顶壳期(S2)表达量达到峰值,且相对表达水平著显高于其他时期;OfABF3、OfABF4和OfABF6在花朵衰老期(S7)的相对表达量最高。推测OfABF1、OfABF2可能与桂花花开放进程有关,而OfABF3、OfABF4和OfABF6响应ABA参与调控花朵衰老的可能性较大。

参考文献 (32)

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