以盆栽‘堰虹桂’为材料，选取相同株龄且生长一致的植株。取桂花不同组织的样品，包括根、茎、叶、叶芽、花芽、盛开期的花朵；同时根据桂花花芽分化进程取叶芽、花序分化期、花萼花瓣分化期、雌雄蕊分化期以及花开放不同阶段圆珠期、铃梗期、初花期、盛花期和盛花末期的样品^[18]，用于基因克隆、组织特异性和时空表达分析。所有材料使用液氮冷冻并于-80 ℃保存备用。

RNA提取试剂盒（RNAprep pure Plant Kit）购自天根公司（北京）。反转录试剂盒、荧光定量试剂盒、胶回收试剂盒、Premix Taq酶、pMD-18T载体和大肠埃希菌Escherichia coli DH5α均购自Takara公司（大连），运用实时荧光定量PCR（Applied Biosystems，Foster City，美国）分析OfAP1基因的组织特异性及时空表达变化。

按照RNAprep pure Plant Kit试剂盒说明书提取各样品的总RNA，并参照Reverse Transcriptase M-MLV反转录酶说明书合成cDNA的第一链后，储存于-20 ℃备用。

利用前期转录组测序获得的AP1 Unigene序列，设计特异性引物AP1-F：5′-TAGAGTGAGAAAATGGGGAGA-3′；AP1-R：5′-AATACAATCCCTGGCTACTT-3′。以花芽分化期茎尖RNA反转录的cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系为：上下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，Premix Taq DNA 10 μL和去离子水7 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；然后进行35个循环，每个循环包括95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min；最后72 ℃保温10 min，4 ℃保存。PCR反应产物经质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳检测后回收、纯化，与pMD18-T载体连接，转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞，蓝白斑筛选阳性克隆，经PCR鉴定后送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

对获得的基因序列进行生物信息学分析，其中编码区分析采用美国国家生物技术信息中心（NCBI）在线网站ORFFinder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html），编码蛋白质的保守区段分析采用NCBI Conserved Domain Search软件（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi），编码区蛋白质特征分析采用在线软件ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）和TMHMM Server v2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）。多序列比对采用软件DNAman，系统进化树构建采用Clustal X+MEGA 7.0软件并选择邻位连接法（neighbor joining method）用Bootstrap法检验1 000次。

按照SYBR^® Premix Ex Taq ^TM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）试剂盒的说明书，检测桂花OfAP1基因不同组织以及不同时期的表达情况。OfAP1定量引物为qAP1-F：5′-GCAGAAGTGGCTTTGATTTG-3′；qAP1-R：5′-GTTTGCTGGTGACTGAGGTT-3′。同时以OfACT为内参qACT-F：5′-CCCAAGGCAAACAGAGAAAAAAT-3′；qACT-R：5′-ACCCCATCACCAGAATCAAGAA-3′^[19]。qRT-PCR反应体系：2×SYBR Premix Ex TaqⅡ（Tli RNaseH Plus）10 μL，上下游定量引物（10 μmol·L^-1）各0.8 μL，cDNA 2 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，双蒸水补齐至20 μL。qRT-PCR程序如下：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。3次生物学重复。反应后根据熔解曲线分析qRT-PCR产物的特异性，并采用2^-△△CT法计算相对表达量。

以‘堰虹桂’花芽分化期cDNA为模板，扩增得到约750 bp片段（图 1），其开放阅读框长为720 bp，编码239个氨基酸（图 2）。该基因片段具有MADS-box基因的保守区，在NCBI上进行BLASTX在线分析，发现该序列与芝麻Sesamum indicum（AIS82596.1），葡萄Vitis vinifera（ACZ26528.1）和油橄榄Olea europaea（XP_022878350.1）等中AP1基因的同源性最高，命名为OfAP1，并在GenBank注册，登录号为MH593222。

图  1  桂花OfAP1电泳图

Figure 1.  PCR products of OfAP1

图  2  桂花OfAP1氨基酸序列比对

Figure 2.  Comparative analysis of OfAP1 protein sequence

OfAP1蛋白氨基酸序列运用NCBI在线CDD（Conserved Domain Datebase）分析发现，OfAP1具有典型的MEF2_like MADS结构域和K-box结构域，MADS结构域位于N端第2~74位氨基酸，K-box结构域位于第90~168位氨基酸（图 2）。OfAP1蛋白的分子式为C₁₁₉₉H₁₉₄₁N₃₄₁O₃₆₈S₁₆，其相对分子质量为27 534.62，理论等电点为8.4。负电荷残基总数（天冬氨酸Asp+谷氨酸Glu）为32，正电荷残基总数（精氨酸Arg+赖氨酸Lys）为35。在组成OfAP1蛋白的20种氨基酸中，亮氨酸（Leu）所占比例最高，为11.7%，其次为谷氨酸（Glu），占10.0%，色氨酸（Trp）所占比例最低，为0.8%。预测亲水性指数（GRAVY）为-0.665，表明OfAP1具有较好的亲水性。

采用GOR4软件对OfAP1蛋白二级结构预测发现，OfAP1蛋白二级结构由α螺旋、伸展链和无规则卷曲组成，其中，α螺旋（Hh）占56.49%，β折叠（Ee）占10.46%，无规则卷曲（Cc）占33.05%。同时采用Phyre 2在线工具对OfAP1蛋白三级结构进行预测，OfAP1有3个典型的α螺旋和2个β折叠（图 3）。NetPhos 2.0 Server预测结果表明：OfAP1蛋白序列中存在11个潜在的磷酸化位点，包括6个Ser位点（22Ser，61Ser，74Ser，87Ser，110Ser，121Ser，135Ser，150Ser，216Ser）和1个Thr位点（220Thr）。NetNGlyc 1.0 Server预测结果表明：OfAP1蛋白存在1个潜在的N-糖基化位点，90Asn。

图  3  桂花OfAP1蛋白的三级结构预测

Figure 3.  Tertiary structure prediction for OfAP1 protein

为了分析OfAP1基因与其他物种中AP1基因的系统进化关系，采用MEGA 7.0软件构建系统进化树（图 4）。单子叶植物（如短柄草Brachypodium distachyon，水稻Oryza sativa，玉米Zea mays）和双子叶植物可以明显地分为2个大类。桂花OfAP1与芝麻，豇豆Vigna unguiculata，枇杷，印加果Plukenetia volubilis，麻疯树，葡萄，芍药Paeonia lactiflora，柑橘Citrus sinensis以及拟南芥中的AP1基因聚在一起，说明这些基因亲缘关系较近且功能具有一定的相似性。

图  4  桂花OfAP1的系统进化树

Figure 4.  Phylogenetic tree based on OfAP1 gene

为明确OfAP1基因在桂花不同组织以及花芽分化不同时期的表达情况，对不同组织和器官（根、茎、叶、叶芽、花芽以及花）及不同发育时期的样品进行荧光定量RT-PCR分析。结果表明：OfAP1基因在花芽中的表达量最高，其次为叶，在茎中的表达比较弱，在根中几乎不表达（图 5）。同时，与叶芽时期相比，OfAP1基因在分化初期（即花原基的形成以及花萼花瓣分化期）表达量最高，随后呈下降趋势（图 6），到花开放阶段表达量均较低。

图  5  OfAP1基因在不同组织中的表达量

Figure 5.  Expression of OfAP1 gene in different tissues

图  6  OfAP1基因在‘堰虹桂’成花及花开放过程的表达量

Figure 6.  Expression pattern of OfAP1 in flowers of different stages

AP1及其同源基因已在多个物种中克隆得到，但桂花中的AP1至今没有相关报道。本研究克隆得到OfAP1基因，发现其与芝麻、葡萄以及油橄榄等AP1基因高度相似，OfAP1氨基酸序列含有高度保守的MEF2_like MADS结构域和次级保守的K-box结构域以及可变C，MADS结构域具有结合DNA、蛋白质二聚化以及与其他因子结合的功能；K-box结构域的蛋白二级结构为3个α螺旋，具有介导蛋白-蛋白之间的相互作用^[20]。AP1基因C末端的变化较大，但是不同类的MADS-box基因常含有一些保守的基序（motif），这些基序在蛋白复合体的形成和转录激活中起重要作用^[21]。

开花是植物重要的发育阶段，是多条基因网络共同调控的复杂过程^[2]。AP1基因是植物特有的MIKCC-Type MADS-box基因，既参与花分生组织的形成，又是花器官形成的重要基因，在植物成花中起关键调控作用^[3]。根据在模式植物拟南芥中的研究，AP1是花分生组织形成的标志物，成花整合基因FT和SOC1能够激活其表达并使其参与对成花抑制基因TFL1基因的拮抗，促进花分生组织的形成。在花器官发育中，AP1一方面通过促进AP3和PI的表达诱导花瓣和雄蕊的发育，另一方面受到AG基因的抑制作用控制萼片和花瓣的发育^[22]。在百合中AP1的同源基因LMADS5/6转基因拟南芥后发现其能够造成早花，并且花器官中萼片变成心皮状，花瓣变成雄蕊状结构^[12]；同样地，在洋桔梗Eustoma grandiflorum中超表达AP1发现：转基因植株花期提前，部分花瓣出现雄蕊类似的结构，进一步突变体互补实验表明：AP1基因对花瓣形成，尤其是第2轮花被片的发育有重要作用^[23]。在建兰Cymbidium ensifolium，芍药以及菊花Chrysanthemum morifolium等中，AP1基因在花芽中的表达量显著高于其他器官组织，尤其在花芽分化的初期阶段^[24-26]。在桂花中，OfAP1在花芽中有较高的表达，其在花芽分化初期表达量显著上调，尤其是成花转变以及花瓣、花萼分化时期，而当完成花萼花瓣分化后，表达量则显著下调。这充分说明桂花OfAP1基因参与了桂花成花转变和花瓣、花萼等器官分化，但其具体作用机制还有待进一步通过转化实验加以验证。