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磷脂酸(phosphatidic acid，PA)是一种常见的细胞甘油磷脂，也是最简单的膜脂之一[1]。几乎所有生物体内都会产生PA，包括酵母[2]、动物[3]和植物[4]等。在植物中PA的合成主要包括2种方式：第1种是从头合成途径，3-磷酸甘油先后在3-磷酸甘油酰基转移酶和溶血磷脂酸脂酰基转移酶的作用下发生连续2步酰化反应生成PA，这也是PA合成的主要途径[5]；第2种是磷脂的降解途径，磷脂降解又可分为2种，一种是磷脂酶D通过水解某些结构磷脂直接生成PA[6−9]，另一种是磷脂酶C通过水解磷脂酰肌醇生成二脂酰甘油[10]，继而经二脂酰甘油激酶磷酸化生成PA[11]。PA作为一种结构膜脂，磷酸基团头部能够以“静电/氢键开关模型”的方式与蛋白质结合[12]。在该模型中，PA结合蛋白中带正电荷的碱性氨基酸残基[13−17]，可以吸引磷脂双分子层上的负电荷，并通过静电作用影响膜环境，继而与PA头部的磷酸基团形成氢键，产生一个稳定的蛋白质结合位点。PA这种携带负电荷并且在生理条件下呈圆锥体的独特分子构型[18]，使得PA结合蛋白的结构域能够特异性的与其结合，保证了生物膜结构的稳定和功能的发挥。除了作为膜脂的一个结构成分以及甘油脂合成的前体物质，PA还是一个关键信号分子，在多种生物学过程中发挥重要作用。正常条件下，行使信号功能的PA含量甚微；在植物应答各种生物与非生物胁迫过程中PA水平则会迅速升高，但这种积累往往是短暂的。这说明生物体拥有一套严格控制信号分子PA含量的机制，这对调节PA信号传递强度、维持细胞物质与能量代谢的动态平衡至关重要[19−22]。
尽管PA拥有多种功能，但目前对于细胞内PA含量的动态变化仍知之甚少，这主要受PA检测手段的限制。过去主要采用诸如薄层层析、高效液相色谱和放射性同位素标记等理化手段对其含量进行测定[23]。近年来，质谱分析技术的应用使得对包括PA在内的各种脂质的测定更准确和高效[24−25]。然而，这些理化手段都只能对组织器官中PA总量与种类进行定量或定性分析，无法捕捉细胞内PA的动态与瞬时变化信息。通常认为，内质网上的PA含量相对较高，这有助于促进磷脂和三酰甘油的合成[26−27]；而质膜和细胞器中行使信号功能的PA含量甚微。显然，采用理化测定会掩盖胞内PA的真实变化。因此，亟需开发一种能可视化分析细胞内PA的工具。
大量研究表明：生物体中PA结合蛋白种类繁多，这些蛋白中的PA结合域(phosphatidic acid binding domains，PABD)结构亦存在差异。其中一些PABD因与PA结合专一性强，被用来开发多种PA探针 [28−33]。酵母蛋白Spo20p中的PA结合域已被证实具有极强的专一性[33]，只结合PA而不结合其他磷脂。目前基于这一PABD所开发的PA探针在医学研究中应用广泛，但在植物中的应用却有限[34]。因此，本研究旨在构建基于Spo20p中的PABD的植物PA荧光探针，为剖析植物早期应答逆境胁迫的细胞分子机制提供新工具。
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将拟南芥Arabidopsis thaliana种子置于含有湿润滤纸的培养皿中，4 ℃冰箱内避光放置3 d后将其点播在湿润的土壤基质上(V营养土∶V蛭石∶V珍珠岩=3∶1∶1)。将播种后的盆栽用透明塑料盖覆盖，置于24~25 ℃室温、50%~60%湿度、14 h光照/10 h黑暗的植物培养箱中培养，7 d后揭去塑料盖间苗。
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将拟南芥种子进行消毒，加入适量灭菌过的蒸馏水，在4 ℃冰箱内避光放置3 d，点播在1/2 MS培养基上，置于植物培养间中培养。
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酵母蛋白Spo20p中存在一个高度专一的PA结构域(PABD)，该PABD由40个氨基酸残基构成，只结合PA而不结合其他磷脂[33−34]，因此，本研究选择该PABD与荧光蛋白融合，构建PA荧光探针。根据PAPD核苷酸序列[33]设计引物(表1)进行PCR扩增，获得与该PABD相对应的DNA片段；同时PCR扩增获得GFP基因编码区序列。随后，利用无缝克隆试剂盒(生工)，将GFP和PABD片段克隆至植物表达载体pSY06的限制性内切酶位点Kpn I和Pst I之间，获得重组质粒pSY06-GFP-PABD。PABD连接至GFP基因编码区的3′端，构成GFP-PABD融合基因，该融合基因的表达由组成型启动子UBQ10驱动。重组质粒中的插入片段经菌落PCR、Kpn I和Pst I双酶切以及测序验证正确后，采用热激法将质粒转化至农杆菌Agrobacterium tumefaciens GV3101，用于后续拟南芥遗传转化。
表 1 相关引物序列
Table 1. Sequence of related primers
用途 引物名称 引物序列(5′→3′) PABD基因合成 ZYP301 CCTGCTAATTTCAAGGCTAATTCATTGCTGTTCGCTCGAGATCTGAGTCCGGACTGCAGGTTGGATCCGGTACCGAGCT ZYP302 GAAGACGTGATAGGCTACATGTGAAGCTTAAATCCTTGAGGAATAAAATCCACAAACAACTTCACCCAAA ZYP303 TGCTTCCTGAACAATTGTCCATTCTAGATTCTGTCTTGTTGATATCAAGACCTGCTAATTTCAAGGCTAA ZYP304 GTACCCAAGCTTCACATGTAGCCTATCACGTCTTCTGCTTCCTGAACAATTGTCC ZYP305 CACAAACAACTTCACCCAAACTGTCGGTTCGATGACGCCACTAAGACTAGTTAAGGTACCGGCGTAATCATGGTC PABD基因克隆 ZYP308 TCCGGACTCAGATCTCGAGC ZYP309 AGCTATAGTTCTAGATCTAGATTAACTAGTCTTAGTGGCGTC GFP基因克隆 ZYP306 TATCGATGGCGCCAGCTGAGGATGGTGAGCAAGGGCGA ZYP307 AGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCCATCCGGACTCAGATCTCGAGC 转基因拟南芥鉴定 MSY01 TGGTGTTAGTTTCTAGTTTGTGCG MSY02 TCATCATGACAGATCTGCGC 表达量分析 ZYP389 GACCACTACCAGCAGAACACC ZYP390 CTTGTACAGCTCGTCCATGC -
以哥伦比亚野生型拟南芥(WT)为植物材料，利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥。将获得的T1代拟南芥种子进行表面消毒，均匀铺在含有草铵膦(10 mg·L−1)和特美汀(50 mg·L−1)的1/2 MS筛选培养基上进行筛选。将具有除草剂抗性的阳性苗移栽到土壤中继续培养，3周后提取叶片DNA并设计引物(表1)进行PCR鉴定，对T2和T3代转基因株系进行除草剂抗性的遗传分析，最终筛选得到纯合单插入位点转基因株系。
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以在1/2 MS培养基中生长7 d的转基因拟南芥根系作为测定材料，使用高纯度RNA提取试剂盒(全式金)提取RNA并对其进行纯度检测和浓度测定。取等量RNA，使用反转录试剂盒(翌圣)进行单链cDNA的合成。选择拟南芥肌动蛋白基因Actin为内参基因，设计引物(表1)进行实时荧光定量PCR (RT-qPCR)，并对数据采用2−∆∆Ct法进行分析。
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将野生型和转基因株系种子点播在1/2 MS方形培养基上，竖直培养6 d后，挑选长势均匀一致的幼苗(每个基因型，20株)，分别转移至含有0和50 mmol·L−1 NaCl的1/2 MS固体培养基中继续竖直培养，7 d后观察表型。
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将在1/2 MS方形培养基上竖直培养6 d的幼苗分别浸泡在含有0、2和10 μmol·L−1 PA的1/2 MS液体培养基中，依次处理5、10、15和20 min后，利用荧光显微镜(ZEISS，Axio Imager 2)对拟南芥根尖分生区PA的分布进行观察并拍照。
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将含PA荧光探针的拟南芥转基因株系种子点播在1/2 MS方形培养基上，竖直培养6 d，选择均匀一致的幼苗分别浸泡在含有100 mmol·L−1 NaCl、10 mmol·L−1 NaHCO3和兼含两者的1/2 MS液体培养基中，处理5、10和15 min后用荧光显微镜观察根尖分生区PA的分布。
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如图1所示：该载体以pSY06为骨架，由35S 启动子驱动植物选择标记基因——草铵膦抗性基因(bar)的表达，而GFP-PABD融合基因的表达则由UBQ10启动子驱动。
图 1 pSY06-GFP-PABD载体图
Figure 1. Vector diagram of pSY06-GFP-PABD
采用农杆菌花序侵染法将GFP-PABD融合基因转入拟南芥，获得T1代转基因种子。对T1代幼苗进行草铵膦(10 mg·L−1)抗性筛选与PCR鉴定，获得56个含融合基因的独立转基因株系。随后，对相应株系的T2代幼苗(每个株系约300株)继续进行草铵膦除草剂抗性筛选。卡方测验显示：符合3(阳性苗数)∶1(阴性苗数)分离规律的株系共8个，这些株系为含单插入位点的转基因株系。再对T2代各个株系不同植株的自交后代(T3代)进行除草剂抗性筛选，最终获得7个纯合、单插入位点转基因拟南芥株系，分别为8-1、11-1、13-12、25-5、42-4、48-1和53-1。
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为了明确不同转基因株系PA荧光探针表达量的差异，对上述7个转基因株系进行了目的基因的表达量测定。RT-qPCR结果(图2)显示：当将转基因株系8-1中融合基因的相对表达量设为参考值“1”，其余6个株系(11-1、13-12、25-5、42-4、48-1和53-1)的相对表达量分别为1.74、15.91、0.72、1.06、1.69和1.52。株系13-12的PA探针的表达量最高，是其他株系的9~22倍，为PA探针高表达转基因株系；相应地，将株系48-1作为PA探针低表达材料。
图 2 不同转基因拟南芥株系中GFP-PABD融合基因的相对表达量
Figure 2. Relative expression level of the GFP-PABD fusion gene in transgenic A. thaliana lines
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为了明确PA荧光探针的表达是否会对植物生长发育产生影响，比较分析了野生型拟南芥和不同转基因株系在整个生长发育周期的表型差异。土培生长实验显示：野生型与转基因拟南芥株系的叶片生长无明显差异，高表达转基因株系(13-12)与低表达转基因株系(48-1)之间亦无可见表型差异(图3A)。另外，在含有0和50 mmol·L−1 NaCl的1/2 MS培养基中生长时，野生型与不同转基因株系之间也未表现出生长速率的差异(图3B)。这些结果说明：在一定范围内PA荧光探针的表达不会影响拟南芥的正常生长发育，这一特性有助于合理解释特定条件下胞内PA变化对植物生长发育产生的影响。
图 3 野生型拟南芥与3个PA荧光探针转基因株系的表型比较
Figure 3. Phenotypic comparison between wild type and three transgenic lines of A. thaliana bearing PA fluorescent probe
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随着荧光探针表达量的增加，细胞内的荧光强度也会增强，这会导致PA检测的信噪比下降；相反，荧光探针表达量过低则会影响PA检测的灵敏度。为了获得检测灵敏度和信噪比都较高的PA荧光探针，用不同浓度的外源PA处理荧光探针表达量存在差异的转基因株系，进而在荧光显微镜下观察根尖PA的积累情况。结果(图4~6)显示：野生型拟南芥在有、无外源PA处理下，根尖细胞自发荧光的强度无明显差别。另外，在不同浓度外源PA处理下，荧光探针低表达的转基因株系(48-1)的根尖分生区的PA含量变化未能被捕捉到。相反，对于荧光探针高表达的转基因株系(13-12)，2和10 μmol·L−1 PA分别处理10 和5 min后，其根尖分生区细胞的胞内或质膜上的PA积累清晰可见(图5)。当外源PA浓度低时，随着处理时间延长，细胞中PA积累减少(图5)，这很可能是因为作为甘油脂合成前体物质的PA已被转化为其他物质。而当外源PA浓度升至10 μmol·L−1时，处理10、20 min后依然可见细胞中的PA呈点状分布(图6)。这些结果说明：荧光探针表达量较高的转基因株系(13-12)可被用于监测细胞中PA含量的变化。
图 4 无外源PA处理下PA探针在野生型和2个转基因拟南芥株系根尖中荧光强度的差异分析
Figure 4. Analysis of discrepancy in fluorescent intensity of PA probe between wild type and two transgenic lines of A. thaliana
图 5 外源PA(2 μmol·L−1)处理下PA荧光探针对PA监测灵敏度的分析
Figure 5. Sensitivity analysis of PA fluorescent probe monitoring PA under treatment with 2 μmol·L−1 exogenous PA
图 6 外源PA (10 μmol·L−1)处理下PA荧光探针对PA监测灵敏度的分析
Figure 6. Sensitivity analysis of PA fluorescent probe monitoring PA under treatment with 10 μmol·L−1 exogenous PA
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为了进一步验证 PA荧光探针的实用性，利用荧光探针表达量较高的转基因株系(13-12)检测盐碱胁迫条件下根尖细胞中PA含量的变化。结果显示：盐、碱单独或混合处理转基因株系，5 min后即可在根尖分生区细胞中观察到PA的点状分布(图7)。因此推断，本研究构建的PA荧光探针可用于监测逆境条件下植物细胞中PA含量的变化。另外，盐碱胁迫可快速诱导PA积累这一现象表明在植物早期逆境响应中PA发挥某种重要作用。
图 7 单独或混合盐碱胁迫下PA在转基因拟南芥根尖分生组织中的分布
Figure 7. Distribution of PA in the root tip meristem of a transgenic A. thaliana line bearing PA sensor under saline and alkaline stresses, alone or in combination
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已知PA在植物生长发育与逆境响应过程中发挥重要作用，但由于缺乏PA的可视化分析工具，对细胞中PA含量动态变化的了解十分有限。这一方面限制了PA作用机制的研究，另一方面给评估基因工程手段操控植物细胞PA含量变化所产生的实际应用效果带来困难。因此，本研究将酵母蛋白Spo20p中对PA高度专一的结合域与荧光蛋白融合，成功构建了可对细胞内PA进行可视化检测的荧光探针。
为了使荧光探针适用于监测整个生长周期不同组织细胞中的PA水平，选择组成型表达启动子UBQ10驱动GFP-PABD融合基因的表达。研究发现：植物细胞中PA的检测灵敏度与PA荧光探针的表达量密切相关，表达量较高的荧光探针可有效检测到外源PA处理带来的胞内PA水平的变化，而表达量较低的探针检测效果则相反。如13-12株系中PA荧光探针的表达量高于其他株系，该株系经2 μmol·L−1外源PA处理10 min，其根尖细胞中PA的点状分布即可被观察到，这也说明外源PA能够被拟南芥根尖快速吸收，继而与PA荧光探针结合。鉴于已有研究中常用浓度高于10 μmol·L−1的外源PA检测PA探针的灵敏度[35]，本研究中构建的荧光探针可有效监测到2 μmol·L−1外源PA处理所带来的细胞内PA含量的变化，推测基于13-12转基因株系的PA荧光探针具有较高的PA检测灵敏度。
需要指出的是，PA荧光探针使用过程中，样品处理时间的延长和观察光源的增强均会使植物细胞造成某种损伤，导致细胞产生自发荧光，从而降低PA检测的信噪比。因此在实验过程中，需尽量缩短植物样本的制片时间及荧光观察的时间，以提高观察结果的真实性。
盐碱地中盐和碱是2种共存但不同的非生物胁迫，共同影响植物的正常生长发育。利用本研究构建的PA荧光探针发现：盐胁迫处理5 min就会造成PA在细胞中的积累，这与已有的研究结果一致[22, 36]。同时，碱胁迫和盐碱混合胁迫也会快速诱导PA的积累。因此，为了全面了解植物早期逆境响应机制，有必要监测早期细胞中PA含量的动态变化。本研究开发的PA荧光探针为这些方面的研究提供了重要技术支撑。
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本研究成功构建了一种基于酵母蛋白Spo20p中PA结合域的荧光探针，可有效监测植物细胞中PA含量变化。应用该探针发现盐碱胁迫可快速诱导拟南芥根尖细胞质膜上和胞内PA的积累，这一结果表明PA在植物对盐碱胁迫早期应答过程中发挥重要作用。
Generation and application of a fluorescent probe for phosphatidic acid in Arabidopsis thaliana
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摘要:
目的 磷脂酸(PA)是甘油脂生物合成的前体，又是参与植物生长发育调节和各种逆境响应的重要信使物质，然而目前对植物细胞中PA含量动态变化的了解十分有限。本研究试图构建一种能有效监测植物细胞PA含量变化的荧光探针，并用之测定盐碱胁迫过程中胞内PA含量的变化。 方法 将Spo20p蛋白中高度专一的PA结合域相对应的核苷酸序列与绿色荧光蛋白基因融合，经遗传转化获得携带该融合基因的转基因拟南芥Arabidopsis thaliana株系，其表达受组成型启动子UBQ10驱动，产生的融合蛋白成为专一结合PA的荧光探针。随后，运用该荧光探针监测盐碱胁迫下胞内PA含量的变化。 结果 构建获得7个不同的纯合、单插入位点转基因拟南芥株系。实时荧光定量PCR (RT-qPCR)分析显示：不同株系中融合基因的表达量存在差异。不同浓度外源PA处理试验显示：随着表达量的升高，PA探针可有效监测到2 μmol·L−1 PA处理根尖10 min后细胞中PA含量的变化；而当PA探针表达量较低时，对PA监测灵敏度显著下降，表明在一定程度上荧光探针对PA监测的灵敏度与其表达量相关联。运用PA荧光探针发现：盐碱胁迫处理根尖5 min即可诱导质膜上或胞内PA的积累，暗示PA在植物早期盐碱胁迫响应中可能产生重要作用。 结论 本研究构建了一种可对细胞内PA含量进行有效监测的荧光探针，该探针可用于监测植物盐碱胁迫早期响应过程中胞内PA水平的变化，从而为早期逆境响应研究提供新工具。图7表1参36 Abstract:Objective Phosphatidic acid (PA) serves as an important signal molecule involved in the regulation of plant growth and development and different responses to various stresses as well as a general precursor for glycerolipid biosynthesis. However, little is known thus far about the dynamic changes of PA in plant cells. This study attempted to construct a fluorescent probe that can effectively monitor the changes of PA in plant cells and use it to measure the changes of intracellular PA under saline-alkaline stresses. Method The corresponding nucleotide sequence for PA-specific binding domain within the Spo20p protein was fused to the green fluorescent protein gene. Transgenic Arabidopsis thaliana lines bearing the fusion gene under the control of the constitutive promoter UBQ10 was then generated via genetic transformation. The resulting fusion protein constituted a fluorescent probe specifically binding to PA. Subsequently, this probe was employed to monitor the changes of cellular PA under saline-alkaline stresses. Result Seven transgenic A. thaliana lines homozygous for single insertion of the fusion gene was generated. Real time quantitative PCR (RT-qPCR) analysis showed that expression levels of the fusion gene varied among different lines. Experiments with various exogeneous PA concentrations revealed that as the expression level of the PA probe increased, it could effectively monitor the changes of cellular PA in the root tips treated with 2 μmol·L−1 exogenous PA for 10 min, whereas this was not the case when the expression level of the probe was low, indicating that the sensitivity of the probe for PA detection is, to a certain degree, associated with its expression level. Based on this fluorescent PA probe, PA accumulation at the plasma membrane or in the intracellular space was evident in the root tips under saline-alkaline stresses for 5 min, implying that PA may play important roles in early plant responses to saline-alkaline stresses. Conclusion A fluorescence probe for effective monitoring of cellular PA was developed in this study. This probe can monitor the alterations in cellular PA level during early plant responses to saline-alkaline stresses, thereby providing a new tool to study early responses to various stresses. [Ch, 7 fig. 1 tab. 36 ref.] -
Key words:
- phosphatidic acid /
- fluorescent probe /
- transgene /
- saline-alkaline stress /
- Arabidopsis thaliana
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铁路、公路等基础设施建设会破坏和占压地表植被，形成大量的裸露坡面，遇到降雨极易发生水土流失，甚至出现滑坡、泥石流等次生地质灾害。裸露坡面常常具有坡度陡、坡体稳定性低、水分条件差和土壤瘠薄等特征，是不利于植被生长的困难立地。客土喷播绿化是裸露坡面恢复植被最快速最有效的方式之一，喷播后灌溉养护对植被生长至关重要[1]。大量调查发现：客土喷播后普遍存在过度灌溉，产生坡面径流，造成水土流失和水资源浪费；同时喷播基质通气不畅也会影响植被生长。可见，确定适合植被生长且能保证灌溉时坡面不产流的客土喷播基质含水量已成为当前亟需解决的问题。目前，关于适宜含水量研究大多集中在林地土壤与林木之间，如夏江宝等[2]对贝壳堤岛旱柳Salix matsudana光合效率的土壤水分临界效应及其阈值进行了分级研究，景雄等[3]对毛竹Phyllostachys edulis实生苗土壤水分有效性及生产力进行了分级研究，张淑勇等[4]对黄刺玫Rosa xanthina叶片光合生理参数的土壤水分阈值响应及其生产力进行了分级研究等，客土喷播基质适宜含水量与植被生长的关系研究则较少。以往的研究大都只关注了植物某一个生长阶段的土壤水分适宜含水量阈值[2, 5-6]，缺乏对不同季节植被生长与基质水分关系的研究。鉴于此，本研究以北方地区常用的喷播修复植物黑麦草Lolium perenne作为研究对象，利用种植盆模拟客土喷播绿化，通过控制不同客土喷播基质水分梯度，分析夏、秋季黑麦草光合特性日变化对不同喷播基质水分的响应规律，以叶片净光合速率(Pn)和水分利用效率(EWU)作为“产”“效”来评价黑麦草生产力和水分利用能力的依据，并进行季节间比较，建立夏、秋季黑麦草喷播基质适宜含水量阈值分级，以期为北京至张家口的公路、铁路等冬季奥林匹克运动会交通廊道以及自然条件相近地区的工程创面客土喷播恢复植被灌溉养护提供参考。
1. 研究区概况与方法
1.1 研究区概况
研究区河北省张家口市涿鹿县为北京冬季奥林匹克运动会延庆赛区和张家口崇礼赛区廊道沿线，高速公路G6和G7之间，地理坐标为40°26′20″N，115°17′03″E。涿鹿县属温带半干旱大陆性季风气候，年均气温为9.1 ℃，极端最高气温为39.2 ℃，极端最低气温为−23.9 ℃，年均降水量为367 mm，年均蒸发量为1 600 mm，无霜期为169 d，年平均积温为2 100~3 400 ℃，风向以西北为主，平均风速2~3 m·s−1，土壤为沙壤质褐土。
1.2 试验材料
喷播基质材料为客土(取自河北省涿鹿县苗圃)、木纤维[长1~3 cm，中矿复地生态环境技术研究院(北京)有限公司]、保水剂(3005KCE，美国艾森公司)、黏合剂(A30，美国艾森公司)、稻壳和黑麦草种子(北京布莱特草业有限公司)。喷播基质层和种子层的材料配比见表1。黑麦草播种量为4 g·m−2。
表 1 基质层和种子层的材料配比Table 1 Material ratio of matrix layer and seed layer喷播层次 客土/
%木纤
维/%稻壳/
%复合肥/
(g·m−3)保水剂/
(g·m−3)黏合剂/
(g·m−3)基质层(10 cm) 70 10 20 300 200 150 种子层(3 cm) 67 33 说明：客土、木纤维和稻壳为体积比 1.3 试验设计
利用种植盆试验模拟客土喷播绿化，种植盆上口直径50 cm、盆底直径40 cm、高15 cm，底部打孔便于排水。使用恒睿牌HKP125型客土喷播机。2021年4月26日，根据表1的材料配比将基质层和种子层分上、下2层先后喷播到种植盆内，采用微喷灌雾化喷头对喷播基质灌溉养护，保持喷播基质充分湿润(每次灌溉以喷播基质表面不积水为准)，保证种子出苗有充足的水分。
2021年5月26日开始控制喷播基质含水量(为质量含水量，下同)，用环刀法测得喷播基质的田间持水量为30.36%，容重为1.12 g·cm−3。喷播基质含水量设置5个水分梯度，分别为30.36%、25.81%、21.25%、16.70%和12.14%，即喷播基质相对含水量(CRW)为100%、85%、70%、55%和40%，每个水分梯度设置3个重复。每天16:00用TDR350土壤水分速测仪(美国Spectrum公司)测定CRW(通过容重换算为质量含水量)，每盆测定重复3次取平均值，并根据公式计算耗水量：w设−w测=m耗/m干。其中：w设为设计质量含水量(%)；w测为实测质量含水量(%)，根据TDR350实测值和容重换算；m耗为每盆黑麦草耗水量(g)；m干为每盆喷播基质干质量(g)，可由基质体积和容重计算得出。使用微喷灌雾化喷头对喷播基质补充水分，为避免降水影响，试验在透明通风遮雨大棚内进行。
1.4 指标观测
于夏季(2021年8月5日，即控水2个月后)、秋季(2021年10月11日，即控水4个月后)选择连续3 d晴朗无云的天气，使用Li-6400XT便携式光合作用测定仪(标准叶室，Li-COR)测定黑麦草叶片Pn (μmol·m−2·s−1)、蒸腾速率Tr (mmol·m−2·s−1)、气孔导度Gs (mol·m−2·s−1)、胞间二氧化碳(CO2)摩尔浓度Ci (μmol·mol−1)等生理参数以及大气CO2摩尔浓度Ca (μmol·mol−1)、光合有效辐射PAR (μmol·m−2·s−1)、气温Ta (℃)和相对湿度Rh (%)等环境因子，并根据公式EWU=Pn/Tr计算水分利用效率、Ls=1−Ci/Ca计算气孔限制值。测定时间为8:00—16:00，隔2 h测1次，每个种植盆选取3株生长健康、长势一致的黑麦草，每株选取3片叶，每片叶记录3次读数，取平均值。
1.5 数据处理
运用Excel 2016整理光合参数与基质相对含水量数据；SPSS 22.0进行差异显著性检验LSD；Origin 2018进行作图和多项式拟合建立回归模型，使用F检验对回归模型进行显著性检验。
2. 结果与分析
2.1 夏秋两季主要环境因子的日变化
由图1可知：夏、秋季PAR的日变化为单峰曲线，均为先升高后下降，峰值均出现在12:00，夏季峰值为(1 393.71±110.04) μmol·m−2·s−1，秋季为(786.73±88.74) μmol·m−2·s−1。夏季PAR日均值(999.75±459.61) μmol·m−2·s−1大于秋季(504.07±274.09) μmol·m−2·s−1。夏、秋季Ca日变化为“V”型曲线，8:00—12:00下降，之后上升。秋季Ca日均值(421.15±17.65) μmol·mol−1大于夏季(411.54 ±10.76) μmol·mol−1，两者相差较小，仅为2.30%。
图 1 夏、秋季光合有效辐射(PAR)和大气CO2摩尔浓度(Ca)的日变化Figure 1 Diurnal variation of photosynthetically active radiation (PAR) and atmospheric CO2 concentration (Ca) in summer and autumn由图2可知：夏、秋季Ta的日变化与PAR相似，也为单峰曲线，在12:00达最大值。夏季Ta最大为(42.88±1.46) ℃，秋季为(28.41±1.06) ℃。夏季日均值(37.87±3.23) ℃大于秋季(26.21±2.03) ℃。夏、秋季Rh的日变化与Ta相反，12:00前下降，之后上升，夏、秋季Rh最低值分别为20.98%±1.65%和17.05%±1.47%。夏季Rh日均值(26.72%±5.56%)大于秋季(19.98%±2.70%)。
图 2 夏、秋季气温(Ta)和相对湿度(Rh)的日变化的日变化Figure 2 Diurnal variation of temperature (Ta) and relative humidity (Rh) in summer and autumn2.2 不同喷播基质含水量下黑麦草光合特性的日变化
2.2.1 不同喷播基质含水量下黑麦草叶片净光合速率(Pn)的日变化
夏、秋季黑麦草叶片Pn日变化对CRW有明显的阈值响应(图3)。当CRW为70%~85%时，Pn的变化呈双峰曲线，均出现光合“午休”现象，上午和下午各出现1个峰值，此水分范围内，Pn在全天各时段均最高。当CRW增加至100%时，Pn呈单峰曲线，峰值出现在12:00。当CRW降低到55%和40%时，Pn为单峰曲线，峰值均出现在8:00(但秋季CRW为55%时Pn峰值出现在10:00)，Pn在全天各时段均处于较低水平，表明CRW低于55%会严重抑制植物的光合作用。由表2可知：Pn日均值对CRW也有明显的阈值响应。当CRW为85%时，夏季Pn日均值最大，达(11.17±3.08) μmol·m−2·s−1，与其他水分梯度有显著差异(P＜0.05)。秋季的Pn日均值在CRW为70%时达最大，为(7.02±1.97) μmol·m−2·s−1，与其他水分梯度也有显著差异(P＜0.05)。夏季Pn日均值均大于秋季，CRW为55%~100%时两季差异达到显著(P＜0.05)。CRW为40%时，两季Pn日均值均较低，可见当CRW较低时植物光合作用将受到严重影响。综上所述，夏、秋两季维持黑麦草较高Pn的CRW为70%~85%，高于或低于此范围，Pn明显受到抑制。
图 3 夏、秋季不同喷播基质含水量下黑麦草净光合速率(Pn)的日变化Figure 3 Diurnal variation of net photosynthetic rate (Pn) of L. perenne under different spraying substrate water content in summer and autumn表 2 夏、秋季不同喷播基质含水量下黑麦草光合生理参数的日均值变化Table 2 Change of daily mean of photosynthetic physiological parameters of L. perenne under different spraying substrate water content in summer and autumnCRW/% Pn/(μmol·m−2·s−1) Tr/(mmol·m−2·s−1) EWU/(mol·mol−1) 夏季 秋季 夏季 秋季 夏季 秋季 100 6.79±2.01 Abc 4.30±0.95 Bb 5.59±1.17 Aab 2.75±0.16 Bab 1.32±0.20 Bbc 1.56±0.26 Acd 85 11.17±3.08 Aa 6.07±1.24 Ba 6.83±1.12 Aa 3.13±0.40 Ba 1.61±0.22 Ba 1.92±0.22 Ab 70 9.26±2.79 Aab 7.02±1.97 Ba 6.76±0.63 Aa 2.92±0.59 Ba 1.43±0.15 Bab 2.37±0.25 Aa 55 5.77±2.09 Ac 3.77±1.03 Bb 4.91±0.93 Ab 2.35±0.30 Bbc 1.20±0.12 Bbc 1.63±0.20 Ac 40 2.80±1.66 Ae 2.74±0.78 Ab 3.03±0.87 Ac 2.16±0.28 Ac 1.01±0.28 Ac 1.28±0.16 Ad 说明：同列不同小写字母、同行不同大写字母均表示差异显著(P＜0.05) 2.2.2 不同喷播基质含水量下黑麦草叶片蒸腾速率(Tr)的日变化
夏、秋季黑麦草叶片Tr日变化规律与Pn基本相似(图4)，当CRW为70%~85%时，黑麦草Tr的日变化呈双峰曲线。当CRW增加至100%时，Tr呈现单峰曲线，夏、秋季峰值均出现在14:00，但日均值却低于CRW为70%~85%时。表明基质水分充足可有效延缓Tr“午休”，但会降低Tr。当CRW≤55%时，Tr呈单峰曲线，峰值出现在8:00或10:00，全天各时段均处于较低的水平。结合表2可知：当CRW≥55%时，夏季Tr日均值显著高于秋季(P＜0.05))，可见不同季节气候环境对植物Tr影响较大。当CRW为40%时，Tr日均值显著低于其他水分梯度(P＜0.05)，表明水分胁迫严重限制Tr。综上所述，CRW过高或过低均会降低黑麦草Tr，当CRW为70%~85%时，黑麦草会保持较高的Tr，保障植物正常生理活动。
图 4 夏、秋季不同喷播基质含水量下黑麦草蒸腾速率(Tr)的日变化Figure 4 Diurnal variation of transpiration rate (Tr) of L. perenne under different spraying substrate water content in summer and autumn2.2.3 不同喷播基质含水量下黑麦草叶片水分利用效率(EWU)的日变化
EWU日变化对基质含水量有明显的阈值响应(图5)。CRW为70%~85%时，EWU为双峰曲线(但秋季CRW=85%时为单峰曲线)，全天各时段EWU均高于其他水分梯度。当CRW增加至100%时，EWU表现为单峰曲线，峰值出现在12:00。CRW为40%~55%时，EWU峰值出现在8:00或10:00，之后不断降低。结合表2可知：当CRW≥55%时，秋季EWU日均值显著高于夏季(P＜0.05)，CRW为40%时秋季EWU日均值高于夏季，但不差异显著。CRW为40%和100%时，EWU日均值均显著低于其他水分梯度(P＜0.05)，表明CRW过高或过低都会降低EWU。综上所述，夏、秋季维持黑麦草同时具有较高Pn和EWU的CRW为70%~85%，在这个水分范围内，Tr也保持较高水平，有利于植物的光合作用。
图 5 夏、秋季不同喷播基质含水量下黑麦草水分利用效率(EWU)的日变化Figure 5 Diurnal variation of water use efficiency (EWU) of L. perenne under different spraying substrate water content in summer and autumn2.2.4 不同喷播基质含水量下黑麦草叶片气孔导度(Gs)、胞间CO2摩尔浓度(Ci)和气孔限制值(Ls)的日变化
夏、秋季黑麦草Gs对CRW具有明显的阈值响应(图6)，当CRW为70%~85%时，Gs呈现双峰曲线。当CRW=100%时，Gs为单峰曲线，峰值出现在12:00。当CRW为40%~55%时，全天Gs峰值出现在8:00，之后一直降低，维持在较低水平。Ci和Ls对CRW的阈值响应表现不同的变化规律(图7和图8)，上午和下午表现也不同。CRW为70%~100%时，Pn下降，Gs和Ci明显下降，Ls明显升高，表明Pn下降原因是气孔限制。CRW=55%时，上午Pn下降，Gs和Ci明显下降，Ls升高，但下午Pn下降，Gs和Ls下降，Ci反而升高，可见限制黑麦草Pn的原因上午和下午不同，上午以气孔限制为主，气孔关闭导致CO2供应不足，下午以非气孔限制为主，水分胁迫导致植物叶片光合结构受损，Pn下降。当CRW=40%时，Ci从8:00开始上升且一直处于较高水平，而Ls全天都较低，表明水分胁迫严重损坏了植物叶片光合结构，降低了光合作用有关酶的活性，从而降低了Pn。由图9可知：夏、秋季不同CRW范围内Pn和Gs的正比关系不同，当CRW＞55%时，随着Gs增大，Pn线性增大，Pn和Gs为线性正比关系；当CRW≤55%时，Pn和Gs为非线性关系。因此，当CRW=55%时，黑麦草不仅发生了Pn限制机制的转变，其Pn和Gs之间的关系也发生转变。综上所述，在CRW=55%时出现上午、下午Ci和Ls变化相反的情况，表明此基质含水量是黑麦草叶片Pn下降由气孔限制为主转变为非气孔限制为主的临界点。
图 6 夏、秋季不同喷播基质含水量下黑麦草气孔导度(Gs)的日变化Figure 6 Diurnal variation of stomatal conductance (Gs) of L. perenne under different water content of spraying substrate in summer and autumn
图 7 夏、秋季不同喷播基质含水量下黑麦草胞间CO2摩尔浓度(Ci)的日变化Figure 7 Diurnal variation of intercellular CO2 concentration (Ci) of L. perenne under different water content of spraying substrate in summer and autumn
图 8 夏、秋季不同喷播基质含水量下黑麦草气孔限制值(Ls)的日变化Figure 8 Diurnal variation of stomatal limit value (Ls) of L. perenne under different spraying substrate water content in summer and autumn
图 9 夏、秋季黑麦草净光合速率(Pn)和气孔导度(Gs)的关系Figure 9 Relationship between net photosynthetic rate (Pn) and stomatal conductance (Gs) of L. perenne in summer and autumn2.3 基于黑麦草光合特性的喷播基质含水量临界值分析
为进一步确定黑麦草喷播基质相对含水量(CRW)分级临界值，对黑麦草Pn、Tr、EWU和Gs的日均值与CRW构建回归模型(表3)。由Pn与CRW的回归模型知：夏、秋季Pn达最大值的CRW分别为78.17%、76.02%，其对应的最大Pn分别为9.68和 6.33 μmol·m−2·s−1。令Pn=0，求出夏、秋季水合补偿点的CRW分别为35.02%、30.83%(CRW大于100%的点均已舍去)。根据回归模型的积分式[2]求出CRW为40%~100%时黑麦草夏季Pn平均值为7.77 μmol·m−2·s−1，对应的CRW分别为58.98%和97.36%。同理可求出黑麦草秋季Pn平均值为5.29 μmol·m−2·s−1，对应的CRW分别为57.71%和94.33%。由此可以确定黑麦草夏、秋季Pn达到中等以上水平的CRW分别为58.98%~97.36%、57.71%~94.33%。
表 3 夏、秋季黑麦草光合参数与喷播基质相对含水量的回归模型Table 3 Regression model between photosynthetic parameters of L. perenne and relative water content of spraying substrate in summer and autumn参数 季节 回归模型 决定系数 F P Pn 夏季 y=−22.092 7+0.813 0x−0.005 2x2 0.88 78.98 9.12×10−11 秋季 y=−11.584 0+0.471 3x−0.003 1x2 0.81 45.60 1.49×10−8 Tr 夏季 y=−9.497 1+0.398 7x−0.002 5x2 0.94 595.83 0.000 秋季 y=−0.574 0+0.083 8x−0.000 5x2 0.83 39.08 5.74×10−8 EWU 夏季 y=−0.844 9+0.061 0x−0.000 4x2 0.80 31.05 3.93×10−7 秋季 y=−2.344 8+0.122 2x−0.000 83x2 0.76 35.29 1.37×10−7 Gs 夏季 y=−0.354 2+0.013 5x−0.000 086x2 0.78 39.97 4.73×10−8 秋季 y=−0.319 7+0.012 2x−0.000 077x2 0.83 53.94 3.30×10−9 说明：y表示各参数，x表示喷播基质相对含水量(CRW) 根据EWU与CRW的回归模型，求出夏、秋季EWU达最大值的CRW分别为76.25%、73.61%，对应的最大值分别为1.48和 2.15 μmol·mmol−1。令EWU＝0，求出夏、秋季的对应的CRW分别为15.41%、22.68%(CRW大于100%的点均已舍去)。根据回归模型的积分式求出CRW为40%~100%时黑麦草夏季EWU的平均值为1.35 μmol·mmol−1，对应的CRW分别为58.17%和94.33%。同理可求出黑麦草秋季EWU的平均值为1.89 μmol·mmol−1，对应的CRW分别为55.81%和91.42%。由此确定黑麦草夏、秋季EWU达到中等以上水平的CRW分别为58.17%~94.33%、55.81%~91.42%。
2.4 基于光合特性的黑麦草喷播基质适宜含水量阈值分级
将Pn和EWU取最大值点、平均值点、最低值点和Pn下降气孔限制转折点的喷播基质CRW临界值，作为黑麦草喷播基质适宜含水量阈值分级临界点，建立喷播基质适宜含水量的阈值分级(表4)。此分级标准将Pn和EWU作为“产”“效”来评价黑麦草生产力和水分利用能力的依据，建立了黑麦草喷播基质适宜含水量阈值分级。以Pn=0时的水合补偿点作为临界点，低于此临界点划为“无产无效水”范围。Pn下降原因由气孔限制为主转为非气孔限制为主对应的CRW称为“Pn气孔限制转折点”。Pn和EWU取最大值时的CRW确定为“高产高效水”临界值点。依据Pn、EWU与CRW的回归模型积分式求解二者的平均值来确定Pn和EWU达到中等以上水平的临界点，在此范围内称为“中产”“中效”，此范围外称为“低产”“低效”。为更清晰地展示5种阈值分级类型，借助坐标轴对其划分参数和数值进行展示(图10)。
表 4 基于光合特性的黑麦草喷播基质适宜含水量阈值分级Table 4 Threshold gradient of suitable water content of L. perenne spraying substrate based on photosynthetic characteristics季节 临界值指标 临界点对应的CRW/% 基质适宜含水量阈值分级类型 基质适宜含水量阈值/% 夏季 Pn=0 35.02 无产无效水 ＜35.02 Pn(sl→nsl) 55.00 低产低效水 35.02~55.00，97.36~100.00 Pn取平均值(Pn-ave) 58.98~97.36 中产中效水 78.17~97.36 Pn取最大值(Pn-max) 78.17 中产高效水 55.00~76.25 EWU取最大值(EWU-max) 76.25 高产高效水 76.25~78.17 EWU取平均值(EWU-ave) 58.17~94.33 秋季 Pn=0 30.83 无产无效水 ＜30.83 Pn(sl→nsl) 55.00 低产低效水 30.83~55.00，94.33~100.00 Pn取平均值(Pn-ave) 57.71~94.33 中产中效水 76.02~94.33 Pn取最大值(Pn-max) 76.02 中产高效水 55.00~73.61 EWU取最大值(EWU-max) 73.61 高产高效水 73.61~76.02 EWU取平均值(EWU-ave) 55.81~91.42 说明：Pn=0为水合补偿点，Pn(sl→nsl)为Pn气孔限制转折点 
图 10 夏、秋季黑麦草喷播基质适宜含水量阈值分级坐标轴图示Figure 10 Coordinate graphic figures of spraying substrate suitable water content threshold gradient of L. perenne in summer and autumn3. 讨论
夏、秋季黑麦草光合生理参数(Pn、Tr、EWU、Gs、Ci和Ls)日变化对喷播基质含水量的阈值响应规律与黄刺玫[5]、文冠果Xanthoceras sorbifolia[6]、连翘Forsythia suspensa[7]、山杏Prunus sibirica[8]、羊草Leymus chinensis和紫花苜蓿Medicago sativa[9]等对土壤水分阈值响应的规律一致，即CRW过高或过低均会抑制植物光合作用。CRW为70%~85%时，夏、秋季Pn、Tr日变化均呈现双峰曲线，在12:00表现出“光合午休”现象。主要原因是中午气温最高，高温影响植物光合酶的活性，降低Pn；空气相对湿度低，叶片表面饱和水汽压差增大，叶片气孔保卫细胞失水过多，导致部分气孔关闭，降低Tr和Pn[10]。CRW为100%时，夏、秋季Pn日变化均呈现单峰曲线，峰值出现在12:00，但Pn日均值并不高。表明水分充足可以延缓植物光合午休，但CRW过高，喷播基质孔隙较小，不利于根系呼吸，影响根系吸收营养元素，造成光合叶绿素含量降低，从而降低Pn[11]。CRW为100%时，夏、秋季Tr日变化的峰值延迟到14:00。已有研究表明：当水分充足时光照强度是影响Tr的主要因子，光合辐射可以促进叶片气孔开放，从而增强Tr[12-13]。CRW为40%~55%时，夏、秋季Pn和Tr均处于较低水平，原因是严重水分胁迫下植物为减少体内水分散失增加了气孔阻力[4]，导致Pn和Tr降低。研究表明：适度的干旱胁迫能有效提高植物的水分利用效率[14-15]，与本研究观点一致，即CRW为70%~85%时黑麦草EWU达最大值，并非在CRW最高的时候。秋季EWU显著高于夏季，主要原因是秋季Tr的降低幅度比Pn的降低幅度要更大，这与许多学者[16-18]的研究结果一致。
夏、秋季黑麦草Gs日变化与Pn的变化规律基本相似，但通过对Pn和Gs的关系拟合可知：Pn和Gs在CRW≤55%时两者为非线性关系，CRW＞55%时为线性正比关系，这与郎莹等[19]的研究结果一致。轻度水分胁迫下，叶片气孔部分关闭，Gs下降，进入叶片CO2减少，因此Ci降低，Ls升高，但是当CRW为55%时，下午时段Gs下降，Ci升高，表明水分胁迫可能破坏了叶片的光合结构，导致叶片吸收CO2、光合作用能力下降。这也进一步说明，在CRW为55%时，黑麦草Pn下降原因已经由气孔限制为主转变为非气孔限制为主。已有研究表明：当植物光合作用受到非气孔限制时，水分胁迫可能开始损坏光合结构[20-21]，叶绿体受损并且不可逆[22]，当CRW进一步降低，植物叶子变黄甚至脱落[21]。因此，CRW=55%被认为是黑麦草喷播基质适宜含水量阈值分级的临界点。
采用Pn和EWU作为土壤水分的“产”“效”指标可评价土壤水分有效性和适宜含水量范围[2-3, 5, 7, 23]，主要方法有3类：第1类为聚类分析法[4, 24]，即通过试验获取多个水分梯度下的Pn和EWU进行聚类分析，得到不同的水分分级临界点。由于获取的水分梯度随机性较大，该方法缺乏足够代表性。第2类为极限值法，即通过获取Pn和EWU与CRW的定量关系，找出Pn和EWU的最低值、最大值点和气孔限制转折点，以此来划分水分分级临界点。但此法并未对中等水平的“产”“效”进行划分[2，6]。第3类为回归方程拟合法，即通过建立植物Pn和EWU与CRW的回归模型，计算Pn的水合补偿点、Pn和EWU最低值点、最大值点和平均值点对应的土壤水分，并以此作为土壤水分有效性阈值分级临界点。该方法对土壤水分分级比较完整[2-3, 21]。本研究结合第2类和第3类方法，即采用回归方程拟合法计算临界值点再结合Pn气孔限制转折点来确定喷播基质适宜含水量阈值分级标准。在拟合时采用了Pn和EWU的日平均值与CRW，相比只测上午光合数据[2, 4, 6, 21]的研究更具有代表性。本研究确定的“无产无效水”“低产低效水”“中产中效水”“中产高效水”和“高产高效水”5种喷播基质适宜含水量阈值分级类型，可以根据不同的工程绿化养护要求和黑麦草不同生长阶段对水分的需求来选择利用。例如，在裸露边坡等困难立地最突出的特征是干旱和缺水，坡面工程绿化以防治水土流失和提高水分利用效率为目标，而不是充分供水达到最高产量 [24-25]。因此既满足边坡植被修复要求，又不因灌溉量过大而造成坡面水土流失、影响植物生长和浪费水资源等问题，可以保持喷播基质含水量在“中产高效水”(55.00%≤CRW≤76.25%和55.00%≤CRW≤73.61%)的范围，以此为标准进行灌溉。
4. 结论
夏、秋季黑麦草净光合速率水合补偿点的喷播基质相对含水量分别为35.02%和30.83%，即实际质量含水量分别为10.63%和9.36%，喷播基质含水量低于此值光合作用无效。夏、秋季黑麦草净光合速率下降由气孔限制转变为非气孔限制的喷播基质相对含水量均为55%，即实际质量含水量为16.70%，喷播基质含水量低于此值将对黑麦草叶片光合结构造成不可逆性损坏，建议灌溉养护时保持基质含水量不能低于此水分范围。客土喷播绿化以快速恢复植被为目标时可以保持喷播基质含水量在“高产高效水”范围，以此为标准进行灌溉，夏、秋季分别为76.25%≤CRW≤78.17%和73.61%≤CRW≤76.02%，即实际质量含水量分别为23.15%~23.73%和22.35%~23.08%。客土喷播绿化以提高水分利用效率并恢复基本植被(即恢复到当地自然植被盖度为准)为目标时，可以保持喷播基质含水量在“中产高效水”范围，以此为标准进行灌溉，夏、秋季分别为55.00%≤CRW≤76.25%和55.00%≤CRW≤73.61%，即实际质量含水量分别为16.70%~23.15%和16.70%~22.35%。
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图 2 不同转基因拟南芥株系中GFP-PABD融合基因的相对表达量
Figure 2 Relative expression level of the GFP-PABD fusion gene in transgenic A. thaliana lines
图 3 野生型拟南芥与3个PA荧光探针转基因株系的表型比较
Figure 3 Phenotypic comparison between wild type and three transgenic lines of A. thaliana bearing PA fluorescent probe
图 4 无外源PA处理下PA探针在野生型和2个转基因拟南芥株系根尖中荧光强度的差异分析
Figure 4 Analysis of discrepancy in fluorescent intensity of PA probe between wild type and two transgenic lines of A. thaliana
图 5 外源PA(2 μmol·L−1)处理下PA荧光探针对PA监测灵敏度的分析
Figure 5 Sensitivity analysis of PA fluorescent probe monitoring PA under treatment with 2 μmol·L−1 exogenous PA
图 6 外源PA (10 μmol·L−1)处理下PA荧光探针对PA监测灵敏度的分析
Figure 6 Sensitivity analysis of PA fluorescent probe monitoring PA under treatment with 10 μmol·L−1 exogenous PA
图 7 单独或混合盐碱胁迫下PA在转基因拟南芥根尖分生组织中的分布
Figure 7 Distribution of PA in the root tip meristem of a transgenic A. thaliana line bearing PA sensor under saline and alkaline stresses, alone or in combination
表 1 相关引物序列
Table 1. Sequence of related primers
用途 引物名称 引物序列(5′→3′) PABD基因合成 ZYP301 CCTGCTAATTTCAAGGCTAATTCATTGCTGTTCGCTCGAGATCTGAGTCCGGACTGCAGGTTGGATCCGGTACCGAGCT ZYP302 GAAGACGTGATAGGCTACATGTGAAGCTTAAATCCTTGAGGAATAAAATCCACAAACAACTTCACCCAAA ZYP303 TGCTTCCTGAACAATTGTCCATTCTAGATTCTGTCTTGTTGATATCAAGACCTGCTAATTTCAAGGCTAA ZYP304 GTACCCAAGCTTCACATGTAGCCTATCACGTCTTCTGCTTCCTGAACAATTGTCC ZYP305 CACAAACAACTTCACCCAAACTGTCGGTTCGATGACGCCACTAAGACTAGTTAAGGTACCGGCGTAATCATGGTC PABD基因克隆 ZYP308 TCCGGACTCAGATCTCGAGC ZYP309 AGCTATAGTTCTAGATCTAGATTAACTAGTCTTAGTGGCGTC GFP基因克隆 ZYP306 TATCGATGGCGCCAGCTGAGGATGGTGAGCAAGGGCGA ZYP307 AGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCCATCCGGACTCAGATCTCGAGC 转基因拟南芥鉴定 MSY01 TGGTGTTAGTTTCTAGTTTGTGCG MSY02 TCATCATGACAGATCTGCGC 表达量分析 ZYP389 GACCACTACCAGCAGAACACC ZYP390 CTTGTACAGCTCGTCCATGC 
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