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酸雨对生态系统的危害已成为举世瞩目的重大环境问题[1]，而中国成为继欧洲和北美之后的第三大酸雨区[2]。研究发现，酸雨是造成森林衰退的直接原因。酸雨能够抑制植物种子萌发与幼苗生长[3-5]。Park等[6]研究发现模拟酸雨对鼠耳芥Arabidopsis thaliana种子萌发与根芽生长具有显著的抑制作用； 水稻Oryza sativa，小麦Triticum aestivum和油菜Brassica chinensis var. oleifera等3种植物对酸雨胁迫强度与胁迫时间的耐受性存在显著差异[7-8]。Ahmed等[9]研究发现，赤桉Eucalyptus camaldulensis凋落物对黄豆树Albizia procera和银合欢Leucaena glauca种子萌发与幼苗生长均有抑制作用；罗侠等[10]研究认为，天山云杉Picea schrenkiana凋落物提取液对自身种子萌发和幼苗生长具有自毒作用，并且与提取液浓度呈正相关。有关酸雨和凋落物复合作用对种子萌发与幼苗生长影响的报道甚少。柳杉Cryptomeria fortunei为常绿针叶乔木，属国家一级保护树种，浙江省临安市天目山国家级自然保护区是世界上最大的柳杉种群聚集地，而临安市在2006年和2007年的酸雨发生率分别高达85%和95%[11-12]。自20世纪90年代初期以来，天目山的柳杉种群逐渐呈现出衰退的迹象。针对天目山柳杉林的研究主要集中在柳杉的病虫害防治[13-14]和蓄积量[15-16]等方面，尚缺乏酸雨与柳杉凋落物复合作用对柳杉天然更新影响方面的研究。因此，我们以柳杉为供试树种，模拟酸雨、柳杉凋落物水浸提液和pH 4.0酸雨浸提液对柳杉种子萌发和幼苗生长的影响，并采用气相色谱-质谱（GC-MS）技术分析鉴定了浸提液的化合物成分，为阐明天目山柳杉天然更新困难和退化原因提供理论依据。
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供试柳杉凋落物2011年10月采自天目山国家级自然保护区天然柳杉林，凋落物带回实验室自然风干后粉碎，备用。柳杉种子由天目山国家级自然保护区管理局提供，置于4 ℃冰箱中保存。
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根据浙江省临安市的酸雨监测分析资料及前人配置模拟酸雨的方法，用浓硫酸和浓硝酸按摩尔比4∶1配置母液，并用蒸馏水分别稀释成pH 3.0，pH 4.0和pH 5.6模拟酸雨溶液。
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准确称取柳杉凋落物干粉10 g 2份，置于三角瓶中，分别加入100 mL蒸馏水和pH 4.0模拟酸雨溶液，在25 ℃条件下浸提48 h，离心后过滤2次，得到100 g·L-1的浸提液，置于4 ℃冰箱中备用。试验前将母液分别配置成5 g·L-1和50 g·L-1的处理液，以蒸馏水作对照。
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取5 mL柳杉凋落物酸雨和水浸提液母液加入2 mL乙酸乙酯萃取，吸取1 μL萃取液进样，进行GC-MS分析。GC（7890A，Agilent Technologies Company）条件：色谱柱HP-5MS（30 m × 250 μm × 0.25 μm）；升温程序初始温度50 ℃，以20 ℃·min-1的速率升至180 ℃，保持2 min，再以10 ℃·min-1升到250 ℃，保持10 min；载气为氦气，进样口温度280 ℃。MS（5975C，Agilent Technologies Company）条件，电离方式EI；电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；四级杆温度150 ℃；传输线温度250 ℃；扫描质量范围28～450。通过NIST 2008谱图库兼顾色谱保留时间定性，采用峰面积表示物质含量。
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选取籽粒饱满、均匀一致的柳杉种子，用40 ℃的温水浸种24 h，再用质量浓度为10 g·L-1的高锰酸钾溶液消毒15 min后，用蒸馏水反复冲洗5~6次。取100粒均匀置于垫有2层滤纸的培养皿（直径15 cm，105 ℃条件下消毒2 h）中，并加入5 mL相应浸提液，对照加蒸馏水5 mL，设3次重复，置于事先用乙醇进行消毒处理的恒温培养箱中培养。培养条件：光照14 h（25 ℃）/黑暗10 h（20 ℃）；光强80 μmol·m-2·s-1；空气相对湿度为60%。处理组补充1 mL·d-1相应浓度浸提液，对照组补充1 mL·d-1蒸馏水。
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按照ISTA 1996《国际种子检验规程》（胚根突出种皮的长度为种子长度的一半即为发芽的种子），每天统计种子发芽数。第15天统计种子发芽势，第 24天统计种子发芽率。
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发芽实验结束后，采用刻度尺测量萌发后幼芽与幼根长度，随机测量10株·处理-1，取其平均值即为幼芽与幼根生长。随机选择10株幼苗，称鲜质量，设3次重复·处理-1。
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试验数据采用 SPSS 13.0软件最小显著差法（LSD）多重比较方法进行统计分析。发芽率和发芽势用以下公式计算：发芽率（PG）=终发芽种子数/供试种子总数×100%；发芽势（EG）=第15天发芽种子数/供试种子总数×100%。参照Williamson等[17]的化感效应指数（IR）进行化感效应分析。当T≥C时，IR=1-C/T；当T≤C时，IR=T/C-1，其中C为对照值，T为处理值。IR＞0为促进作用，IR＜0为抑制作用，绝对值大小和作用强度一致。
1.1. 供试材料
1.2. 研究方法
1.2.1. 酸雨溶液的制备
1.2.2. 柳杉凋落物浸提液的制备
1.2.3. 柳杉凋落物浸提液化学成分分析
1.2.4. 柳杉种子萌发与幼苗培养
1.3. 指标测定
1.3.1. 种子萌发的测定
1.3.2. 生长指标的测定
1.4. 数据统计分析
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通过GC-MS分析，在凋落物水浸提液和凋落物酸雨浸提液（pH 4.0）中均发现了醇类、酚类、烷烯类、酯类、酮类和醛类等化合物（图 1，表 1）。水浸提液中鉴定出42种化合物，其中醇类化合物19种，占总量的36.2%；酚类化合物5种，占总量的19.8%；烷烯类化合物共7种，占总量的15.7%；酯类化合物共3种，占总量的13.4%；酮类化合物5种，占总量的6.3%；醛类化合物3种，占总量的2.4%。酸雨浸提液中鉴定出48种化合物，其中新提取化合物包括4种酮类化合物和2个醇类，占了总量的2.6 %。凋落物酸雨浸提液的总离子流比凋落物水浸提液的强。
Figure 1. Total ion current of extract ingredients from litters of Cryptomeria fortunei
序号 t/min 化合物 分子式 相对含量% 水浸提液 酸浸提液 1 5.76 苯酚phenol C6H6O 2.74 1 0.11 2.68 ± 0.12 2 6.30 苯甲醇 benzyl alcohol C7H8O 2.21 ± 0.18 2.34 ± 0.16 3 6.65 2-壬烯-1-醇 2-nonyn-1-ol C9H16O 0.72 1 0.01 0.73 ± 0.07 4 6.79 愈创木酚guajol C7H8O2 2.57 ± 0.03 2.50 ± 0.34 5 7.48 香芹酮carvone C10Hl6O 1.55 ± 0.15 1.68 ± 0.09 6 7.56 脱氢芳樟醇hotrienol C10Hl6O 0.70 ± 0.08 0.76 ± 0.14 7 7.61 邻苯二酚 pyrocatechol C6H6O2 1.56 ± 0.06 1.13 ± 0.07 8 8.20 马鞭埽酮verbenone C10Hl4O 0.89 ± 0.04 0.92 ± 0.14 9 8.50 香茅酵 citronellal C10Hl8O 0.46 ± 0.05 0.50 ± 0.09 10 8.65 2-甲氧基-4-乙埽基苯酚4-vinylguaiacol C9H0O2 0.80 ± 0.06 0.91 ± 0.04 11 8.71 乙基梓檬醒ethyl citral C11H18O 0.50 ± 0.02 0.42 ± 0.02 12 8.87 1，8-松油二醇 terpin C10H20O2 0.48 ± 0.01 0.51 ± 0.21 13 9.07 薇埽乙二醇醚DHS activator C10H18O2 1.24 ± 0.11 1.15 ± 0.11 14 9.18 1,4-桉叶素 1，4-cineole C10H18O 2.66 ± 0.21 2.76 ± 0.27 15 9.27 顺式氧化胡薄荷酮cis-pulegone oxide C10Hl6O2 0.75 ± 0.03 0.79 ± 0.19 16 9.55 二氢香芹醇 dihydrocarveol C10H18O 0.90 ± 0.06 0.99 ± 0.14 17 9.60 4-松油醇 4-terpineol C10H18O 1.68 ± 0.12 1.72 ± 0.14 18 9.75 丙烯醇 allethrolone C9H12O2 - 0.41 ± 0.04 19 9.98 十二烷二酸 dodecanedioic acid C14H31N 1.17 ± 0.13 0.63 ± 0.32 20 10.08 异广藿香院isopatchoulane C15H26 0.59 ± 0.06 0.69 ± 0.07 21 10.57 环氧化马兜铃埽aristolene epoxide C15H24O 1.09 ± 0.11 0.99 ± 0.12 22 10.65 榄香醇elemol C15H26O - 0.41 % 0.09 23 11.26 二氢-α-紫罗兰酮 dihydro-α-ionone C13H22O 0.95 ± 0.03 1.11 ± 0.32 24 11.44 檀香醇santalol C15H24O 0.62 ± 0.02 0.46 ± 0.11 25 11.70 柠檬烯-6-醇特戍酸酷limonen-6-ol，pivalate C15H24O2 1.63 ± 0.11 1.49 ± 0.22 26 11.81 甲酸松油酷terpinyl formate C11H18O2 2.14 ± 0.13 1.91 ± 0.12 27 11.91 蓝桉醇globulol C15H26O 1.30 ± 0.14 0.90 ± 0.11 28 12.17 柏木埽醇cedrenol C15H24O 0.78 ± 0.02 - 29 12.29 长叶醒 longifolenaldehyde C15H24O 1.47 ± 0.13 1.37 ± 0.12 30 12.60 新郁金二酮 neocurdione C15H24O2 - 0.41 ± 0.03 31 12.84 落叶松醇larixol C20H34O2 6.48 ± 1.01 6.30 ± 1.08 32 12.99 3-(十二烯基）二氢-2,5-呋喃二酮 dodecenyl succinic anhydride C16H26O3 - 0.44 ± 0.03 33 13.15 异戊酸香叶酿geranyl isovalerate C15H26O2 1.28 ± 0.32 1.27 ± 0.25 34 13.25 表蓝桉醇epiglobulol C15H26O 1.19 ± 0.41 1.01 ± 0.75 35 13.39 二乙酸-2-甲基间苯二酚 2-methylresorcinol，diacetate C11H12O4 12.16 ± 1.56 12.00 ±1.63 36 13.58 1-胺甲基金刚院 1 -adamantanemethylamine C11H19N 9.92 ± 1.21 9.65 ± 1.12 37 13.71 β-按叶醇β-eudesmol C15H26O 6.95 ± 1.01 6.10 ± 1.04 38 13.78 喇叭埽醇 ledene alcohol C15H24O 1.78 ± 0.58 1.63 ± 0.73 39 13.84 柏木埽醇 8-cedren-13-ol C15H24O 1.46 ± 0.76 1.11 ± 0.65 40 14.10 愈创木烯guaiene C15H24 0.57 ± 0.45 0.54 ± 0.05 41 14.19 紫堇酮 corymbolone C15H24O2 - 0.40 ± 0.04 42 14.24 斯巴醇 spathulenol C15H24O 0.64 ± 0.09 0.62 ± 0.21 43 14.32 异长叶烯 isolongifolene C15H24 2.91 ± 0.81 2.80 ± 0.19 44 14.52 桉油烯醇spathulenol C15H24O 7.40 ± 0.79 7.94 ± 0.98 45 15.12 邻苯二甲酸二丁酯 dibutyl phthalate C16H22O4 10.51 ± 2.01 12.07 ±1.97 46 15.33 丁香烧 clovane C15H26 1.18 ± 0.61 0.98 ± 0.21 47 15.56 氧化石竹烯 epoxycaryophyllene C15H24O 0.47 ± 0.13 0.48 ± 0.18 48 15.70 水菖蒲酮shyobunone C15H24O - 0.50 ± 0.04 49 15.76 韦得醇widdrol C15H26O 0.94 ± 0.07 0.87 ± 0.05 说明：“-”表示未检测到物质。 Table 1. Chemical components of aquatic and acid extracts from litter of Cryptomeria fortunei
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酸雨、凋落物水浸提液和凋落物酸雨浸提液对柳杉种子萌发的影响具有明显差异（图 2）。pH 5.6和 pH 4.0酸雨对柳杉种子萌发无显著影响，pH 3.0酸雨处理显著降低柳杉种子发芽率（P＜0.05），与对照相比降低了6.9%；5 g·L-1凋落物水浸提液处理显著降低柳杉种子发芽率（P＜0.05），比对照降低了15.6%，且随着浸提液质量浓度的增大对柳杉种子发芽率的抑制作用加强；5 g·L-1酸雨浸提液处理极显著降低柳杉种子发芽率（P＜0.01），与对照相比降低了26.3%；pH 5.6酸雨处理对柳杉种子发芽势无显著影响，pH 4.0酸雨处理显著降低柳杉种子发芽势（P＜0.05），与对照相比降低了16.8%。5 g·L-1凋落物水浸提液和凋落物酸雨浸提液处理均显著降低柳杉种子发芽势（P＜0.05），分别比对照降低了17.8%和25.2%，且随着浸提液质量浓度的增大对柳杉种子发芽势的抑制作用加强。
Figure 2. Effects of different treatments on the seed germination of Cryptomeria fortunei
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pH 5.6和 pH 4.0酸雨处理对柳杉幼苗芽生长无显著影响，pH 3.0显著抑制柳杉幼苗芽生长（P＜0.05），与对照相比降低了10.2%（图 3）；5 g·L-1凋落物水浸提液处理显著抑制柳杉幼苗芽生长（P＜0.05），与对照相比降低了13.7%；5 g·L-1酸雨浸提液处理极显著抑制柳杉幼苗芽生长（P＜0.01），与对照相比降低了17.1%。pH 5.6酸雨处理对柳杉幼苗根生长影响不显著，pH 4.0和pH 3.0酸雨处理显著抑制柳杉幼苗根生长（P＜0.05），分别比对照降低了15.9%和18.8%。5 g·L-1凋落物水浸提液和凋落物酸雨浸提液处理均显著抑制柳杉幼苗根生长（P＜0.05），分别比对照降低了22.7%和31.9%，并且随着浸提液质量浓度的增大对柳杉芽和根生长的抑制作用加强。
Figure 3. Effects of different treatments on seeding growth of Cryptomeria fortunei
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酸雨、凋落物水浸提液和凋落物酸雨浸提液均显著降低柳杉幼苗生物量（图 4）。pH 5.6酸雨处理显著降低柳杉幼苗生物量（P＜0.05），与对照相比降低了9.0%，且随着pH值的降低抑制强度增大；5 g·L-1凋落物水浸提液和凋落物酸雨浸提液处理均极显著降低柳杉幼苗生物量（P＜0.01），分别比对照降低了27.4%和37.8%，且随着浸提液质量浓度的增大对柳杉幼苗生物量的抑制作用加强。酸雨处理对柳杉幼苗的根芽比无显著影响。50 g·L-1凋落物水浸提液和凋落物酸雨浸提液处理均显著抑制柳杉幼苗根芽比（P＜0.05），分别比对照减少了0.14和0.23，且随着浸提液质量浓度增大对柳杉根芽比的抑制作用加强。
Figure 4. Effects of different treatments on biomass of Cryptomeria fortunei
2.1. 柳杉凋落物浸提液的成分及含量分析
2.2. 不同处理对柳杉种子萌发的影响
2.3. 不同处理对柳杉幼苗生长的影响
2.4. 不同处理对柳杉幼苗生物量的影响
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发芽率是反映种子质量优劣的重要指标，而发芽势反映了种子的活力状况。这2个指标是反映环境胁迫对植物种子萌发影响程度的重要指标，而生长指标可以更直观地显示植物幼苗受环境胁迫的程度。大量研究[18-21]表明：酸雨和化感作用对植物种子萌发过程、幼苗和根系的生长发育有抑制作用。本研究结果表明：酸雨和凋落物水浸提液处理使柳杉种子发芽率和发芽势降低，这可能是由于酸雨制约种子储藏物质分解、运输及细胞增殖和新器官的构建[22-24]，而柳杉凋落物中的酚酸等化感物质抑制了种子萌发时所需的关键酶类[25-26]。酸雨和凋落物水浸提液处理使柳杉幼苗根生长和芽生长均受到不同程度的抑制作用，降低了柳杉幼苗生物量和根芽比。这可能是由于酸和化感物质抑制种子保护酶的活性，破坏了细胞的正常结构，造成细胞代谢异常，影响了胚的正常发育，加剧植物细胞的质膜过氧化[27-28]。酸雨和凋落物复合作用对柳杉种子发芽率和发芽势以及芽生长、根生长、根芽比和幼苗生物量的抑制效果比酸雨和凋落物水浸提液增强，其原因可能是酸雨增强了凋落物次生代谢物质的释放[29]，从而使凋落物化感物质的种类和数量增多。
本研究表明：柳杉凋落物水浸提液和酸雨浸提液的主要化学物质为醇类、酚类、烷烯类、酯类、酮类和醛类等化合物，凋落物酸雨浸提液中鉴定出的新提取化感物质包括4种酮类化合物和2个醇类，占了总量的2.6%，与其他植物的化感物质相类似[30]，高质量浓度时不仅降低受试植物种子的发芽率和发芽势，同时还减少幼苗根生长和芽生长，降低植物幼苗的生物量。大多数化感物质具有广谱性作用机制，能够影响生物的许多生理生化过程，柳杉凋落物水浸提液中以二乙酸-2-甲基间苯二酚含量最高，酸雨浸提液中以邻苯二甲酸二丁酯含量最高，很可能是影响柳杉凋落物自毒作用的主要化感物质。
综上所述，本研究证实：酸雨增强了柳杉凋落物浸提液的化感强度，加强了柳杉凋落物的自毒作用，凋落物酸雨浸提液化感物质种类和含量的增加也证明了这点。此外，本研究通过GC-MS分析，进一步检测出更多的柳杉凋落物化感物质成分，对柳杉凋落物自毒作用产生的影响在整个柳杉天然更新中所占的比例究竟有多大有了更明确的估计，为酸雨干扰下柳杉凋落物对柳杉天然更新影响机制提供依据。
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