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凋落物是森林生态系统内由生物组分产生并归还到林地表面的所有有机物质的总称[1]，也是种子落地后最先接触到的物理环境，对种子萌发、幼苗存活和生长等天然更新关键环节具有重要作用[2-4]。凋落物的存在会改变种子萌发和生长的微环境，同时其物理阻隔作用也对天然更新产生一定障碍[5-6]，并且这种作用因凋落物类型、厚度和覆盖方式的不同而对幼苗出土及早期生长产生不同程度的影响[4, 6-8]。
水杉Metasequoia glyptostroboides为中国特有的杉科Taxodiaceae水杉属Metasequoia孑遗植物，属国家Ⅰ级保护树种，有植物界“活化石”之称。现仅存原生母树5 696株，集中分布于湖北利川、湖南龙山和重庆石柱之间狭窄的三角区域内，林下鲜见其天然更新的幼苗及幼树，天然更新困难[9-10]。天然更新是指植物从其种子成熟、萌发、生长到幼苗建成的连续过程[11]。它不仅是种群得以繁衍和恢复的重要方式[12]，也是维持天然林动态稳定和可持续发展的基础[13]。有许多研究已对水杉天然更新障碍因素及机制进行了探讨，但主要集中在生物学特性[14]、遗传、种群结构[15, 10]、人为干扰[10]等方面。徐来仙等[8]研究发现：凋落物对水杉自身种子萌发和生长具有化感抑制作用，且不同类型凋落物的化感作用存在差异，而关于凋落物对水杉更新幼苗出土和生长的影响还未见报道。基于野外调查发现水杉母树林内有大量凋落物，凋落物质量一般达145.60~9 775.36 g·m−2，而水杉种子极小极轻(千粒重为2.57 g)[8]，因此提出假设：水杉凋落物对水杉幼苗出土及早期生长是否具有物理阻隔作用？其影响程度是否与凋落物类型、覆盖方式及质量的多少紧密相关？鉴于此，本研究模拟种子成熟脱落后位于凋落物下方和上方的情况，通过野外模拟试验，采用不同类型、不同质量凋落物对种子进行覆盖或铺垫，探讨凋落物物理阻隔对水杉幼苗出土和早期生长的影响，旨在为解除水杉种群天然更新障碍提供科学依据。
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为保证凋落物收集具有代表性，在湖北省利川市林业科学研究所水杉母树林内按东南西北中5个方向分30个区域随机布设凋落物收集框。于2020年10月末收集水杉母树上自然脱落的当季凋落物为新鲜凋落物[即尚未进入分解过程的混合物，其中各组成部分依据凋落物实际组成设定比例，为m(叶)∶m(枝)∶m(果皮等)=11.0∶8.0∶1.0]；2020年11月末收集水杉母树林内地表的凋落物为自然凋落物[包括各分解层的枝叶果皮等混合物，其中各分解层同样依据凋落物实际组成设定比例，为m(未分解层)∶m(半分解层)∶m(全分解层)=1.2∶1.2∶1.0]。考虑到烘干可能会改变凋落物的化学成分，因此采集的凋落物置于室温风干后储藏于信封备用。
水杉种子为2020年11月从水杉原生母树1076号(树龄118 a，树高31 m，胸径87.6 cm，生长地理位置为30°07′21″N，108°35′45″E，海拔为1 114 m)采集。种子含水量为(9.78±1.13)%，千粒重为(2.57±0.17) g，储藏于4 ℃冰箱备用。
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采用野外大田模拟试验，选取凋落物类型、凋落物覆盖方式、凋落物质量为控制因子，其中凋落物类型包括2种：新鲜凋落物和自然凋落物；覆盖方式设置2个水平：种子下层铺垫凋落物(即种子播种在凋落物上方，简称上方)、种子上层覆盖凋落物(即种子播种在凋落物下方，简称下方)；凋落物质量设置6个梯度：0 (对照)、100、300、500、700、900 g·m−2。
于2021年4月初在湖北省利川市林业科学研究所基地(30°16′01″N，108°57′12″E)开展试验，试验地海拔为1 112.5 m，土壤为山地黄壤。播种前将试验田除草、整地、杀菌，起垄(宽100 cm)，留沟(宽30 cm)，将垄面划分成1 m×1 m的小样块。按试验设计将种子和凋落物均匀撒播，播种密度为300粒·m−2，每个处理3个重复，采用称量法控制各个处理的凋落物质量。吴漫玲[16]研究发现：3针遮阳网(遮光率为62.21%)更适于水杉幼苗早期生长，故本研究在3针遮阳网条件下进行。播种完成后，浇水使土壤湿透，每隔30 d记录幼苗出土和存活的数量(种子上层覆盖凋落物时以子叶穿过凋落物为出苗成功[17])，且在小样块内随机抽取10株幼苗并挂牌测量苗高。水杉幼苗经历150 d (1个生长季)后收苗，量取苗高、地径、主根长度和叶片数，并采用扫描仪结合Image J软件测量叶面积，随后将幼苗从基部分成地上和地下2个部分，分别置于信封中在80 ℃下烘干至恒量(48 h)，用天平称取幼苗生物量。根据种子萌发和存活计算出苗率、存活率。出苗率=(穿过凋落物表面的幼苗数/播种种子总数)×100%[18]；存活率=(试验结束后存活的幼苗数/播种种子总数)×100%[18]。
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利用SPSS对各指标进行凋落物类型、覆盖方式、质量的多因素方差分析和单因素方差分析，采用Duncan法判断差异显著性(P=0.05)。采用Origin绘图。
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由表1可知：水杉种子出苗率和幼苗存活率均在不同质量新鲜和自然凋落物的2种覆盖方式间存在极显著差异(P＜0.01)，对照达最高值。由图1可知：处理为上方时，随着新鲜和自然凋落物质量的增加，出苗率和存活率随之降低；当凋落物质量高于100 g·m−2时，出苗率和存活率都显著小于对照 (P＜0.05)。处理为下方时，不同凋落物类型则表现出一定差异：新鲜凋落物处理后随着凋落物质量增加，出苗率和存活率呈先上升后下降的变化趋势，且各处理均显著低于对照(P＜0.05)，在凋落物质量为300 g·m−2时达到第2个峰值；自然凋落物处理后，凋落物质量越大，出苗率和存活率越低，且凋落物质量为300~900 g·m−2时显著低于对照 (P＜0.05)。
表 1 凋落物类型、质量、覆盖方式对水杉幼苗早期生长的单因素方差分析
Table 1. One-way ANOVA of of litter type, mass and mulching method on early growth of M. glyptostroboides seedlings
影响因子 出苗率 存活率 苗高 地径 根长 叶片数 叶面积 地上生物量 地下生物量 上方新鲜凋落物质量 0.000** 0.000** 0.003** 0.002** 0.002** 0.031* 0.004** 0.012* 0.001** 上方自然凋落物质量 0.000** 0.000** 0.517 0.280 0.001** 0.086 0.007** 0.005** 0.000** 下方新鲜凋落物质量 0.000** 0.000** 0.001** 0.020* 0.017* 0.019* 0.504 0.008** 0.002** 下方自然凋落物质量 0.004** 0.009** 0.005** 0.002** 0.017* 0.069 0.199 0.019* 0.000** 说明：数据为检验性P值。*表示差异显著(P＜0.05)，**表示差异极显著(P＜0.01) 
图 1 凋落物类型、质量、覆盖方式对水杉种子出苗率和幼苗存活率的影响
Figure 1. Effect of litter type, mass and mulching method on seed emergence rate and survival rate of M. glyptostroboides seedling
多因素方差分析结果(表2)显示：只有凋落物覆盖方式与凋落物质量的交互作用对水杉种子出苗率和幼苗存活率有极显著影响(P＜0.01)。当凋落物质量高于100 g·m−2时，水杉种子出苗率和幼苗存活率均表现为下方处理高于上方处理。2种凋落物覆盖方式均在凋落物质量为500~900 g·m−2呈现出：新鲜凋落物处理比自然凋落物处理的种子出苗率和幼苗存活率低。总的来说，凋落物的存在降低了水杉种子出苗率和幼苗存活率，尤其是当凋落物质量大于100 g·m−2时，明显阻碍幼苗出土和存活。
表 2 凋落物类型、质量、覆盖方式对水杉幼苗早期生长的多因素方差分析
Table 2. Multivariate analysis of variance of litter type, mass and mulching method on early growth of M. glyptostroboides seedlings
因子间交互作用 出苗率 存活率 苗高 地径 根长 叶片数 叶面积 地上生物量 地下生物量 凋落物质量×覆盖方式 0.000** 0.000** 0.528 0.233 0.158 0.965 0.676 0.812 0.995 凋落物质量×凋落物类型 0.140 0.258 0.090 0.069 0.367 0.224 0.275 0.265 0.955 凋落物类型×覆盖方式 0.052 0.101 0.441 0.985 0.002** 0.017* 0.049* 0.001** 0.008** 凋落物质量×覆盖方式×凋落物类型 0.652 0.423 0.281 0.507 0.260 0.143 0.396 0.035* 0.023* 说明：数据为检验性P值。*表示差异显著(P＜0.05)，**表示差异极显著(P＜0.01) -
由表1可知：水杉幼苗苗高、地径、根长在不同质量新鲜和自然凋落物的2种覆盖方式间呈现出一定差异。在上方处理后，不同质量自然凋落物对水杉幼苗根长有极显著影响(P＜0.01)，对幼苗苗高和地径无显著影响(P＞0.05)，而不同质量新鲜凋落物对水杉幼苗苗高、地径和根长有极显著影响(P＜0.01)；在下方处理后，不同质量新鲜凋落物对水杉幼苗苗高有极显著影响(P＜0.01)，对地径和根长有显著影响(P＜0.05)，而不同质量自然凋落物对水杉幼苗苗高和地径有极显著影响(P＜0.01)，对根长有显著影响(P＜0.05)。由图2可知：上方处理时，水杉幼苗苗高随着不同质量新鲜和自然凋落物增加呈先上升后下降的趋势，且均在凋落物质量为300 g·m−2时达峰值，但300 g·m−2处理与对照差异不显著(P＞0.05)。下方处理时，新鲜和自然凋落物处理后的水杉幼苗苗高均在凋落物质量为300 g·m−2时达最高值，比对照分别增加了6.69%、15.25%；当凋落物质量超过100 g·m−2时，凋落物质量越大，幼苗苗高越小。在上方处理时，随新鲜凋落物质量的增加，水杉幼苗地径先在凋落物质量为100~300 g·m−2时逐渐上升，随后在凋落物质量为500~900 g·m−2时逐渐下降；当自然凋落物质量大于100 g·m−2时，水杉幼苗地径随凋落物质量增加而逐渐下降。在下方处理时，不同质量新鲜和自然凋落物对水杉幼苗地径生长表现出相同的变化规律，同时，当凋落物质量超过500 g·m−2时，地径显著低于对照(P＜0.05)。不同质量新鲜和自然凋落物处理后的水杉幼苗根长与苗高和地径变化规律有一定差异，在下方处理时，幼苗根长均在对照达到最大值(14.11 mm)，且随着新鲜和自然凋落物质量的增加而降低；在上方处理时，不同质量新鲜凋落物处理后，幼苗根长在凋落物质量为100 g·m−2时达最高值，比对照高了7.51%，但在凋落物质量为700、900 g·m−2时显著小于对照(P＜0.05)；自然凋落物处理后，幼苗根长均显著小于对照(P＜0.05)，且凋落物质量越高，幼苗根长越短。
图 2 凋落物类型、质量、覆盖方式对水杉幼苗苗高、地径和根长的影响
Figure 2. Effect of litter type, mass and mulching method on seedling height, base diameter and root length of M. glyptostroboides seedlings
多因素分析结果(表2)显示：凋落物类型、凋落物质量和覆盖方式对幼苗苗高和地径的交互作用均不显著(P＞0.05)。同一凋落物质量下，水杉幼苗苗高和地径呈现相似规律，即上方处理＜下方处理；在凋落物质量为500~900 g·m−2时，水杉幼苗苗高和地径为自然凋落物处理＞新鲜凋落物处理。只有凋落物覆盖方式和凋落物类型对幼苗根长有极显著交互作用(P＜0.01)。当凋落物质量为300~900 g·m−2时，各处理的幼苗根长均小于对照，且上方处理小于下方处理；除新鲜和自然凋落物质量为100、300 g·m−2外，其余处理的幼苗根长表现为新鲜凋落物小于自然凋落物。综合来看，凋落物质量为300 g·m−2时促进幼苗苗高和地径生长，但未达显著水平(P＞0.05)；凋落物质量高于300 g·m−2时，明显抑制幼苗生长。同时，凋落物质量越大，幼苗根长越短。
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由表1可知：在上方处理时，不同质量新鲜凋落物对水杉幼苗叶片数有显著影响(P＜0.05)，对幼苗叶面积有极显著影响(P＜0.01)，不同质量自然凋落物对水杉幼苗叶片数无显著影响(P＞0.05)，但对幼苗叶面积影响极显著(P＜0.01)；在下方处理时，不同质量新鲜凋落物对水杉幼苗叶片数有显著影响(P＜0.05)，但对叶面积无显著影响(P＞0.05)，不同质量自然凋落物对水杉幼苗叶片数和叶面积均无显著影响(P＞0.05)。由图3可知：在上方处理时，自然凋落物质量越高，幼苗叶片数越少，所有处理显著小于对照(P＜0.05)；不同质量新鲜凋落物处理后，幼苗叶片数在凋落物质量为300 g·m−2时最高，但与对照差异不显著(P＞0.05)，对照的幼苗叶片数显著比凋落物质量为700、900 g·m−2处理的增加了31.42%、56.73%(P＜0.05)。在下方处理时，随着新鲜和自然凋落物质量增加，幼苗叶片数逐渐减少，且幼苗叶片数在凋落物质量为900 g·m−2时比对照显著减少了29.67%、22.50%(P＜0.05)。
图 3 凋落物类型、质量、覆盖方式对水杉幼苗叶片数和叶面积的影响
Figure 3. Effect of litter type, mass and mulching method on leaf number and leaf area of M. glyptostroboides seedlings
在上方处理时，经新鲜凋落物处理后，幼苗叶面积在凋落物质量为300 g·m−2时达最高，比对照处理增加了3.30%；当凋落物质量高于300 g·m−2时，各处理幼苗叶面积均小于对照，且凋落物质量越大，幼苗叶面积越小；而不同质量自然凋落物处理后，幼苗叶面积随凋落物质量增加而逐渐减小，且对照处理显著比凋落物质量为900 g·m−2时高了83.37%(P＜0.0.5)。在下方处理时，新鲜凋落物质量越大，幼苗叶面积越小，但均与对照差异不显著(P＞0.05)；随着自然凋落物质量的增加，幼苗叶面积表现为增加—下降—增加—再逐渐下降的变化。
只有凋落物覆盖方式和凋落物类型在水杉幼苗叶片数和叶面积上存在显著交互作用(表2，P＜0.05)。同一凋落物质量下(＞300 g·m−2)，水杉幼苗叶片数和叶面积均小于对照，且新鲜凋落物处理小于自然凋落物处理，上方处理小于下方处理。总之，与对照相比，水杉幼苗叶片数和叶面积在“上方+新鲜凋落物+100、300 g·m−2”处理和“下方+自然凋落物+100、300 g·m−2”处理时不显著增加(P＞0.05)，其余处理均抑制了幼苗叶片数和叶面积。当凋落物质量高于300 g·m−2时，水杉幼苗叶片数和叶面积随凋落物质量的增加而减少。
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由表1可知：2种凋落物覆盖方式下，不同质量新鲜和自然凋落物对水杉幼苗地上生物量有显著影响(P＜0.05)，而对幼苗地下生物量表现为极显著影响(P＜0.01)。由图4可知：在上方处理时，幼苗地上生物量随着新鲜凋落物质量增加表现为在100、300 g·m−2时先上升，高于300 g·m−2后逐渐下降，且凋落物质量为300 g·m−2时，幼苗地上生物量比对照高了24.75%(P＞0.05)；经不同质量自然凋落物处理后，幼苗地上生物量均显著低于对照(P＜0.05)，且随凋落物质量增加而减少。在下方处理时，新鲜凋落物处理后，幼苗地上生物量均小于对照，且在凋落物质量高于300 g·m−2时达到显著水平；不同质量自然凋落物处理后，幼苗地上生物量的变化规律与上方处理时的新鲜凋落物相同。
图 4 凋落物类型、质量、覆盖方式对水杉幼苗地上和地下生物量的影响
Figure 4. Effect of litter type, mass and mulching method on aboveground biomass and belowground biomass of M. glyptostroboides seedlings
在上方处理时，不同质量新鲜凋落物处理后的幼苗地下生物量均小于对照，且对照处理的幼苗地下生物量是凋落物质量为500、700、900 g·m−2时的1.94、2.19、2.76倍；与对照相比，自然凋落物均显著抑制幼苗地下生物量累积(P＜0.05)，且凋落物质量越大，地下生物量越低。在下方处理时，新鲜和自然凋落物不同程度地抑制幼苗地下生物量，当凋落物质量高于300 g·m−2时抑制作用达到显著水平(P＜0.05)。
如表2所示：不同凋落物覆盖方式和凋落物类型对水杉幼苗地上和地下生物量有极显著的交互作用(P＜0.01)，凋落物质量、覆盖方式和类型对幼苗地上和地下生物量有显著的交互作用(P＜0.05)。同一凋落物质量下，除凋落物质量为100、300 g·m−2外，幼苗地上生物量和地下生物量均表现为上方处理小于下方处理，新鲜凋落物处理小于自然凋落物处理。总之，当凋落物质量高于300 g·m−2时，凋落物对水杉幼苗地上和地下生物量均起显著的抑制作用(P＜0.05)。
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种子萌发和幼苗生长是植物天然更新中最脆弱、最敏感和最关键的阶段，凋落物对其有重要影响。不同质量水杉母树凋落物均降低了水杉种子出苗率和幼苗存活率，当凋落物质量高于100 g·m−2时阻碍作用达显著水平(P＜0.05)。除种子上层覆盖300 g·m−2新鲜凋落物稍有波动外，其余处理的水杉种子出苗率和幼苗存活率均随着凋落物质量增加而逐渐降低，这与李根柱等[19]、RUPRECHT等[20]的研究结果一致。凋落物的存在会降低气温日较差，减少水分，且随着凋落物质量的增加，种子发生霉变和虫蛀等概率也逐渐增大。同时，凋落物的消光作用使幼苗的光合作用无法与呼吸作用的需求相匹配[21]，从而对幼苗生长造成一定的损伤。本研究结果中水杉凋落物阻碍了水杉幼苗的出土和存活，故建议在种子萌发阶段适当清除林下地表凋落物，为种子接触土壤创造条件，以促进种子出苗率。
植物幼苗形态生长具有一定的可塑性，可以根据环境变化而改变自身生长，凋落物对其起到关键作用。随凋落物质量的增加，水杉幼苗苗高、地径、叶片数、叶面积和地上生物量表现为先上升后下降。这与赵冲等[22]对杉木Cunninghamia lanceolata幼苗生长的研究结果一致，也与杉木幼苗生物量随着凋落物厚度的增加呈先增加后减少的规律相同[4]。浅层凋落物对幼苗生长可能表现无影响甚至会有促进现象，但随着凋落物、物种以及微生境不同而存在差异[20, 23]。适量凋落物铺垫或覆盖激活植物体内产生抗逆蛋白[8]，故分配更多能量来促进幼苗建成[24]，同时适量凋落物覆盖也能减少土壤水分及温度的急剧变化，为幼苗快速生长提供良好的微环境[25]，因此凋落物质量为300 g·m−2时，凋落物对水杉幼苗生长起到促进作用(P＞0.05)。所以，在幼苗生长阶段，建议避免过多干扰而伤害幼苗，可以保留少量凋落物促进幼苗快速生长。然而，大量凋落物可能超过植物自身的调节阈值，导致凋落物质量超过300 g·m−2时，水杉幼苗生长明显受阻。此外，凋落物质量越大，幼苗根长越短。这与徐来仙等[8]的研究结论一致，凋落物的存在使植物能量物质分配时选择以减少根长来促进苗高[26]。
本研究表明：同一凋落物质量(＞300 g·m−2)下，自然和新鲜凋落物类型处理后的水杉幼苗各指标均小于对照，其中自然凋落物类型在水杉种子出苗率、存活率、苗高、地径、根长、叶片数、叶面积、地上和地下生物量均高于新鲜凋落物类型，进一步证实了新鲜水杉母树凋落物对水杉种子萌发和生长的抑制作用大于自然凋落物[8]。可能因为不同分解阶段的2种水杉凋落物类型拥有不同的化感物质，其中水杉新鲜凋落物中化感自毒物质数量和种类比自然凋落物多，加之自然凋落物包括经过分解的混合物，受到土壤中微生物影响较大[27]，导致自然凋落物对水杉种子萌发和生长的抑制小于新鲜凋落物。
同一凋落物质量下(＞300 g·m−2)，不同凋落物覆盖方式对水杉幼苗出土和早期生长的影响表现为：水杉种子出苗率、存活率、苗高、地径、根长、叶片数、叶面积、地上和地下生物量从大到小依次为对照、下方、上方。这与ELLWORTH等[26]发现上方处理的南蛇藤Celastrus orbiculatus种子出苗率和存活率低于下方的结论相同，也与朱静等[28]发现上方处理对格氏栲Castanopsis kawakamii种子萌发和胚根生长的抑制强于下方处理的结果一致，同样与王大洋等[18]发现杉木种子着生在凋落物表层比种子着生在凋落物下方的杉木幼苗生物量低的结果相似。种子在凋落物下方时，种子与土壤密切接触，有利于种子吸收养分和水分，加之适量凋落物覆盖保持了种子萌发所需的土壤温度和湿度，降低了土壤水分蒸发速度，而上方处理的种子则出现吸水缓慢，甚至接触不到土壤，种子水分蒸发快，从而导致种子出苗和幼苗生长时受到更明显的抑制。相对于上方处理而言，下方处理有利于种子出苗和幼苗快速生长[28-29]。
然而，在凋落物质量为100、300 g·m−2处理时，凋落物类型和覆盖方式的变化规律存在一定波动，可能因为在田间1 m×1 m的样框里，300 g·m−2的凋落物质量太少，导致凋落物覆盖方式对幼苗的影响不突出。此外，造成天然更新困难的原因是多重、复杂的，如何有效促进水杉天然更新还需进一步综合研究。
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水杉母树凋落物类型、覆盖方式和质量均对水杉幼苗出土和早期生长产生一定的物理阻隔作用。凋落物质量是阻碍水杉幼苗出土和早期生长的主要影响因子，新鲜凋落物阻隔作用大于自然凋落物，且种子下层铺垫凋落物比上层覆盖凋落物更加阻碍幼苗出土和生长。水杉林下大量凋落物所形成的物理阻隔是导致林下幼苗天然更新困难的重要原因之一。建议在种子雨高峰期前，对不同类型的水杉凋落物进行及时清除，保证种子与土壤接触，获得较高的种子出苗率；同时，在幼苗生长阶段清理部分凋落物时避免过多干扰幼苗，为幼苗生长提供适宜环境，促进水杉天然更新。
Effect of litter physical barrier on emergence and early growth of Metasequoia glyptostroboides seedlings
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摘要:
目的 探讨水杉Metasequoia glyptostroboides母树凋落物物理阻隔对水杉天然更新的影响，为解除水杉天然更新障碍及保护水杉种群提供科学依据。 方法 通过野外模拟试验，对不同类型凋落物(新鲜凋落物和自然凋落物)采用0(对照)、100、300、500、700、900 g·m−2的质量梯度，分别在种子下层和上层覆盖凋落物来探究凋落物对水杉幼苗出土及早期生长的影响。 结果 ①凋落物对水杉种子出苗率和幼苗存活率产生抑制作用，在凋落物质量为300~900 g·m−2时抑制作用显著增强(P＜0.05)。②除在种子下层铺垫自然凋落物外，其余处理在凋落物质量为300 g·m−2时促进水杉幼苗苗高和地径生长，但与对照差异不显著(P＞0.05)；当凋落物质量高于300 g·m−2时，全部处理均抑制幼苗生长。随着凋落物质量的增加，对水杉幼苗根长的抑制作用逐渐增强。③随凋落物质量增加，水杉幼苗地上生物量和地下生物量呈先上升后下降的变化趋势，只有在种子下层铺垫300 g·m−2的自然凋落物处理后有一定波动，其余各处理均抑制幼苗地下生物量累积；当凋落物质量达500 g·m−2以上时，凋落物显著阻碍幼苗地上和地下生物量的累积(P＜0.05)。④同一凋落物质量下(＞300 g·m−2)，新鲜凋落物对水杉幼苗出土和早期生长的抑制作用大于自然凋落物，种子下层铺垫凋落物比种子上层覆盖凋落物的抑制作用更强。 结论 水杉母树凋落物对水杉幼苗出土和早期生长具有明显的物理阻隔作用，进而影响水杉更新生长。因此，建议在种子雨高峰期前，对水杉林下不同类型的凋落物进行及时清理，以促进水杉天然更新。图4表2参29 Abstract:Objective This study aims to explore the effect of physical barrier of litter from Metasequoia glyptostroboides mother tree on its natural regeneration, so as to provide scientific basis for removing obstacles of M. glyptostroboides natural regeneration and protecting its population. Method Through field simulation experiments, different types of litter (fresh litter and natural litter) with different mass gradients (0, 100, 300, 500, 700 and 900 g·m−2) were used to investigate the effect of litter on emergence and early growth of M. glyptostroboides seedlings by spreading litter on the lower layer of seeds and covering litter on the upper layer of seeds. Result (1) Litter inhibited the seed emergence rate and seedling survival rate of M. glyptostroboides, and the inhibitory effect was significantly enhanced when the litter mass was 300−900 g·m−2 (P＜0.05). (2) Except for spreading natural litter on the lower layer of seeds, the other treatments promoted the growth of seedling height and ground diameter M. glyptostroboides seedlings when the litter mass was 300 g·m−2 (P＞0.05), but the difference with the control was not significant. When the litter mass was higher than 300 g·m−2, all treatments inhibited seedling growth. With the increase of litter mass, the inhibitory effect on the root length of M. glyptostroboides seedlings enhanced gradually. (3) With the increase of litter mass, the aboveground biomass and underground biomass of M. glyptostroboides seedlings first increased and then decreased. There was a certain fluctuation only after 300 g·m−2 natural litter treatment on the low layer of seeds, and the other treatments inhibited the underground biomass accumulation of seedlings. The accumulation of aboveground and underground biomass of seedlings was significantly hindered when the litter mass was above 500 g·m−2 (P＜0.05). (4) Under the same litter mass (＞300 g·m−2), the inhibitory effect of fresh litter on the emergence and early growth of M. glyptostroboides seedling was greater than that of natural litter, and the inhibitory effect of litter on the lower layer of seeds was stronger than that on the upper layer of seeds. Conclusion The litter of M. glyptostroboides mother tree has an obvious physical barrier effect on the emergence and early growth of M. glyptostroboides seedlings, which affects the natural regeneration of M. glyptostroboides. Therefore, it is suggested to treat the litter of different types under M. glyptostroboides forests in time before the peak of seed rain, so as to promote the natural regeneration of M. glyptostroboides. [Ch, 4 fig. 2 tab. 29 ref.] -
Key words:
- natural regeneration /
- Metasequoia glyptostroboides /
- physical barrier /
- biomass /
- litter /
- seedling growth
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换锦花Lycoris sprengeri为石蒜属Lycoris球根花卉，春初出叶，叶片为带状，宽约1.0 cm，长约30.0 cm，叶顶钝圆；秋初开花，花茎高约60.0 cm，伞形花序4~6朵，6片倒披针形花瓣，长约4.5 cm，宽约1.0 cm；花多淡紫红色，花被顶端蓝色，花色花型丰富，是石蒜属特殊的复色花卉[1]。
目前，换锦花的花色性状改良主要以传统的种间杂交和选择育种为主，分子标记育种为辅的育种模式。徐炳声等[2]利用杂交授粉技术，以换锦花为母本，中国石蒜L. chinensis为父本，选育出粉白色的秀丽石蒜L.× elegans；张定成等[3]在安徽和淮南发现三倍体和二倍体野生换锦花资源，表明换锦花可能是由其他石蒜属植物杂交而来。然而换锦花生长周期长，在自然状态下授粉率低且结实少，种子萌发率低，制约了换锦花传统育种研究。为了克服传统杂交育种的缺陷，不少研究者利用现代分子生物学技术探索换锦花花色分子育种性状改良的有效手段[4−6]。花色苷生物合成途径是类黄酮生物合成的一个分支途径，主要由结构基因和调控基因共同调控，花色苷积累受光照、温度和水分等多种因素的影响，植物受到强光、低温、氮亏缺等逆境协迫时会大量合成花色苷以增强自身抗性[7]，花色苷的生物合成也受到植物体自身生长发育过程的影响[8]。大量研究表明：R2R3-MYB 是花色苷生物合成的重要调控因子，常与bHLH和WD40形成MBW复合体结合到结构基因启动子序列上共同调控葡萄Vitis vinifera、风信子Hyacinthus orientalis、苹果Malus pumila花色素苷的生物合成[9]。许振渊等[10]和侯朔等[11]克隆了换锦花R2R3-MYB转录因子LsMYB4和LsMYB5基因，周洋丽等[12]通过病毒介导的基因沉默(VIGS)技术研究发现LsMYB4和LsMYB5是换锦花花青素合成的抑制性转录因子。周洋丽[13]和薛惠敏等[14]成功克隆了换锦花LsANS、LsF3'H、LsUFGT1和LsUFGT2基因启动子序列，为研究换锦花花色形成的调控机制和遗传改良提供基础。为进一步探讨换锦花花色形成的调控网络，本研究根据换锦花花瓣(红色部分和蓝色部分)转录组信息筛选到与换锦花花色形成相关的差异R2R3-MYB转录因子LsMYB7并进行生物信息学分析，通过病毒介导的基因沉默(VIGS)技术研究该基因调控花色苷积累的相关功能，结果可为通过基因工程手段改良换锦花的花色奠定理论基础。
1. 材料与方法
1.1 材料
2019年8—9月于浙江农林大学石蒜属植物种质资源圃采集换锦花花瓣，取换锦花小花苞(2.0~3.5 cm)、大花苞(4.5~6.0 cm)、盛花期和败花期4个不同花发育时期(图1A)和不同花色无性系H1、H2、H3、H4和H5盛花期花瓣(图1B)，液氮速冻后于−80 ℃冰箱保存备用。
图 1 换锦花不同花发育时期(A)和不同花色无性系盛花期(B)Figure 1 Different stages of flower development (A) and peak flowering stage in different clonal plants (B)1.2 方法
1.2.1 换锦花花瓣总RNA提取和cDNA第1链的合成
采用RNAiso plus法提取换锦花花瓣总RNA[15]，参照PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(Takara)方法合成cDNA 第1链。
1.2.2 换锦花LsMYB7基因cDNA序列的PCR扩增
根据转录组测序信息设计LsMYB7基因 cDNA序列特异引物LsMYB7-F：CAAGCAGTGGTCTCAACA和LsMYB7-R：AGAACAGCACTACTAAAGGT，参照Premix PrimeSTAR HS的PCR扩增体系扩增目的基因cDNA序列，PCR扩增反应程序为94 ℃变性30 s；58 ℃ 退火30 s；72 ℃延伸90 s，32个循环，72 ℃延伸10 min，质量浓度为1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，于凝胶成像系统(Bio-RAD)观察拍照；采用Hingene琼脂糖凝胶回收试剂盒(杭州麦克德勒科技有限公司)回收目的DNA，于−20 ℃保存备用。
1.2.3 目的基因连接和转化
参照pEASY-Blunt Zero Cloning Kit说明书将目的基因LsMYB7序列连接到pEASY-Blunt载体，转化大肠埃希菌Escherichia coli DH5α感受态细胞；在含有氨苄青霉素(Amp)、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和5-溴-4-氯-3-吲哚 β-D-半乳糖苷(X-Gal)的LB培养基(Luria-Bertani medium)上培养过夜，挑取阳性克隆于LB液体(含50 mg·L−1 Amp)培养基中，37 ℃振荡培养，PCR检测呈阳性的菌液送浙江有康生物科技有限公司测序；采用质粒DNA提取试剂盒(杭州创试生物科技有限公司)提取目的序列重组质粒DNA，于−20 ℃保存。
1.2.4 LsMYB7及花色形成相关基因的表达
采用Primer 5.0设计LsMYB7基因和花色形成相关基因(LsCHS、LsF3H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2)的RT-qPCR引物(表1)，使用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(Takara)方法合成cDNA 第1链。参照SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ(Takara)方法，于CFX96TM荧光定量 PCR 仪(BIO-RAD)进行RT-qPCR验证。RT-qPCR体系(20.0 uL)：cDNA(＜100 ng) 1.6 uL，正反引物各0.8 uL，TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 10.0 uL，RNase Free ddH2O 6.8 uL。RT-qPCR程序为95 ℃ 30 s，95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，循环40次。以LsGADPH为内参基因[15]，2−ΔΔCt方法计算实时荧光各基因的相对表达量，重复3次。
表 1 RT-qPCR所用引物Table 1 Primers for fluorescence RT-qPCR引物 正向(5′→3′) 反向(5′→3′) LsGADPH AGGGTTTGATGACCACCGTGCA ACAGCCTTGGCAGCTCCAGTAC LsMYB7 GCGCGGAGTTCTTGGCTCTGAT TCTGGCACCGTTCTCATCACGC LsCHS CAAGACATGGTGGTGGTCGAGGTC CGAGGAGTTTGGTGAGCTGGTAGTC LsF3H AACCGAGGACGCAACGGAATGC ACCATCTTCATCGCAGCCACCA LsANS CGTGCCAGGTCTCCAGGTCTTCTA TCGAGAGTGTCACCGACGTGAACTA LsUFGT1 GGTGGTGAAGGATGAGGAAGGTAGG GTTGAACCGCTCGAACCGCAATC LsUFGT2
LsF3'HGCGTAGCCTTCTCCTTCCTCACCT
TTGTACAGCCATGCACAGAATCCGCCATGAATCGCTTCACCTCCTC
GCAACCAAGGCAAGAAATCA说明：引物参考文献[16]。 1.2.5 换锦花花瓣花色苷的HPLC测定
参照刘跃平等[17]方法提取并用高效液相色谱(HPLC)测定换锦花花瓣花色苷质量浓度。精密称量换锦花花瓣干粉0.040 0 g，加入2 mL体积分数为1%甲醇/HCl提取溶液，振荡混匀；20 ℃超声提取30 min；12 000 r·min−1，离心15 min，取上清液；0.45 μm滤膜过滤；梯度洗脱：流动相为甲醇(A)-体积分数为1%的甲酸水(B)，0~20 min(A体积分数从5%升至60%)，20~25 min(A体积分数从60%升至100%)，25~30 min(A体积分数保持100%)，流速1 mL·min−1，检测波长280 nm，柱温30 ℃，进样量10 uL；以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷、飞燕草素-3-O-葡萄糖苷等3个花色苷为标准品。每样3个生物学重复。
1.2.6 亚细胞定位
采用XbaⅠ和BamHⅠ分步酶切法酶切亚细胞定位载体pAN580，再采用ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit (杭州霆喜生物科技有限公司)将LsMYB7基因序列连接到pAN580上，并转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞，在含有50 g·L−1Amp的LB培养基上进行筛选，挑选阳性克隆进行菌液PCR检测，成功构建pAN580-LsMYB7亚细胞定位载体，采用无内毒素质粒提取试剂盒(AxyPrep)提取pAN580-LsMYB7重组载体质粒DNA；聚乙二醇法(PEG 4000)转化烟草Nicotiana tabacum原生质体，用激光共聚焦荧光显微镜观察拍照。
1.2.7 VIGS沉默载体构建
采用双酶切法构建VIGS沉默载体pTRV2-LsMYB7：利用Primer 5.0设计长为400 bp的LsMYB7基因cDNA序列插入片段引物pTRV-LsMYB7-F: TACCGAATTCTCTAGAGAGGACAACATGCTACAATCCC和pTRV-LsMYB7-R：GCTCGGTACCGGATCCGCTCGAATCGCTAACATCCG；用限制性内切酶XbaI和BamHI分别双酶切VIGS载体(pTRV2)与LsMYB7基因的插入序列，T4 DNA连接酶连接载体与目的序列，转化大肠埃希菌DH5α，并在含有50 g·L−1 卡那霉素(Kan)的LB固体培养基筛选，提取pTRV2-LsMYB7重组质粒DNA。
1.2.8 换锦花花瓣瞬时转化
采用微量注射法转化换锦花花苞[12]，将重组质粒pTRV2-LsMYB7、pTRV2和pTRV1质粒DNA转化根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens GV3101，于YEP液体培养基(50 mg·L−1 Rif和50 mg·L−1 Kan)中，28 ℃，220 r·min−1振荡培养12~14 h；4 000 r·min−1, 离心10 min，去上清液；加入侵染液(10 mmol·L−1 MES + 200 μmol·L−1 AS + 10 mol·L−1 MgCl2，pH 5.6±0.03)重悬后的菌液D(600)=0.8~1.0；将pTRV1与pTRV2空载体、pTRV2-LsMYB7农杆菌液按照体积比1∶1混合均匀，室温黑暗静置4~6 h；使用1 mL注射器，吸取1 mL混合农杆菌菌液。选取3~4 d的换锦花花苞，在花苞基部缓慢注射混合根癌农杆菌菌液，充分侵染换锦花花苞，侵染5 d后采集花瓣用于LsMYB7和花色形成相关结构基因的表达分析(见1.2.4和表1)。
1.2.9 数据统计分析与作图
采用Excel 2020 统计和整理数据，采用SPSS 20.0 对数据进行差异显著性分析，采用Graphpad 8.0作图。
2. 结果与分析
2.1 LsMYB7 基因的克隆和序列分析
以换锦花花瓣的cDNA为模板，采用RT-qPCR技术扩增获得长度为951 bp 的LsMYB7 cDNA序列(图2)。该cDNA序列含有1个825 bp的开放阅读框(ORF)，编码274个氨基酸，分子量为6.84 kD，蛋白分子式为C2402H3981N825O982S258，理论等电点(pI)为5.04，不稳定系数为43.43，总体亲水性(GRAVY)为0.936。
2.2 LsMYB7氨基酸序列同源性分析
通过与美国国家生物技术信息中心(NCBI)搜索的其他植物MYB氨基酸同源序列进行比对，发现换锦花LsMYB7蛋白含有2个R2R3-MYB典型的SANT结构域R2和R3[18](图3)，属于R2R3-MYB类转录因子。与茶Camellia sinensis KAF5956278.1、狭叶油茶Camellia lanceoleosa KAI8015846.1、粗柄象腿蕉Ensete ventricosum RRT35038.1/RWV93016.1、椰子Cocos nucifera XP_KAG1363931.1、番红花Crocus sativus QBF29477.1、香根鸢尾Iris pallida KAJ6804060.1/KAJ6829988.1、河岸葡萄Vitis riparia XP_034676575.1和拟南芥Arabidopsis thaliana等其他植物的同源性为44.52%~60.57%，其中，与茶KAF5956278.1的同源性最高达60.57%，其次是香根鸢尾 KAJ6804060.1/KAJ6829988.1(59.32%)，与拟南芥AtMYB44(Q9FDW1.1)、AtMYB70(AEC07437.1)、AtMYB73(O23160.1)和AtMYB77(Q98N12.1)的同源性为44.52%~47.44%，且同源部分均集中在N端的R2R3 DNA结合结构域，而C端的同源性较低。
图 3 LsMYB7与其他植物的R2R3-MYB氨基酸同源序列比对Figure 3 Comparison of R2R3-MYB amino acid homologous sequences between LsMYB7 and other plants, R2R3-MYB2.3 LsMYB7系统进化与功能预测
从NCBI数据库下载拟南芥(AtMYB 16条)、换锦花(LsMYB 2条)和石蒜L. radiata (LrMYB 2条) R2R3-MYB氨基酸序列进行比对并构建系统进化树(图4)。参考拟南芥MYB基因家族的分类方法[19]，LsMYB7与拟南芥R2R3-MYB S22亚家族的AtMYB44、AtMYB70、AtMYB73和AtMYB77 聚为一类，由于拟南芥S22亚家族参与调控拟南芥的生长和发育过程，响应高盐、干旱低温等非生物胁迫反应，同一亚族基因的功能相似，结合花色基因表达分析，推测LsMYB7可能通过响应干旱和高温等调控换锦花花瓣花色苷的形成。
图 4 LsMYB7与拟南芥R2R3-MYB蛋白系统进化树Figure 4 Phylogenetic tree between LsMYB7 and R2R3-MYB from A. thaliana2.4 换锦花花瓣花色苷质量浓度
利用HPLC分别测定换锦花4个花发育时期和5个不同花色无性系(H1、H2、H3、H4和H5)盛花期花瓣的花色苷质量浓度(图5A和5B)，结果表明：换锦花花瓣花色苷的主要成分为矢车菊素，含有少量的天竺葵素和飞燕草素，说明花色苷的种类和质量浓度决定换锦花花色的多样性。随着换锦花花器官的生长发育，花瓣花色苷总质量浓度和矢车菊素质量浓度呈逐渐下降的趋势，小花苞时期矢车菊素质量浓度大约是败花期的3倍，说明换锦花花瓣花色苷的积累可能主要在花瓣发育的早期完成(图1A和5A)；在浅色换锦花无性系H4和H5中，矢车菊素质量浓度明显低于深色换锦花无性系H1、H2和H3(图1B和5B)。因此，从换锦花不同花发育时期和不同花色无性系花瓣颜色和花色苷质量浓度来看，矢车菊素对换锦花花瓣的颜色影响最大，矢车菊素质量浓度越高，换锦花花瓣的颜色就越深。
图 5 换锦花不同花发育时期(A)和不同花色无性系(B)花瓣的花色苷质量浓度Figure 5 Anthocyanin contents in petals of different stages of flower development (A) and different clones (B) of L. sprengeri2.5 换锦花LsMYB7和花色形成相关基因的表达
2.5.1 在换锦花不同发育时期的表达
利用RT-qPCR对LsMYB7和换锦花花色形成相关基因(LsC4H、LsCHS、LsF3H、LsF3'H、LsANS和LsUFGT1、LsUFGT2)在换锦花不同发育时期花瓣中的表达进行分析，结果(图6)表明：LsMYB7与LsCHS和LsF3'H基因的表达随着换锦花花苞发育呈逐渐上升趋势，LsC4H、LsCHS、LsUFGT1、LsUFGT2、LsF3'H和LsMYB7在败花期大量表达，LsF3H则在花苞发育前期几乎无表达，盛花期开始大量表达，而在败花期表达量开始下降；LsANS、LsUFGTs等花色苷合成的后期基因在盛花期的表达最低。其中LsCHS和LsF3'H基因的表达与花色苷总质量浓度和矢车菊素质量浓度正好相反(图5A)。
图 6 换锦花LsMYB7和花色形成结构基因在不同花发育时期的表达Figure 6 Expression of LsMYB7 and structure genes related to anthocyanin biosythesis in different flower development stages2.5.2 在换锦花不同花色无性系花瓣中的表达
LsMYB7和换锦花花色形成关键基因LsC4H、LsCHS、LsF3H、LsF3'H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2在换锦花不同花色无性系中的表达差异显著(图7)。2个花色苷合成的前期基因LsC4H和LsCHS及后期基因LsANS在淡色的无性系换锦花花瓣中表达量高。LsF3H在蓝色为主的H3无性系中表达量达到最高。LsMYB7在H1和H4中表达量比较高。LsMYB7基因的表达与LsCHS和LsF3'H基因的表达正好相反，而与不同花色无性系花色苷总质量浓度和矢车菊素质量浓度基本一致，这一结果与不同花发育时期的基因表达结果一致。因此，LsMYB7可能对LsCHS和LsF3'H基因的表达有一定的调控作用。
图 7 换锦花LsMYB7和花色形成结构基因在不同无性系中的表达Figure 7 Expression of LsMYB7 and structure genes related to anthocyanin biosythesis in different flower clones2.6 换锦花LsMYB7基因的亚细胞定位
通过双酶切法构建亚细胞定位载体pAN580-LsMYB7，转化烟草原生质体，于激光共聚焦荧光显微镜观察，LsMYB7荧光信号定位在细胞核中(图8)，说明LsMYB7基因为转录因子基因，在细胞核中起转录调控的作用。
2.7 LsMYB7基因沉默后对换锦花花瓣花色苷形成相关基因表达的影响
构建LsMYB7的VIGS基因沉默载体pTRV2-LsMYB7，通过微量注射法转化换锦花花苞，LsMYB7 基因沉默后，换锦花同朵花中一半花瓣明显变短，且颜色变深(图9A)；对LsMYB7和花色苷形成相关基因在换锦花花瓣中的表达进行分析(图9B和C)，与ck (空载)相比，LsMYB7基因换锦花花瓣中的表达量明显下降，同时，花色苷形成相关基因LsCHS、LsF3'H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2的表达量极显著下降(P＜0.01)，而LsF3H基因的表达量反而上升，LsC4H基因表达变化不大，说明LsMYB7转录因子可能参与调控花瓣的生长发育，且对LsCHS、LsF3'H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2的表达起正调控作用，而对LsF3H基因的表达起负调控作用。
图 9 LsMYB7基因沉默后表型变化及花色苷形成相关基因的表达Figure 9 Phenotype and relative expression levels of LsMYB7 and genes related to anthocyanin biosynthesis after LsMYB7 silencedA.表型变化；B. LsMYB7基因的表达；C. 花色苷形成相关基因的表达**表示差异极显著(P＜0.01)3. 讨论
植物R2R3-MYB转录因子广泛参与调控次生代谢、细胞形态发生、激素刺激、环境胁迫应答、分生组织形成和细胞周期等过程[20]。根据C-末端的不同，拟南芥R2R3-MYB基因家族可分成22个不同的亚族，其中，拟南芥S4、S5、S6和S7亚族基因参与花青素和类黄酮类化合物生物合成途径的结构基因的转录调控[18, 21−22]，换锦花LsMYB4、LsMYB5和拟南芥S4亚族基因聚为一类。通过花青素形成相关基因表达和VIGS基因沉默技术研究表明，LsMYB4和LsMYB5对花青素生物合成基因的表达有负调控的作用[10−12]。
S22亚族基因AtMYB44、AtMYB77、AtMYB73和AtMYB70主要参与拟南芥响应高盐、干旱、低温等非生物胁迫反应，其中，AtMYB73基因启动子中含有ABA响应元件ABRE及干旱胁迫和热胁迫顺式作用元件。AtMYB73突变体atmyb73在干旱胁迫处理下，ABA 下游基因ABI2、ABI5 的表达水平均较野生型明显增强。外源 ABA 处理野生型和突变体种子、幼苗，获得了与干旱胁迫处理类似的结果[23−24]。本研究结果表明：LsMYB7蛋白含有2个R2R3-MYB典型的SANT结构域R2和R3，属R2R3-MYB类转录因子，且R2和R3的保守结构域与其他植物高度同源，系统进化树分析结果显示LsMYB7和S22亚族基因AtMYB44、AtMYB77、AtMYB73和AtMYB70聚为一类，推测LsMYB7可能与S22亚族基因有相似的功能。
本研究中，LsMYB7基因的表达与换锦花花色苷形成相关基因LsCHS、Ls4CL2和LsUFGT2的表达趋势一致，推测LsMYB7可能参与换锦花花瓣花色苷的生物合成。而LsMYB7属于拟南芥S22亚族，未见该亚族基因AtMYB44、AtMYB77、AtMYB73和AtMYB70参与花色苷的生物合成的转录调控。已有报道认为AtMYB73/44能够参与调控拟南芥对干旱胁迫的响应[25−26]，而干旱胁迫可诱导植物细胞合成和积累花色苷。花色苷的光化学性质、亚细胞积累位点及在植物器官、组织中的空间分布决定了花色苷能强化植物的耐旱性，其中，花色苷提高植物细胞在干旱胁迫下的抗氧化能力可能是花色苷强化植物耐旱性的主要原因[27]。有研究表明：干旱胁迫可激活紫麦Triticum aestioum ‘Guizi 1’、甘薯Ipomoes batats等植物花色苷合成相关基因表达，通过提高花青素含量抵御干旱胁迫[28−29]。本研究中LsMYB7 基因沉默后，花色苷形成相关基因LsCHS、LsF3'H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2的表达明显下降，说明LsMYB7可能直接或间接调控花色苷的积累，而LsMYB7与S22亚族基因聚为一类，由于换锦花开花季为夏末秋初的8—9月，此时多为高温和干旱季节，因此推测LsMYB7可能通过对干旱胁迫响应来调控花色苷形成相关基因的表达，大量积累花色苷。这一研究结果与云南文山辣椒Capsicum annuum、番茄Lycopersicon esculentum的研究[30−31]相似，因此，植物可以通过干旱胁迫激活与花色苷合成相关基因的表达水平促进花色苷积累，进而提高抗旱能力。
4. 结论
本研究通过RT-qPCR获得长为951 bp 的LsMYB7 cDNA序列，开放阅读框(ORF) 825 bp，编码274个氨基酸，LsMYB7为R2R3-MYB转录因子家族，定位于细胞核，与其他植物R2R3-MYB有较高的同源性。系统进化分析表明LsMYB7和参与调控干旱等非生物胁迫响应的S22亚族基因聚为一类；LsMYB7基因主要在败花期和花色苷含量较高的H1无性系中表达，与花色苷合成相关基因的表达趋势一致；LsMYB7基因沉默后，换锦花部分花瓣明显变短，颜色变深，LsCHS、LsF3'H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2等花色苷形成相关基因的表达显著下调，因此，LsMYB7参与调控换锦花花瓣的生长发育，且通过对LsCHS、LsF3'H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2花色苷形成相关基因的表达调控花色苷的积累。此外，LsMYB7可能通过响应干旱胁迫激活花青素合成相关基因表达促进花色苷积累，进而提高换锦花的抗旱能力，LsMYB7调控花色苷积累抵御干旱的机制需要进一步研究。
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图 1 凋落物类型、质量、覆盖方式对水杉种子出苗率和幼苗存活率的影响
Figure 1 Effect of litter type, mass and mulching method on seed emergence rate and survival rate of M. glyptostroboides seedling
图 2 凋落物类型、质量、覆盖方式对水杉幼苗苗高、地径和根长的影响
Figure 2 Effect of litter type, mass and mulching method on seedling height, base diameter and root length of M. glyptostroboides seedlings
图 3 凋落物类型、质量、覆盖方式对水杉幼苗叶片数和叶面积的影响
Figure 3 Effect of litter type, mass and mulching method on leaf number and leaf area of M. glyptostroboides seedlings
图 4 凋落物类型、质量、覆盖方式对水杉幼苗地上和地下生物量的影响
Figure 4 Effect of litter type, mass and mulching method on aboveground biomass and belowground biomass of M. glyptostroboides seedlings
表 1 凋落物类型、质量、覆盖方式对水杉幼苗早期生长的单因素方差分析
Table 1. One-way ANOVA of of litter type, mass and mulching method on early growth of M. glyptostroboides seedlings
影响因子 出苗率 存活率 苗高 地径 根长 叶片数 叶面积 地上生物量 地下生物量 上方新鲜凋落物质量 0.000** 0.000** 0.003** 0.002** 0.002** 0.031* 0.004** 0.012* 0.001** 上方自然凋落物质量 0.000** 0.000** 0.517 0.280 0.001** 0.086 0.007** 0.005** 0.000** 下方新鲜凋落物质量 0.000** 0.000** 0.001** 0.020* 0.017* 0.019* 0.504 0.008** 0.002** 下方自然凋落物质量 0.004** 0.009** 0.005** 0.002** 0.017* 0.069 0.199 0.019* 0.000** 说明：数据为检验性P值。*表示差异显著(P＜0.05)，**表示差异极显著(P＜0.01) 
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表 2 凋落物类型、质量、覆盖方式对水杉幼苗早期生长的多因素方差分析
Table 2. Multivariate analysis of variance of litter type, mass and mulching method on early growth of M. glyptostroboides seedlings
因子间交互作用 出苗率 存活率 苗高 地径 根长 叶片数 叶面积 地上生物量 地下生物量 凋落物质量×覆盖方式 0.000** 0.000** 0.528 0.233 0.158 0.965 0.676 0.812 0.995 凋落物质量×凋落物类型 0.140 0.258 0.090 0.069 0.367 0.224 0.275 0.265 0.955 凋落物类型×覆盖方式 0.052 0.101 0.441 0.985 0.002** 0.017* 0.049* 0.001** 0.008** 凋落物质量×覆盖方式×凋落物类型 0.652 0.423 0.281 0.507 0.260 0.143 0.396 0.035* 0.023* 说明：数据为检验性P值。*表示差异显著(P＜0.05)，**表示差异极显著(P＜0.01)
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链接本文:
https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20210704
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