Screening and identification of Bacillus strain BU108 and bio-control effects on potato scab

病原菌疮痂链霉菌由本实验室保存提供。

土样采自黑龙江省克山县马铃薯发病地块；马铃薯品种为‘大西洋’Solanum tuberosum ‘Atlantic’。

YME固体培养基：麦芽糖10.0 g·L^-1，酵母提取物4.0 g·L^-1，葡萄糖4.0 g·L^-1，琼脂20.0 g·L^-1，pH 7.2；LB固体培养基：氯化钠(NaCl)10.0 g·L^-1，蛋白胨10.0 g·L^-1，酵母浸粉5.0 g·L^-1，琼脂20.0 g·L^-1，pH 7.5；发酵条件优化基础培养基^[13]：葡萄糖10.0 g·L^-1，蛋白胨10.0 g·L^-1，氯化钠10.0 g·L^-1，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)1.5 g·L^-1，硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)1.5 g·L^-1。

采集有伤病的马铃薯周围的土壤带回实验室，土壤加水匀浆并倍比稀释至10^-6，把10^-4，10^-5，10^-6倍的土壤稀释液涂布。在平板上挑取单个菌落纯化培养，保存分离到的单个菌株，在涂有链霉菌的平板上做抑菌实验。

形态观察：显微镜观察单菌的颜色、形状、状态。分子生物学鉴定：基于16S rDNA序列分析的生防菌株种属鉴定。50.0 μL聚合酶链式反应(PCR)反应体系：2.0 μL细菌基因组DNA，4.0 μL 10 mmol·L^-1 16S引物27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-TACCTTGTTACGACTT-3′，1.2 μL 10 μmol·L^-1三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTPs)，4.0 μL 50 mmol·L^-1氯化镁(MgCl2)，5.0 μL 10×PCR缓冲液，0.3 μL DNA聚合酶。PCR扩增条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，40个循环，4 ℃无限循环。反应结果经8 g·L^-1琼脂糖凝胶电泳进行条带检测，纯化后样品送交上海生工完成测序。所获得的碱基序列在美国生物技术信息中心(NCBI)数据库中进行Blast同源性对比，利用MEGA 5软件进行多序列比对并构建系统发育树。

根据种子培养基的营养条件，分别更换不同质量浓度和种类的碳源、氮源及不同比例的无机盐离子和碳氮比(C/N)加入装有50 mL发酵液培养基的100 mL的三角瓶中，改变培养菌株的发酵条件(培养温度、pH值、培养时间等)，将活化好的菌株接种到发酵液培养基中，37 ℃，160 r·min-1恒温振荡培养24 h后。菌液离心4 min，12 000 r·min-1，菌液上清使用0.22 μm滤膜过滤后采用管碟法进行抑菌实验。

抑菌活性的测定采用管碟法，把培养好的病原菌用涂布棒涂匀在已制作好的平板，在平板上放牛津杯加入抑菌物粗提液。抑菌活性通过测量抑菌圈的半径，计算平均值比较大小进行确定。

根据培养基的营养条件，采用单因素多水平试验设计方法，分别加入10.0 g·L^-1的葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖作为不同的碳源，其他因素同种子液培养基，重复5次·水平^-1，采用管碟法测定抑菌活性确定适宜碳源的种类。

在适宜碳源试验结果基础上，根据培养基的营养条件，设计氮源单因素多水平试验，分别加入10.0 g·L^-1的蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母浸粉、牛肉粉作为不同的氮源，其他因素不变，重复5次·水平-1，采用管碟法测定抑菌活性确定适宜的氮源种类。

在适宜碳、氮源试验结果基础上，根据培养基的营养条件，设计C/N单因素多水平试验，选取C/N分别为1:1，1:2，1:3，1:4，1:5进行发酵试验，其他因素不变，重复5次·水平-1，采用管碟法测定的抑菌活性确定适宜的C/N。

在适宜碳、氮源及C/N试验结果基础上，根据培养基的营养条件，选择培养基中的KH₂PO₄，MgSO₄·7H₂O，NaCl为正交试验因素，设计3水平3因素试验(表 1)，设置空白项为对照(ck1)。分别将不同水平的KH₂PO₄，MgSO₄·7H₂O，NaCl加入发酵培养基中，培养基pH值调至pH 7.0，其他因素不变，重复5次·水平^-1，采用管碟法测定抑菌物活性确定适宜的无机离子。

在适宜碳，氮源，C/N，无机离子正交试验结果基础上，根据培养基的营养条件，设计初始最适pH值单因素多水平试验，分别调节初始pH值为pH 5，pH 6，pH 7，pH 8，pH 9，重复5次·水平^-1，采用管碟法测定抑菌活性确定适宜的pH值。

在适宜碳，氮源，C/N及pH值，无机离子正交试验结果基础上，根据培养基的营养条件，设计培养温度单因素多水平试验，分别调节初始温度为22，28，32，37，44 ℃，重复5次·水平-1，采用管碟法测定抑菌活性确定最适温度。

在上述最佳培养条件确定基础上，根据培养基的营养条件，设计培养时间单因素多水平试验，分别设置8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28和30 h的培养时间，重复3次·水平-1，采用管碟法测定的抑菌活性确定适宜的培养时间。

实验在黑龙江八一农垦大学大庆市重点实验室中进行，采用盆栽实验，实验用盆钵为28 cm × 20 cm的聚乙烯塑料盆，钵装风干土为3 kg·盆^-1，装入马铃薯疮痂病发病土壤。选取健康的有芽马铃薯，用清水冲洗干净，切成三角块，在盆钵土壤中植入2块有芽马铃薯，芽尖向上。同时制备发酵培养基，接种BU108生防菌。设置3组处理，重复6次·处理^-1，分别为对照(ck₂)，低浓度BU108(1×10⁸ cfu·m^-2)和高浓度BU108(1×10¹⁰ cfu·m^-2)。各个处理中菌液最终施用量为100 mL，在栽种时加入菌液，之后不再添加，栽种前浇水1 000 mL。根据马铃薯生长情况定量加水，待马铃薯成熟后，进行病斑数的统计与分析。

从有病害马铃薯根际土壤中分离得到200余株菌株，命名按BU1，BU2，BU3等依次排列，对所有得到的菌株进行抑菌实验。结果显示：BU108与其他菌株相比抑菌圈半径最大，抑菌效果最为明显(图 1)。BU108菌落形态白色不透明，边缘不整齐、干燥、中间有星状皱起；在液体培养基中色暗、皱褶、完整的膜、轻度混浊，可知BU108对疮痂链霉菌有抑菌效果。在16S rDNA序列分析的基础上进行NCBI序列比对，找到与目的菌株相似度最为接近的碱基序列。应用MEGA5软件对这些碱基序列进行分析，构建系统进化树。从图 2可以看出：BU108属于芽孢杆菌属，但与目前鉴定到的芽孢杆菌种之间存在不同，与Bacillus sp.(KT583425.1)亲缘关系最近。

Figure 1.  Inhibiton of BU108 against Streptomyces scabies

Figure 2.  Phylogenetic tree of BU108 16S rDNA

分别用葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖代替培养基中的葡萄糖。结果显示：抑菌实验的半径平均值分别为11，7.6，7.8和8.2 mm。由图 3可知：当葡萄糖作为碳源时，抑菌效果最为明显。由方差分析可知：组内间的差异较小，而且葡萄糖与其他的碳源有极显著差异(P＜0.01)，因此确定葡萄糖为最佳碳源。

Figure 3.  Effect of carbon source on the activity of Bacillus BU108

在最佳碳源确定的基础上，分别用胰蛋白胨、蛋白胨、大豆蛋白、牛肉粉、酵母浸粉代替培养基中的蛋白胨。结果(图 4)显示：抑菌实验的半径平均值分别为6.8，6.6，6.4，7.2和8.6 mm。当酵母浸粉作为氮源时，抑菌效果最为明显。由方差分析可知：酵母浸粉与其他的氮源有极显著差异(P＜0.01)，因此确定酵母浸粉为最佳氮源。

Figure 4.  Effect of nitrogen source on the activity of Bacillus BU108

碳源和氮源之间的比例对微生物的生长和代谢同样重要。在最佳碳、氮源确定的基础上，设置C/N为1:1，1:2，1:3，1:4，1:5。结果显示(图 5)：抑菌圈的半径平均值分别9.0，12.5，7.3，7.8和7.0 mm。当C/N为1:2时抑菌效果最为明显，与方差分析组内间的差异较小，与其他组间有极显著差异(P＜0.01)，因此确定最佳C/N为1:2。

Figure 5.  Effect of C/N on the antagonistic activity of Bacillus BU108

在最佳碳源、氮源和C/N确定的基础上改变无机离子的浓度，并检测无机离子对抑菌活性影响。由表 2可知：NaCl对抑菌效果影响最大，极差R大小依次为NaCl＞MgSO₄·7H₂O＞KH₂PO₄＞ck。由表 3可知：NaCl对抑菌物的产生影响最大，影响最小的为KH₂PO₄。可见，NaCl质量浓度为5.0 g·L^-1时对菌株的抑菌效果最佳。

在最佳碳源、氮源和C/N及无机离子比例确定的基础上，改变培养基pH为5，6，7，8，9。结果(图 6)显示：抑菌圈的半径平均值分别为9.0，9.6，9.8，12.4和8.4 mm。当pH为8时，抑菌效果最为明显，由方差分析可知各个组内间的差异较小而且pH为8时与其他组有极显著差异(P＜0.01)，因此确定pH 8是最佳pH值。

Figure 6.  pH effect on the antibacterial activity of Bacillus BU108

在最佳碳源、氮源、C/N和无机离子比例及pH确定的基础上，设置培养温度为22，28，32，37，44 ℃。结果(图 7)显示：抑菌圈的半径平均值分别为9.0，12.6，9.0，8.2和7.0 mm。芽孢杆菌BU108在22，32，37 ℃下生长良好，在44 ℃下生长一般，28 ℃下生长情况最佳。由方差分析可知：培养温度为28 ℃时组内间的差异较小，与其他组相比具有极显著差异(P＜0.01)，因此28 ℃为最佳培养温度。

Figure 7.  Effect of culture temperature on the antibacterial activity of Bacillus BU108

培养时间过长营养物质消耗殆尽不利于菌株的生长，时间过短微生物代谢物质的分泌量不足影响菌株的抑菌效果。在最佳碳源、氮源、C/N、无机离子比例和pH值及培养温度确定的基础上，设置培养时间为8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28和30 h。结果显示(图 8)：抑菌实验的半径平均值分别5.2，5.2，6.7，7.2，7.7，8.3，8.7，11.7，9.0，7.7，7.0和6.3 mm。22 h时抑菌半径最大，抑菌效果最好。由方差分析可知：组内间的差异较小，与其他组相比具有极显著差异(P＜0.01)，因此最适培养时间为22 h。

Figure 8.  Effect of culture time on the antibacterial activity of Bacillus BUI08

对3组处理的盆栽实验的病斑数进行统计(图 9)：对照组的病斑数平均值为12.0，高浓度BU108组的病斑数平均值为1.0，低浓度BU108组的病斑数平均值为8.3。由方差分析可知：高浓度BU108组与其他组别间有极显著差异，抑制率为91.6%。低浓度BU108组与对照之间有极显著差异(P＜0.01)，抑制率为30.8%。表明芽孢杆菌BU108能够抑制马铃薯疮痂病的发生，且浓度越高，抑制效果越好。

Figure 9.  Effect of Bacillus BUI08 on potato scab

本研究通过平板涂布法、平板划线法分离单菌，利用本实验室提供的病原菌筛选拮抗菌，对200余株菌株做抑菌实验，测量抑菌圈的半径，发现菌株BU108抑菌圈半径最大，抑菌效果最为明显。通过形态学观察和菌株的进化树分析，初步确定BU108属于芽孢杆菌。因BU108与目前已知的芽孢杆菌序列之间存在较大不同，无法归类到具体的种。

通过摇瓶发酵对芽孢杆菌BU108抑菌活性物质的培养条件进行了研究，BU108的最佳培养条件：碳源为葡萄糖，氮源为酵母浸粉，C/N为1:2，无机离子KH₂PO₄为0.5 g·L^-1，MgSO₄·7H₂O为0.5 g·L^-1，NaCl为5.0 g·L^-1，pH 8，培养时间为22 h，培养温度为28 ℃。有些生防菌的最佳碳源为葡萄糖、氮源为大豆饼粉^[14-15]，最佳的pH偏酸性^[16]，而BU108的最佳碳源为葡萄糖、氮源为酵母浸粉，在偏碱性条件下生长良好并且抑菌效果最佳。证明其培养条件的不同对芽孢杆菌BU108菌株抑菌物的产生有很大影响。无机离子质量浓度对BU108菌株抑菌物的产生也有很大影响，在本研究中无机离子质量浓度最小时，抑菌效果最好。由此可见，生防菌株不同其培养条件相差很大，每个菌株都有其相应的营养要求和培养方式。

本研究采用盆栽实验检验了菌株BU108对马铃薯疮痂病的抑制效果。实验设置了不同浓度的生防菌发酵液处理土壤，发现抑菌效果与发酵菌液的浓度之间存在正相关，发酵液浓度高的处理组其抑菌效果也高。原因可能是低浓度的发酵液菌数少则抑菌物分泌量也相对较少，抑制率也低。本研究确定了BU108在土壤中具有抑制疮痂病发病的效果，可以作为生物防治的候选。本次盆栽试验为了保证马铃薯发病，盆栽土壤采用马铃薯疮痂病发病土壤，马铃薯发病和生防菌抑菌效果表现良好，但是在实际应用中面对复杂的土壤微生物，能否取得理想效果还有待检验。

在前人利用芽孢杆菌防治植物病害的研究中，芽孢杆菌多与其他微生物或药剂共同使用^[17-20]。在今后的实际应用中也可以尝试与其他生防菌组合使用，增强对马铃薯疮痂病的抑制效果。