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无患子SRAP-PCR反应体系的优化

彭珠清 范辉华 刘宝 刘燕 李静

彭珠清, 范辉华, 刘宝, 刘燕, 李静. 无患子SRAP-PCR反应体系的优化[J]. 浙江农林大学学报, 2014, 31(2): 322-328. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2014.02.024
引用本文: 彭珠清, 范辉华, 刘宝, 刘燕, 李静. 无患子SRAP-PCR反应体系的优化[J]. 浙江农林大学学报, 2014, 31(2): 322-328. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2014.02.024
PENG Zhuqing, FAN Huihua, LIU Bao, LIU Yan, LI Jing. Optimization of SRAP-PCR in Sapindus mukurossi[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2014, 31(2): 322-328. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2014.02.024
Citation: PENG Zhuqing, FAN Huihua, LIU Bao, LIU Yan, LI Jing. Optimization of SRAP-PCR in Sapindus mukurossi[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2014, 31(2): 322-328. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2014.02.024

无患子SRAP-PCR反应体系的优化

doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2014.02.024
基金项目: 

国家林业公益性行业科研专项 201104100

详细信息
    作者简介: 彭珠清, 从事植物地理学研究。E-mail:13489945975@126.com
    通信作者: 范辉华, 教授级高级工程师, 从事森林培育学研究。E-mail:jofhh@163.com
  • 中图分类号: S722.3

Optimization of SRAP-PCR in Sapindus mukurossi

  • 摘要: 建立适合无患子Sapindus mukurossi的相关序列扩增多态性-聚合酶链式反应(SRAP-PCR)最佳反应体系, 为研究无患子种质资源的遗传多样性、亲缘关系及遗传改良等奠定基础。以南平产的无患子叶片为材料, 采用单因素法对体系中的DNA模板、镁离子、三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTPs), 引物和TaqDNA聚合酶等5因素进行优化。确立了适合无患子SRAP的最佳反应体系(20 μL):1×PCR缓冲液, 50 ng模板DNA, 2.0 mmol·L-1镁离子, 0.2 mmol·L-1 dNTPs, 0.5×16.67 nkat (0.5 U) TaqDNA聚合酶, 0.4 μmol·L-1引物。利用该体系对12份无患子种源材料进行PCR扩增, 获得了清晰、稳定的DNA谱带, 说明优化后的体系适宜无患子地理种源的遗传多样性分析。
  • 图  1  不同无患子总DNA电泳检测图

    M表示标记物,泳道1~24分别表示各种源的DNA条带(相邻2个泳道为1个样本)。

    Figure  1  Electrophoresis of total genomic DNA from 12 different Sapindus mukurossi provenances

    图  2  模板DNA用量对PCR扩增的影

    M表示标记物,泳道1~10分别表示DNA用量10,20,30,40,50,60,70,80,90,100ng。

    Figure  2  Effect of DNA template concentration on PCR amplification

    图  3  锾离子浓度对PCR扩增的影响

    M表示标记物,泳道1~9分别表示镁离子浓度1.00,1.25,1.50,1.75,2.00,2.25,2.50,2.75,3.00 mmol·L-1

    Figure  3  Effect of Mg2+concentration on PCR amplification

    图  4  dNTPs浓度对PCR扩增的影响

    M表示标记物,泳道1〜9分别表示dNPs浓度 0.05,0.10,0.15,0.20,0.25,0.30,0.35, 0.40,0.45 mmol • L-1

    Figure  4  Effect of dNTPs concentration on PCR amplification

    图  5  TaqDNA用量对PCR扩增的影响

    M表示标记物,泳道1〜9分别表示ragDNA 用量(0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0,1.2, 1.5,2.0)×16.60nkat。

    Figure  5  Effect of TaqDNA concentration on PCR amplification

    图  6  引物浓度对PCR扩增的影响

    M表示标记物,泳道1〜9分别表示引物浓度 0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0,8,0.9,1.0 [imol • L-1

    Figure  6  Effect of primers concentration on PCR amplification

    图  7  优化体系验证图(左m2e7,右m6e1)

    各泳道分别表示不同种源无患子材料的PCR产物检测结果。

    Figure  7  Optimi山ed system verification(left m2e7, right m6el)

    表  1  引物序列

    Table  1.   Primer sequence

    引物名称引物序列
    me25′-TGAGTCCAAACCGGAGC-3′
    me65′-TGAGTCCAAACCGGTAA-3′
    em15′-GACTGCGTACGAATTAAT-3′
    em75′-GACTGCGTACGAATTCAA-3′
    说明:me2和me6为正向引物; em1和em7为反向引物。
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    表  2  反应体系各因子水平

    Table  2.   Reaction system in each factor level

    水平 DNA用量/ng 镁离子浓度/ (mmol • L-1) dNTPs 浓度/ (mmol • L-1) TaqDNA/ (×16.67 nkat) 引物浓度/ (μmol • L-1)
    1 10 1.00 0.05 0.5 0.2
    2 20 1.25 0.10 0.6 0.3
    3 30 1.50 0.15 0.7 0.4
    4 40 1.75 0.20 0.8 0.5
    5 50 2.00 0.25 0.9 0.6
    6 60 2.25 0.30 1.0 0.7
    7 70 2.50 0.35 1.2 0.8
    8 80 2.75 0.40 1.5 0.9
    9 90 3.00 0.45 2.0 1.0
    10 100
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    表  3  无患子总DNA浓度检测

    Table  3.   Concentration detection of total genomic DNA from 12 different Sapindus mukurossi provenances

    序号 产地 D260 D280 D310 D260/D280 DNA质量浓度 (μg·L-1)
    1 广西钦州 0.121 0.089 0.056 1.361 605.0
    2 福建南平 0.149 0.116 0.081 1.285 745.0
    3 福建清流 0.158 0.104 0.05 1.515 790.0
    4 福建三明 0.319 0.157 0.008 2.030 1 595.0
    5 福建漳州龙海 0.342 0.160 -0.006 2.134 1 710.0
    6 福建顺昌高阳 0.219 0.119 0.026 1.834 1 095.0
    7 浙江杭州 0.149 0.097 0.043 1.534 745.0
    8 江西樟树 0.164 0.089 0.013 1.835 820.0
    9 福建顺昌 0.086 0.043 0.002 1.983 430.0
    10 印度 0.156 0.113 0.065 1.377 780.0
    11 福建永安 0.130 0.088 0.045 1.486 650.0
    12 印度(林科院) 0.118 0.085 0.046 1.379 590.0
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出版历程
  • 收稿日期:  2013-05-05
  • 修回日期:  2013-09-23
  • 刊出日期:  2014-04-20

无患子SRAP-PCR反应体系的优化

doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2014.02.024
    基金项目:

    国家林业公益性行业科研专项 201104100

    作者简介:

    彭珠清, 从事植物地理学研究。E-mail:13489945975@126.com

    通信作者: 范辉华, 教授级高级工程师, 从事森林培育学研究。E-mail:jofhh@163.com
  • 中图分类号: S722.3

摘要: 建立适合无患子Sapindus mukurossi的相关序列扩增多态性-聚合酶链式反应(SRAP-PCR)最佳反应体系, 为研究无患子种质资源的遗传多样性、亲缘关系及遗传改良等奠定基础。以南平产的无患子叶片为材料, 采用单因素法对体系中的DNA模板、镁离子、三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTPs), 引物和TaqDNA聚合酶等5因素进行优化。确立了适合无患子SRAP的最佳反应体系(20 μL):1×PCR缓冲液, 50 ng模板DNA, 2.0 mmol·L-1镁离子, 0.2 mmol·L-1 dNTPs, 0.5×16.67 nkat (0.5 U) TaqDNA聚合酶, 0.4 μmol·L-1引物。利用该体系对12份无患子种源材料进行PCR扩增, 获得了清晰、稳定的DNA谱带, 说明优化后的体系适宜无患子地理种源的遗传多样性分析。

English Abstract

彭珠清, 范辉华, 刘宝, 刘燕, 李静. 无患子SRAP-PCR反应体系的优化[J]. 浙江农林大学学报, 2014, 31(2): 322-328. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2014.02.024
引用本文: 彭珠清, 范辉华, 刘宝, 刘燕, 李静. 无患子SRAP-PCR反应体系的优化[J]. 浙江农林大学学报, 2014, 31(2): 322-328. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2014.02.024
PENG Zhuqing, FAN Huihua, LIU Bao, LIU Yan, LI Jing. Optimization of SRAP-PCR in Sapindus mukurossi[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2014, 31(2): 322-328. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2014.02.024
Citation: PENG Zhuqing, FAN Huihua, LIU Bao, LIU Yan, LI Jing. Optimization of SRAP-PCR in Sapindus mukurossi[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2014, 31(2): 322-328. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2014.02.024
  • 无患子Sapindus mukurossi属于无患子科Sapindaceae无患子属Sapindus,是一种非常有潜力的经济树种,其果可以用来制作洗涤剂,种仁能提取生物柴油,树形美观,可用于园林观赏等。日本、法国、中国台湾等对其蕴含的经济价值有一定的开发利用,而中国大陆虽早在几百年前就已对其有初步利用,但深度开发这方面却尚在起步阶段[1-3]。目前,对无患子的研究主要集中在生物学特性、繁殖技术[1, 4]、化学成分和分离提取技术及其利用价值的开发研究[5-7]等方面,而在分子生物学方面的研究报道不多[8-9]。分子标记技术是研究种质资源遗传背景的重要手段,2001年美国加州大学蔬菜作物系Li与Quiros博士提出了一种新型的基于聚合酶链式反应(PCR)的标记方法的相关序列扩增多态性(sequence-related amplified polymorphism,SRAP)标记方法[8, 10]。该标记通过独特的双引物设计对基因的ORFs(open reading frames)的特定区域进行扩增。与其他分子标记相比,该方法具有简单高效、多态性高、重复性较好等特点,并已成功应用于多种蔬菜、经济树种的种质资源分析中[5-7, 11-13]。但在无患子的遗传多样性以及种质鉴定等方面还鲜见报道。为此,本研究以无患子叶片为材料,采用单因素优化的方法建立无患子SRAP-PCR的最佳反应体系,旨在为不同地理种源无患子的遗传多样性分析、亲缘关系鉴定、遗传图谱构建、遗传改良等奠定基础。

    • 试验材料采于福建顺昌无患子种源收集区,共12个种源地36份种质材料。本优化试验以福建南平种源地的基因组DNA为试验材料。

    • 试验中所用的三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTP)s,TaqDNA酶,琼脂糖和DNA 标记物均购自上海生工生物工程有限公司,其中100 bp 标记物是加DNA 梯度。所用的SRAP引物序列由上海生物工程(上海)股份有限公司合成,其序列参照Li等[10]和Ren等[14]的方法。

      优化试验引物选用me2-em7组合,体系验证引物选用me2-em7和me6-em1,序列具体如表 1

      表 1  引物序列

      Table 1.  Primer sequence

      引物名称引物序列
      me25′-TGAGTCCAAACCGGAGC-3′
      me65′-TGAGTCCAAACCGGTAA-3′
      em15′-GACTGCGTACGAATTAAT-3′
      em75′-GACTGCGTACGAATTCAA-3′
      说明:me2和me6为正向引物; em1和em7为反向引物。
    • 无患子总DNA提取采用改良的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法[15-16]。DNA的浓度和纯度,分别用质量浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计分析检测。样品稀释至10 μg·L-1后,置-20 ℃冰箱保存备用。

    • SRAP-PCR基本反应体系:在20.0 μL总体积中,含2.0 μL 10×PCR 缓冲液(free Mg2+),2.0 mmol·L-1 镁离子(Mg2+),0.2 mmol·L-1 dNTPs,2.0×16.67 nkat(2.0 U) TaqDNA聚合酶,正反引物各0.5 μmol·L-1,用双蒸水补足至20 μL。

      SRAP-PCR扩增程序为:94 ℃预变性3 min;94 ℃变性l min,35 ℃复性l min,72 ℃延伸l min;共5个循环。随后94 ℃变性l min,50 ℃复性1min,72 ℃延伸l min,共35个循环;最后72 ℃延伸10 min。PCR仪为ABI梯度PCR仪。

      本试验采用单因素法对反应体系进行优化,分别调整模板DNA,镁离子,dNTPs,引物,TaqDNA聚合酶各因子的用量(表 2)。

      表 2  反应体系各因子水平

      Table 2.  Reaction system in each factor level

      水平 DNA用量/ng 镁离子浓度/ (mmol • L-1) dNTPs 浓度/ (mmol • L-1) TaqDNA/ (×16.67 nkat) 引物浓度/ (μmol • L-1)
      1 10 1.00 0.05 0.5 0.2
      2 20 1.25 0.10 0.6 0.3
      3 30 1.50 0.15 0.7 0.4
      4 40 1.75 0.20 0.8 0.5
      5 50 2.00 0.25 0.9 0.6
      6 60 2.25 0.30 1.0 0.7
      7 70 2.50 0.35 1.2 0.8
      8 80 2.75 0.40 1.5 0.9
      9 90 3.00 0.45 2.0 1.0
      10 100
    • 将PCR产物与上样缓冲液混合后于质量分数为1.5%琼脂糖凝胶上电泳,用溴化乙锭(EB)染色后,在凝胶成像系统(AlphaImager HP)上观察。

    • 无患子叶片内富含多酚、多糖、蛋白质及其他次生代谢物质[14],操作时易发生褐变,干扰DNA的提取,这些物质若残留在DNA样品中将会严重影响PCR的效果,导致DNA的酶切、扩增失败,对后续试验研究的开展有很大的影响。本研究采用改良的CTAB法,成功提取出质量较高的基因组DNA,条带较为清晰、完整、无拖尾,符合SRAP分子标记对DNA质量的要求(图 1)。

      图  1  不同无患子总DNA电泳检测图

      Figure 1.  Electrophoresis of total genomic DNA from 12 different Sapindus mukurossi provenances

      经紫外分光光度计测定,其D260/D280为1.2~2.2(表 3),经纯化均能达到1.8左右的比值。所有样品质量浓度均大于430 μg·L-1,在SRAP分析中可获得较为清晰、稳定的扩增结果产物。

      表 3  无患子总DNA浓度检测

      Table 3.  Concentration detection of total genomic DNA from 12 different Sapindus mukurossi provenances

      序号 产地 D260 D280 D310 D260/D280 DNA质量浓度 (μg·L-1)
      1 广西钦州 0.121 0.089 0.056 1.361 605.0
      2 福建南平 0.149 0.116 0.081 1.285 745.0
      3 福建清流 0.158 0.104 0.05 1.515 790.0
      4 福建三明 0.319 0.157 0.008 2.030 1 595.0
      5 福建漳州龙海 0.342 0.160 -0.006 2.134 1 710.0
      6 福建顺昌高阳 0.219 0.119 0.026 1.834 1 095.0
      7 浙江杭州 0.149 0.097 0.043 1.534 745.0
      8 江西樟树 0.164 0.089 0.013 1.835 820.0
      9 福建顺昌 0.086 0.043 0.002 1.983 430.0
      10 印度 0.156 0.113 0.065 1.377 780.0
      11 福建永安 0.130 0.088 0.045 1.486 650.0
      12 印度(林科院) 0.118 0.085 0.046 1.379 590.0
    • 本试验设定了10个用量梯度(10~100 ng),研究不同模板DNA用量对PCR扩增的影响。模板DNA使用量在设定范围内,都能扩增出几乎相同的清晰条带(图 2)。10 ng时条带比较模糊;70~100 ng时,条带较淡、呈波浪状,20~60 ng时主带比较清晰。DNA较长时间保存会部分降解,致使有效含量降低。考虑到试验时间较长,为避免DNA降解对试验结果的影响,最终选择50 ng作为模板优化用量。

      图  2  模板DNA用量对PCR扩增的影

      Figure 2.  Effect of DNA template concentration on PCR amplification

    • 镁离子浓度对PCR扩增影响较大。镁离子浓度过高时,TaqDNA聚合酶催化非特异性扩增,降低反应的忠实性;反之,镁离子浓度过低时,则又会使TaqDNA聚合酶的活性下降,反应产物减少。当镁离子浓度为1.00 mmol·L-1时,未扩增出条带;当Mg2+浓度为1.25~1.75 mmol·L-1时,条带模糊,出现缺失现象;当镁离子浓度为2.00~2.50 mmol·L-1时,扩增带型基本一致;当镁离子浓度增至2.75,3.00 mmol·L-1时,条带呈弥散趋势(图 3)。高浓度镁离子易产生非特异性产物,为避免高浓度镁离子对后续试验的影响。本研究最终选择2.00 mmol·L-1作为镁离子的优化浓度。

      图  3  锾离子浓度对PCR扩增的影响

      Figure 3.  Effect of Mg2+concentration on PCR amplification

    • dNTPs对SRAP-PCR反应有极其重要的作用,dNTPs浓度过高会增加DNA聚合酶的错配率,而浓度过低又会降低产量。dNTPs浓度为0.05~0.15 mmol·L-1时,条带较少且模糊,0.20~0.25 mmol·L-1时条带较为清晰,在0.30~0.45 mmol·L-1时条带又开始模糊,最终确定0.20 mmol·L-1为dNTPs的优化浓度(图 4)。

      图  4  dNTPs浓度对PCR扩增的影响

      Figure 4.  Effect of dNTPs concentration on PCR amplification

    • TaqDNA聚合酶的用量与反应体积、酶活性等因素有关。一般酶用量过多会使非特异性增加、弥散背景增强,用量过少则会降低产量,使条带不够明亮。当TaqDNA聚合酶用量为0.5×16.67 nkat(0.5 U)和1.0×16.67 nkat(1.0 U)时,条带均较多,但0.5×16.67 nkat(0.5 U)时,条带亮度更佳;当TaqDNA聚合酶用量(0.6~0.9)×16.67 nkat(0.6~0.9 U)时,条带较少;当TaqDNA聚合酶用量为(1.2~2.0)×16.67 nkat(1.2~2.0 U)时,条带少(图 5)。综上,当TaqDNA聚合酶用量为0.5×16.67 nkat(0.5 U)时,扩增效果最理想,以此作为TaqDNA聚合酶的优化用量。

      图  5  TaqDNA用量对PCR扩增的影响

      Figure 5.  Effect of TaqDNA concentration on PCR amplification

    • 引物过多会产生引物二聚体,引物过低则降低产量。在设定的引物浓度范围内,PCR产物量基本相同(图 6)。当引物浓度为0.2~0.4 μmol·L-1有较清晰、一致的条带,且0.4 μmol·L-1时,条带较亮;当引物浓度为0.5~1.0 μmol·L-1开始条带渐变弱,扩增效果不佳,均较模糊。综上,选择0.4 μmol·L-1作为引物的优化浓度。

      图  6  引物浓度对PCR扩增的影响

      Figure 6.  Effect of primers concentration on PCR amplification

    • 本研究用引物组合m2e7和m6e1在无患子材料中进行SRAP-PCR优化反应体系验证,扩增结果比较稳定、条带清晰(图 7),且引物组合m6e1扩增出的多态性条带较引物组合m2e7多,表现出更高的多态性。由此说明,该体系适宜无患子SRAP-PCR反应。

      图  7  优化体系验证图(左m2e7,右m6e1)

      Figure 7.  Optimi山ed system verification(left m2e7, right m6el)

      通过对反应体系的验证,从结果的稳定性和经济性出发,确立了适合无患子的SRAP-PCR反应体系为:在20 μL反应体系中,含模板DNA为50 ng,镁离子 2.0 mmol·L-1,dNTPs 0.2 mmol·L-1,TaqDNA聚合酶0.5×16.67 nkat(0.5 U),引物0.4 μmol·L-1

    • SRAP标记是一种基于PCR的新型分子标记技术,具有以下优点:①有一套通用引物,可任意搭配,通过筛选获取适合引物对,极大降低了引物合成费用。②反应条件相对固定,试验重复性较好,操作简易。因此,在林木种质资源遗传多样性、品种鉴定等方面应用前景广阔[17-19]

      SRAP-PCR反应体系主要包含5个影响因素,即DNA模板、镁离子、dNTPs、引物和TaqDNA聚合酶。各个因素用量不同,将明显影响扩增效果,进而影响SRAP分子标记的可靠性。高质量DNA的获取是PCR成功的根本性因素,DNA中残留的蛋白、酚类等物质,会抑制DNA聚合酶。本研究中,采用改良的CTAB法提取了较高质量的DNA,符合SRAP-PCR反应要求。

      PCR混合物中,DNA模板、引物和dNTPs的磷酸碱基均可与镁离子结合,降低镁离子的实际浓度;而对TaqDNA聚合酶起作用的是游离的镁离子,因此,镁离子加入量应高于dNTPs[13]。本试验中,镁离子浓度比dNTPs 高出1.8 mmol·L-1。PCR扩增产物的大小是由引物限定的,引物浓度过高,不仅会促进非特异性产物的合成,而且还会增加引物二聚体的形成,本研究最终选择0.4 μmol·L-1作为引物的优化浓度。

      本试验采用传统的单因素法,确立了适合无患子的SRAP-PCR反应体系。利用该体系对12个种源地的无患子进行扩增,得到了稳定清晰的条带,效果良好,说明优化后的体系适宜无患子种质资源的分子标记分析,但需对SRAP引物进行筛选。SRAP-PCR优化体系的建立,为SRAP分子标记在无患子地理种源多态性分析、遗传图谱构建、品种鉴定等方面打下良好的基础。

参考文献 (19)

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