Taxonomic study of Cayratia s.l. from Zhejiang, China

用于茎、叶毛被特征观察的9种9个样品和种子形态观察的6种6个样品取自野外采集的标本。样品的凭证标本信息见表1。DNA材料均取自野外采集经硅胶干燥的叶片，凭证标本保存于杭州师范大学植物标本馆(HTC)和浙江自然博物院植物标本馆(ZM)；部分用于系统发育分析的序列下载自GenBank (表2)，系统发育分析共涉及61种(包括种下等级) 73样品(其中外类群4种4样品)。

茎、叶毛被特征用扫描电镜观察。9种共9个样品材料取自采集的腊叶标本，在标本上取下健康成熟的茎段约5 mm长，叶片材料剪取叶片中部，大小约0.5 cm×0.5 cm。将所取的茎、叶材料直接粘贴于样品台上，置于喷金仪内抽真空后溅射式喷金2 min，再置于KYKY-EM 3200扫描电镜下观察并摄像。

观察种子形态的共有6种，6个样品。在对种子样品观察时，先剥去果实外果皮、果肉，取出种子，在清水中揉搓，去除膜质层后晾干。每个种随机取出10粒种子，测量大小(种子长度和宽度)，并在解剖镜下观察和描述种子的背面、腹面洼穴形态和横切胚乳形状，逐一记录后拍照。

DNA提取和PCR扩增：取约0.1 g经硅胶干燥的叶片，利用TIANGEN的植物基因组试剂盒(Plant Genomic DNA Kit)提取样品总DNA，后保存于−20 ℃的冰箱中备用。选取4个叶绿体基因atpB-rbcL、trnC-petN、trnH-psbA和trnL-F进行系统发育分析，所用引物参考SOEJIMA等^[14]、CHEN等^[15]和REN等^[16]。PCR反应体系为25.0 μL，其中包括12.5 μL 2×Reaction Mix，上下游引物各1.0 μL，1.0 μL基因组DNA，0.3 μL Golden DNA Polymerase (TIANGEN，中国)(2.5×16.67 mkat·L⁻¹)和9.2 μL双蒸水。PCR反应程序为：DNA模板94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s和72 ℃延伸1 min (37个循环)，最后72 ℃总延伸5 min。凝胶电泳检测扩增产物，选取条带明显、单一的样品送北京擎科生物公司双向测序。

数据分析：用Lasergene中的SeqMan对测序产物进行拼合，后在MAFFT中比对序列并在BioEdit中进行手动调整和剪切，利用jModeltest分别计算4个叶绿体基因片段的最佳核苷酸模型(atpB-rbcL和trnL-F为GTR+I，trnC-petN和trnH-psbA为GTR+G)，利用SequenceMatrix将4个片段进行拼接。系统发育分析构建了贝叶斯树和最大似然(maximum likelihood, ML)树，利用Mrbayes v3.2.6构建贝叶斯树，用MCMC (Markov chain Monte Carlo)算法搜索10 000 000代，每1000代取1次样，舍弃起始的2 500棵不稳定树(burn in为0.25)，并计算后验概率(PP)。用门户网站CIPRES工具箱中的RAxML-HPC BlackBox构建ML树，其中设置bootstraps为1000，核苷酸替代模型为GTR+G+I。构建完成的系统发育树在FigTree中查看和编辑。

所观察的浙江广义乌蔹莓属9种植物(乌蔹莓属6种和拟乌蔹莓属3种)茎和叶的毛被形态特征见图1。茎上的毛被除了角花乌蔹莓无毛，文采乌蔹莓被多节长柔毛外，其他7种均疏被短柔毛。叶片背面的毛被，乌蔹莓、薄叶乌蔹莓、尖叶乌蔹莓、山地乌蔹莓、华东拟乌蔹莓等5种沿中脉和侧脉疏被短柔毛，角花乌蔹莓为无毛，文采乌蔹莓则被多节长柔毛；美丽拟乌蔹莓叶片背面仅中脉和侧脉密被伏生柔毛，而白毛拟乌蔹莓叶片背面密被开展柔毛。可见，茎和叶片背面的毛被在种间存在一定的差异。

Figure 1.  Indumentum of stem and leaf of Cayratia s.l. in Zhejiang

浙江乌蔹莓属4种和拟乌蔹莓属2种植物的种子形态和横切胚乳形态特征如图2及表3。所有种子背腹面外形均为宽倒卵形，大小有差异，最小的是文采乌蔹莓(3.88~4.20 mm×3.18~3.91 mm)，最大的是华东拟乌蔹莓(6.23~7.48 mm×5.30~5.94 mm)，属内(乌蔹莓属4种间、拟乌蔹莓属2种间)无显著差异，但这2属之间种子大小存在显著差异(P＜0.05)。乌蔹莓属4种的种子背面具明显横棱纹，但数目有差异，拟乌蔹莓属2种的种子背面无横棱纹；所有种的种子腹面具突出的中棱脊，两侧具洼穴。洼穴形状和凹陷程度在属间有差异。种子横切面乌蔹莓属4种植物为M型，而拟乌蔹莓属2种为T型。

Figure 2.  Seed morphology of Cayratia s.l. in Zhejaing

联合4个叶绿体基因片段总长度为3478 bp，atpB-rbcL、trnC-petN、trnH-psbA和trnL-F分别为914、993、497和1074 bp。构建的贝叶斯树和植物系统发育树树形一致，崖爬藤属Tetrastigma、拟乌蔹莓属Pseudocayratia、乌蔹莓属Causonis、大麻藤属Cayratia和苦蔹藤属Afrocayratia均为单系类群并且有很高的支持率(后验概率为1.00，自展值为100%)(图3)。其中：浙江产崖爬藤属、拟乌蔹莓属和乌蔹莓属3属，在拟乌蔹莓属支中。浙江所产3种为美丽拟乌蔹莓、白毛拟乌蔹莓和华东拟乌蔹莓，美丽拟乌蔹莓2个个体和白毛拟乌蔹莓2个个体组成1支(后验概率为0.97，自展值为74%)，但在支内两者无法区分；在乌蔹莓属中，浙江有6种：薄叶乌蔹莓、乌蔹莓、尖叶乌蔹莓、文采乌蔹莓、山地乌蔹莓和角花乌蔹莓，薄叶乌蔹莓的3个个体、乌蔹莓8个个体和尖叶乌蔹莓2个个体组成1支(后验概率为1.00，自展值为97%)，但在支内三者混杂，无法区分。

Figure 3.  Maximum likelihood tree for Cayratia s.l. based on the combined chloroplast data sets

茎和叶的毛被是以往广义乌蔹莓属分类的重要依据之一^[1-2]。对浙江乌蔹莓属和拟乌蔹莓属9植物的茎、叶毛被扫描电镜观察结果显示：其毛被较为稳定，其叶片背面沿脉的毛被在种间具有差异，分别疏被短柔毛(乌蔹莓、山地乌蔹莓、薄叶乌蔹莓、尖叶乌蔹莓和华东拟乌蔹莓)、多节长柔毛(文采乌蔹莓)、无毛(角花乌蔹莓)、密被柔毛(白毛拟乌蔹莓和美丽拟乌蔹莓)，可见毛被特点在近似种之间具有可区别的差异，如角花乌蔹莓和文采乌蔹莓、美丽拟乌蔹莓和华东拟乌蔹莓之间，但乌蔹莓属和拟乌蔹莓属之间尚无法判断是否存在差异。

种子形态是广义乌蔹莓属分亚属(或组)的重要依据^[1-2]，是分属的重要依据^[10–13]。所观察的浙江6种植物而言，乌蔹莓属和拟乌蔹莓属之间在种子大小、背面是否具横棱纹、腹面洼穴形态和种子横切面形态存在本质区别，可以作为这2个属的区别特征。

除了毛被类型、种子形态外，小叶片数目、叶缘锯齿数目与形态，叶柄、小叶柄长短，卷须分枝数目，花瓣先端形态等常作为分种(或变种)的依据^{[1-4, 7]}。值得注意的是，乌蔹莓属植物花序均为上举，但果序有上举与下垂2类，果序总梗、果梗的颜色有红色与绿色2类，果实成熟前的颜色变化有由红色转黑色、由绿色转黑色、由绿色转白色、淡蓝紫色转黑色等类型；花盘的颜色在初花时至花后期也会发生变化；种子新鲜时和压干制作标本以后的形状变化。以上形态性状在标本室难以观察，故而也是腊叶标本容易被误定的主要原因。

本研究的系统发育分析和以往研究结果一致，均证实了崖爬藤属、拟乌蔹莓属、乌蔹莓属、大麻藤属和苦蔹藤属为单系类群，承认了这些属的独立地位^[10-12]。以往认为：浙江产的广义乌蔹莓属植物现分为2属：拟乌蔹莓属和乌蔹莓属，前者现知3种，分别为美丽拟乌蔹莓、白毛拟乌蔹莓和华东拟乌蔹莓，其中美丽拟乌蔹莓和白毛拟乌蔹莓在系统发育树上亲缘关系最近且无法区分，但在形态上后者叶柄、小叶柄、小叶片背面(至少中、侧脉上)均密被灰白色开展柔毛，有一定的区别，茎叶毛被作为种下等级处理较为合适。乌蔹莓属有6种，其中尖叶乌蔹莓和薄叶乌蔹莓在系统发育树上与乌蔹莓无法区分开，但在形态上，尖叶乌蔹莓小叶3 (稀4或5)，中央小叶片具4~7对侧脉，边缘每侧有2~9 (12)浅钝齿，卷须不分枝(稀2分枝)，花盘黄色，花后转白色；而薄叶乌蔹莓花盘黄色，花后转白色，果实幼时中上部常缢缩，呈乳头状、倒梨形或葫芦形，与乌蔹莓有明显区别。

综合考虑形态特征、种子形态和系统发育关系等多方面的证据，将薄叶乌蔹莓和白毛拟乌蔹莓分别作为乌蔹莓和美丽乌蔹莓的亚种处理，尖叶乌蔹莓归属发生改变，故作出如下组合。

Causonis japonica (Thunb.) Raf. subsp. tenuifolia (Wight et Arn.) X. F. Jin et Z. H. Chen, comb. et stat. nov. − Vitis tenuifolia Wight et Arn., Prodr Fl Ind Orient,1834, 1: 129. − Cayratia tenuifolia (Wight et Arn.) Gagnep., Notul Syst (Paris), 1911, 1: 348.

《中国植物志》第48卷第2分册^[1]未对薄叶乌蔹莓作处理，而CHEN等^[2]在Flora of China中将其处理为乌蔹莓的异名。从形态上看，薄叶乌蔹莓的花盘黄色，花后转白色，果实幼时中上部常缢缩，呈乳头状、倒梨形或葫芦形；乌蔹莓的花盘橙黄色，花后通常变为粉红色，浆果近球形。薄叶乌蔹莓主要分布在浙江滨海地区，乌蔹莓主要为山地分布。从系统发育关系树上看，薄叶乌蔹莓的3个个体嵌套于乌蔹莓的个体之中。本研究认为将薄叶乌蔹莓作为乌蔹莓的亚种处理较合适。

Causonis japonica (Thunb.) Raf. subsp. pseudotrifolia (W. T. Wang) Z. H. Chen, Y. F. Lu et X. F. Jin, comb. et stat. nov. —— Cayratia pseudotrifolia W. T. Wang, Acta Phytotax Sin, 1979, 17(3): 79. —— Cayratia japonica (Thunb.) Gagnep. var. pseudotrifolia (W. T. Wang) C. L. Li, Chin J Appl Environ Biol, 1996, 2(1): 51.

王文采^[3]在发表新种尖叶乌蔹莓时，明确指出其为叶片3小叶，有时可为4或5小叶。李朝銮^[6]将其作为乌蔹莓的变种处理，CHEN等^[2]也采纳这个观点。从浙江的材料来看，小叶3，稀4或5，中央小叶片具4~7对侧脉，边缘每侧具2~9 (12)个浅锯齿，卷须不分枝，稀具2分枝，花盘黄色，花后变为白色；乌蔹莓的鸟足状复叶具5小叶，中央小叶片具5~9对侧脉，边缘每侧具6~12 (15)个锯齿，卷须具2或3分枝，花盘橙黄色，花后通常变为粉红色。系统发育树显示尖叶乌蔹莓的2个个体也嵌套于乌蔹莓种，故作为亚种处理，并作了转隶组合。

Pseudocayratia speciosa J. Wen et L. M. Lu subsp. pengiana (T. W. Hsu et J. Wen) Z. H. Chen, Y. F. Lu et X. F. Jin, comb. et stat. nov. —— P. pengiana T. W. Hsu et J. Wen, J Syst Evol, 2018, 56: 378.

WEN等^[11]在建立新属拟乌蔹莓属时，共收录了2个新种和3个新组合种，认为新种P. pengiana与另一新种P. speciosa的区别在于叶片背面均被短柔毛，沿脉尤密。这与本研究所观察的完全一致(包括扫描电镜结果)。但当时系统发育分析时，P. pengiana仅1个个体，与本次研究结果不同。本研究增加了浙江的P. pengiana和P. speciosa各1个个体后发现，两者在系统树上无法区分。因此，将P. pengiana作为P. speciosa的亚种更为合理。

杭州植物园教授级高级工程师裘宝林先生指导并审阅全文，浙江清凉峰国家级自然保护区高级工程师张宏伟先生、代英超女士协助采集标本。在此一并致谢！