Role of flavonoids and mining of drought-tolerant genes in the drought response of Opisthopappus taihangensis

选用抗旱种质太行菊和干旱敏感种质菊花脑为研究材料，均栽培于温室。2种材料的扦插苗先在体积比为1∶1的蛭石与珍珠岩基质中生根，随后移栽至体积比为6∶3∶1的草炭、珍珠岩与松针土基质中培养45 d。培养条件为光周期12 h光照/12 h黑暗、温度25 ℃、相对湿度60%。

选取生长状态良好且一致的植株，将扦插苗的根部用去离子水清洗干净后转入霍格兰德(Hoagland)营养液培养，缓苗7 d后进行干旱胁迫模拟。干旱模拟采用200 g·L⁻¹聚乙二醇6000 (PEG 6000)，并设置复水处理。共设7个处理：0、3、6、9、12、24 h干旱胁迫和胁迫后复水24 h。每个处理分别对叶片和根系进行取样，部分样品经锡纸包裹和液氮速冻后，保存于−80 ℃超低温冰箱，用于RT-qPCR检测；部分样品经阴干、粉碎、过40目筛后，保存于干燥器，用于黄酮类化合物测定。每个处理设置3个生物学重复。

芦丁标准曲线建立参考刘海芳等^[22]并稍做改动，具体步骤如下：精准称取芦丁对照品20.00 mg，溶解于体积分数为1%的盐酸-甲醇溶液，制备成0.2 mg·mL⁻¹的储备液，于4 ℃保存备用。采用硝酸铝络合-紫外分光光度法建立标准曲线，将储备液稀释为不同质量浓度(0、0.008、0.016、0.024、0.032、0.040、0.048 mg·mL⁻¹)的标准品，在紫外可见分光光度计中于波长510 nm处分别检测吸光度。用最小二乘法进行线性拟合，得质量浓度(y)与吸光度(x)的线性回归方程为y=13.576x+0.003 6 (R²=0.999 8)。

精准称取5种类黄酮类标准品(芦丁、木犀草素、槲皮素、山奈酚和芹菜素)各10.00 mg，分别溶解于甲醇制备成的0.2 mg·mL⁻¹储备液。随后，将储备液稀释成20 ng·mL⁻¹的混标工作液，用于高效液相色谱(HPLC)分析。检测条件如下：色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB-C18柱，柱温为30 ℃，流速为1.0 mL·min⁻¹，进样量为10 μL，检测波长为254 nm。流动相A相为甲醇，B相为体积分数为0.01%的磷酸水溶液，梯度洗脱程序如下：0~40 min，体积分数为25%的A；40~41 min，62.5%~100%A；41~56 min，100%A；56~57 min，100%~25%A；57~67 min，25%A，以实现5种标准品的良好分离。为确保测定准确性，在全部样品分析完成后，根据各化合物的峰面积选定其标准曲线的线性范围，并建立线性回归方程用于定量分析(表1)。

供试色谱仪：Agilent1100高效液相色谱仪。供试试剂：芦丁(153-18-4，HPLC≥98%)、木犀草素(491-70-3，HPLC≥98%)、槲皮素(117-39-5，HPLC≥98%)、山奈酚(520-18-3，HPLC≥98%)、芹菜素(520-36-5，HPLC≥98%)，均购自上海源叶公司。色谱纯甲醇(67-56-1)、磷酸(7664-38-2)购自艾览公司；超纯水由超纯水机CASCADA制得。

分别精准称取0.20 g太行菊及菊花脑样品，加入10 mL 体积分数为1%的盐酸-甲醇溶液4 ℃静置4 h，离心过滤后用体积分数为1%的盐酸-甲醇溶液定容至25 mL容量瓶中，为样品溶液。平行制备3份样品溶液，将样品溶液浓度稀释至40%，按1.3.1方法测定吸光度，根据芦丁线性回归方程计算。

黄酮类物质提取及检测参考孙翊等^[23]并稍做改动，具体步骤如下：分别精准称取0.20 g太行菊及菊花脑样品，加入1.5 mL 体积分数为1%的盐酸-甲醇溶液4 ℃避光提取24 h，每8 h震荡1次。离心后0.22 μm微孔滤膜过滤，为样品溶液。平行制备3份样品溶液用于HPLC检测，HPLC检测条件同1.3.2。据5种物质的线性回归方程计算样品溶液中黄酮类物质的质量浓度。

以拟南芥AtMYB12基因的蛋白质序列为查询序列^[24]，使用BLASTP v2.5.0+在太行菊转录组及其他18个被子植物的基因组中搜索对应的同源基因，E-value 阈值设为1.0×10^−5[25]。为进行系统发育分析，各基因的氨基酸序列使用MAFFT v7.505进行比对^[26]，并通过PAL2NAL v14生成对应的基于密码子的核苷酸比对^[27]。随后使用IQ-TREE 2.1.4-beta构建最大似然系统发育树(maximum likelihood tree)，参数设置为“-bb 1000 -nt AUTO”^[28]，并利用MEGA11进行可视化^[29]。本研究用到的转录组和基因组数据均下载于已发表论文或者公共数据库(表2)。

取太行菊胁迫各阶段根系及叶片于液氮中研磨，使用OMEGA试剂盒提取太行菊RNA。根据Takara试剂盒说明书，采用两步法进行反转录实验。RT-qPCR引物由Integrated DNA Technologies在线设计，基因的表达水平以OtActin基因为内参。

以太行菊cDNA为模板进行PCR扩增，扩增产物经电泳分离回收后进行连接并转化大肠埃希菌Escherichia coli，挑取单克隆菌落测序验证。选择Kpn I作为酶切位点进行无缝克隆，构建pSuper1300::OtMYB12::GFP重组载体，并采用唯地公司冻融法将载体转化入农杆菌Agrobacterium tumefaciens GV3101。配置侵染液后，将重组质粒注射入烟草Nicotiana benthamiana叶片，暗培养3 d。随后将注射叶片切块制片，并在激光共聚焦显微镜下进行观察。

由图1A可见：在太行菊中，无论是根还是叶片，总黄酮质量分数总体均随干旱胁迫时间持续上升，在胁迫24 h时达最大，分别为0.561和 6.929 mg·g⁻¹；复水24 h后，总黄酮质量分数下降，但与胁迫24 h差异不显著。菊花脑中干旱胁迫及复水后总黄酮变化趋势类似于太行菊，但复水处理后，菊花脑叶片总黄酮质量分数仍略有上升，与胁迫24 h时差异不显著。太行菊根和叶片中的总黄酮质量分数均高于菊花脑。上述结果表明：虽然干旱胁迫均可诱导黄酮类物质积累，但太行菊在黄酮合成与储存方面表现出更高的能力，可为其优异抗旱性提供生理基础。

Figure 1.  Changes of total flavonoids and 5 flavonoids in root and leaves of 2 species of Asteraceae under drought and rehydration

在干旱胁迫响应过程中，不同黄酮类物质的积累式样可能存在差异。由图1B~E可见：在太行菊叶片中，芦丁、木犀草素、槲皮素和芹菜素质量分数总体在干旱处理后随胁迫时间延长均上升，均在胁迫24 h达峰值，显著高于其他处理(P＜0.05)，复水后下降，其中，木犀草素和芹菜素质量分数在复水24 h后与胁迫24 h时差异不显著，而槲皮素差异显著(P＜0.05)。在太行菊的根中，木犀草素质量分数虽变化幅度不大，但整体趋势仍表现为随干旱胁迫延长而上升，在胁迫12 h时达峰值，复水后下降，但复水24 h与胁迫24 h时差异不显著；芦丁和槲皮素质量分数虽表现为干旱胁迫下上升、复水后下降，但上升与下降趋势均不显著。上述几类物质，在菊花脑叶片中仅检测到2种(芦丁和木犀草素)，且二者在复水后仍呈上升趋势，但与胁迫24 h时差异不显著；在菊花脑的根中积累非常少，未呈现明显积累规律。如图1F可知：山奈酚的积累模式最为特殊，且在2个物种中较为保守：随干旱延长而上升，于胁迫9 h时达峰值，随后显著下降(P＜0.05)，复水后变化不显著。

在干旱胁迫响应过程中，不同黄酮类物质的总量也可能存在差异。在太行菊叶片中，4种黄酮类物质质量分数均在胁迫24 h时达到峰值，其中，芦丁质量分数最高，达2.939 mg·g⁻¹；其次为木犀草素、槲皮素和芹菜素，分别为1.635、0.142 和0.078 mg·g⁻¹；叶片中未检测到山奈酚。在太行菊的根中，芦丁质量分数最高，为0.648 mg·g⁻¹；木犀草素和山奈酚相对较低，分别为0.474和0.172 mg·g⁻¹；而槲皮素积累极为微量，且未检测到芹菜素。胁迫24 h时，太行菊根与叶中的芦丁和木犀草素质量分数均显著高于菊花脑(P＜0.05)；太行菊根中槲皮素和山奈酚质量分数低于菊花脑，但并无显著差异。

上述结果表明：干旱胁迫均可诱导2种植物黄酮类化合物积累，但不同化合物在不同器官中的积累优势存在差异：太行菊叶片以芦丁为主，但根部差异较小，这说明不同成分可能在不同器官中发挥特异性作用。同时，太行菊在多数黄酮类化合物的合成与储存能力上均明显优于菊花脑，进一步凸显其在干旱适应方面的优势。

为鉴定太行菊中参与黄酮类物质合成、响应干旱胁迫的关键基因，进行了同源搜索和系统发育分析。由图2可见：在太行菊转录组中筛选到一个胁迫后显著上调的基因MYB12，命名为OtMYB12。进化分析显示：该基因在太行菊的进化过程中未经历基因重复或丢失事件，始终保持单拷贝状态。上述结果表明：OtMYB12进化较为保守，其功能可能与其他物种中的MYB12一致，主要参与调控黄酮类化合物的合成。

Figure 2.  Phylogenetic tree of MYB12

为明确OtMYB12在干旱响应过程中的作用，对干旱胁迫及复水处理后其表达动态进行了检测。由图3A~B可见：无论在叶片还是根部，OtMYB12的表达量均随胁迫时间延长升高，在胁迫24 h时达到峰值，复水24 h后显著下调(P＜0.05)，其表达趋势与干旱及复水条件下黄酮类化合物质量分数的变化高度一致。对部分黄酮合成结构基因进行了检测，由图3C~J可见：OtMYB12与黄酮合成结构基因表达趋势基本一致。上述结果表明：OtMYB12可能参与调控太行菊黄酮类化合物的生物合成，并在干旱胁迫响应中发挥重要作用。

Figure 3.  Expression changes of OtMYB12 and flavonoid biosynthetic structural genes under drought stress and rehydration

由图4可见：绿色荧光蛋白(GFP)空载荧光信号定位于细胞核和细胞膜，而太行菊OtMYB12荧光信号定位于细胞核中，表明OtMYB12于细胞核中发挥调控作用，符合转录因子的特征。

Figure 4.  Confocal images of transiently expressed GFP fusions in leaves of Nicotiana benthamiana

植物生长发育过程中，黄酮类物质在多种胁迫中发挥着关键调控作用，如干旱胁迫下类黄酮含量增加可降低白车轴草Trifolium repens 的ROS含量^[50]；拟南芥中黄酮类化合物可能通过激活抗氧化系统间接提高渗透调节能力，从而提高耐旱性^[51]。本研究结果表明：干旱胁迫可同时诱导太行菊和菊花脑体内黄酮类物质积累，与前人研究结果相似。但太行菊在黄酮合成与调节方面表现出了更高的能力，无论是根还是叶片，总黄酮量均显著高于菊花脑，可能是其优异抗旱性的生理基础。5种黄酮类物质质量分数变化进一步揭示了黄酮类物质在太行菊干旱胁迫中的作用。在太行菊叶中，芦丁的质量分数最高，而根部各种黄酮类物质的积累差异较小。这种特异性积累模式暗示了不同化合物可能在不同部位行使特异性的功能，如刺桐Erythrina variegata根中类黄酮可能吸引土壤微生物，从而调节胁迫下的水分状况^[52]；干旱胁迫下黄酮类化合物(橙皮苷、异泽兰黄素等)在蓝莓Vaccinium uliginosum叶中显著积累，赋予蓝莓更强的耐旱性^[53]。

分子水平上，黄酮类合成途径关键调控转录因子OtMYB12在干旱胁迫下表现出显著差异表达。系统发育分析表明：该基因在太行菊的进化过程始终保持单拷贝状态，这暗示着OtMYB12进化较为保守，可能与其他物种中MYB12一样参与黄酮类生物合成途径，为太行菊的优异抗旱性提供了分子基础。拟南芥中AtMYB11、AtMYB12、AtMYB111通过控制局部黄酮醇积累特异性介导气孔运动，从而维持细胞内的活性氧稳态^[54]；AtMYB12通过调控乙烯和生长素介导的黄酮合成通路，控制拟南芥黄酮类化合物合成^[55]；梨中PbMYB12通过靶向PbCHS、PbFLS正向调控黄酮醇合成^[56]。本研究所选择的OtMYB12如何深入参与黄酮类生物合成途径，有待进一步研究。

干旱胁迫下太行菊、菊花脑的总黄酮质量分数均显著升高，但太行菊根和叶片中总黄酮质量分数均高于菊花脑，且在多数黄酮类化合物的合成与调节能力上均明显优于菊花脑。此外，通过荧光定量和系统发育分析，发现OtMYB12定位于细胞核中，表达动态与黄酮类化合物及其结构基因的变化趋势高度一致，且它的进化较为保守，可能同样参与调控太行菊黄酮类生物合成途径。本研究不仅揭示了黄酮类化合物在太行菊干旱胁迫响应中的作用，也为抗旱菊花新品种培育提供了可利用的基因资源。