Effects of cultivation modes on phenotype, kinsenoside content and non-green leaf coloration in Anoectochilus roxburghii

以苗高为5~6 cm的尖叶品系金线莲瓶苗(购自浙江省金华市荆龙生物科技有限公司)为种苗，分别经组织培养(图1A)、大棚种植(图1B)和林下种植(图1C) 3个月后，获组培苗、林下苗和大棚苗(图1D~F)。组织培养在浙江农林大学中药学科组培室(30.15°N, 119.43°E)进行，培养条件：温度为(25±2) ℃、光周期为16 h光照/8 h黑暗，相对湿度为75 %。大棚种植在浙江农林大学百草园(30.15°N，119.43°E)，种植条件：气温为(25±2) ℃，光照条件为自然光加适当补光至光周期为16 h光照/8 h黑暗，相对湿度为75 %，用兰科植物专用土穴盘种植。林下种植在浙江省杭州市杨村桥金线莲种植基地(29.57°N，119.45°E)，种植条件：白天及晴天时，杉木Cunninghamia lanceolata林下自然光照及温度，夜间低温及雨天通过覆盖塑料膜控制温度及雨水量，杉木林下原土种植。3种栽培模式在2024年及2025年4月中旬至6月中旬各重复1次，共2次。采集组培苗、大棚苗和林下苗用于表型分析。采集金线莲全草、根、茎和叶，用于测定金线莲苷及其差向异构体质量分数。采集叶片用于代谢组学分析。

Figure 1.  Cultivation modes, plant and leaf phenotypes of A. roxburghii

观察和测定组培苗、大棚苗和林下苗单株生物量、茎长和茎直径、叶片数目和叶片面积、根数和根长等指标。利用显微镜分析茎段纵切面和叶片下表皮细胞形态，并记录细胞长度、细胞宽度、单位面积内表皮细胞的数量。每种栽培模式取样10株用于表型分析。观察金线莲叶片表面颜色，并利用ImageJ软件中红色(R)、绿色(G)和蓝色(B)检测方法对叶片表面颜色进行数值化分析，叶片表面颜色值= 0.299R+0.587G+0.114B，叶片表面非绿色颜色值= 0.299R+0.114B。每种栽培模式取30片叶片进行分析。

金线莲中金线莲苷及差向异构体的分离、提取及质量分数测定参照本课题组已发表的方法^[18－19]。金线莲苷及其差向异构体标准曲线参照已发表文献[19]。

非靶向代谢组利用液相色谱-质谱联用(LC-MS，LC, Vanquish UHPLC, Thermo Fisher; MS, Q Exactive™ HF-X, Thermo Fisher)检测，由北京诺禾致源科技股份有限公司完成。称取样本(100 mg)置于500 µL的80%甲醇中匀浆，冰浴5 min，15 000 r·min⁻¹离心20 min。上清液经0.22 µm滤膜过滤后，备用。所有样品重复6次。LC-MS分析采用电喷雾电离正离子(ESI⁺)和电喷雾电离负离子(ESI⁻)模式。色谱分离条件：Hypersil Gold C18色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.9 μm)，柱温为 40 ℃，进样体积为2 µL，流速为 0.2 mL·min⁻¹。ESI⁺离子模式用0.1%甲酸水(A)和甲醇(B)梯度洗脱，ESI⁻离子模式用5 mmol·L⁻¹醋酸铵(pH 9.0)(A)和甲醇(B)梯度洗脱。ESI⁺和ESI⁻离子模式洗脱条件：2% B (0~1.5 min)，2%~85% B (1.5~3 min)，85%~100% B (3~10 min)，100%~2% B (10~11 min)，2% B (11~12 min)。电喷雾电离(ESI)源设置：喷雾电压为3.5 kV，鞘气流速为3 510 L·min⁻¹，辅助气流速为10 L·min⁻¹，离子传输管温度为320 ℃，辅助气加热器温度为350 ℃。质谱(MS)扫描范围[ 质荷比(m/z)]为100~1 500，原始LC-MS/MS数据利用Compound Discoverer 3.1软件进行峰对齐、提取与定量，参数设置：保留时间偏差为0.2 min和质量偏差为5×10⁻⁶ 进行峰对齐，设置质量偏差为510⁻⁶、信号强度偏差30%、信噪比3、最小信号强度、加和离子等信息进行峰提取和代谢物定量。整合目标离子，经与mzCloud、mzVault和Masslist数据库比对对定量结果进行标准化处理，获得代谢物的鉴定和相对定量结果。使用京都基因与基金组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)数据库、人类代谢组数据库(Human Metabolome Database，HMDB)和脂质图谱数据库(Lipid Metabolites and Pathways Strategy，LIPID MAPS)进行注释。使用metaX对数据转换后进行主成分分析(principal components analysis，PCA)和偏最小二乘法判别分析(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)，获得代谢物变量重要性投影值(关于VIP(variable importance in projection，VIP)。计算2组间代谢物差异倍数(fold change，FC)，并通过t检验计算2组间各代谢物差异显著性(P)，筛选差异代谢物(DAMs)参数为：VIP＞1，P＜0.05， 同时满足FC≥1.5 或 FC≤0.67，其中 VIP＞1 保证代谢物具备区分2组样本的模型分类能力；P＜0.05 保障差异的统计学可信度；FC阈值用于筛选具有显著生物学变化幅度的代谢物，最终获得DAMs。绘制 DAMs 交集韦恩图，解析其在各比较组中的分布特征。

宏观和微观表型指标、金线莲苷及其差向异构体质量分数用平均值±标准差表示，利用SPSS 27.0分析样品差异显著性。

与组培苗相比，林下苗和大棚苗植株高大，茎较长，叶片面积大，根数多，根更长(图1)，且林下苗这些表型略优于大棚苗。表型指标测定结果与观察结果一致，林下苗和大棚苗单株生物量、茎长、叶片面积和根长均显著(P＜0.05)高于组培苗(表1)，说明植株大小、茎长、叶片面积、根长是区分林下苗、大棚苗和组培苗的重要指标。

分析3种栽培模式金线莲茎段纵切面细胞形态可知：组培苗茎段纵切面细胞呈长梭形，细胞壁较厚，细胞间隙小，纵向紧密排列(图2A)。林下苗茎段纵切面细胞呈长纺锤形，细胞壁较薄，细胞间隙略大，纵向疏松排列(图2B)。大棚苗茎段纵切面细胞呈短纺锤形，细胞壁较厚，细胞紧凑排列(图2C)。林下苗单个细胞最长、最宽，大棚苗单个细胞长度、宽度居中，组培苗单个细胞最短、最窄(表2)。该结果与3种栽培模式金线莲茎长和茎直径表型差异一致，说明栽培模式通过影响细胞形态、大小和排列方式影响茎长。分析金线莲叶片下表面表皮细胞形态、气孔形态及气孔数目可知：3种栽培模式金线莲叶片下表面表皮细胞均呈不规则多边形，叶绿体少(图2D~F)。气孔呈卵圆形或椭圆形，由2个肾形保卫细胞和2~3个形态不规则副卫细胞组成，气孔张开或关闭(图2D~F)。其中，组培苗叶片表皮细胞垂周壁较平直，细胞排列紧密且规则，细胞间隙较小(图2D)，气孔数目居中(表2)。林下苗叶片表皮细胞垂周壁呈波浪状弯曲，细胞排列较疏松，细胞间隙较大(图2E)，气孔数目最少(表2)。大棚苗叶片表皮细胞垂周壁平直，细胞排列疏松且杂乱，细胞间隙明显(图2F)，气孔数目最多(表2)。该结果说明栽培模式通过影响表皮细胞形态、大小和排列方式影响叶片面积。

Figure 2.  Longitudinal sections of stems and microscopic structures of the lower leaf surface of A. roxburghii under 3 cultivation modes

3种栽培模式金线莲叶片下表面呈淡红棕色(图1D~F)。组培苗叶片上表面为淡绿色，具淡黄色叶脉(图1G)；林下苗叶片上表面为深绿色，具金红色叶脉(图1H)；大棚苗叶片上表面颜色为墨绿色，具金黄色叶脉(图1I)。3种栽培模式金线莲叶片呈色各异，具有“一种栽培模式，一种叶片颜色”特征，并呈现显著的“上深下浅”模式。对3种栽培模式叶片上表面颜色进行数值化分析，数值越大，表明叶片表面颜色越浅，反之越深。3种栽培苗中，组培苗叶片颜色数值最大，大棚苗叶片颜色次之，林下苗叶片表面颜色数值最低(表3)。叶片颜色数值化分析结果与叶片颜色表型差异基本一致，说明叶片颜色是区分3种栽培模式金线莲的核心指标。

从3种栽培模式金线莲叶片中共鉴定到1 266种代谢物。主成分分析结果显示：3种栽培模式金线莲代谢组沿2个主成分明显分开，同一栽培模式样品聚在一起，说明3种栽培模式金线莲叶片代谢组差异显著(图3A)。分析林下苗对比组培苗、大棚苗对比组培苗2个比组中的DAMs数量。结果表明：DAMs数量分别为156种(80种上调，76种下调)和348种(181种上调，167种下调，图3B)。2个比较对中共有DAMs 74种(30种上调，44种下调)，林下苗对比组培苗和大棚苗对比组培苗中组别特异性上调DAMs分别有50和151种(图3C)，组别特异性下调DAMs分别有32和123种(图3D)，说明3种栽培模式金线莲叶片中DAMs积累模式存在明显差异。这些数据为解析栽培模式对叶片中金线莲苷积累和呈色影响奠定了基础。

Figure 3.  Metabolomics of A. roxburghii under 3 cultivation modes

从2个比较对的上调DAMs中共筛选到15种呈色相关代谢物，全部为黄酮醇(图4和表4)，说明黄酮醇是3种栽培模式金线莲叶片呈色的主要色素。这15种代谢物在3种栽培模式金线莲叶片中积累模式分为2类：第1类包括红景天苷、槲皮素-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-半乳糖苷、山奈酚、槲皮素-3β-吡喃葡萄糖基-6′-乙酸酯、芦丁、槲皮素、槲皮素-3-β-D-葡萄糖苷和鼠李素。这些代谢物在林下苗叶片中相对含量最高，大棚苗叶片中相对含量次之，组培苗叶片中相对含量最低(图4和表4)。这些代谢物在金线莲叶片中的积累模式与叶片颜色表型差异一致，其中，6种代谢物积累模式与叶片颜色数值差异显著负相关(P＜0.05，图4)，表明这6种黄酮醇是3种栽培模式金线莲叶片呈色的主要色素，红景天苷、山奈酚-3-O-半乳糖苷和山奈酚非显著负相关，暗示代谢物在3种栽培模式金线莲叶片呈色中或具有重要作用。第2类包括：杨梅素-3-O-半乳糖苷、杨梅素、杨梅苷、异鼠李素、异鼠李素-3-葡萄糖苷和槲皮素-3,4′-二葡萄糖苷。这些代谢物在林下苗和大棚苗叶片中相对含量相似，高于组培苗叶片中相对含量(图4和表4)，其积累模式与叶片颜色差异相似，其中，杨梅苷和槲皮素-3,4′-二葡萄糖苷积累模式与叶片颜色数值显著负相关(P＜0.05)。以上结果说明：在金线莲叶片呈色中，这些代谢物或具有重要作用。另外，在2个比较对下调DAMs中筛选到飞燕草素葡萄糖苷和矮牵牛素-3-O-芸香糖苷2种花青素，这2种代谢物在组培苗中相对含量高于林下苗和大棚苗，其积累模式与金线莲叶片呈色表型相反，其中，飞燕草素葡萄糖苷积累模式与颜色数值显著正相关(P＜0.05)，矮牵牛素-3-O-芸香糖苷积累模式与颜色数值非显著正相关(图4和表4)，说明它们在3种栽培模式金线莲叶片呈色中作用微弱。

Figure 4.  Distribution of kinsenoside and color-related metabolites in A. roxburghii under 3 cultivation modes, and correlation analysis between color-related metabolites and leaf color value

利用HPLC-ELSD分析3种栽培模式金线莲全草、根、茎和叶片中金线莲苷及其差向异构体质量分数，所有组织中均检测不到金线莲苷差向异构体，只含有金线莲苷(表5和图5)，因此，3种模式栽培的均为金线莲苷型金线莲，说明栽培模式不影响金线莲化学型。金线莲茎和叶片中金线莲苷质量分数远高于根中，均呈地上部分优势分布，说明栽培模式不影响金线莲苷分布模式。林下苗全草、根、茎和叶片中金线莲苷质量分数均最高，组培苗中次之，大棚苗中最低，说明栽培模式影响金线莲苷质量分数。利用代谢组学和HPLC-ELSD分析3种栽培模式中金线莲苷积累模式，分析结果一致(图1、图4、表1和表5)，说明这2种分析方法都可以准确对金线莲中金线莲苷进行定性定量分析。

Figure 5.  Chromatograms of kinsenoside and its isomer of A. roxburghii under 3 cultivation modes

金线莲兼具药用和观赏价值，然而，金线莲野生资源濒临枯竭，市售金线莲产品以人工栽培为主。组织培养、大棚种植及林下种植是人工栽培金线莲的主要模式。通过分析3种栽培模式金线莲株型大小、茎长和茎直径、叶片面积和根长，可有效区分组培苗、大棚苗和林下苗。茎段纵切面及叶片下表面细胞的形态、大小与排列方式存在差异，这是导致3种栽培模式金线莲茎长和叶片面积不同的根本原因。通过宏观观察、微观表征结合数字化分析金线莲表型特征来区分3种栽培模式的金线莲，契合传统中药材“辨状论质”的核心本质^[20−22]。在3种栽培模式中，林下苗的单株生物量最大，叶片面积最大，茎长、茎直径与根长度也最大，表明林下种植是提升金线莲产量的有效策略。

色泽是中药材“优形”的典型表现之一，也是“辨状论质”的核心内容^[21]。3种栽培模式金线莲叶片呈色各异，提示栽培模式是影响金线莲叶片呈色的重要因素。其中，林下苗叶片表面颜色最深，预示通过林下种植有望实现优色金线莲的精准育种。植物外在色泽的形成，根本原因在于内在色素的积累^{[21, 23−24]}，黄酮醇、花青素、类胡萝卜素及甜菜素是植物中常见的4类非绿色色素^[23−29]。本研究在林下苗对比组培苗、大棚苗对比组培苗的上调DAMs中只筛选到黄酮醇，表明DAMs是引发3种栽培模式金线莲叶片非绿色呈色差异的关键色素，也是导致不同品系金线莲叶片呈色差异的主要色素^[18]。

中药材的外在色泽优势源于其内在色素的积累^[21]。3种栽培模式金线莲呈现“一种栽培模式，一种叶片颜色”的特征，说明其内在色素的种类或相对含量存在差异。3种栽培模式金线莲中，9种黄酮醇的积累模式与叶片非绿色颜色表型一致，其中，6种积累模式与叶片非绿色颜色数值呈显著负相关，是引起3种栽培模式金线莲叶片非绿色差异的主要色素。该研究结果与黄酮醇(尤其是槲皮素、山奈酚及其糖苷)使植物呈现黄色或金黄色^[23－28]的报道一致。另外，在3种栽培模式金线莲中，6种黄酮醇积累模式与叶片颜色表型差异相似，说明这些黄酮醇在3种栽培模式金线莲叶片呈色中或具有着重要作用。矮牵牛素、飞燕草素及其糖苷可使植物呈现粉色、红色、红棕色或紫色^[23−24]，飞燕草素葡萄糖苷和矮牵牛素-3-O-芸香糖苷在3种栽培模式金线莲叶片中的作用微弱，与叶片表面的黄酮醇叠加后，共同形成金线莲叶脉的金黄色或金红色^[18]。

根据金线莲中是否存在金线莲苷差向异构体，可将其分为金线莲苷型和混合型2种化学型^[18−19]。本研究中，3种栽培模式的金线莲均未检测到金线莲苷差向异构体，且金线莲苷均呈地上部分优势分布，表明栽培模式不影响金线莲的化学型及金线莲苷的分布模式。在3种栽培模式中，林下苗全草、根、茎和叶中的金线莲苷质量分数均最高，说明栽培模式是影响金线莲苷质量分数的重要因素，进一步证实林下种植是实现优质金线莲精准育种的有效策略^[30−31]。

本研究分析了组织培养、大棚种植和林下种植对金线莲表型和品质的影响。植株大小、茎长和茎直径、叶片面积和根长是区分组培苗、林下苗和大棚苗的重要表型指标，其中，林下苗表型指标数值均最大，林下种植是提升金线莲产量的有效措施。叶片颜色是区分3种栽培模式金线莲的核心指标，林下苗叶片中黄酮醇(尤其是山奈酚、槲皮素及衍生物)相对含量最高，颜色最深，林下种植是实现优色金线莲精准育种的有效策略。林下苗中金线莲苷质量分数最高，林下种植是实现优质金线莲精准育种的有效措施。