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中国小麦花叶病毒(Chinese wheat mosaic virus,CWMV)是引起小麦Triticum aestivum黄花叶病的重要病原体,严重威胁小麦的生产安全[1]。CWMV病毒直径约为20 nm,长度为80~360 nm[2],包含2条正义RNA(ssRNA)链,根据大小分别命名为RNA1和RNA2。CWMV-RNA1全长7 147 nt,编码甲基转移酶、RNA聚合酶蛋白(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)和运动蛋白(movement protein,MP)等3个完整蛋白质,分子量分别是153、212和37 kDa[3]。CWMV-RNA2全长3 563 nt,编码病毒外壳蛋白(coat protein,CP)、N-CP蛋白(cystein rich protein,CRP)、CP-RT蛋白和1个富含半胱氨酸蛋白等4个蛋白质,分子量分别是19、25、84及18~19 kDa。CWMV以根部专性寄生的禾谷多黏菌Polymyxa graminis为介体传播[4-5]。当带毒的禾谷多黏菌侵染植株后,病毒会在寄主体内不断复制使植株发病;未带毒的禾谷多黏菌通过侵染带毒植株后获得病毒,成为新的病源侵染其他植株[6],且常与小麦黄花叶病毒(wheat yellow mosaic virus,WYMV)复合侵染[7];由于禾谷多黏菌的休眠孢子具有极强的抗逆性,小麦黄花叶病毒病的防治难度大大增加[6],患病小麦出现花叶、黄化、分蘖增生等症状[2]。国内外大量实践证明,培育并推广抗病品种是防治小麦黄花叶病毒病最为经济有效的措施。目前,小麦抗病毒研究仅得到少量的抗病毒病相关基因,亟需挖掘新的基因资源。利用病毒基因对植物进行遗传改良是近年来新出现的病害防治方法,原理包括利用病毒外壳蛋白、病毒复制酶、病毒运动蛋白介导的抗性途径等来增强植物的抗病性,以病毒外壳蛋白介导的抗病性应用最为广泛[8]。自ABEL等[9]报道获得携带烟草Nicotiana tabacum花叶病毒(tobacco mosaic virus, TMV)的外壳蛋白转基因植株后,黄瓜Cucumis sativus花叶病毒(cucumber mosaic virus, CMV)[10]、马铃薯Solanum tuberosum Y属病毒(potato virus Y, PVY)[11]、玉米Zea mays矮花叶病毒(maize dwarf mosaic virus, MDMV)[12]等重组外壳蛋白的转基因植株相继出现。该抗病性的机制目前存在3种假说:一是认为转基因植物细胞中形成的外壳蛋白一定程度上抑制了病毒外壳蛋白的脱壳,二是认为转基因植株在RNA水平上通过依赖同源序列的酶降解mRNA从而获得抗性,三是认为当病毒的核酸进入细胞后,立即被细胞中的自由外壳蛋白重新包裹,从而抑制了病毒的侵染[13-16]。此外,有研究表明:病毒外壳蛋白介导的抗性途径不仅对该种病毒存在抗性,在某些情况下对该病毒的不同菌株以及近缘病毒也存在抗性[13]。本研究拟利用农杆菌介导的转基因方法将CWMV的外壳蛋白基因导入烟草,获得阳性转基因植株后,通过抗病性鉴定证实转基因烟草对CWMV的抗病性,以期提高寄主植物的抗病性,并为利用病毒基因培育小麦抗病材料奠定基础。
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利用农杆菌介导基因转化法[11]将1.1中构建的表达载体(PCV-CP-GFP)转至本氏烟中。通过组织培养技术获得表达外壳蛋白的转基因烟草(OECP),共获得10个株系,20株·株系-1,移苗并栽培至4叶期,其中OECP-4和OECP-6株系的烟草没有存活。随机挑选存活10株·株系-1转基因苗,提取总蛋白质进行免疫分析。结果发现:OECP-1、OECP-3、OECP-7、OECP-9表达量较低,而OECP-10、OECP-8、OECP-5、OECP-2这4个株系表达量较高,条带大小为43 kDa,与CP-GFP蛋白大小一致(图 1)。为进一步证实得到的转基因植株为阳性植株,提取样株DNA进行PCR检测,结果发现:OECP-10、OECP-8、OECP-5、OECP-2均扩增出约530 bp的片段,与CWMV外壳蛋白基因大小一致(图 2)。表明外壳蛋白在转基因烟草中能够正常表达。
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筛选到的OECP阳性植株放置于25 ℃的恒温培养室中培养2个月,观察发现:与野生型本氏烟草相比,OECP-2和OECP-8的阳性烟草植株出现了矮化表型(表 1)。OECP-8与野生型的平均株高比为1.00:0.65,OECP-2与野生型的平均株高比为1.00:0.43,表明外壳蛋白干扰了烟草植株的正常生长。
不同转基因烟草的株高/cm OECP-10 OECP-8 OECP-5 OECP-2 MOCK 34.9 ± 0.4 a 23.1 ± 1.5 b 34.2 ± 1.0 a 15.3 ± 6.0 c 35.6 ± 1.0 a 说明:不同小写字母表示差异显著(P<0.05) Table 1. Plant height of transgenic tobaccos
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对OECP-2及OECP-8接种CWMV并栽植7 d,之后提取系统叶RNA,并检测其植株中运动蛋白(move protein,MP)基因的表达量。由图 3可知:转基因植株中CWMV的运动蛋白基因表达量显著低于对照植株,表明表达外壳蛋白基因提高了烟草对CWMV的抗病性。