Effects of host plants and temperatures on digestive enzyme activities in Heterolocha jinyinhuaphaga larvae

金银花尺蠖幼虫采集于安徽省明光市三界镇野生金银花上，带回，在人工气候箱（RXZ-288A型，宁波江南仪器制造厂）中饲养。设置人工气候箱光周期为14 h/10 h，温度为（25±1）℃，相对湿度为70%±7%。将幼虫放在600 mL的罐头瓶内（每瓶放10头幼虫），每天采摘新鲜的金银花叶片饲养。待其化蛹后，用湿润纱布铺于瓶底，每天定期检查羽化情况，把同日羽化的雌雄成虫配对后放于同一养虫笼内，用质量分数为10%的蔗糖水作食物，让其交配产卵。

取刚孵化的金银花尺蠖幼虫，单头放在罐头瓶中，然后放在人工气候箱中[光周期设置为14 h/10 h，温度设置为（25±1）℃，相对湿度设置为70%±7%]，分别用4种金银花（‘九丰1号’‘Jiufeng No. 1’、‘响水1号’‘Xiangshui No. 1’、‘响水2号’‘Xiangshui No. 2’、野生种）新鲜叶片饲养，用湿棉花包裹叶片基部以保持叶片新鲜，每天9：00更换新鲜叶片，一直饲养到5龄（根据头壳宽度判断）。每种金银花1次饲养20头幼虫，重复4次。

25 ℃左右是金银花尺蠖取食的最适温度^[17]，因此，设16、19、22、25、28、31、34 ℃等7个温度处理，设置光照周期为14 h/10 h，相对湿度为70%。取刚孵化的金银花尺蠖幼虫，单头放在各个罐头瓶中，并放入新鲜金银花（‘九丰1号’）叶片（用湿棉花包裹叶片基部以保持叶片新鲜，每天定时更换叶片），一直饲养到5龄。每个温度处理下1次饲养20头幼虫。重复4次。

每处理挑取大小一致的5龄幼虫10头，用去离子水洗净，滤纸擦干，冰浴中迅速取出中肠，加入预冷的磷酸盐缓冲溶液（PBS，0.02 mol·L^-1，pH 8.0）5.0 mL，迅速研磨成匀浆，离心15 min（-4 ℃，15 000 r·min^-1），取上清液作酶液。以牛血清蛋白（BSA）为标准蛋白，采用考马斯亮蓝G-250染色法测定样品蛋白含量^[18]。

采用3, 5-二硝基水杨酸法^[19]。在试管中分别加入酶液80 μL、质量分数为2%淀粉0.2 mL和0.2 mol·L^-1 PBS（pH 6.0）0.8 mL，摇匀，室温下反应10 min，37 ℃水浴中保温60 min，加入3, 5-二硝基水杨酸1.0 mL终止反应，沸水浴加热5 min，冷却后于550 nm波长测吸光值。空白对照用80 μL 0.2 mol·L^-1 PBS（pH 6.0）代替酶液。采用麦芽糖标准曲线计算样品反应后麦芽糖的含量。淀粉酶活性以每分钟每克样品蛋白催化水解生成麦芽糖的量（mmol·g^-1·min^-1）表示。重复4次。

采用3, 5-二硝基水杨酸法^[19]。在试管中分别加入酶液80 μL、质量分数为4%蔗糖0.2 mL和0.2 mol·L^-1 PBS（pH 5.8）0.8 mL，摇匀，室温下反应10 min，37 ℃水浴中保温60 min，加3, 5-二硝基水杨酸1.0 mL终止反应，沸水浴加热5 min，冷却后于550 nm波长测吸光值。用80 μL 0.2 mol·L^-1 PBS（pH 5.8）代替酶液做空白对照。采用葡萄糖标准曲线计算样品反应后葡萄糖含量。蔗糖酶活性以每分钟每克样品蛋白催化水解生成葡萄糖的量（mmol·g^-1·min^-1）表示。重复4次。

采用福林-酚法^[7]。在试管中加入酶液40 μL和质量分数为0.5%酪蛋白溶液100 μL，混匀后水浴15 min（37 ℃），加入质量分数为10%三氯乙酸100 μL，混匀，离心15 min（10 000 r · min^-1，4 ℃）。取上清液150 μL，分别加入0.55 mol·L^-1碳酸钠溶液750 μL和Folin-酚试剂150 μL，混匀后水浴15 min（37 ℃），然后于680 nm处测量吸光值。空白对照以缓冲液代替酶液，采用酪氨酸标准曲线计算样品反应后酪氨酸含量。蛋白酶活性以每分钟每克样品蛋白催化水解生成酪氨酸的量（mmol·g^-1·min^-1）表示。重复4次。

采用标准氢氧化钠溶液滴定法^[7]。取PBS缓冲液（0.025 mol·L^-1，pH 7.5）0.5 mL，放入10 mL试管中，加入聚乙烯醇橄榄油乳液0.4 mL，摇匀，40 ℃水浴加热10 min，加入酶液0.5 mL，继续加热20 min（40 ℃水浴），加入体积分数为95%乙醇1.5 mL和1滴体积分数为1%酚酞指示剂。用标准氢氧化钠溶液（0.05 mol·L^-1）滴定至微红色，记录所消耗的氢氧化钠体积。脂肪酶活性以每分钟每克样品蛋白催化水解生成脂肪酸的量（mmol·g^-1·min^-1）表示。对照以缓冲液代替酶液。重复4次。

用SPSS 11.5进行方差分析，采用Duncan氏新复极差法在P < 0.05水平上进行差异显著性检验。

取食不同金银花后，金银花尺蠖各龄幼虫的消化酶活性均不相同（表 1）。取食野生金银花的淀粉酶、蔗糖酶和蛋白酶活性最高，在1龄幼虫中分别为18.37、26.45和22.31 mmol·g^-1·min^-1。1龄幼虫取食野生金银花、‘九丰1号’和‘响水2号’的淀粉酶活性之间差异不显著（F_{3, 8}=3.147，P=0.954），但与响水1号差异显著（P < 0.05）；1龄幼虫取食这4种寄主植物的蔗糖酶活性之间（F_{3, 8}=1.379，P=0.317）、蛋白酶活性（F_{3, 8}=2.455，P=0.138）之间差异不显著。取食‘响水1号’的脂肪酶活性最高，在1龄幼虫中为7.54 mmol·g^-1·min^-1，取食野生金银花的脂肪酶活性最低，在1龄幼虫中为5.54 mmol·g^-1·min^-1。1龄幼虫取食‘九丰1号’、‘响水1号’和‘响水2号’的脂肪酶活性之间，以及取食‘响水2号’与野生金银花的脂肪酶活性之间差异不显著（F_{3, 8}=2.238，P=0.061）。

金银花尺蠖幼虫取食‘九丰1号’、‘响水1号’、‘响水2号’和野生金银花的淀粉酶、蔗糖酶、蛋白酶和脂肪酶活性均随着幼虫龄期的增加而增大，5龄幼虫取食这4种金银花的淀粉酶活性分别为23.45、19.67、21.65和26.69 mmol·g^-1·min^-1，分别比1龄幼虫增加了33.39%、27.48%、33.31%和45.29%。5龄幼虫取食这4种金银花的蔗糖酶活性分别为30.53、27.79、28.34和34.29 mmol·g^-1·min^-1，分别比1龄幼虫增加了19.12%、15.02%、14.64%和29.64%。5龄幼虫取食这4种金银花的蛋白酶活性分别为27.42、23.12、24.74和31.56 mmol·g^-1·min^-1，分别比1龄幼虫增加了25.55%、18.69%、21.69%和41.46%。5龄幼虫取食这4种金银花的脂肪酶活性分别为11.43、12.67、11.57和9.85 mmol·g^-1·min^-1，分别比1龄幼虫增加了84.95%、68.04%、68.41%和77.80%。方差分析显示：寄主植物、幼虫龄期对金银花尺蠖幼虫4种消化酶活性均有显著影响（P < 0.05），但寄主植物和幼虫龄期的交互作用对金银花尺蠖幼虫4种消化酶活性没有显著影响（P>0.05）。

不同温度下金银花尺蠖取食‘九丰1号’鲜叶后，各龄幼虫消化酶活性均不相同（表 2），在16~34 ℃均呈先上升后下降的趋势。1~5龄幼虫的淀粉酶活性在22 ℃最高，分别为19.95、20.57、21.79、23.64和25.86 mmol·g^-1·min^-1，高于或低于22 ℃，淀粉酶活性均下降；1~5龄幼虫的蔗糖酶活性也在22 ℃最高，分别为27.65、28.89、29.85、31.45和32.89 mmol·g^-1·min^-1，高于或低于22 ℃，蔗糖酶活性均下降；1~5龄幼虫的蛋白酶活性在25 ℃时最高，分别为21.65、22.76、23.43、25.71和26.98 mmol·g^-1·min^-1，高于或低于25 ℃，蛋白酶活性均下降；1~5龄幼虫的脂肪酶活性在28 ℃时最高，分别为7.38、8.49、9.81、11.33和13.21 mmol·g^-1·min^-1，高于或低于28 ℃，脂肪酶活性均下降。方差分析显示：温度和幼虫龄期的交互作用对金银花尺蠖幼虫4种消化酶活性没有显著影响（P>0.05）。

根据不同温度下金银花尺蠖1~5龄幼虫4种消化酶活性的变化趋势进行回归分析，回归模型见表 3。对模型进行计算，得出金银花尺蠖1~5幼龄虫淀粉酶活性最高的温度分别为21.39、20.60、20.48、20.50和21.20 ℃；蔗糖酶活性最高的温度分别为21.83、21.11、20.89、20.96和21.12 ℃；蛋白酶活性最高的温度分别为24.70、24.97、25.51、25.24和24.35 ℃；脂肪酶活性最高的温度分别为28.41、28.08、27.52、28.69和29.30 ℃。

昆虫体内的消化酶活性与取食密切相关。昆虫取食寄主植物后依靠消化酶将其中的营养物质转化为自身所需的物质，消化酶活性的高低在一定程度上反映了昆虫所需营养的种类，以及各类营养物质被昆虫利用的状况，常可以用来表示昆虫对植物的嗜食程度^[20]。在取食不同寄主植物时，昆虫可以根据自身生长发育的需求调节体内消化酶的活性^[8]。本研究表明：金银花尺蠖各龄幼虫取食野生金银花的淀粉酶、蔗糖酶、蛋白酶活性均高于其他寄主，而脂肪酶活性低于其他寄主。向玉勇等^[21]研究发现：金银花尺蠖幼虫对4个品种金银花的取食量大小均从高到低依次为野生品种、‘九丰1号’、‘响水2号’、‘响水1号’，野生金银花叶片可溶性糖含量、蛋白质含量均高于其他寄主，脂肪含量低于其他寄主。这说明金银花尺蠖幼虫取食营养成分含量高的寄主时，其消化酶活性会升高。这可能是金银花尺蠖对不同寄主的一种自我生理调节，取食营养成分含量高的寄主时，通过提高自身消化酶活性分解大量的营养物质，以保证机体的快速生长。但其他种类昆虫则存在不一致的现象，如棉铃虫Helicoverpa armigera幼虫在取食糖类含量较高的寄主植物时，淀粉酶活性会下降，在取食蛋白含量高的寄主植物时，中肠蛋白酶活性会下降^[22]；椰心叶甲Brontispa longissima 5龄幼虫取食营养丰富的叶片后，中肠的蔗糖酶、淀粉酶、蛋白酶及脂肪酶活性均显著下降^[7]。这说明取食不同寄主植物时，不同昆虫的消化酶活性变化存在差异，这些昆虫体内可能存在另一种机制，当寄主植物营养成分含量高时，利用较低的消化酶活性就可以满足机体的新陈代谢^[23]。金银花尺蠖幼虫取食金银花的淀粉酶、蔗糖酶、蛋白酶和脂肪酶活性均随着幼虫龄期的增加而增大。寄主植物和幼虫龄期的交互作用对金银花尺蠖幼虫4种消化酶活性没有显著影响。

温度是影响昆虫生理代谢过程的重要环境因子。不同温度下金银花尺蠖各龄幼虫体内淀粉酶、蔗糖酶、蛋白酶和脂肪酶活性均不一样，在16~34 ℃，这4种消化酶活性均随着温度的升高表现为先上升后下降的趋势。在波纹龙虾Panulirus homarus^[11]、嘉陵江鲇Silurus asotus^[24]等其他变温动物也存在类似现象。这可能是低温下这些酶的活化分子数比较少，催化食物分解的反应速率低，随着温度上升，酶的活化分子逐渐增多，催化反应速率加快，酶的催化活性增强，高温下这些酶蛋白发生变性，酶的催化活性又下降。在刺参Apostichopus japonicus^[25]中却存在不一致的现象，在6~21 ℃，其胰蛋白酶与淀粉酶活力随水温升高呈先升高后降低的趋势, 而脂肪酶活力随着养殖水温升高呈下降趋势。这表明：不同种类动物的消化酶对温度的耐受性存在差异。金银花尺蠖各龄幼虫体内4种消化酶的最适温度不同，淀粉酶和蔗糖酶活性在22 ℃最高，蛋白酶活性在25 ℃时最高，脂肪酶活性在28 ℃时最高。这与金银花尺蠖的生长气候条件相吻合，金银花在春夏季生长迅速，尤其在夏季多雨期，而金银花尺蠖消化酶活性恰好在22~28 ℃最高，有利于对食物的消化，加速生长发育，导致其大发生。

总之，寄主植物、温度均对金银花尺蠖幼虫消化酶活性产生影响，不同寄主植物不仅含有不同含量的营养物质，而且还含有不同的抑制因子以及次生代谢物质，寄主植物的任何变化都会影响消化酶的活性及随后的生理过程^{[26, 8]}。因此，还应进一步研究不同寄主植物的次生物质与金银花尺蠖幼虫体内消化酶活性的变化情况，以更深入地阐明金银花尺蠖与环境适应性的生理生化机制。