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水体富营养化是目前全球普遍面临的环境问题之一。近年来，城市废水与工业废水的大量排放，含有高浓度氮、磷元素的污水汇入周边水域，严重影响了中国几大重要水域的水质，部分湖泊总氮浓度甚至超过富营养化临界值的10倍以上[1]。大面积的水体富营养化不仅危害人体健康，破坏生态平衡，还影响水体景观。相对于易造成二次污染的化学修复，以植物修复技术为主的生物修复因无污染和低成本，能够与绿化环境及改善景观相结合，在水体富营养化的防治中应用广泛[2]。其中，兼具生态价值和观赏价值的水生观赏植物既能净化富营养化水体[3]，还能构成优美的水体景观，受到越来越多的关注。
目前，关于单种水生植物对富营养化水体修复的研究较多[4]，但由于富营养化水体的污染程度和原因不同，不同植物对不同营养盐的去除也存在差异性，应用单种植物可能存在净化效果不稳定的问题。组合种植水生植物有利于实现不同植物间的优势互补，并可提高景观质量，且合理的水生植物混合栽种可使群落更加稳定、景观季相变化更为丰富。RODRIGUEZ等[5]发现：2种特定水生植物混合栽植可以提高去污效率，MOORE等[6]也认为：未来植物修复富营养水体研究时，应参考天然水生植被的混合种群。COLEMAN等[7]研究发现：灯心草Juncus effusus、香蒲Typha orientalis、水葱Scirpus validus等3种植物混合种植净化废水的效果比单独种植好。周玥等[8]选取不同生活型湿地植物黄菖蒲Iris pseudacorus、香蒲、浮萍Lemna mino和金鱼藻Ceratophyllum demersum，研究其单种及组合种植对低、高质量浓度富营养化水体的净化效果，认为香蒲+浮萍+金鱼藻对总氮去除效果较单种好；香蒲+浮萍+金鱼藻和黄菖蒲+浮萍+金鱼藻对低质量浓度污水中总磷去除率较单种高；黄菖蒲+浮萍+金鱼藻对低质量浓度污水中化学需氧量净化效果最佳，并且优于单种植物。因此，研究水生植物科学配置和组合种植十分必要。
本研究以适应性较强的挺水、浮水、沉水3类水生观赏植物为对象，设置不同的种植组合，比较其在不同富营养化程度的水体中的生长情况以及对总磷、总氮、氨氮的去除及降低化学需氧量等水体的净化效果，为科学搭配水生观赏植物，净化富营养化水体提供科学依据。
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水生植物选取主要遵循以下原则[9]：①具有较好的去污净化效果；②能够较好地适应被污染的水体环境，耐性较强；③有一定的观赏价值；④优先选择乡土植物；⑤具有较大生物量的大型水生植物。基于以上原则，本研究选用6种水生植物：挺水植物千屈菜Lythrum salicaria、黄菖蒲Iris pseudacorus、水葱，浮水植物荇菜Nymphoides peltatum、睡莲Nymphaea tetragon ，沉水植物金鱼藻。
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试验地点为南京市栖霞区龙潭街道太平村南京农业大学龙潭荷花基地，全程在避雨棚内进行。试验期间日最高气温为27~36 ℃，日最低气温为20~28 ℃。将供试植物根系洗净，先在自来水中培养7 d，然后种植于直径55 cm的无孔花盆中。种植土取自该基地的园土，土壤的初始pH约为6.93，有机质为20.13~21.76 g·kg−1，底泥厚约 10 cm。加入20 L自来水，待土充分吸收水分后标记水位，蒸发消耗的水每天用自来水补充到原水位高度。设置6种植物组合处理(表1)，无植物的为对照组(ck)。于2020年4月下旬上盆，每盆种植1株挺水植物，1株浮水植物，15 g沉水植物。
表 1 植物种植组合处理
Table 1. Planting combination treatment
编号 种植组合 对照组(ck) 无植物 QXJ 千屈菜+荇菜+金鱼藻 QSJ 千屈菜+睡莲+金鱼藻 HXJ 黄菖蒲+荇菜+金鱼藻 HSJ 黄菖蒲+睡莲+金鱼藻 SXJ 水葱+荇菜+金鱼藻 SSJ 水葱+睡莲+金鱼藻 根据GB 3838—2002《地表水环境质量标准》规定的劣五类水水质[10]的标准，采用氯化氨、硝酸钾、磷酸二氢钾、尿素、葡萄糖人工配制低、中、高3种不同富营养化程度的水体。其中氨氮∶硝态氮∶有机氮的质量比为1∶1∶1。具体参数见表2。每个组合设置3个质量浓度梯度，每个梯度设置3个平行组。
表 2 水体参数
Table 2. Parameters of the test water
富营养
化程度总氮/
(mg·L－1)总磷/
(mg·L－1)氨氮/
(mg·L－1)化学需氧量/
(mg·L－1)低 2.00 0.20 0.67 20.00 中 10.00 1.00 3.34 50.00 高 20.00 2.00 6.67 100.00 -
隔7 d于9:00—10:00用注射器于每盆的不同方位、不同水位(0、10、20 cm)分别取水样100 mL，用于总氮、总磷、氨氮、化学需氧量等水质指标测定。于取样前一天补充蒸发、蒸腾和取样所消耗的水分以保持水位。试验周期为35 d。试验开始前及结束时测定株高、分枝、叶片数量等植物形态指标。
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①用卷尺测量植物株高；统计植物分枝/叶片的数量； 用天平称量试验前后的沉水植物生物量(鲜质量)。 株高、分枝/叶片数、沉水植物生物量的相对增长量(Δa)：Δa=ai−a0。其中：ai和a0分别为试验结束时开始前的株高、分枝/叶片数量、沉水植物生物量。②水样的测定方法参考《水与废水监测分析方法》(第4版)[11]。总磷采用过硫酸钾消解-钼蓝比色法检测；总氮采用碱性过硫酸钾消解-紫外分光光度法检测；氨氮采用纳氏试剂法，格林凯瑞水质检测仪检测；化学需氧量用粉末试剂法，格林凯瑞水质检测仪进行检测； 溶解氧采用雷磁JPBJ-609L便携式溶解氧测定仪现场测定；pH采用便携式pH计现场测定。
总氮、总磷、氨氮、化学需氧量去除率(降低率，R)的计算方法[12]：R=(C0−Ci)/C0×100%。其中：C0和Ci分别为总磷、总氮、氨氮、化学需氧量的初始质量浓度和第i天质量浓度；
计算植物降低总磷、总氮、氨氮、化学需氧量的效果时应排除底泥自身吸附的影响，公式如下：ΔR=R1−R0。其中：R0和R1分别为无植物组和有植物组的总磷、总氮、氨氮、化学需氧量去除率。
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采用SPSS 25.0对数据进行统计分析，用GraphPad Prism 8作图。
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如图1所示：在不同质量浓度富营养下，挺水植物千屈菜和黄菖蒲的株高相对增长量均大于水葱。在低质量浓度下，同种挺水植物与睡莲组合时株高增量比与荇菜组合时大；中质量浓度下，QXJ组合中千屈菜的株高增量显著高于其他处理组的挺水植物(P＜0.05)。
图 1 挺水植物株高相对增长量
Figure 1. Relative growth in height of water-retaining plants
如图2所示：3种质量浓度富营养处理下，千屈菜的分枝相对增长量大于黄菖蒲和水葱。千屈菜在与睡莲组合时的分枝增量比与荇菜组合时大，尤其是在低、高质量浓度下差异显著(P＜0.05)，说明千屈菜在高质量浓度下长势较好，最好的组合是QSJ。3种质量浓度处理下，HXJ中黄菖蒲的叶片相对增长量基本保持不变；而HSJ中黄菖蒲的叶片相对增长量随处理质量浓度升高呈增加趋势；水葱的叶片相对增长量基本持平。总的来看，3种挺水植物在中、高质量浓度富营养水体中正常增加分枝和叶片数。
图 2 挺水植物分枝/叶片相对增长量
Figure 2. Relative growth of aquatic plant branches/leaves
由图3所示：3种质量浓度富营养处理下，浮水植物荇菜叶片相对增长量大于睡莲，尤其是HXJ组中的荇菜，叶片增量较大，同种浮水植物与黄菖蒲组合时，浮水植物叶片增量均较大，如中质量浓度处理HSJ组的睡莲叶片增量显著大于QSJ组(P＜0.05)。总的来看，荇菜在高质量浓度下叶片数相对增长量较大，叶片数增长速度较快；睡莲的叶片数则在中、高质量浓度中增长速度较快。
图 3 浮水植物叶片相对增长量
Figure 3. Relative growth of leaves of floating water plants
由图4所示，低质量浓度富营养处理下，沉水植物金鱼藻与黄菖蒲+睡莲、与千屈菜+睡莲组合时生物量相对增长量显著大于与千屈菜+荇菜、与水葱+荇菜以及与水葱+睡莲组合(P＜0.05)。中、高质量浓度下，金鱼藻在与水葱+睡莲、黄菖蒲+睡莲组合时生物量增量最大，与千屈菜+荇菜组合时最小，差异显著(P＜0.05)。3种质量浓度处理下，挺水植物相同时，金鱼藻与睡莲组合时的生物量增量均较与荇菜组合时大。浮水植物相同时，低质量浓度下，金鱼藻与黄菖蒲组合时生物量增量最大；中、高质量浓度处理下，金鱼藻与水葱、黄菖蒲组合时的生物量增量比与千屈菜组合时大。另外，HSJ组的金鱼藻在低、中质量浓度处理下生物量增量较高质量浓度处理组大；QSJ组的金鱼藻则在低质量浓度下生物量增量最大，随质量浓度增加有所减小；SSJ组中的金鱼藻生物量增量则在中、高质量浓度中较大。总的来看，沉水植物金鱼藻可通过与不同的挺水、浮水植物组合适应中、高质量浓度的富营养水体。
图 4 沉水植物生物量相对增长量
Figure 4. Relative growth of submerged plant biomass
综上所述，3种质量浓度富营养处理下，3类6种供试水生植物长势均较好，挺水植物中千屈菜长势最好；浮水植物中荇菜长势优于睡莲，荇菜虽然长势快，但与其他植物组合配植时，可能会产生种间竞争；沉水植物金鱼藻具有较强的适应中高质量浓度富营养化水体的能力。
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从图5A可看出：低质量浓度富营养处理下，各植物组合中水体的总磷质量浓度在7 d时快速下降；7 d后，除SXJ外，其他组水体总磷整体上呈缓慢上升趋势；试验结束时(35 d)，植物组合处理水体的总磷由开始时0.20 mg·L−1下降至0.03~0.08 mg·L−1，对照组下降至0.12 mg·L−1。将对照组总磷去除率减去之后计算植物组合实际去除率，结果表明(表3)：处理14 d之前，SSJ组合对总磷的去除率较大，而SXJ的去除率最低，可能与其前期对水体环境暂未完全适应有关；所有植物组合对总磷的去除率在28 d时达最大值，其中QXJ和HSJ去除率较大， SSJ去除率最低；至35 d时，所有组合对总磷的去除率较28 d都有所下降。
图 5 不同质量浓度富营养水体中总磷的变化
Figure 5. Changes of TP content under different eutrophication concentrations
表 3 不同质量浓度富营养处理下不同水生植物组合对水体总磷的去除率
Table 3. Removal of TP from water bodies by different aquatic plant combinations under different eutrophic concentration treatments
富营养化程度 t/d 不同植物种植组合处理对总磷的去除率/% QXJ QSJ HXJ HSJ SXJ SSJ 低 7 0.00±1.88 ab 0.35±2.20 ab −4.90±0.30 b 5.85±4.83 a −46.04±2.66 c 12.53±4.43 a 14 36.06±0.94 ab 32.80±2.72 b 40.78±0.76 ab 33.76±0.06 b 3.83±3.99 c 47.57±3.76 a 21 34.53±6.23 a 26.86±4.73 a 37.60±9.64 a 49.87±3.91 a 42.59±4.36 a 36.83±0.94 a 28 81.13±1.45 a 64.28±5.05 b 61.39±2.88 bc 74.59±2.21 ab 72.89±1.76 ab 49.15±0.92 c 35 16.10±1.33 b 42.93±6.68 a 31.05±3.45 ab 42.93±2.17 a 34.50±2.30 a 33.75±5.53 a 中 7 4.37±0.69 a 1.53±2.62 a 2.76±1.59 a 1.38±2..42 a 0.92±0.92 a 4.30±0.61 a 14 26.47±1.57 a 27.16±0.79 a 22.71±4.93 a 26.24±1.86 a 20.56±4.82 a 20.95±4.09 a 21 9.21±1.36 a 12.43±1.16 a 6.91±1.33 a 11.66±0.81 a 11.05±1.46 a 11.74±1.47 a 28 20.34±0.58 a 19.53±1.53 a 21.03±0.59 a 21.71±0.23 a 18.93±0.94 a 19.59±1.85 a 35 8.06±1.21 a 8.42±1.12 a 3.96±0.68 ab 8.52±0.23 a 2.15±1.34 b 7.37±0.99 a 高 7 4.45±0.41 a 6.22±0.13 a 4.83±0.72 a 5.06±0.80 a 5.99±0.27 a 4.95±1.35 a 14 6.98±0.27 a 7.21±0.13 a 6.98±0.46 a 4.99±0.31 b 6.98±0.03 a 6.29±0.13 ab 21 10.97±0.44 a 10.97±0.48 a 7.37±0.76 bc 10.13±1.07 ab 9.94±0.83 ab 6.14±0.01 c 28 12.20±0.62 a 12.50±0.31 a 10.66±0.67 a 10.36±1.38 a 10.66±1.31 a 12.04±1.77 a 35 9.30±0.60 ab 7.60±1.74 b 11.59±0.15 ab 12.20±0.70 a 7.75±1.01 b 12.35±0.81 a 说明：同行平均值后不同小写字母表示同一时间不同植物组合对总磷的去除率差异显著(P＜0.05)。 图5B所示：中质量浓度富营养化各植物组合水体总磷质量浓度在7 d时下降明显，在7~14 d时略微上升，随后下降。HXJ和SXJ组在28 d后总磷质量浓度有所增加。35 d时，各植物组合水体总磷质量浓度由1.00 mg·L−1下降为0.04~0.10 mg·L−1，对照组的总磷质量浓度则下降为0.13 mg·L−1。从植物组合总磷去除率来看(表3)，14 d时出现第1个去除率高峰，此时QSJ、QXJ和HSJ的TP去除率均较高， SXJ的总磷去除率最低；28 d时出现第2个总磷去除率高峰，此时HSJ和HXJ对总磷去除率较大。35 d时， HSJ、QSJ、QXJ以及SSJ为净化总磷效果较好的植物组。
由图5C可知：高质量浓度富营养处理下，各植物组合水体总磷质量浓度在7 d时下降趋势明显；HSJ和SSJ的总磷质量浓度在7~21 d时上升，随后下降，其余组合组一直保持缓慢增长趋势。至35 d，植物组合组的水体总磷质量浓度由2.00 mg·L−1降至0.03~0.13 mg·L−1，对照组的水体总磷质量浓度降至0.28 mg·L−1。各组合的总磷去除率总体随时间延长呈上升趋势(表3)，35 d时，HSJ及SSJ对总磷去除率最高，显著高于SXJ和QSJ。
相同的植物组合在不同质量浓度富营养水体中，对总磷的净化效果也不相同。就黄菖蒲+睡莲+金鱼藻组(HSJ)而言，其在低、中、高3种质量浓度处理中均有相对良好的净化总磷的效果。水葱+荇菜+金鱼藻组(SXJ)在低质量浓度处理中，对总磷的去除效果前期较差，后期才逐渐达到较为良好的效果；在中、高质量浓度富营养化水体中净化总磷效果相对较差。
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低质量浓度富营养处理下，7~28 d各植物组合水体总氮质量浓度总体上呈不同程度下降趋势，28 d后，QXJ、QSJ和HXJ的总氮质量浓度均有所增加；35 d时，所有植物组合的总氮质量浓度均低于对照组(图6A)，由2.00 mg·L−1下降为0.98~1.36 mg·L−1，对照组下降至1.60 mg·L−1。从表4可知，前28 d各植物组合对总氮的去除率不高，至35 d时，各植物组合组对总氮的去除率达峰值，其中SXJ、SSJ和HSJ对水体总氮的去除率最高。
图 6 不同质量浓度富营养水体中总氮的变化
Figure 6. Changes of TN content under different eutrophication concentrations
表 4 不同质量浓度富营养处理下不同水生植物组合对水体总氮的去除率
Table 4. Removal of TN from water bodies by different aquatic plant combinations under different eutrophic concentration treatments
富营养化程度 t/d 不同植物种植组合处理对总氮的去除率/% QXJ QSJ HXJ HSJ SXJ SSJ 低 7 0.44±2.06 a −0.83±0.74 a −0.78±1.15 a 9.75±4.14 a 2.08±0.93 a 2.19±1.30 a 14 2.62±1.18 a 0.34±3.95 a 1.90±1.19 a 6.23±3.33 a 6.04±2.71 a 8.79±6.38 a 21 1.36±1.81 a 2.33±1.22 a 1.39±0.98 a −2.42±2.48 a 1.50±1.29 a 2.53±2.74 a 28 3.64±0.13 a 11.40±2.49 a 11.63±11.62 a −10.00±2.60 a 0.25±2.02 a 11.62±6.19 a 35 12.05±4.07 d 16.93±2.62 cd 22.10±1.04 bcd 24.95±1.41 bc 47.33±1.99 a 30.90±0.17 b 中 7 0.40±0.06 a 0.67±0.35 a −0.05±0.41 a 1.15±1.30 a −0.42±0.39 a −0.66±0.60 a 14 0.24±0.30 a 0.30±0.41 a 0.94±0.18 a 0.59±0.21 a 2.10±1.04 a 0.60±0.34 a 21 0.28±0.23 a 0.13±0.27 a 0.40±0.17 a 0.55±0.10 a 0.11±0.35 a 0.32±0.23 a 28 8.43±0.63 a 9.44±0.77 a 12.58±3.92 a 13.66±0.84 a 9.44±0.12 a 10.51±1.26 a 35 2.15±0.56 bc 2.67±0.44 bc 0.79±0.08 c 3.36±0.24 abc 3.43±0.56 ab 5.59±0.94 a 高 7 0.23±0.27 a −0.58±0.21 a −0.48±0.22 a −0.11±0.04 a −0.13±0.10 a −0.05±0.22 a 14 0.41±0.12 ab −0.06±0.06 c 0.67±0.00 a 0.71±0.04 a 0.15±0.11 bc 0.48±0.08 ab 21 0.22±0.40 a −0.17±0.15 a 0.33±0.10 a 0.05±0.13 a 0.20±0.11 a 0.24±0.22 a 28 1.29±0.13 a 1.20±0.05 a 1.08±0.06 a 1.27±0.05 a 1.29±0.09 a 1.23±0.05 a 35 2.59±0.06 b 2.85±0.04 b 2.78±0.09 b 3.47±0.24 a 2.76±0.09 b 2.60±0.12 b 说明：同行平均值后不同小写字母表示同一时间不同植物组合对总氮的去除率差异显著(P＜0.05)。 中质量浓度富营养化处理下，各植物组合水体总氮质量浓度在7 d时快速下降，随后呈相对缓慢的下降趋势，在前21 d与对照组接近；自28 d开始，植物组合的总氮质量浓度均低于对照；35 d时，植物组合水体总氮质量浓度由10.00 mg·L−1下降至0.54~1.02 mg·L−1，对照组则降至1.09 mg·L−1(图6B)。各植物组合对总氮去除率在前21 d较低，28 d时总氮净化率达最大值，其中HSJ、HXJ组对总氮的去除效果最高，QXJ组的总氮去除率最低；至35 d时，所有水生植物组合对总氮的净化率出现下降(表4)。
高质量浓度富营养处理下(图6C)，各植物组合水体总氮质量浓度在前期剧烈下降，7 d后一直保持下降的趋势；各植物组合水体中总氮质量浓度在前21 d对与照组差异较小，自28 d开始显著低于对照组；至35 d时，植物组合水体总氮质量浓度由20.00 mg·L−1降为0.92~1.10 mg·L−1，对照组的水体总氮质量浓度为1.62 mg·L−1。从对总氮的去除率来看(表4)，各植物组合仅在14 d时对总氮的去除率较大，去除率最高的为HSJ和HXJ组；35 d时，各植物组合对总氮的去除率达最大值，其中HSJ对总氮净化率最高，QXJ去除率最低。
同种植物组合在不同质量浓度富营养水体中净化总氮的效果不同。HSJ组在3种质量浓度下净化总氮效果较好，尤其在后期效果较为明显；SXJ组在低、中质量浓度富营养水体中去除总氮效果较好，但在高质量浓度下前期净化效果较差。
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由表5可见：低质量浓度富营养处理下，7 d内各植物组合水体中氨氮质量浓度下降十分明显；在7~21 d时总体呈缓慢下降，21~28 d时，迅速上升，随后又显著下降。至35 d，植物组合组水体中氨氮质量浓度由0.67 mg·L−1下降为0.05~0.09 mg·L−1，对照组则下降至0.14 mg·L−1(图7A)。各植物组合对氨氮的去除率在前期较低，21和28 d时达到峰值，21 d时，SSJ、SXJ和HSJ组去除率较高，显著高于其他植物组合；28 d时，SXJ、HSJ、QSJ组对氨氮的去除率较高；至35 d时，SXJ组对氨氮的净化率最高(表5)。
表 5 不同质量浓度富营养处理下不同水生植物组合对水体氨氮的去除率
Table 5. Removal of NH3-N from water bodies by different aquatic plant combinations under different eutrophic concentration treatments
富营养化程度 t/d 不同植物种植组合处理对氨氮的去除率/% QXJ QSJ HXJ HSJ SXJ SSJ 低 7 −1.49±4.80 a −4.98±5.87 a −9.70±3.02 a −0.75±3.88 a −8.96±5.24 a −7.96±7.77 a 14 1.50±0.43 a −38.06±4.31 d −13.43±0.43 c −3.73±1.72 ab −12.69±1.72 bc 0.75±0.00 a 21 21.89±0.86 b 21.89±1.72 b 20.40±0.86 b 30.35±1.79 a 31.34±1.99 a 33.08±1.29 a 28 11.19±15.08 ab 29.85±6.03 a −15.67±1.29 b 31.34±2.59 a 38.06±7.32 a 18.66±1.29 ab 35 10.65±0.28 ab 7.66±1.75 b 11.74±1.04 ab 7.56±1.42 b 14.03±1.29 a 9.48±0.73 ab 中 7 −2.69±0.46 a 1.10±0.87 a −1.05±1.12 a −0.90±1.04 a −0.60±1.38 a −2.84±0.09 a 14 1.40±0.17 a 0.30±0.10 a 0.10±1.90 ab 0.65±0.09 a −0.40±0.35 ab −1.00±0.17 b 21 2.30±0.53 a 4.09±0.36 a 3.44±0.61 a 1.20±0.35 ab 2.20±1.21 a −1.35±0.09 b 28 0.00±0.17 a 0.15±1.30 a 0.75±0.78 a −0.60±0.52 a 0.20±1.15 a 1.00±0.40 a 35 0.91±0.03 bc 1.68±0.10 ab 0.67±0.29 bc 0.61±0.22 c 1.50±0.25 abc 2.27±0.29 a 高 7 2.60±0.40 a 1.40±0.80 a 1.45±0.35 a 2.65±0.17 a 0.70±1.08 a 0.30±0.13 a 14 3.42±0.87 a 2.82±0.56 a 3.87±0.22 a 3.82±0.09 a 3.37±0.69 a 2.17±0.61 a 21 1.15±1.00 a 0.60±1.15 a −0.75±1.73 a 0.75±0.94 a 1.25±0.53 a −0.97±1.34 a 28 0.65±0.48 ab 0.12±0.87 ab −0.37±1.04 b 2.70±0.13 ab 2.32±0.43 ab 3.07±0.61 a 35 0.66±0.01 c 0.95±0.08 b 1.08±0.04 ab 1.19±0.03 a 1.04±0.06 ab 1.08±0.02 ab 说明：同行平均值后不同小写字母表示同一时间不同植物组合对氨氮的去除率差异显著(P＜0.05)。 
图 7 不同质量浓度富营养水体中的氨氮的变化
Figure 7. Changes of NH3-N content under different eutrophication concentrations
如图7B所示：中质量浓度处理下，各植物组合水体氨氮质量浓度在前7 d快速下降，7~21 d保持相对平稳，随后迅速增加，28 d后水体氨氮质量浓度又显著下降。35 d时各植物组合水体氨氮质浓度由3.34 mg·L−1降至0.09~0.12 mg·L−1，对照组为0.15 mg·L−1。多数植物组合在前期对氨氮的去除率较低(表5)，后期才先后发挥对氨氮的净化效果，21 d时出现氨氮去除高峰，此时QSJ的去除率最高。35 d时，SSJ和QSJ对氨氮的净化效果最好。
高质量浓度富营养处理下，各植物组合水体氨氮质量浓度前期均略微下降，随后迅速增长，28 d后又明显下降。35 d时，植物组合处理水体氨氮质量浓度由6.67 mg·L−1降至0.04~0.05 mg·L−1，对照组则为0.12 mg·L−1(图7C)。各植物组合在14 d时形成第1个去除氨氮的高峰，之后对氨氮的去除率有所下降；SSJ、HSJ和SXJ在28 d时形成第2个氨氮去除高峰。35 d时，对氨氮的去除率最大的为HSJ组，最小的为QXJ组(表5)。
比较同种植物在不同质量浓度富营养处理对氨氮的去除效果可知：HSJ组在高质量浓度处理下能维持较为良好的净化氨氮效果。QSJ组在低质量浓度处理下处理前期对氨氮的去除十分缓慢，后期净化效果较好；中质量浓度处理下能保持良好的净化效果；高质量浓度处理下，前期去除效果较差，35 d时，恢复到较好的效果。
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低质量浓度富营养处理下，各植物组合处理水体化学需氧量质量浓度在前28 d随时间延长而增加，随后HSJ、SSJ、SXJ和HXJ组的化学需氧量质量浓度下降，保持平稳(图8A)。至35 d时，低质量浓度处理下植物组合水体化学需氧量质量浓度由20.00 mg·L−1增加至29.00~53.33 mg·L−1，此时，对照组则增加至52.00 mg·L−1。SSJ在处理前期对化学需氧量去除率最高；HSJ、SSJ和SXJ在35 d时达到对化学需氧量去除率的高峰，且显著高于QXJ、QSJ和HXJ组(表6)。
图 8 不同质量浓度富营养下的化学需氧量质量浓度变化
Figure 8. Changes of COD content under different eutrophication concentrations
表 6 不同质量浓度富营养处理下不同水生植物组合对水体化学需氧量的去除率
Table 6. Removal of COD from water bodies by different aquatic plant combinations under different eutrophic concentration treatments
富营养化程度 t/d 不同植物种植组合处理对化学需氧量的去除率/% QXJ QSJ HXJ HSJ SXJ SSJ 低 7 25.00±5.00 ab 6.67±9.28 ab −16.67±23.15 b −1.67±12.02 ab −13.33±11.67 b 50.00±10.41 a 14 −41.67±3.33 a −47.50±10.10 ab −78.33±23.33 b −10.00±10.00 a −25.00±22.55 a −3.33±6.01 a 21 57.50±15.28 a 52.50±11.55 a 27.50±25.98 a 69.17±3.33 a 37.50±7.64 a 54.17±8.33 a 28 60.00±7.22 a 30.83±12.02 a −0.83±30.05 a 25.83±4.41 a 45.83±16.91 a 59.17±10.93 a 35 12.50±7.22 b −6.67±4.41 b −7.50±10.10 b 115.00±8.67 a 105.00±0.00 a 108.33±16.07 a 中 7 10.00±6.11 a 14.67±2.40 a 9.33±0.67 a 2.00±16.17 a 16.00±9.24 a −4.00±7.57 a 14 37.33±5.21 a 4.67±8.33 ab −14.33±9.81 b 13.33±6.36 ab 5.33±13.28 ab −10.00±7.06 b 21 6.00±5.29 a 2.00±5.03 a 4.00±12.70 a 6.00±4.62 a 16.00±5.29 a −13.00±0.58 a 28 −7.33±9.96 a 3.33±11.39 a 4.67±10.67 a 7.33±0.67 a 4.67±6.96 a 10.00±8.00 a 35 41.33±3.46 ab 36.00±6.36 ab 19.33±3.46 b 46.00±2.91 a 43.33±7.02 a 34.67±2.91 ab 高 7 11.67±2.85 ab 9.67±2.91 b 15.67±2.19 ab 25.33±1.76 a 17.00±2.31 ab 11.33±4.67 b 14 −8.00±5.51 a −6.33±2.85 a 3.00±3.61 a −5.33±4.84 a −5.33±5.55 a −4.00±1.00 a 21 1.33±6.96 a 11.00±3.76 a 13.33±1.20 a 10.00±1.20 a 7.33±9.02 a 13.33±3.38 a 28 11.00±3.46 a 5.50±2.02 a 15.00±1.15 a 14.00±4.16 a 10.00±4.04 a 10.67±4.81 a 35 27.00±0.58 c 36.00±1.15 b 41.33±0.88 a 41.50±0.29 a 19.00±0.58 d 6.00±0.58 e 说明：同行平均值后不同小写字母表示同一时间不同植物组合对化学需氧量去除率差异显著(P＜0.05)。 从图8 B可看出：中质量浓度富营养处理下，各组合水体化学需氧量质量浓度在前7 d下降明显，在7~28 d时总体呈上升趋势，28 d后迅速下降。至35 d时，中质量浓度富营养处理下，植物组合组水体化学需氧量质量浓度由50.00 mg·L−1下降至31.67~37.33 mg·L−1，对照组则降为54.67 mg·L−1。从表6可以看出：14 d时QXJ组的化学需氧量净化效果较好；各植物组合在35 d时达到化学需氧量去除率的最大值，此时HSJ和SXJ对化学需氧量的去除率最高，HXJ去除率最低。
由图8C可知：高质量浓度富营养处理下，所有种植组合的化学需氧量质量浓度在处理前期下降较为迅速，在7~28 d期间缓慢增加，随后除SXJ及SSJ组外，其余组合下降明显。试验期间，各植物组合的水体化学需氧量质量浓度由100.00 mg·L−1降至24.67~60.00 mg·L−1，对照组降至66.00 mg·L−1。进一步对植物组合的化学需氧量去除率进行分析(表6)，所有植物组合对化学需氧量的去除率在7 d时达到第1个高峰，此时HSJ组的化学需氧量净化率最大；至35 d时，SSJ组对化学需氧量的净化效率最低，且除SSJ组外，其他植物组合达到化学需氧量去除率最大值，其中化学需氧量去除率最高的为HSJ和HXJ组(表6)。
HSJ组在低质量浓度富营养处理下对化学需氧量的净化在后期效果较好；在中、高质量浓度富营养处理下对化学需氧量去除效果整体较好。XSJ组在低质量浓度下能较好地净化水体中化学需氧量。中质量浓度富营养下，SSJ组在前期对化学需氧量的去除率一直处于较低水平，后期才发挥较好效果；而在高质浓度富营养下的后期对化学需氧量的去除效果较差。
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本研究发现：同一挺水植物在不同组合中长势不一致，可能存在植物间的竞争关系，如低质量浓度富营养化水体中，与荇菜组合的挺水植物整体上长势都弱于与睡莲组合的挺水植物，且3种质量浓度富营养处理中的沉水植物也存在类似情况。另外，荇菜生长速度过快，优于睡莲，快速覆盖水面，挤占了同一组合中其他植物的生存空间，导致含荇菜的植物组合中的挺水植物、沉水植物整体上都弱于与睡莲组合的挺水植物和沉水植物，如千屈菜和金鱼藻在千屈菜+荇菜+金鱼藻组合中长势明显弱于其在千屈菜+睡莲+金鱼藻中的长势。吴中华[13]认为：荇菜与较弱的竞争对手共存时，往往在水面通过叶片快速生长形成覆盖层，以获取更多的生态位和营养空间。所以需考虑各植物生物学特性，避免种间竞争。水葱在低质量浓度富营养下长势较好，而黄菖蒲作为块茎类挺水植物具有较强的净水能力[14]，其在中、高质量浓度富营养化水体中比低质量浓度中长势更好，发挥效用更明显。这可能与黄菖蒲在低质量浓度富营养化水体中不能获得足够的氮、磷而生长受限制有关[15]。
黄菖蒲+睡莲+金鱼藻组对不同质量浓度富营养化水体中总磷、总氮、化学需氧量均有较优的去除效果，在高质量浓度富营养化水体中，还对氨氮净化效果良好。各植物组合在前28 d对化学需氧量的去除效果没有显著差异，推测与水体中植物和微生物之间的相互作用有关，王兴华等[16]研究也表明：植物微生物协同处理比微生物或植物单独处理能更有效降低污水中化学需氧量的浓度。在本研究中，各组合的植物在生长过程中为水中微生物提供较好的生存环境和营养物质。微生物在生长过程中又能把水中的氮、磷等转变为植物更容易吸收的盐类。浮水植物睡莲净化营养盐的能力较强，挺水植物黄菖蒲的磷去除率高，两者组合适用于净化重度污染水体、氮污染形式主要为氨氮且污染较严重的富营养化水体[15−19]，能更好地发挥两者净化营养盐的优势。
供试水体中营养盐总氮、总磷、氨氮、化学需氧量质量浓度在前7 d迅速下降，但大部分水生植物组合对以上营养盐的去除率较低，后期其去除率有所上升。相关文献表明：由于生物化学作用较慢，水生植物生长相对缓慢而减少了前期对水柱中的氮、磷吸收和同化，因此试验前期营养盐的净化以基质吸附等物理作用为主，后期以植物吸收等生物化学作用为主[20]。在本试验后期对照组的总磷质量浓度均明显下降，该结果与杨澜等[21]的研究结果类似，推测为长时间放置后对照组盆内水分蒸发或水中磷元素被土壤吸附所致。
就各水生植物的景观特性而言，合理地利用植物的花色进行色彩搭配显得尤为重要[22]。挺水植物中千屈菜夏、秋季节开花，花红紫色，花朵繁密；黄菖蒲春季开花，花黄色，花大且姿态优美；水葱夏季开花，秆直立高达，花药线性。浮水植物荇菜夏季开花，花黄色；睡莲春、夏季开花，花淡橘色，花型优美且大[23]，对周围环境的净化作用较强，能吸附空气中有毒物质，具康养价值[24]。综上所述，千屈菜+睡莲+金鱼藻组能到达春、夏、秋3个季节有花可观，景观时序性丰富；黄菖蒲+睡莲+金鱼藻组中睡莲春、夏季开花，能达到两季有花可观赏，景观时序性较丰富。千屈菜+睡莲+金鱼藻组与黄菖蒲+睡莲+金鱼藻组景观应用价值较高。
综合上述分析可知：黄菖蒲+睡莲+金鱼藻组在不同质量浓度富营养化水体中均有较为良好的净化效果，对总磷、总氮、化学需氧量综合净化能力较强，且具有较高的景观应用价值。
本研究植物组合数量上均为1株挺水植物、1株浮水植物、15 g沉水植物。但研究表明：组合中不同植物数量的配比对于水质净化效果不同[25]，可对植物组合的数量配比从景观效果以及净化效果进一步研究。微生物在污水处理时有着重要作用，可进行不同植物组合与微生物协同作用的研究，为受损湿地生态系统修复提供科学依据。
Purification effects of different combinations of ornamental aquatic plants on eutrophic water
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摘要:
目的 以适应性较强的挺水、浮水、沉水等观赏植物为试材，研究不同组合的水生观赏植物对不同质量浓度富营养化水体的净化效果。 方法 从2020年4月下旬开始，以挺水植物千屈菜Lythrum salicaria、黄菖蒲Iris pseudacorus、水葱Scirpus validus，浮水植物荇菜Nymphoides peltatum、睡莲 Nymphaea tetragon，沉水植物金鱼藻Ceratophyllum demersum进行不同种植组合处理，比较这些组合处理植物在低、中、高3种不同质量浓度(3种实验水体的总磷、总氮、氨态氮、化学需氧量分别为：2.00、0.20、0.67、20.00 mg·L−1；10.00、1.00、3.34、50.00 mg·L−1；20.00、2.00、6.67、100.00 mg·L−1)的富营养化水体中的生长情况以及去除总磷、总氮、氨氮及降低化学需氧量等的水体净化效果。 结果 ①总体来看，水葱在低质量浓度富营养化水体中长势较好，而千屈菜、黄菖蒲在中、高质量浓度处理下比低质量浓度处理下长势好；荇菜长势快，优于睡莲，但可能会影响组合配植植物的生长，而金鱼藻在与荇菜组合时长势弱于与睡莲组合。②总磷去除效果：在低质量浓度处理中，水葱+睡莲+金鱼藻组在前期对富营养水体总磷去除能力较强，去除率达47.57%；黄菖蒲+睡莲+金鱼藻的组合在后期净化效果最好，35 d时最高总磷去除率达74.59%；高质量浓度处理中，黄菖蒲+睡莲+金鱼藻组与水葱+睡莲+金鱼藻均有较好的去除效果。③总氮去除效果：在低质量浓度处理中，水葱所在的2个植物组合去除效果较好，总氮去除率均在30.00%以上；中质量浓度处理中，水葱+睡莲+金鱼藻组效果较好；黄菖蒲+睡莲+金鱼藻在低、中、高3种质量浓度处理中都有不错的净化效果。④氨氮去除效果：在低质量浓度处理中，水葱+荇菜+金鱼藻组去除氨氮效果最好，去除率达14.03%；中质量浓度处理中，千屈菜+睡莲+金鱼藻组净化效果最好，最高去除率达4.09%；高质量浓度处理中，黄菖蒲+睡莲+金鱼藻组和水葱+睡莲+金鱼藻组综合净化效果最好。⑤化学需氧量去除效果：在低质量浓度处理中，水葱+睡莲+金鱼藻组去除化学需氧量综合净化效果最好，去除率达108.33%；黄菖蒲+睡莲+金鱼藻组在低、中、高3种质量浓度处理下都有良好的净化效果，去除率分别为115.00%、46.00%、41.50%。 结论 结合各组合的景观应用价值分析，最终得出黄菖蒲+睡莲+金鱼藻组在不同质量浓度富营养化水体中均有良好的净化效果，且具有较高的景观应用价值，是最佳的种植组合。图4表6参25 Abstract:Objective The objective is to study the purification effects of aquatic ornamental plants on eutrophic water bodies. Method From late April 2020, different planting combinations were carried out with the water-holding plants Lythrum salicaria, Iris pseudacorus and Scirpus validus, the floating plants Nymphoides peltatum and Nymphaea tetragon, and the submerged plant Ceratophyllum demersum to compare their growth in water with 3 different levels of eutrophication: low, medium and high, and the water purification effects of removing total phosphorus (TP), total nitrogen (TN), ammonia nitrogen (NH3-N) and reducing chemical oxygen demand (COD). TP, TN, NH3-N and COD of the 3 experimental water bodies were 2.00, 0.20, 0.67, 20.00 mg·L−1, 10.00, 1.00, 3.34, 50.00 mg·L−1, and 20.00, 2.00, 6.67, 100.00 mg·L−1). Result (1) S. validus grew well in the eutrophic water body with low mass concentration, while L. salicaria and I. pseudacorus grew better in the treatment of medium and high mass concentration than in the treatment of low mass concentration. N. peltatum grew faster and better than N. tetragon, but it might affect the growth of combined plants. C. demersum grew weaker in combination with N. peltatum than with N. tetragon. (2) In the low concentration treatment, the S. validus, N. tetragon and C. demersum algae group had a better ability to remove TP from eutrophic water body in the early stage, with a removal rate of 47.57%. The combination of I. pseudacorus, N. tetragon and C. demersum algae had the best purification effect in the late stage, with a TP removal rate of 74.59%. In the medium and high concentration treatment, both the I. pseudacorus, N. tetragon and C. demersum algae group and S. validus, N. tetragon and C. demersum algae group had good TP removal effects. (3) In the low concentration treatment, the two planting combinations with S. validus had better removal effects, reaching 30.00% or more. In the medium concentration treatment, the TN removal effect of S. validus, N. tetragon and C. demersum algae group was better. I. pseudacorus, N. tetragon and C. demersum algae had good purification effect in the treatment of low, medium and high concentrations. (4) In the low concentration treatment, the group of S. validus, N. peltatum and C. demersum algae had the best effect of removing NH3-N, with a removal rate of 14.03%. In the medium concentration treatment, the group of L. salicaria, N. tetragon and C. demersum algae had the best purification effect, reaching 4.09%. In the high concentration treatment, both I.pseudacorus, N. tetragon and C. demersum algae group and S. validus, N. tetragon and C. demersum algae group had the best purification effect. (5) In the low concentration treatment, the effect of S. validus, N. tetragon and C. demersum algae group on COD removal was the best, up to 108.33%. The group of I. pseudacorus, N. tetragon and C. demersum algae had good purification effect in the treatment of low, medium and high concentrations, and the removal rates were 115.00%, 46.00% and 41.50% respectively. Conclusion The group of I. pseudacorus, N. tetragon and C. demersum has good purification effects in eutrophic water bodies of different concentrations and has high landscape application value. It proves to be the best planting combination. [Ch, 4 fig. 6 tab. 25 ref.] -
Key words:
- aquatic plant /
- eutrophication /
- plant combination /
- water restoration
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陆地棉Gossypium hirsutum是主要的经济作物之一，在经济发展过程中占有重要地位。而今因优质耕地面积减少导致的粮棉争地问题日益突出，中国陆地棉产区又整体呈现西北内陆棉区面积不断扩大，黄河、长江棉区面积持续减少的趋势[1]。在西北内陆地区栽培早熟棉能充分发挥其可晚播的特点，减少因早春干燥、降温，以及晚霜等原因造成的育苗病虫害，降低杀虫剂施用量[2]，增加霜前开花率并改善陆地棉品质[3]。因此，筛选早熟棉对提高耕地利用效率具有重要意义[4]。
植物从生理生长转向生殖生长的过程为开花[5]，受环境激素影响[6]，目前较为广泛的调控开花途径是光周期途径、春化途径、自主途径及年龄途径等[7]。自主及春化途径主要通过开花抑制基因FLC位点进行[8]，FLC调控FT和SOC1抑制开花[9]，受光周期途径正向调控[10]，可被FLD等通路抑制[11]。光周期靠CO/FT表达改变模式[12]。CO是光周期的核心基因[13]，其蛋白有2个锌指结构域正向调控FT[14−15]，N端蛋白控制光稳定，C端CCT区域用于核定位[16]。对拟南芥Arabidopsis thaliana研究表明：CCA1/LHY在TOC1上游调控光形态建成抑制其节律[17−18]。激活CCA1/LHY和TOC1翻译组蛋白可调控昼夜节律[19]。RVE8/LCL5也可通过结合TOC1启动子调节昼夜节律[20]，节律核心基因限制TOC1的降解[21]。TOC1和CCA1的mRNA转录水平受Hesp调控[22]。
PRR亚家族成员是生物钟重要组分。中心环CCA1和LHY通过结合启动子负调控TOC1(APRR1)[23]。CCA1和LHY是PRR9、PRR7的正调控因子[24]，也可能是PRR5的正调控因子。3个PRR基因通过结合启动子负调控CCA1和LHY[25]。PRR5促进TOC1积累使其稳定[26]，PRR3和PRR5阻断TOC1与ZTL互作使其稳定[24]。对玉米Zea mays研究表明：PRR家族成员参与包括光响应在内的多种信号传导[27]。对大豆Glycine max研究表明：PRR家族CCT结构缺失与无意义突变影响开花时间[28]。对大白菜Brassica pekinensis[29]、大豆突变体[30]研究也表明：TOC1可控制早花，参与非生物胁迫应答[31]。
陆地棉中开花相关基因大多数属于光周期和生物钟相关途径[32]。前人对陆地棉中光周期通路CO[33]、FT[34]，赤霉素途径FPF1[35]、SPL3[36]和部分MADS-box[37−38]家族基因进行研究，说明研究开花通路相关基因具有重要意义。结合生物信息学分析的基因功能研究有助于更好地理解基因功能[39−40]。本研究将从陆地棉群体高密度遗传图谱[41]及数量性状基因座(QTL)定位[42]中发掘陆地棉中拟南芥TOC1(APRR1)的同源基因GhPRR9进行家族分析和功能验证，预测GhPRR9的结构及可能行使的功能，并对GhPRR9功能加以验证，为培育早熟棉提供一定的理论参考。
1. 材料与方法
1.1 生物信息学分析
陆地棉全基因组数据下载于Cottongen[43]，拟南芥全基因组数据下载于TAIR[44]，水稻Oryza sativa、草棉Gherbaceum、可可Theobroma caca、玉米、大豆、毛果杨Populus trichocarpa基因组数据下载于Phytozome[45]。
根据拟南芥PRR亚家族的定义，在Pfam上获得CCT (PF06203)和REC (PF00072)结构域隐马模型，用HMMER扫描整个陆地棉基因组取交集，利用在线工具[46]鉴别所筛选出的基因是否同时包含CCT和REC结构域，最终得到GhPRR家族基因成员。使用ExPASY网站[47]分析工具和WoLF对家族成员进行蛋白理化性质分析。
用MEGA[48]对8个物种的PRR亚家族蛋白进行多序列比对，邻接法JJT模型构建系统进化树，校验重复100次。用DNAMAN进行保守序列比对和绘制。
利用TBtool[49]软件制作染色体定位图和domain结构；使用MEME[50]网站分析家族成员所含Motif并进行可视化。使用Plant Care[51]分析GhPRR亚基因家族上游2 000 bp顺式启动子元件，使用TBtools进行可视化。在美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中下载陆地棉相关的表达数据(序列号：PRJNA490626，编号：490626)，用TBtools绘制热图。
1.2 拟南芥阳性植株构建
提取陆地棉标准系‘TM-1’花蕾RNA，并用试剂盒(CAT#037A)反转录得到底物。使用Primer 5设计引物并扩增目标片段。使用TaKaRa纯化试剂盒(9761)纯化片段，pMD18-T Vector Cloning Kit (CAT# 6011)连接T载。热激法转化DH5α感受态菌株，活化涂板后挑单菌落进行菌液PCR分析，选取合理条带单克隆测序。
以T载为模板克隆片段并连接至过表达载体，热激转化农杆菌Agrobacterium tumefaciens GV3101，筛选阳性单克隆后取带花序的健康拟南芥提前剪下角果。浸入活化农杆菌液侵染1 min，沥干后黑暗1 d正常培养，收集种子为T0代。消毒播种T0代种子至相应抗性培养基上，其中，正常生长幼苗转入正常条件培养。筛选并验证拟南芥的阳性植株，成熟后收取T1代种子，如此培养至T3代。
1.3 启动子分析及GUS染色
从陆地棉基因组中提取GhPRR9起始密码子上游2 000 bp片段并预测顺式启动子元件。从陆地棉标准系‘TM-1’叶片DNA中分别克隆以起始编码为原点，长500、1 000、1 500和2 000 bp的片段，XcmⅠ酶切链接载体pCXGUS-P，热激法转入大肠埃希菌Escherichia coli，测序无误后将质粒转入农杆菌中侵染拟南芥得到种子。在卡那霉素培养基上播种筛选阳性植株培养至开花，取相关组织染色并观察。
1.4 烟草瞬时转化
将完成转化的表达载体以及绿色荧光蛋白(GFP)空载体通过热激法转入农杆菌菌株GV3101。培养后离心收集菌体重新悬浮，注射幼嫩烟草下表皮。注射后的烟草黑暗培养1 d后恢复正常光照周期。取下表皮制成临时切片，在激光共聚焦显微镜(LSM880)下观察记录影像。
1.5 实时荧光定量PCR (RT-qPCR)分析
相对定量使用2−ΔΔCt法，内参基因为GhHistone3 (陆地棉)和AtUBQ5 (拟南芥)。扩增程序为95 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。
陆地棉时空表达分析取样：选取4个品种陆地棉材料的不同器官组织，每个品种20株随机取样，混合研磨。日周期节律分析：取三叶期的陆地棉标准系‘TM-1’植株，在人工气候室中培养1周后，隔4 h取1次顶芽，重复3株混样研磨。
1.6 病毒诱导沉默(VIGS)株系的构建
用SGN VIGS Tool设计最佳VIGS片段。以测序正确的T载为模板进行扩增，SpeI和AscI酶切位点链接到pCLCrVA载体并转化至农杆菌LBA4404中。pCLCrVA-GhPRR9、pCLCrVA、pCLCrVA-PDS重悬液分别与pCLCrVB的重悬液按体积比1∶1混合均匀。
选取子叶完全展平，第1片真叶尚未完全显形的健康植株进行注射。侵染后的陆地棉设置辅助对照、沉默株、烟草花叶病毒株和空白对照植株，避光培养1 d后转入正常光照培养至开花，记录现蕾开花时间。
2. 结果与分析
2.1 陆地棉GhPRR亚家族基因特性分析
2.1.1 陆地棉GhPRR亚家族成员鉴定及定位分析
在陆地棉全基因组中共鉴定到14个PRR亚基因家族成员，分别命名为GhPRR1~GhPRR14 (表1)。理化性质分析显示：PRR亚家族成员蛋白有552~775个氨基酸，相对分子量为60.76~85.30 kDa，平均等电点为6.77，酸性蛋白8个，碱性蛋白6个。亚细胞定位结果显示：有11个蛋白定位于细胞核中，2个定位于叶绿体，1个定位于内质网。
表 1 GhPRR亚家族蛋白理化性质Table 1 Physicochemical properties of protein in GhPRR subfamily蛋白名称 染色体位置 等电点 分子量/kDa 氨基酸/个 亚细胞定位 亲水性 GhPRR1 ChrA03 5.49 53.53 487 细胞核 −0.876 GhPRR2 ChrA05 7.32 76.62 696 细胞核 −0.725 GhPRR3 ChrA05 8.07 81.80 743 叶绿体 −0.738 GhPRR4 ChrA05 8.55 60.76 552 细胞核 −0.834 GhPRR5 ChrA09 6.33 73.66 669 内质网 −0.592 GhPRR6 ChrA11 6.53 68.72 625 细胞核 −0.565 GhPRR7 ChrA11 5.16 73.11 665 细胞核 −0.688 GhPRR8 ChrA11 6.84 82.54 750 细胞核 −0.689 GhPRR9 ChrD03 5.66 61.96 563 细胞核 −0.743 GhPRR10 ChrD09 7.11 85.30 775 叶绿体 −0.677 GhPRR11 ChrD11 7.56 70.20 638 细胞核 −0.692 GhPRR12 ChrD11 5.62 72.77 661 细胞核 −0.622 GhPRR13 ChrD11 7.91 76.08 691 细胞核 −0.680 GhPRR14 ChrD12 6.67 70.92 645 细胞核 −0.742 用TBtools绘制出染色体定位图(图1A)，可观察到GhPRR家族基因保守分布在染色体两端，14个成员分布在8条染色体上，A亚族8个，D亚族6个，其中Chr A05、Chr A11、Chr D11染色体上分别拥有3个该家族的基因，其余染色体均为1个，表明GhPRR亚家族在陆地棉AD亚基因组上呈现不完全均匀分布。
图 1 陆地棉GhPRR亚家族成员定位及多重序列对比Figure 1 Mapping and multiple sequence comparison of GhPRR subfamily members in cotton2.1.2 陆地棉GhPRR亚家族进化树及蛋白序列对比
从水稻、拟南芥、玉米、草棉、可可、大豆、毛果杨中分别鉴定出5、6、9、9、24、35、49个PRR亚家族成员，与陆地棉GhPRR亚家族成员蛋白构建系统进化树(图1B)。聚类结果显示：陆地棉GhPRR亚家族进化关系最接近的物种是草棉和可可。不同物种中该基因家族成员的数量差异较为明显，也体现出PRR家族成员在不同物种中的多样性。
多重序列比对(图1C)显示：陆地棉GhPRR亚家族蛋白共有4处位点保守性较强，其中有2个高度保守的g位点，说明该家族拥有2段特征结构域(REC与CCT)。
2.1.3 陆地棉GhPRR亚家族成员结构分析
蛋白结构分析显示：14个蛋白均含有CCT结构域(图2A)。GhPRR6、GhPRR1、GhPRR2、GhPRR4、GhPRR8和GhPRR13含有REC超家族结构域(cl19078)，其余成员含有psREC_PRR结构域(cd17852，属cl19078超家族)，亚家族成员有一定的保守性，REC结构域主要功能为核酸识别，CCT结构域主要标志转录因子，以上2个结构的保守性显示了该家族成员的功能。
图 2 陆地棉GhPRR亚家族成员结构(A~D)及时空表达量(E~F)分析Figure 2 Structure (A－D) and spatiotemporal expression (E－F) of GhPRR subfamily members in cottonMEME分析共得到5个保守基序(图2B)。除GhPRR5外其余成员均含有Motif 2和Motif 5。GhPRR1仅有Motif 1，没有Motif 3和Motif 4，GhPRR4没有Motif 1、Motif 3和Motif 4，其余成员都拥有Motif 1、Motif 3和Motif 4。
基因结构(图2C)显示：该亚家族成员GhPRR1外显子最少(5个)，GhPRR2最多(11个)，其中，5个成员有8个外显子，3个成员有9个外显子，2个成员有7个外显子，2个成员有6个外显子。最长外显子在3′端较为保守，结构相似度和进化关系基本一致。
2.1.4 陆地棉GhPRR亚家族启动子顺式元件分析
使用Plant Care对陆地棉GhPRR亚家族成员上游2 000 bp顺式启动子元件进行分析(图2D)发现：主要存在三类顺式元件，一是生长发育响应元件，如光响应元件、生物钟控件；二是激素响应元件，如赤霉素、脱落酸等响应元件；三是非生物胁迫元件，如逆境、盐胁迫等响应元件。其中光响应元件最多(184个)，其次为赤霉素响应元件(28个)。说明该亚家族成员主要参与光响应和赤霉素通路。
2.1.5 陆地棉GhPRR亚家族成员表达分析
利用公开的转录组数据对陆地棉GhPRR亚家族成员进行组织表达分析(图2E)发现：不同成员组织表达水平差异较大。其中茎叶和花药中表达量最高的是GhPRR4，最少的分别是GhPRR8、GhPRR3和GhPRR2。GhPRR13和GhPRR9在花丝、花苞、花萼中表达量较高，GhPRR2和GhPRR6最少。根中GhPRR13表达量最多，GhPRR7最少，雌蕊花托中GhPRR13表达量最高，GhPRR12和GhPRR2最少。GhPRR4、GhPRR11和GhPRR6可能主要作用于维管组织，GhPRR13和GhPRR9可能作用于花器官组织。
时间表达模式分析(图2F)显示：除GhPRR7、GhPRR12、GhPRR2、GhPRR3和GhPRR10外，GhPRR亚家族其他成员表达量均呈现开花前3 d至开花后1 d逐渐增加，开花后3~5 d逐渐降低的趋势，说明其可能集中在开花前和开花时发挥作用。GhPRR7主要作用在开花后5 d及之后，GhPRR12和GhPRR2可能较少参与开花过程。胚珠中GhPRR13表达量在第10天达到顶峰，说明它在胚珠发育前期可能发挥着一定的作用，GhPRR10、GhPRR5、GhPRR9、GhPRR18、GhPRR3、GhPRR4和GhPRR14也呈现相似的趋势，说明这些基因可能拥有类似的作用模式。纤维发育期间，GhPRR13、GhPRR10和GhPRR4表达量较高，说明这些基因可能参与纤维发育调控。时间模式上，GhPRR13在10~25 d纤维中表达量持续下降，而GhPRR10和GhPRR4则表现出持续上升的趋势，可知GhPRR10和GhPRR4可能参与纤维发育的后期调控，而GhPRR13则参与早期的纤维发育调控。丰富的时空表达说明陆地棉GhPRR家族成员广泛参与到开花前后、胚珠和纤维的发育过程中。
2.2 GhPRR9基因启动子和表达特性分析
使用Plant Care在线工具对该基因上游2 000 bp进行启动子顺式元件分析(表2)，发现拟南芥AtTOC1的同源基因GhPRR9上存在着大量的光响应元件，说明光对该基因的转录有着重要的调控作用。除此之外，在GhPRR9基因的启动子区域还存在茉莉酸等激素响应元件，说明该基因可能参与激素相关通路的调节。
表 2 GhPRR9启动子顺式元件预测Table 2 Cis-acting element prediction of GhPRR9 promoter名称 起始位置/bp 所在链 功能 名称 起始位置/bp 所在链 功能 ARE 43 − 厌氧胁迫响应 TATA-box 635 − 核心元件 P-box 1 121 − 赤霉素响应 TATA-box 636 − 核心元件 G-box 167 + 光响应 Sp1 1 057 − 光响应 G-box 1 070 + 光响应 G-Box 1 009 − 光响应 A-box 882 − 顺式调节 ABRE 168 + 脱落酸响应 TCCC-motif 871 + 光响应 TGACG-motif 878 + 茉莉酸响应 CAAT-box 249 + 增强区域 TGACG-motif 1 991 − 茉莉酸响应 CAAT-box 354 + 增强区域 Box Ⅱ 1 007 − 光响应 AE-box 535 − 光响应 Box 4 419 + 光响应 GATA-motif 710 + 光响应 MRE 1 513 − 光响应MYB结合 ATCT-motif 1 343 − 光响应 CGTCA-motif 878 − 茉莉酸响应 TATA-box 634 − 核心元件 对陆地棉标准系‘TM-1’进行荧光定量分析(图3A)表明：GhPRR9在花丝、萼片、花托中表达量较高，叶片最低，表明GhPRR9可能更多参与陆地棉的生殖生长。
图 3 基因GhPRR9的时空表达量、亚细胞定位和启动子染色Figure 3 Spatial and temporal expression of GhPRR9 gene, subcellular localization and promoter staining对在人工光照条件下陆地棉三叶期标准系‘TM-1’顶芽隔4 h取样并进行荧光定量分析(图3B)表明：GhPRR9在光照开始后逐渐积累，并在中午达到顶峰，之后慢慢下降，在光周期内的表达呈现出一定的周期性。
进一步对GhPRR9早熟品种‘中50’‘ZHONG 50’、‘中58’‘ZHONG 58’和晚熟品种‘TM-1’、‘豫棉21号’‘YM21’的表达量分析发现：GhPRR9在早熟品种中表达量显著高于晚熟品种(图3C)，说明GhPRR9和早熟性状呈正向相关。
将未转化的GFP质粒和35S::GhPRR9-GFP质粒分别转入农杆菌GV3101，并侵染烟草叶片组织，制作表皮切片置于激光共聚焦显微镜下发现：对照组分布于整个细胞中，而GFP融合蛋白荧光仅分布于细胞核(图3D)。
截取GhPRR9不同长度的启动子与携带GUS报告基因的质粒进行重组，分别转入农杆菌GV3101后通过沾花法侵染拟南芥，获得纯合转基因株系染色观察，结果显示上游500 bp启动子几乎没有表达(图3E)，而上游2 000 bp的启动子着色程度最深，说明GhPRR9启动子上游500~2 000 bp内可能存在关键调控元件诱导基因的表达。
2.3 GhPRR9在拟南芥中的功能分析
将拟南芥GhPRR9过表达株系培养至抽薹，并观察表型性状(图4A)发现：过表达株系GhPRR9表达量比野生型明显提高(图4B)，且转基因过表达株系连座叶数量明显减少(图4C)，抽薹时间和开花提前(图4D和图4E)，首花抽薹高度极显著矮于野生型(图4F，P＜0.01)，说明GhPRR9正向调控植物的早花性状。过表达GhPRR9能促进开花关键基因LFY与FT表达(图4G和图4H)，表明GhPRR9也可能通过影响关键基因表达调控通路进而影响开花时间。
图 4 拟南芥过表达株系的表型及表达量Figure 4 Phenotype and expression levels of A. thaliana overexpressed strains2.4 病毒诱导(VIGS)的GhPRR9基因沉默实验
对VIGS沉默株系进行表达量检测发现：沉默株系中，GhPDS株系出现白化表型(图5A)，且GhPRR9的表达量极显著降低(图5B，P＜0.01)，表明GhPRR9基因成功得到了沉默。与对照株系相比，沉默株系现蕾时间延迟约3~4 d，开花时间延迟约2~5 d，表明沉默GhPRR9可推迟开花时间，反向证明其调节陆地棉早花的功能。
图 5 陆地棉病毒诱导(VIGS)植株的表型及影响Figure 5 Phenotype and effect of G. hirsutum virus induced silencing (VIGS) plants3. 讨论
本研究共鉴定出陆地棉14个GhPRR亚家族成员，成员含有CCT和REC保守结构域，说明其行使转录因子功能。转录组分析显示：大部分成员主要在开花前的茎叶、纤维发育后期和胚珠发育中期发挥作用，表明大部分成员可能存在功能冗余或协同拮抗作用。启动子元件分析显示：陆地棉GhPRR亚家族可能频繁地参与光感效应相关的生理过程，这与在拟南芥的结果中一致，据此可推测其与拟南芥同源基因作用相似。进化分析表明：陆地棉GhPRR亚家族成员基因数量多于拟南芥。前人研究也发现：棉花基因组进化加倍使该家族基因得到了扩增[52]。
对过表达株系研究发现：抽薹日期、开花日期都稍有提前，抽薹高度显著高于同期野生型植株，证明GhPRR9可以使拟南芥花期提前。构建GFP表达载体侵染烟草叶片，表明GhPRR9蛋白定位于细胞核，与生物信息学分析相互印证，进一步确认该基因行使转录因子的功能。对GhPRR9基因1 d内表达水平分析显示：光暗交替条件下基因表达量存在着周期性变化，按照其表达模式推断该基因在光照开始后积累，中午达到顶峰后慢慢下降，这与拟南芥同源基因的表达模式[53]相似，据此推测，陆地棉早花基因GhPRR9可能与拟南芥中的同源基因行使着类似的功能。陆地棉三叶期叶片的基因表达量结果显示：GhPRR9基因在早熟种中表达量高于晚熟种，据此可推断其与早熟性状有正向关联。构建VIGS株系发现：沉默株系高度降低，生育期推迟，反向证明了其促进生育期的功能。启动子分析显示：光和赤霉素可能影响该基因的转录。GUS染色结果显示：启动子上游500~2 000 bp可能存在关键调控元件。有研究显示：陆地棉转录因子与通路主要基因启动子的结合可随温度产生变化[54]，且同源转录因子可能存在相互调控的作用[55]。
4. 结论
本研究预测了陆地棉GhPRR亚家族的功能和作用模式，找到拟南芥早花基因AtTOC1的陆地棉同源基因GhPRR9，并成功克隆，构建遗传转化株系对其功能进行验证显示：GhPRR9对早花性状存在正向促进作用。
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图 5 不同质量浓度富营养水体中总磷的变化
Figure 5 Changes of TP content under different eutrophication concentrations
图 6 不同质量浓度富营养水体中总氮的变化
Figure 6 Changes of TN content under different eutrophication concentrations
图 7 不同质量浓度富营养水体中的氨氮的变化
Figure 7 Changes of NH3-N content under different eutrophication concentrations
图 8 不同质量浓度富营养下的化学需氧量质量浓度变化
Figure 8 Changes of COD content under different eutrophication concentrations
表 1 植物种植组合处理
Table 1. Planting combination treatment
编号 种植组合 对照组(ck) 无植物 QXJ 千屈菜+荇菜+金鱼藻 QSJ 千屈菜+睡莲+金鱼藻 HXJ 黄菖蒲+荇菜+金鱼藻 HSJ 黄菖蒲+睡莲+金鱼藻 SXJ 水葱+荇菜+金鱼藻 SSJ 水葱+睡莲+金鱼藻 
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表 2 水体参数
Table 2. Parameters of the test water
富营养
化程度总氮/
(mg·L－1)总磷/
(mg·L－1)氨氮/
(mg·L－1)化学需氧量/
(mg·L－1)低 2.00 0.20 0.67 20.00 中 10.00 1.00 3.34 50.00 高 20.00 2.00 6.67 100.00
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表 3 不同质量浓度富营养处理下不同水生植物组合对水体总磷的去除率
Table 3. Removal of TP from water bodies by different aquatic plant combinations under different eutrophic concentration treatments
富营养化程度 t/d 不同植物种植组合处理对总磷的去除率/% QXJ QSJ HXJ HSJ SXJ SSJ 低 7 0.00±1.88 ab 0.35±2.20 ab −4.90±0.30 b 5.85±4.83 a −46.04±2.66 c 12.53±4.43 a 14 36.06±0.94 ab 32.80±2.72 b 40.78±0.76 ab 33.76±0.06 b 3.83±3.99 c 47.57±3.76 a 21 34.53±6.23 a 26.86±4.73 a 37.60±9.64 a 49.87±3.91 a 42.59±4.36 a 36.83±0.94 a 28 81.13±1.45 a 64.28±5.05 b 61.39±2.88 bc 74.59±2.21 ab 72.89±1.76 ab 49.15±0.92 c 35 16.10±1.33 b 42.93±6.68 a 31.05±3.45 ab 42.93±2.17 a 34.50±2.30 a 33.75±5.53 a 中 7 4.37±0.69 a 1.53±2.62 a 2.76±1.59 a 1.38±2..42 a 0.92±0.92 a 4.30±0.61 a 14 26.47±1.57 a 27.16±0.79 a 22.71±4.93 a 26.24±1.86 a 20.56±4.82 a 20.95±4.09 a 21 9.21±1.36 a 12.43±1.16 a 6.91±1.33 a 11.66±0.81 a 11.05±1.46 a 11.74±1.47 a 28 20.34±0.58 a 19.53±1.53 a 21.03±0.59 a 21.71±0.23 a 18.93±0.94 a 19.59±1.85 a 35 8.06±1.21 a 8.42±1.12 a 3.96±0.68 ab 8.52±0.23 a 2.15±1.34 b 7.37±0.99 a 高 7 4.45±0.41 a 6.22±0.13 a 4.83±0.72 a 5.06±0.80 a 5.99±0.27 a 4.95±1.35 a 14 6.98±0.27 a 7.21±0.13 a 6.98±0.46 a 4.99±0.31 b 6.98±0.03 a 6.29±0.13 ab 21 10.97±0.44 a 10.97±0.48 a 7.37±0.76 bc 10.13±1.07 ab 9.94±0.83 ab 6.14±0.01 c 28 12.20±0.62 a 12.50±0.31 a 10.66±0.67 a 10.36±1.38 a 10.66±1.31 a 12.04±1.77 a 35 9.30±0.60 ab 7.60±1.74 b 11.59±0.15 ab 12.20±0.70 a 7.75±1.01 b 12.35±0.81 a 说明：同行平均值后不同小写字母表示同一时间不同植物组合对总磷的去除率差异显著(P＜0.05)。
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表 4 不同质量浓度富营养处理下不同水生植物组合对水体总氮的去除率
Table 4. Removal of TN from water bodies by different aquatic plant combinations under different eutrophic concentration treatments
富营养化程度 t/d 不同植物种植组合处理对总氮的去除率/% QXJ QSJ HXJ HSJ SXJ SSJ 低 7 0.44±2.06 a −0.83±0.74 a −0.78±1.15 a 9.75±4.14 a 2.08±0.93 a 2.19±1.30 a 14 2.62±1.18 a 0.34±3.95 a 1.90±1.19 a 6.23±3.33 a 6.04±2.71 a 8.79±6.38 a 21 1.36±1.81 a 2.33±1.22 a 1.39±0.98 a −2.42±2.48 a 1.50±1.29 a 2.53±2.74 a 28 3.64±0.13 a 11.40±2.49 a 11.63±11.62 a −10.00±2.60 a 0.25±2.02 a 11.62±6.19 a 35 12.05±4.07 d 16.93±2.62 cd 22.10±1.04 bcd 24.95±1.41 bc 47.33±1.99 a 30.90±0.17 b 中 7 0.40±0.06 a 0.67±0.35 a −0.05±0.41 a 1.15±1.30 a −0.42±0.39 a −0.66±0.60 a 14 0.24±0.30 a 0.30±0.41 a 0.94±0.18 a 0.59±0.21 a 2.10±1.04 a 0.60±0.34 a 21 0.28±0.23 a 0.13±0.27 a 0.40±0.17 a 0.55±0.10 a 0.11±0.35 a 0.32±0.23 a 28 8.43±0.63 a 9.44±0.77 a 12.58±3.92 a 13.66±0.84 a 9.44±0.12 a 10.51±1.26 a 35 2.15±0.56 bc 2.67±0.44 bc 0.79±0.08 c 3.36±0.24 abc 3.43±0.56 ab 5.59±0.94 a 高 7 0.23±0.27 a −0.58±0.21 a −0.48±0.22 a −0.11±0.04 a −0.13±0.10 a −0.05±0.22 a 14 0.41±0.12 ab −0.06±0.06 c 0.67±0.00 a 0.71±0.04 a 0.15±0.11 bc 0.48±0.08 ab 21 0.22±0.40 a −0.17±0.15 a 0.33±0.10 a 0.05±0.13 a 0.20±0.11 a 0.24±0.22 a 28 1.29±0.13 a 1.20±0.05 a 1.08±0.06 a 1.27±0.05 a 1.29±0.09 a 1.23±0.05 a 35 2.59±0.06 b 2.85±0.04 b 2.78±0.09 b 3.47±0.24 a 2.76±0.09 b 2.60±0.12 b 说明：同行平均值后不同小写字母表示同一时间不同植物组合对总氮的去除率差异显著(P＜0.05)。
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表 5 不同质量浓度富营养处理下不同水生植物组合对水体氨氮的去除率
Table 5. Removal of NH3-N from water bodies by different aquatic plant combinations under different eutrophic concentration treatments
富营养化程度 t/d 不同植物种植组合处理对氨氮的去除率/% QXJ QSJ HXJ HSJ SXJ SSJ 低 7 −1.49±4.80 a −4.98±5.87 a −9.70±3.02 a −0.75±3.88 a −8.96±5.24 a −7.96±7.77 a 14 1.50±0.43 a −38.06±4.31 d −13.43±0.43 c −3.73±1.72 ab −12.69±1.72 bc 0.75±0.00 a 21 21.89±0.86 b 21.89±1.72 b 20.40±0.86 b 30.35±1.79 a 31.34±1.99 a 33.08±1.29 a 28 11.19±15.08 ab 29.85±6.03 a −15.67±1.29 b 31.34±2.59 a 38.06±7.32 a 18.66±1.29 ab 35 10.65±0.28 ab 7.66±1.75 b 11.74±1.04 ab 7.56±1.42 b 14.03±1.29 a 9.48±0.73 ab 中 7 −2.69±0.46 a 1.10±0.87 a −1.05±1.12 a −0.90±1.04 a −0.60±1.38 a −2.84±0.09 a 14 1.40±0.17 a 0.30±0.10 a 0.10±1.90 ab 0.65±0.09 a −0.40±0.35 ab −1.00±0.17 b 21 2.30±0.53 a 4.09±0.36 a 3.44±0.61 a 1.20±0.35 ab 2.20±1.21 a −1.35±0.09 b 28 0.00±0.17 a 0.15±1.30 a 0.75±0.78 a −0.60±0.52 a 0.20±1.15 a 1.00±0.40 a 35 0.91±0.03 bc 1.68±0.10 ab 0.67±0.29 bc 0.61±0.22 c 1.50±0.25 abc 2.27±0.29 a 高 7 2.60±0.40 a 1.40±0.80 a 1.45±0.35 a 2.65±0.17 a 0.70±1.08 a 0.30±0.13 a 14 3.42±0.87 a 2.82±0.56 a 3.87±0.22 a 3.82±0.09 a 3.37±0.69 a 2.17±0.61 a 21 1.15±1.00 a 0.60±1.15 a −0.75±1.73 a 0.75±0.94 a 1.25±0.53 a −0.97±1.34 a 28 0.65±0.48 ab 0.12±0.87 ab −0.37±1.04 b 2.70±0.13 ab 2.32±0.43 ab 3.07±0.61 a 35 0.66±0.01 c 0.95±0.08 b 1.08±0.04 ab 1.19±0.03 a 1.04±0.06 ab 1.08±0.02 ab 说明：同行平均值后不同小写字母表示同一时间不同植物组合对氨氮的去除率差异显著(P＜0.05)。
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表 6 不同质量浓度富营养处理下不同水生植物组合对水体化学需氧量的去除率
Table 6. Removal of COD from water bodies by different aquatic plant combinations under different eutrophic concentration treatments
富营养化程度 t/d 不同植物种植组合处理对化学需氧量的去除率/% QXJ QSJ HXJ HSJ SXJ SSJ 低 7 25.00±5.00 ab 6.67±9.28 ab −16.67±23.15 b −1.67±12.02 ab −13.33±11.67 b 50.00±10.41 a 14 −41.67±3.33 a −47.50±10.10 ab −78.33±23.33 b −10.00±10.00 a −25.00±22.55 a −3.33±6.01 a 21 57.50±15.28 a 52.50±11.55 a 27.50±25.98 a 69.17±3.33 a 37.50±7.64 a 54.17±8.33 a 28 60.00±7.22 a 30.83±12.02 a −0.83±30.05 a 25.83±4.41 a 45.83±16.91 a 59.17±10.93 a 35 12.50±7.22 b −6.67±4.41 b −7.50±10.10 b 115.00±8.67 a 105.00±0.00 a 108.33±16.07 a 中 7 10.00±6.11 a 14.67±2.40 a 9.33±0.67 a 2.00±16.17 a 16.00±9.24 a −4.00±7.57 a 14 37.33±5.21 a 4.67±8.33 ab −14.33±9.81 b 13.33±6.36 ab 5.33±13.28 ab −10.00±7.06 b 21 6.00±5.29 a 2.00±5.03 a 4.00±12.70 a 6.00±4.62 a 16.00±5.29 a −13.00±0.58 a 28 −7.33±9.96 a 3.33±11.39 a 4.67±10.67 a 7.33±0.67 a 4.67±6.96 a 10.00±8.00 a 35 41.33±3.46 ab 36.00±6.36 ab 19.33±3.46 b 46.00±2.91 a 43.33±7.02 a 34.67±2.91 ab 高 7 11.67±2.85 ab 9.67±2.91 b 15.67±2.19 ab 25.33±1.76 a 17.00±2.31 ab 11.33±4.67 b 14 −8.00±5.51 a −6.33±2.85 a 3.00±3.61 a −5.33±4.84 a −5.33±5.55 a −4.00±1.00 a 21 1.33±6.96 a 11.00±3.76 a 13.33±1.20 a 10.00±1.20 a 7.33±9.02 a 13.33±3.38 a 28 11.00±3.46 a 5.50±2.02 a 15.00±1.15 a 14.00±4.16 a 10.00±4.04 a 10.67±4.81 a 35 27.00±0.58 c 36.00±1.15 b 41.33±0.88 a 41.50±0.29 a 19.00±0.58 d 6.00±0.58 e 说明：同行平均值后不同小写字母表示同一时间不同植物组合对化学需氧量去除率差异显著(P＜0.05)。
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