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桢楠Phoebe zhennan为樟科Lauraceae楠属Phoebe常绿大乔木，是中国特有的珍贵用材树种和国家二级重点保护植物[1-2]，是“金丝楠木”中最好的一种；主要分布于四川、重庆，少量分布在湖北西部和贵州西北部等地区[2]。由于长期砍伐破坏，桢楠自然森林资源近于枯竭，现只在四川邛崃山、大娄山、小凉山及其周边地区的以散生状态存在小片天然林，以及在寺庙、风景名胜区与村舍旁偶有大树存在[3-4]。作为珍稀用材树种，桢楠人工林的发展正日益受到重视，苗木培育、栽培技术等方面取得了一定成果[5-7]；近年来，在华东地区如浙江、安徽等地区有少量引种栽培[8-10]。桢楠为耐荫树种，幼年期尤喜阴湿的生长环境，成年后渐好阳[2]，但目前还没有关于光环境对桢楠苗期生长影响的报道。桢楠苗期生长速度缓慢，寿命长，因此桢楠人工林常以大径材为培育目标。对天然林中桢楠的生长过程的研究发现：自然状态下桢楠生长速度非较慢；其中，0~20 a树高生长缓慢，20~70 a为速生期，之后趋于平缓；胸径生长0~30 a较慢，30~90 a为快速生长期，90 a后稍减缓；材积生长为0~50 a较慢，50~90 a为速生期，90 a左右趋于平缓但并未达到峰值。四川地区90年生天然林大树的平均树高为33.8 m，平均胸径为43.1 cm，平均材积为2.24 m3[11]。因此，培育措施调控桢楠苗期生长以缩短桢楠培育周期成为桢楠培育中的重要内容。由于自然资源有限，要恢复桢楠自然资源和发展珍贵用材，开展桢楠人工林资源培育成为必要途径。张炜[7]研究发现适度施肥可以明显促进桢楠的高生长；本研究拟探索光照条件和养分需求对1年生桢楠苗生长的影响，以期为桢楠人工林苗期生长调控提供科学依据。
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试验地安徽省舒城县德昌苗木基地(31°12′26″N，116°47′54″E)为亚热带温润性季风气候，四季分明，雨水充沛。年平均气温16.2 ℃，极端最低温−16.8 ℃，最高温度40.5 ℃，最热为7月，最冷为1月，年日照时数1 969.0 h，有效积温4 972.4 ℃，平均降水量约1 100.0 mm。基地土壤为砂壤土，土质疏松肥沃，土壤有机质含量为1.67%，水解氮、有效磷和速效钾分别为120.6、71.2 和13.2 mg·kg−1。
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以2018年初从四川引种的1年生桢楠实生苗为材料，苗木长势良好，大小一致。所有苗木定植于基地大田中，株行距为0.5 m × 1.0 m。
遮光和施肥处理于2018年6月初进行，试验采用二裂式裂区试验设计，主区为遮光处理(A)，包括3个不同处理，分别为不遮光(透光率100%，A1)、遮光1层(透光率45.5%，A2)、遮光2层(透光率14.7%，A3)；副区为施肥处理(B)，也包括3个不同水平，分别为不施肥(0 g·株−1，B1)、中度施肥(3.3 g·株−1，B2)和大量施肥(6.7 g·株−1，B3)，具体如表1所示。即试验共包括9个处理，每个处理重复3次，每个重复包括4株幼苗。同一遮光强度下的3个处理不做分隔，不同遮光处理间隔约2.0 m用遮阳网分隔。本试验遮光采用遮阳率为60%的黑色尼龙网，遮阳网架设于离地面约2.0 m高处；施肥使用复合肥(N∶P2O5∶K2O = 15∶15∶15)，于6月初和6月中旬分2次采用环状施肥法施入。于6月下旬开始进行相关指标的测定和数据收集。
表 1 二裂式裂区试验设计
Table 1. Split-plot randomized design of the experiment
处理 透光率/% 施肥量/(g·株−1) 处理 透光率/% 施肥量/(g·株−1) A1B1 100 0 A2B3 45.5 6.7 A1B2 100 3.3 A3B1 14.7 0 A1B3 100 6.7 A3B2 14.7 3.3 A2B1 45.5 0 A3B3 14.7 6.7 A2B2 45.5 3.3 -
于6月下旬开始测量各试验单元中桢楠幼苗的苗高(cm)和地径(cm)，以后每月下旬进行调查，直至11月下旬。
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待苗高和地径测定完毕，按处理挖取所有桢楠植株，清水洗净后分根、茎和叶于70 ℃烘干至恒质量。称取各部分干质量，并用根、茎和叶干质量之和表示总生物量。
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不同处理桢楠苗净光合速率测定于8月下旬进行。根据当月苗高和地径测定结果，从各处理中选取接近其平均值的5株桢楠苗进行标记。选取标记植株顶芽向下的第3个枝条中间部位的健康、完全功能叶片作为测量对象，并于天气晴朗的9:00−11:00采用LI-6400XT光合系统(LI-COR，Inc. Lincoln NE，美国)在自然光条件下测量。为了尽量减小测量时间带来的误差，各处理每次只测定1株，并依此循环直至将标记植株全部测完。测定期间，全光下的光照强度、空气温度和相对湿度分别为1 088~1 619 μmol·m−2·s−1，36.5~41.4 ℃和50%~69%；1层遮光下的光照强度、空气温度和相对湿度分别为312~497 μmol·m−2·s−1，33.6~37.3 ℃和63%~80%；2层遮光下的的光照强度、空气温度和相对湿度分别为105~178 μmol·m−2·s−1，32.4~35.7 ℃，68%~85%。从测量光合参数后的植株上采集新鲜小叶，洗净、擦干，剪碎后采用丙酮-乙醇(V/V＝17/3)溶液浸提叶片中的光合色素，过夜，待叶片变白后取上清液分别在λ＝663 nm和λ＝645 nm下测定光密度，叶绿素相对含量按AMON方法[12]计算。
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收集1.3.2中烘干至恒质量的植物样品，粉碎过筛后称取0.5 mg左右，用2 mm × 5 mm的锡杯包裹，使用元素分析仪(EA3000，Euro Vector，Italy)测定样品中的总碳和总氮质量。
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以双因素方差分析结果比较遮光、施肥以及两者交互作用对桢楠生长、氮素相对含量等指标的影响；以Duncan’s多重比较分析处理之间的差异。所有统计数据均由SPSS进行分析，分析结果表示为95%的置信水平上的显著水平。
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如图1A所示：在6−11月，不同处理桢楠的苗高月生长量均表现为“慢—快—慢”的月份生长节律，其中7−9月为苗的生长高峰期，其生长量平均达到整个观测期的52.4%。但苗高月生长量在处理间存在一定差异，双因素方差分析结果表明：遮光、施肥和两者交互作用均对月生长节律产生了显著影响(P＜0.05，表2)。平均苗高在1层遮光下(A2)达到最大，明显高于全光和2层遮光处理(表3)，变异范围为7.35~16.55 cm。最大平均苗高在中度施肥水平(B2)下测得，明显高于大量施肥(B3)和不施肥(B1)处理，但变异范围略小(10.71~12.85 cm)。双因素作用下，1层遮光和中度施肥(A2B2)处理时苗高总生长量最大，并向两侧依次下降，呈“单峰”变异模式。桢楠地径的月生长量和总生长量均与苗高基本一致(图1B)，但施肥及交互作用对地径生长未产生显著影响(表2和表3)。
图 1 遮光和施肥对桢楠苗高(A)、地径(B)生长的影响
Figure 1. Effects of shading and fertilization on tree height (A) and basal diameter (B) growth of P. zhennan seedlings
表 2 遮光和施肥对桢楠生长、生物量积累、光合速率、叶绿素相对含量及氮素积累影响的显著性分析
Table 2. Summary of significance levels for the effects of shading and fertilization on growth, biomass accumulation, photosynthetic rate, chlorophyll content and nitrogen accumulation
因子 苗高 地径 总生物量 根冠比 光合速率 叶绿素相对含量 叶绿素a/b 氮质量分数 氮素积累量 遮光(A) ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 施肥(B) ＜0.001 0.205 ＜0.001 0.108 ＜0.001 ＜0.001 0.694 ＜0.001 ＜0.001 交互作用 0.027 0.825 ＜0.001 0.768 0.002 0.001 0.801 ＜0.001 ＜0.001 表 3 遮光和施肥对桢楠生长、生物量积累、光合速率、叶绿素相对含量及氮素积累影响的多重比较
Table 3. Duncan’s multiple-range test of growth, biomass accumulation, photosynthetic rate, chlorophyll content and nitrogen accumulation after a two-way analysis of variance
处理 水平 苗高 地径 总生物量 根冠比 光合速率 叶绿素相对含量 叶绿素a/b 氮质量分数 氮素积累量 遮光(A) A1 11.34 b 1.91 a 14.02 b 0.51 a 4.66 a 1.50 c 1.72 a 1.84 c 0.26 b A2 16.55 a 2.07 a 19.57 a 0.39 b 4.28 b 2.54 a 1.29 b 2.34 a 0.46 a A3 7.35 c 1.28 b 10.13 c 0.38 b 2.12 c 1.92 b 1.11 b 1.99 b 0.21 c 施肥(B) B1 10.71 c 1.65 a 12.10 b 0.46 a 3.19 c 1.77 b 1.43 a 1.98 b 0.24 c B2 12.85 a 1.86 a 18.32 a 0.41 a 4.31 a 2.32 a 1.38 a 2.10 a 0.39 a B3 11.67 b 1.74 a 13.31 b 0.40 a 3.55 b 1.87 b 1.32 a 2.09 a 0.30 b 说明：同列不同字母表示差异显著(P＜0.05) -
由表4可知：桢楠苗的根系、茎秆、叶片和总生物量在不同处理间的变异趋势基本一致。全光和1层遮光处理时，中度施肥促进生物量的积累，不施肥组生物量最低。2层遮光处理时，除茎生物量外，中度施肥有利于生物量积累，大量施肥抑制生物量的积累。方差分析结果表明：遮光、施肥和两者交互作用均对生物量积累产量了显著影响(P＜0.05)；遮光还对桢楠苗的根冠比产生了显著影响(P＜0.05)，随着遮光强度加大，桢楠苗根冠比明显下降。另外，随着施肥量的增大，桢楠苗根冠比也依次下降，但差异不显著(P＞0.05)。
表 4 遮光与施肥对桢楠生物量积累的影响
Table 4. Effects of shading and fertilization on biomass accumulation in P. zhennan
处理 根/(g·株−1) 茎/(g·株−1) 叶/(g·株−1) 总生物量/(g·株−1) 根冠比 A1B1 3.91 ± 0.71 cde 4.59 ± 0.52 de 2.73 ± 0.61 d 11.24 ± 1.53 ef 0.53 ± 0.04 a A1B2 5.87 ± 0.29 ab 5.80 ± 0.27 cd 5.60 ± 0.83 b 17.27 ± 0.84 c 0.52 ± 0.07 a A1B3 4.28 ± 0.61 cde 5.27 ± 1.18 cde 4.01 ± 0.77 c 13.56 ± 2.53 de 0.47 ± 0.04 ab A2B1 4.55 ± 0.49 cd 6.19 ± 0.94 c 4.04 ± 0.78 c 14.78 ± 0.62 d 0.45 ± 0.04 ab A2B2 6.41 ± 1.20 a 9.63 ± 0.75 a 8.27 ± 0.59 a 24.30 ± 2.15 a 0.36 ± 0.05 b A2B3 5.12 ± 0.89 bc 8.19 ± 1.02 b 6.33 ± 0.47 b 19.64 ± 0.31 b 0.35 ± 0.07 b A3B1 2.98 ± 0.57 ef 4.07 ± 0.64 e 3.22 ± 0.75 cd 10.27 ± 0.40 f 0.41 ± 0.08 ab A3B2 3.39 ± 0.64 de 3.92 ± 0.59 e 6.08 ± 0.32 b 13.40 ± 0.38 de 0.34 ± 0.08 b A3B3 1.86 ± 0.55 f 2.39 ± 0.72 f 2.47 ± 0.58 d 6.73 ± 1.03 g 0.37 ± 0.07 b 说明：根冠比为地下部分干质量与地上部分干质量的比值。同列不同字母表示差异显著(P＜0.05) -
遮光和施肥对桢楠苗净光合速率影响显著，且存在显著的交互作用(P＜0.05，表2)。随着遮光强度增大，桢楠叶净光合速率显著下降，2层遮光处理时净光合速率仅为全光下的45%(表3和图2)。随着光照减少，桢楠叶片中叶绿素a/b呈直线下降，但总叶绿素质量分数在1层遮光时达到最大，明显高于全光和2层遮光下(P＜0.05)。由此可见，桢楠叶片叶绿素质量分数与净光合速率对遮光的响应并不完全一致。总体来说，施肥有利于桢楠叶片叶绿素合成和净光合速率提高，两者均在中度施肥水平下达最大；随着施肥量增大，叶绿素a/b不断下降，但并未达到显著水平(P＞0.05)。
图 2 遮光和施肥对桢楠叶绿素质量分数(A)、净光合速率(B)的影响
Figure 2. Effects of shading and fertilization on total chlorophyll content (A) and net photosynthetic rate (B) of P. zhennan seedlings
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如图3A所示：全光和1层遮光处理，桢楠苗氮素相对含量随着施肥量的增大而不断增大；但1层遮光下桢楠苗氮相对含量明显高于全光(P＜0.05)。2层遮光处理时，大量施肥降低了桢楠苗的氮相对含量，中度施肥时达到最大值。由图3B可知：单株氮累积量与苗中氮相对含量呈现不同的变异模式，不同遮光处理时，均以中度施肥的单株生物量最大，单株氮素累积量也最大。相比之下，1层遮光强度中度施肥(A2B2)处理下单株桢楠苗积累的氮素最多(P＜0.05)。
图 3 遮光和施肥对桢楠苗氮相对含量(A)及单株氮积累量(B)的影响
Figure 3. Effects of shading and fertilization on nitrogen content (A) and nitrogen accumulation per plant (B) of P. zhennan seedlings
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桢楠是中国特有的珍贵用材和观赏树种，幼年期生长速度较慢，成材周期长，其苗期生长调控一直是珍贵用材树种研究和产业发展的重要内容。本研究发现：中等遮光和施肥有利于桢楠苗高和地径生长、生物量积累，过度遮光一定程度上抑制桢楠苗生长，过量施肥则降低桢楠生长量。罗杰[13]发现：不施肥及过量施肥均不利于桢楠苗的生长和生物量积累，相比于复合肥，油枯和鸭粪等有机肥更利于促进桢楠苗的生长。在自然界，桢楠适生于肥沃、偏酸性土壤的山谷或山洼的阴坡中下部，在土壤贫瘠、干旱的地方往往生长不良[14]。本研究也证明通过施肥提高土壤肥力可以促进桢楠苗期的生长，但要控制施肥量，过多无机肥的施用会在一定程度上降低生长量。为了实现更加精细化的生长调控和管理，今后还需要进一步养分需求规律及施肥量的研究。光照是影响植物生长发育最重要的环境因子之一，净光合速率和叶片叶绿素相对含量可以在一定程度上解释遮光和施肥的综合效益对桢楠苗生长和生物量积累的影响。本研究设置的9个处理，桢楠苗生长和叶绿素相对含量的变异规律基本一致，都呈“单峰”变异模式，说明适度遮光促进桢楠苗生长和干物质积累，而遮光过度则会抑制其生长。为适应遮光和施肥处理而发生的生长环境的变化，桢楠苗在形态结构上也发生了一系列适应性改变，如随着遮光强度的加大，桢楠苗的地上部分生物量比例和叶绿素b相对含量升高等；这一结果与之前在其他植物上开展的相关研究结果基本一致[15-18]，提示对桢楠等耐荫树种开展光照探索具有重要意义。
全年中7−9月是桢楠苗的生长高峰期，苗高和地径生长量分别占观测期生长总量的52.4%和53.4%，表现为“慢—快—慢”的变化规律，与大多数物种生长节律一致。不同作物生长发育阶段的生长速率不同，但对水分和养分需求量也表现为“两头少中间多”[19-20]。研究发现：甘蔗Saccharum arunndinaceum干物质快速积累期处于全年水热条件最好的季节，植株对养分的需求量达到整个生长季的50%以上，吸氮量占到全生育期的80%，而在成熟期氮素不再积累[21]；即在旺盛生长期结束前，随着株龄的增大，植株体内氮素不断积累，到旺盛生长期结束后，氮素积累逐渐达到最大值并不再增加[22]。说明植物体内养分的累积速率与干物质的累积速率保持着较高的同步性，并且这种同步性对处在营养生长期的植物而言更加明显[22]。本研究中，分析不同处理间的氮素累积量与生长间的关系可知：中等强度遮光和施肥处理，桢楠植株中氮素积累量最大，苗高和地径生长、生物量积累也最大。因此，本研究可以为桢楠苗期施肥量和施肥时期的确定提供更加可靠的依据。
与氮素在桢楠叶片中的积累相比，氮素相对含量在不同处理间表现出不同的变异规律，施肥和适度遮光提高了桢楠叶片的氮相对含量，但过度遮光则使叶片中的氮含量下降。这也可以解释为什么在重度遮光下桢楠叶片的叶绿素含量和光合速率比中度遮光更低。植物体保持较高水平的氮含量有利于植物在生长过程中对储存氮素的逐步利用，从而延长植物生长期，促进生长[19]。但是，在华东地区引种桢楠尤其需要注意冬季可能发生的冻害。因此，桢楠引种培育还需加强施肥技术和防冻技术的相关研究。
遮光和施肥显著影响了桢楠苗的生长和氮素积累(P＜0.05)，且两者存在显著的交互效应，生长和氮素积累在适度遮光和施肥(A2B2)下达到最大值。6−11月，桢楠表现为“慢—快—慢”的生长节律，其中7−9月为其生长高峰，苗高和地径生长量分别占观测期总生长量的52.4%和53.4%。综上所述，适度遮光和施肥可以通过提高桢楠对氮素的吸收，提高叶绿素含量和净光合速率，促进生长和生物量积累。
Effects of shading and fertilization on growth and nitrogen accumulation of Phoebe zhennan seedlings
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摘要:
目的 探索遮光和施肥对桢楠Phoebe zhennan苗期生长和氮素积累的影响，可为其苗期生长调控提供科学依据。 方法 采用二裂式裂区试验设计，设置全光(A1，遮光率0%)、1层遮光(A2，遮光率54.5%)、2层遮光(A3，遮光率85.3%)等3个遮光水平和不施肥(B1)、中度施肥(B2，施复合肥3.3 g·株−1)、大量施肥(B3，施复合肥6.7 g·株−1)等3个施肥水平，分析遮光、施肥及两者交互作用对1年生桢楠生长、生物量积累和氮素积累的影响。 结果 遮光、施肥和两者交互作用显著影响了桢楠的生长和氮素积累(P＜0.05)，其中A2B2处理下桢楠的苗高、地径和总生物量比其他处理平均高77.2%、30.3%和62.1%。同样氮素积累量在A2B2处理下达最大值，比其他处理平均高68.3%。然而，桢楠苗氮质量分数在A3B3处理下达最大，且显著高于其他处理(P＜0.05)。 结论 中等强度的遮光和施肥可提高桢楠幼苗氮素的积累，促进光合作用，提高生长和生物量积累，但过度的遮光和施肥则会在一定程度上抑制其生长。图3表4参22 Abstract:Objective This study aims to reveal the effects of shading and fertilization on growth and nitrogen accumulation of Phoebe zhennan seedlings to provide scientific basis for the growth control of this plant. Method The two-split-plot test design was used to analyze the effects of shading, fertilization, and interaction of shading and fertilization on the growth, biomass accumulation and nitrogen accumulation of the 1-year-old P. zhennan seedlings. The main plot contained three different shading levels: natural light (A1, 0% of shading rate), one-layer shading (A2, 54.5% of shading rate), and two-layer shading (A3, 85.3% of shading rate). Each main plot contained three different sub-plots with three different fertilization levels: no fertilization (B1), mild fertilization (B2, 3.3 g compound fertilizer per plant), and moderate fertilization (B3, 6.7 g compound fertilizer per plant). A total of 9 treatments were included in this study. Result The growth and nitrogen accumulation were significantly influenced by shading, fertilization, and their interaction (P＜0.05). The seedling height, basal diameter, and biomass accumulation under A2B2 treatment were 77.2%, 30.3% and 62.1% higher than those under other treatments, respectively. Furthermore, the nitrogen accumulation reached the maximum under A2B2 treatment, 68.3% higher than that of other treatments. However, the nitrogen content was highest under A3B3 treatment, and was significantly higher than that under other treatments (P＜0.05). Conclusion Moderate shading and fertilization can increase the nitrogen accumulation, and promote the photosynthesis, growth and biomass accumulation of P. zhennan, but excessive shading and fertilization can inhibit its growth to some extent. [Ch, 3 fig. 4 tab. 22 ref.] -
Key words:
- silviculture /
- shading /
- fertilization /
- biomass /
- nitrogen accumulation /
- Phoebe zhennan
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沙棘Hippophae rhamnoides又名醋柳，是胡颓子科Elaeagnaceae沙棘属Hippophae的落叶性灌木[1]。作为药食同源植物的沙棘不仅在食疗、医药、农林牧渔等领域具有较大的经济价值，在水土保持、恢复生物链及防风固沙中也具有极大的生态价值[2-5]。生长过程中沙棘根部会遭受土壤中放线菌、细菌的侵染形成根瘤。部分菌种会在根瘤中高度富集发挥固氮、促生长、抵御逆境胁迫、防止有害病菌侵染等功能[6-8]。传统的微生物研究方法主要以培养基进行分离纯培养，再进而探究其培养特征、显微结构、生理特性等[9]。而自然界中90%以上的微生物为不可培养微生物，且现有培养基与培养技术不适应未知菌群的生长，或部分菌群生长缓慢、丰度较小等情况都会对菌群的多样性评估产生影响[10]。以二代高通量测序为基础的16S rDNA技术通过对编码原核核糖体小亚基rRNA的DNA序列进行测序，不仅克服了传统方法难以获得不可培养菌株的弊端，还能对样品中的物种相对丰度进行排序，并分析各群组样品中发挥重要作用的优势物种，解析样品中微生物之间的相互作用。该技术对研究沙棘根瘤内生菌微生物多样性与环境关系以及微生物资源的开发利用有重要的理论和现实意义[11-16]。
本研究通过16S rRNA测序技术对沙棘根瘤内生菌进行物种注释、分类学分析、α多样性分析、β多样性分析、组间差异显著性分析，比较高通量测序和纯培养方法的差异与优劣，为发掘具有应用价值的根瘤内生菌资源提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 材料采集
采样地为内蒙古自治区巴彦淖尔市磴口县中国林业科学研究院沙漠林业实验中心试验林场(40°29′34″N，106°74′06″E)。该研究区海拔为1 054 m，年平均气温为7.4 ℃。2020年7月，选取人为干扰因素较少的沙漠边缘地带采集沙棘根瘤样品。在每个样地10 m×10 m的区域内用网格法定9个点，运用梅花形采样法在边角及中心共5个点分别采集根瘤样品并进行混合，共设计6组重复样，分别命名为M1、M2、M3、M4、M5、M6。
1.2 沙棘根瘤内生菌的分离培养
1.2.1 沙棘根瘤内生菌的分离
依据文献[17-18]的方法进行修改，使其更加适宜沙棘根瘤内生菌的分离。详细步骤如下：选取新鲜饱满的根瘤，冲洗掉土粒泥沙，将根瘤团用解剖刀分割成带有单柄的瘤瓣，用纱布包裹，先用体积分数为95%的酒精溶液浸泡30 s，再用体积分数为10%的次氯酸钠溶液表面灭菌5 min，取出后用无菌水冲洗数次。在灭菌滤纸上，用无菌解剖刀先切取根瘤头部，再将其均分成2~3份薄片，置于固体培养基中28 ℃恒温暗处静置培养。根据相关研究，本研究选取BAP[19]、S[20]、JA[19]、高氏一号培养基[19]进行分离培养。
1.2.2 沙棘根瘤内生菌的鉴定
提取纯培养的沙棘根瘤内生菌DNA后，对16S rDNA全长进行PCR扩增。序列引物采用YU等[21]设计的细菌通用引物(引物序列27F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，1492R：5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3′)，PCR总反应体系为50 μL，包括10×缓冲液(KOD buffer) 5 μL、2 mmol·L−1三磷酸脱氧核糖核苷酸混合液(dNTPs) 5 μL、基因组DNA (genomic DNA) 1 μL、上游引物(forward primer) (10 μm) 1 μL、下游引物(reverse primer) (10 μm) 1 μL、DNA聚合酶(KOD DNA polymerase) 1 μL、超纯水(ddH2O) 36 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性 3 min，94 ℃变性 30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环，最后72 ℃延伸10 min。用质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳，确定有特异扩增后，进行PCR产物回收和测序注释，并参考文献[22-25]进行比对校验。
1.3 沙棘根瘤内生菌的高通量测序分析
1.3.1 建库测序
提取沙棘根瘤总DNA后，根据16S rDNA保守区设计引物(引物序列335F：5′-CADACTCCTACGGGAGGC-3′，769R：5′-ATCCTGTTTGMTMCCCVCRC-3′)，在引物末端加上测序接头，便于建库时添加能区分样本的碱基序列的条码/索引(barcode/index)。再进行PCR扩增并对其产物进行紫外分光光度计定量及混样、过柱纯化和均一化形成测序文库，建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用Illumina HiSeq 2500进行测序[26]。高通量测序得到的原始图像数据文件，经碱基识别分析转化为原始测序序列，结果以FASTQ (简称为fq)文件格式存储[27]。
1.3.2 测序数据处理
首先使用 Trimmomatic v.0.33软件[28]，对测序得到的原始测序序列进行过滤；其次使用cutadapt 1.9.1软件进行引物序列的识别与去除，得到不包含引物序列的高质量测序序列；然后使用FLASH v1.2.7软件[29]，按照最小重叠(overlap)长度为10 bp、重叠区允许的最大错配比率为0.2的要求，对每个样品高质量的一小段短的基因测序片段(reads)进行拼接，得到的拼接序列即原始序列质控后的高质量测序序列(clean reads)；最后使用UCHIME v4.2软件[30]，鉴定并去除嵌合体序列，得到最终有效数据。使用Usearch软件对reads在97.0%的相似度水平下进行聚类，获得分类操作单元(OTU)[31]，以测序所有序列数的0.005%作为阈值过滤OTU[32]。以SILVA (
http://www.arb-silva.de/ )为参考数据库使用朴素贝叶斯分类器对特征序列进行分类学注释，可得到每个特征对应的物种分类信息，进而在各水平(门、纲、目、科、属、种)统计样品群落组成，利用QIIME软件生成不同分类水平上的物种丰度表，再利用R语言工具绘制样品分类学水平下的群落结构图[33]。使用QIIME软件对样品α多样性进行评估和t检验(显著性水平为0.01)。利用Mothur v1.30软件和R语言工具包绘制稀释曲线。基于独立OTU，采用加权分析方法和Bray-Curtis算法，使用QIIME软件进行非加权组平均法(UPGMA)分析，比较各组样品间的物种差异。2. 结果与分析
2.1 分类操作单元(OTU)聚类分析
使用Usearch软件对clean reads在97.0%的相似度水平下进行聚类，共计获得651个OTU。各样品OTU个数分布较为均匀，样品M1~M6分别为551、583、579、518、593、589个。如图1所示：6组样品中共有的OTU数为417个。M3、M5、M6中分别有4、2、9个特有的OTU，为样品特有OTU，非单个样品特有或所有样品间共有的OTU在图1未做展示。从整体来看，不同地点的各样品间的OTU差异性远小于共性，说明采样方法设计合理。
图 1 沙棘(M1~M6)根瘤样品分类操作单元(OTU)花瓣图Figure 1 Petal image of operational taxonomic unit (OTU) of H. rhamnoides root nodule sample (M1－M6)2.2 测序深度分析与α多样性指数分析
对6组样品测序共获得 810 039对reads，双端reads质控、拼接后共产生617 188条clean reads。其中质量≥20的碱基占总碱基数的比例(Q20)为98.7%，质量≥30的碱基占总碱基数的比例(Q30)为95.4%，表明测序质量较好。从图2可见：各样品稀释性曲线趋向平缓，表明在持续抽样下新物种出现的速率逐渐趋于平缓，此环境中物种数量不会随测序数量的增加而显著增多[34]，说明取样合理，能较好体现6组样品中根瘤内生菌的多样性，可以进行数据分析。M5的Shannon和Simpson指数最大(表1)，说明物种多样性最高。同理，M4的物种多样性最低。物种丰度方面M5与M6差别不大，均有较高水平。M4根瘤样品的物种丰度最低。样点的Shannon指数平均为4.24，Simpson指数平均为0.70，Ace指数平均为585.79，Chao1指数平均为595.47，样本文库平均覆盖率为99.95%。说明采样地的沙棘根瘤内生菌的物种丰富且多样性较大，各物种分配相对均匀，其微生物物种信息得到了充分体现。
表 1 各组样品的α多样性指数Table 1 Alpha diversity index for each group of samples样品 Shannon
指数Simpson
指数Ace
指数Chao1
指数覆盖
率/%M1 2.53 0.47 568.45 598.57 99.95 M2 4.73 0.79 595.09 600.60 99.95 M3 4.28 0.75 600.58 607.45 99.95 M4 2.52 0.44 542.32 543.52 99.94 M5 6.58 0.95 605.66 610.71 99.94 M6 4.82 0.77 602.63 611.97 99.94 平均 4.24 0.70 585.79 595.47 99.95 2.3 传统纯培养与高通量测序分析沙棘根瘤内生菌的群落结构及其差异
通过传统分离方法从BAP、JA、S、高氏一号培养基中得到纯培养菌株96株。所有菌株均可传代培养，但菌株之间培养周期差异较大，培养周期在1~30 d呈离散型分布。对各菌株进行分子鉴定，共有4门8纲8目13科19属。在门的分类水平分别为变形菌门Proteobacteria、放线菌门Actinobacteria、厚壁菌门Firmicutes和柔膜菌门Tenericutes。在属的分类水平上，96株菌分属于支原体属Mycoptasma 1株、慢生根瘤菌属Bradyrhizobim 6株、土壤杆菌属Agrobacterium 7株、肠杆菌属Enterobacter 6株、小坂菌属Kosakonia 8株、柠檬酸杆菌属Citrobacter 1株、约克氏菌属Yokenella 1株、欧文氏菌属Erwinia 1株、克罗诺杆菌属Cronobacter 2株、泛菌属Pantoea 1株、莫拉菌属Moraxella 1株、贪噬菌属Variovorax 1株、草螺菌属Herbaspirillum 1株、假单胞菌属Pseudomonas 5株、链霉菌属Streptomyces 14株、小单孢菌属Micromonospora 1株、短杆菌属Brevibacterium 6株、葡萄球菌属Straphylococcus 1株和芽孢杆菌属Bacillus 32株。其中，优势门为变形菌门和厚壁菌门，优势属为芽孢杆菌属和链霉菌属。
高通量测序分析发现：6组样品共有14门34纲89目148科314属。将相对丰度大于0.1%的门与相对丰度前10的属进行汇总(图3、表2、表3)发现：在门的分类水平上，6组样品中相对丰度较高的主要为放线菌门和变形菌门，两者相对丰度之和为87.5%~97.1%。其次为拟杆菌门Bacteroidetes、杆菌门Patescibacteria、厚壁菌门、酸杆菌门Acidobacteria。在属的分类水平上，弗兰克氏菌属Frankia占绝对优势，相对丰度为20.12%~74.81%，平均相对丰度为51.49%。其次为根瘤菌属Rhizobium、类固醇杆菌属Steroidobacter、糖单孢菌属Saccharimonadales、肠杆菌属、泛菌属、欧文氏菌属、假黄色单胞菌属Pseudoxanthomonas、鞘脂单胞菌属Sphingomonas、假单胞菌属、固氮弓菌属Azoarcus、伯克氏菌属Burkholderia、芽单胞菌属Blastomonas、聚集杆菌属Congregibacter、拉恩氏菌属Rahnella、鞘氨醇菌属Chitinophaga、独岛杆菌属Dokdonella、普雷沃氏菌属Prevotella、链霉菌属、Microtrichales属。
表 2 沙棘微生物区系门水平的相对分布Table 2 Relative abundance of microbiota taxa at the level of phylum分类 6组样品在门水平的相对丰度/% M1 M2 M3 M4 M5 M6 放线菌门 73.55 47.56 51.24 76.09 27.73 57.68 变形菌门 22.38 41.91 41.63 21.01 60.35 29.82 拟杆菌门 0.89 1.42 1.30 0.40 2.18 4.42 杆菌门 0.31 5.66 3.89 0.73 1.42 1.72 厚壁菌门 2.18 2.74 1.30 1.21 2.18 4.42 酸杆菌门 0.15 0.26 0.42 0.18 1.16 0.53 其他 0.54 0.45 0.22 0.38 0.75 0.60 表 3 沙棘微生物区系属水平的相对分布Table 3 Relative abundance of microbiota taxa at the level of genus分类 6组样品在属水平的相对丰度/% M1 M2 M3 M4 M5 M6 弗兰克氏菌属 72.62 44.45 49.50 74.81 20.12 47.41 根瘤菌属 1.17 1.97 2.89 2.04 3.13 4.13 类固醇杆菌属 0.73 0.83 1.05 2.20 7.19 2.87 糖单孢菌属 0.28 5.61 3.85 0.71 1.41 1.68 肠杆菌属 6.93 2.19 1.05 0.08 0.22 0.40 泛菌属 0.63 5.19 4.69 0.01 0.05 0.11 欧文氏菌属 0.60 4.66 3.77 0.10 0.18 0.23 假黄色单胞菌属 0.85 1.98 1.67 0.75 3.56 0.68 鞘脂单胞菌属 0.39 1.06 2.10 1.55 2.10 1.64 假单胞菌属 0.51 1.27 5.60 0.03 0.21 0.09 其他 15.29 30.79 23.83 17.72 61.83 40.76 
图 3 6组根瘤样品的非加权组平均法(UPGMA)聚类树与物种分布柱状图Figure 3 UPGMA clustering tree and the species distribution histogram of the six groups of nodule samples are combined drawing在门、纲、目、科、属的各分类单元中，高通量测序的检测灵敏度(高通量测序/纯培养)依次是纯培养方法的3.50、4.25、11.20、11.38和16.53倍。在门水平上，纯培养菌株中占比较高的厚壁菌门在高通量测序中占比并不高。在属水平上，纯培养菌株中占比较高的芽孢杆菌属和链霉菌属皆在高通量测序中占比很低。该对比结果差异性较大，说明高通量测序在微生物多样性分析中占据优势地位，要优于纯培养方法。同时也说明，沙棘根瘤内共生细菌群落结构更为复杂，群落更为稳定。
3. 结论与讨论
3.1 结论
在运用传统方法分离纯培养微生物时，共分离纯培养菌株96株，分属于4门8纲8目13科19属，未获得弗兰克氏菌属的菌株，可能是培养基中弗兰克氏菌属的菌株生长缓慢，易被其他菌群取代，因此仍需探索新的培养基与培养方法以遏制根瘤中其他菌株的繁殖。在微生物多样性分析中，由于环境中的微生物复杂多样，各环境之间组成差异较大，通常采用非加权方法进行分析。该方法简单易操作，主要考虑物种的有无，但未考虑物种的丰度，所以采用非加权的方法难以区别各样品间的差异。
高通量测序分析共检测到14门34纲89目148科314属。在门、纲、目、科、属的各分类单元中，高通量测序的检测灵敏度(高通量测序/纯培养)依次是纯培养方法的3.50、4.25、11.20、11.38和16.53倍。与纯培养获得的菌株相比，高通量测序分析结果更加完整地揭示了沙棘根瘤内生菌的微生物多样性。高通量测序表明：在门的分类水平上，样品中相对丰度较高的主要为放线菌门和变形菌门，两者相对丰度之和为87.5%~97.1%。在属的分类水平上，弗兰克氏菌属占绝对优势，相对丰度为20.12%~74.81%，平均相对丰度为51.49%。
3.2 讨论
张爱梅等[35]和刘志强等[36]分别对甘肃榆中、辽宁通辽、内蒙古赤峰等地沙棘根瘤内生菌微生物多样性做过类似研究，其高通量测序所得的微生物多样性高于本研究结果，说明沙棘根瘤内生菌微生物多样性受地理位置、土壤成分、气候条件、宿主种类及生长环境等多种因素的影响。本研究的沙棘取样于内蒙古乌兰察布沙漠边缘地带，采样地荒漠化土壤与干旱少雨气候对内生菌多样性有特别影响。
属于非豆科Leguminosae植物的沙棘根瘤共生固氮体系是以弗兰克氏菌属为主导的[37]微生物—微生物—植物互作体系。高通量测序分析显示：弗兰克氏菌属所占比例较高，然而本次传统方法分离却未得到纯培养菌株，这可能是由于培养基中缺乏某种信号物质或与其他菌属竞争存在劣势导致的，建议添加制霉菌素、萘啶酮酸和放线菌酮抑制其他菌群的繁殖[18]。非豆科植物结瘤固氮过程，单一属的菌株难以完成此任务。有研究[38]表明：纯培养分离的贪噬菌属是复杂微生物组中维持根生长的核心菌属，并且具有产生和降解生长素的能力，是细菌—细菌—植物通讯网络的关键角色。小单孢菌是植物益生菌，在促进植物生长的同时还可以分泌细胞壁降解酶促进细胞壁的降解，进而便于弗兰克氏菌的侵染[39-40]，但是小单孢菌的快速繁殖也对弗兰克氏菌的生长起到抑制作用。沙棘作为胡颓子科植物，根部结瘤侵染方式为细胞间侵入。研究[41]表明：草螺旋菌属Spirillum、慢生根瘤菌属、肠杆菌属的相关细菌与弗兰克氏菌存在负相关性(即抑制关系)，以上3个菌属均在豆科、禾本科Poaceae植物中发挥固氮相关的重要作用，但在胡颓子科中此类细菌与弗兰克氏菌属相互作用的机制尚未明确。
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图 1 遮光和施肥对桢楠苗高(A)、地径(B)生长的影响
月生长量表示相邻2个月份生长的差值，总生长量表示6月与11月生长的差值
Figure 1 Effects of shading and fertilization on tree height (A) and basal diameter (B) growth of P. zhennan seedlings
图 2 遮光和施肥对桢楠叶绿素质量分数(A)、净光合速率(B)的影响
不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)
Figure 2 Effects of shading and fertilization on total chlorophyll content (A) and net photosynthetic rate (B) of P. zhennan seedlings
图 3 遮光和施肥对桢楠苗氮相对含量(A)及单株氮积累量(B)的影响
不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)
Figure 3 Effects of shading and fertilization on nitrogen content (A) and nitrogen accumulation per plant (B) of P. zhennan seedlings
表 1 二裂式裂区试验设计
Table 1. Split-plot randomized design of the experiment
处理 透光率/% 施肥量/(g·株−1) 处理 透光率/% 施肥量/(g·株−1) A1B1 100 0 A2B3 45.5 6.7 A1B2 100 3.3 A3B1 14.7 0 A1B3 100 6.7 A3B2 14.7 3.3 A2B1 45.5 0 A3B3 14.7 6.7 A2B2 45.5 3.3 
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表 2 遮光和施肥对桢楠生长、生物量积累、光合速率、叶绿素相对含量及氮素积累影响的显著性分析
Table 2. Summary of significance levels for the effects of shading and fertilization on growth, biomass accumulation, photosynthetic rate, chlorophyll content and nitrogen accumulation
因子 苗高 地径 总生物量 根冠比 光合速率 叶绿素相对含量 叶绿素a/b 氮质量分数 氮素积累量 遮光(A) ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 施肥(B) ＜0.001 0.205 ＜0.001 0.108 ＜0.001 ＜0.001 0.694 ＜0.001 ＜0.001 交互作用 0.027 0.825 ＜0.001 0.768 0.002 0.001 0.801 ＜0.001 ＜0.001
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表 3 遮光和施肥对桢楠生长、生物量积累、光合速率、叶绿素相对含量及氮素积累影响的多重比较
Table 3. Duncan’s multiple-range test of growth, biomass accumulation, photosynthetic rate, chlorophyll content and nitrogen accumulation after a two-way analysis of variance
处理 水平 苗高 地径 总生物量 根冠比 光合速率 叶绿素相对含量 叶绿素a/b 氮质量分数 氮素积累量 遮光(A) A1 11.34 b 1.91 a 14.02 b 0.51 a 4.66 a 1.50 c 1.72 a 1.84 c 0.26 b A2 16.55 a 2.07 a 19.57 a 0.39 b 4.28 b 2.54 a 1.29 b 2.34 a 0.46 a A3 7.35 c 1.28 b 10.13 c 0.38 b 2.12 c 1.92 b 1.11 b 1.99 b 0.21 c 施肥(B) B1 10.71 c 1.65 a 12.10 b 0.46 a 3.19 c 1.77 b 1.43 a 1.98 b 0.24 c B2 12.85 a 1.86 a 18.32 a 0.41 a 4.31 a 2.32 a 1.38 a 2.10 a 0.39 a B3 11.67 b 1.74 a 13.31 b 0.40 a 3.55 b 1.87 b 1.32 a 2.09 a 0.30 b 说明：同列不同字母表示差异显著(P＜0.05)
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表 4 遮光与施肥对桢楠生物量积累的影响
Table 4. Effects of shading and fertilization on biomass accumulation in P. zhennan
处理 根/(g·株−1) 茎/(g·株−1) 叶/(g·株−1) 总生物量/(g·株−1) 根冠比 A1B1 3.91 ± 0.71 cde 4.59 ± 0.52 de 2.73 ± 0.61 d 11.24 ± 1.53 ef 0.53 ± 0.04 a A1B2 5.87 ± 0.29 ab 5.80 ± 0.27 cd 5.60 ± 0.83 b 17.27 ± 0.84 c 0.52 ± 0.07 a A1B3 4.28 ± 0.61 cde 5.27 ± 1.18 cde 4.01 ± 0.77 c 13.56 ± 2.53 de 0.47 ± 0.04 ab A2B1 4.55 ± 0.49 cd 6.19 ± 0.94 c 4.04 ± 0.78 c 14.78 ± 0.62 d 0.45 ± 0.04 ab A2B2 6.41 ± 1.20 a 9.63 ± 0.75 a 8.27 ± 0.59 a 24.30 ± 2.15 a 0.36 ± 0.05 b A2B3 5.12 ± 0.89 bc 8.19 ± 1.02 b 6.33 ± 0.47 b 19.64 ± 0.31 b 0.35 ± 0.07 b A3B1 2.98 ± 0.57 ef 4.07 ± 0.64 e 3.22 ± 0.75 cd 10.27 ± 0.40 f 0.41 ± 0.08 ab A3B2 3.39 ± 0.64 de 3.92 ± 0.59 e 6.08 ± 0.32 b 13.40 ± 0.38 de 0.34 ± 0.08 b A3B3 1.86 ± 0.55 f 2.39 ± 0.72 f 2.47 ± 0.58 d 6.73 ± 1.03 g 0.37 ± 0.07 b 说明：根冠比为地下部分干质量与地上部分干质量的比值。同列不同字母表示差异显著(P＜0.05)
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