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种子活力是指种子具有的发芽潜力、生长潜力和生产潜力，是检验种子质量优劣的最可靠指标[1-2]。高活力的种子抗逆性强，具有实现高产量和优品质的潜在能力[3]。测定种子活力是农林业生产中不可缺少的步骤。目前，种子活力的测定方法主要有直接法和间接法2类。直接法指在实验室模拟一定条件直接测定萌发率，如低温发芽测定[4]和冷冻测定[5]；间接法通过测定某些与种子活力相关的生理生化指标间接评价种子活力的方法，比较常用的方法如四氮唑法(TTC)测定、电导率测定[6]、加速老化测定[7]等。不同物种的最适种子活力测定方法也不相同。POONGUZHALI等[8]发现最能正确反映黑吉豆Vigna mungo种子活力的方法是加速老化法；电导率法评价紫花苜蓿Medicago sativa种子活力最为敏感[9]；而通过记录平均胚根突出时间是测定燕麦Avena sativa种子活力高低的重要指标[10]。一般来讲，直接法测定种子活力最准确，但较为耗费时间，难以大规模进行。因此多采用电导率法和TTC法等间接法测定种子活力。TTC法测定种子活力具有方便快速、结果重复性好等优点，主要用于农作物种子活力的测定[11]。电导率法根据细胞膜的完整性来评价种子活力大小，但精度受到标准参考物、温度、水质等因素的影响较大[12]。紫外分光光度计法(UVS)由电导率法改进而来，通过测定种子浸出液的紫外吸光值，来判定浸出液中氨基酸等有机物的相对含量间接推断种子活力。鲁黎明等[13]利用UVS法测定烟草Nicotiana tabacum种子活力时发现：UVS法测定种子活力简便快捷，准确度较高。杉木Cunninghamia lanceolata是中国南方地区的优良速生用材树种，生长快、材质较好，在中国商品材生产中占有重要地位。杉木种子活力的测定与评价是杉木良种培育、种苗生产和人工林营建的重要环节，但由于杉木种子细小、种皮坚硬，胚小易碎等，一般的种子测量方法并不能快速有效检测。本研究以标准发芽试验为参照，比较了TTC法和UVS法测定杉木种子活力的准确性和便捷性，旨在建立一种快速方便且较为准确的种子活力检测方法。
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2017年10月底至11月初，分别收集普通杉木(普杉)ZLP-1、速生型杉木(速杉)ZLS-9、龙15×闽33双系杂交(杂杉)种子，其中普杉种子和速杉种子采自浙江农林大学林木种质资源圃，杂杉种子由浙江省开化县林场提供。另于2018年11月初在浙江农林大学林木种质资源圃中采集优良无性系速1、新6和红47的半同胞种子用于测定方法验证。
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采集健康成熟球果，于阴凉通风处晾干；将种子从球果抖出，挑选健康饱满种子装入玻璃广口瓶，密封后置于4 ℃冰箱保存，约6个月后用于种子活力测定。
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取3个品种杉木种子各150粒，体积分数为10%的安替福明灭菌15 min，无菌水清洗3次，无菌水中25 ℃浸泡24 h。取无菌培养皿，铺上无菌滤纸，并用无菌水湿润；将浸泡后的种子铺于滤纸上，置于25 ℃光照培养箱中萌发。各样品重复3次，每5 d 观察统计发芽情况，15 d后统计萌发种子数，计算平均萌发率(%)。
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取3个品种杉木种子各150粒，按1.2.2灭菌浸泡后剥去种皮，切下种胚，加质量分数为0.1%的TTC溶液10 mL，置于35 ℃恒温箱中染色120 min。吸去多余TTC液，清水冲洗1~2次，观察并记录被染色的种胚数。胚染成红色的为具有活力的种子，计算染色百分率(%)。重复3次。
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取3个品种杉木种子各150粒，蒸馏水清洗2次，超纯水清洗1次，滤纸吸干后放入50 mL离心管中，用20 mL超纯水在25 ℃下浸泡，于4、8、12、24 h后测定种子浸出液吸光度D(260)。重复3次。以D(260)为x，种子真实萌发率为y，利用Excel软件进行线性回归分析，建立不同时间浸出液与萌发率间的回归方程，通过拟合系数(R2)选定用于种子活力预测的回归方程。
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采用Excel及SPSS进行统计分析。
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由表1发现：相同萌发环境下，3个品种杉木种子萌发率差异显著(P＜0.05)。杂杉种子萌发初期萌发率较小，普杉和速杉种子在萌发初期(5 d)就表现出很高的发芽势，均在萌发15 d时趋于稳定。统计萌发15 d 时的萌发率发现：速杉种子萌发率最高(44.88%)，普杉较低(41.11%)，杂杉最低，仅为37.33%；总体上萌发率变异系数较小，均略大于5%。
表 1 不同杉木种子真实萌发率
Table 1. Real germination rate of different C. lanceolata seeds
种子类型 萌发率/% 变异系数/% 普杉 41.11±2.34 b 5.69 速杉 44.88±2.25 a 5.01 杂杉 37.33±2.33 c 6.24 说明：同列不同字母表示差异显著(P＜0.05) -
如表2可知：不同杉木种子的胚染色率存在差异，其中速杉最高(49.78%)，杂杉略低(42.22%)，普杉最低(38.89%)；变异系数波动较大。
表 2 不同杉木种子胚TTC染色率
Table 2. TTC staining rate of different C. lanceolata seed embryos
种子类型 染色率/% 变异系数/% 普杉 38.89±8.88 c 22.83 速杉 49.78±3.04 a 6.10 杂杉 42.22±3.35 b 7.93 说明：同列不同字母表示差异显著(P＜0.05) -
由图1可知：随着浸泡时间延长，同一种子浸出液吸光度[D(260)]呈现逐渐增大的趋势；相同浸泡时长下，不同种子浸出液吸光度[D(260)]不同，3种种子间存在显著差异。速杉种子浸出液紫外吸光值最小，说明萌发率最高，杂杉紫外吸光值最大，说明种子萌发率最低，与实际萌发率一致。对不同浸泡时间下吸光度[D(260)]与真实萌发率做线性回归分析，得到回归方程如下：① 4 h浸泡，y=−0.566 6x+0.449 3 (R2=0.953)；② 8 h浸泡，y=−0.309 7x+0.440 2 (R2=0.899)；③ 12 h浸泡，y=−0.506 7x+0.458 8 (R2=0.902)；④ 24 h浸泡，y=−0.145 7x+0.444 6 (R2=0.689)。由回归方程可看出4 h种子浸出液的紫外吸光度与萌发率之间拟合系数最高(0.953)，说明在本研究条件下，杉木种子浸泡4 h后的浸出液紫外吸光值能够较好地反映杉木种子的活力。利用该回归方程计算3个品种种子的萌发率(表3)，发现速杉种子萌发率为44.94%，普杉为41.00%，杂杉为37.39%；且其变异系数均约为5%。
图 1 不同浸泡时间下杉木种子浸出液吸光度
Figure 1. Absorbance of leaching solution of different C. lanceolata seeds at different soaking times
表 3 浸泡4 h后杉木种子吸光度[D(260)]所对应的萌发率波动
Table 3. Fluctuation range of germination rate corresponding to obsorbance [D(260)] of different C. lanceolata seeds soaked for 4 h
种子类型 萌发率/% 变异系数/% 普杉 41.00±1.96 b 4.78 速杉 44.94±1.95 a 4.33 杂杉 37.39±2.10 c 5.61 说明：同列不同字母表示差异显著(P＜0.05) -
由表4可知：标准发芽法步骤简单，但耗时最长；TTC染色法需将种胚剥出染色，操作最为繁琐，且较为耗时；UVS法操作简单，耗时也最短。比较3种方法测定的萌发率(图2)，TTC法测得的种子萌发率与实际萌发率间存在显著差异(P＜0.05)，UVS法测定的种子活力与实际萌发率没有显著差异(P＞0.05)。
图 2 3种方法测得萌发率比较
Figure 2. Comparison of germination rates measured by three methods
表 4 3种方法测定种子活力步骤与耗时比较
Table 4. Comparison of three methods for determining seed vigor and time-consuming
方法 步骤(耗时) 总耗时/h 标准发芽法 安替福明灭菌(15 min) 无菌水浸泡(24 h) 测定自然萌发率(15 d) 约384 TTC法 安替福明灭菌(15 min) 蒸馏水浸泡(24 h) 剥种胚恒温染色(1~3 h) 结果统计(1 h) 26~28 UVS法 种子清洗(1 h) 去离子水浸泡(4 h) OD值测定(0.5 h) 5.5 -
为了进一步验证UVS法的稳定性，随机选取速1、新6和红47共3个杉木无性系，于2018年11月采集其半同胞种子进行UVS法种子活力测定，同时也采用标准发芽法和TTC法测定进行比较。活力测定方法按方法1.2.2，1.2.3和1.2.4进行。结果如表5所示：UVS法测定的结果与标准发芽法较为一致，没有显著差异，而TTC法测得的萌发率与其他2种方法差异显著，说明UVS法所测得的萌发率可靠程度较高，也比较稳定，是杉木种子活力测定的较好方法。
表 5 3种测定方法的稳定性比较
Table 5. Comparison of the stability of the three methods
方法 萌发率/% 速1 新6 红47 TTC法 57.33±10.28 a 55.33±7.83 a 56.67±9.55 a 标准发芽法 49.33±3.47 b 46.67±3.67 b 50.00±3.26 b UVS法 44.81±5.71 b 45.16±3.06 b 45.27±5.51 b 说明：同列不同字母表示差异显著(P＜0.05) -
种子活力可以通过标准发芽法、加速老化法、TTC染色法和电导率法等多种方法进行评价，但由于受到物种、基因型和环境等因素的影响，目前并没有通用的种子活力测定方法[14-15]。因此，针对特定植物进行种子活力测定方法的比较，对于建立适用于特定植物种子活力测定具有重要意义。
作为一种公认的种子活力测定标准方法[16]，TTC法可以根据种子的种属、状态等调整染色时间以达到最佳活力检测效果[17-19]。本研究发现：由于杉木种子种皮较厚，用TTC法测定活力时需从种子中将胚剥离后再进行染色；此过程不仅费时费力，剥胚时还会造成损伤。同时由于不同种子胚的染色效果存在差异，易造成假阳性，导致活力测定结果与实际萌发率偏差较大。UVS法测定时间短、通量高、所需样本量少，可以有效提高检测效率，是近年来使用较多的测定种子活力的方法。边子星等[20]在利用该方法测定濒危华石斛 Dendrobium sinense种子活力时发现：浸泡4 h的种子浸出液吸光值与发芽率相关性较高，通过拟合回归方程可快速预测华石斛的种子活力。岳媛[21]比较了5种杜鹃Rhododendron种子活力测定方法发现，UVS法(种子浸泡8 h)能较准确地反映出田间出苗的情况，变异系数相对较小，试验结果较稳定，可以作为杜鹃花属植物种子活力测定的方法。本研究首次采用UVS法对杉木种子活力进行了测定，结果发现种子浸泡4 h后，种子浸出液吸光度[D(260)]与种子活力间有较高相关性(R2=0.953)，通过预测回归方程可以较好地拟合杉木种子活力。在实际操作中，受试种子往往不同批次、不同年份，因而萌发率会有较大波动，因此应分别计算不同批次种子浸出液吸光值与真实萌发率的相关性，从而避免较大的误差。总体上来讲，这种方法简便快速，准确性高，有利于提高测定效率。
综合上述实验结果，本研究认为TTC法在测定杉木种子活力时，检测准确率与速度上均较差；UVS法可快速检测杉木种子活力，且操作简便，尤其对于检测大量不同杉木种子的活力具有更高效率。
A comparative study of three determination methods for seed vigor of Cunninghamia lanceolata
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摘要:
目的 建立一种快速简便的杉木Cunninghamia laneolata种子活力测定方法。 方法 以3个不同品种杉木种子为材料，以标准发芽法为参照，比较四氮唑法(TTC)和紫外分光光度计法(UVS)测定种子活力时的准确性和便捷性。 结果 标准发芽法测定种子活力最为准确，但耗费时间长，难以开展大批量测定；TTC法测定杉木种子活力准确度不稳定，且操作繁琐；UVS法的测定值与真实萌发率比较接近，有较高可信度，且操作简便。 结论 UVS法可作为快速测定杉木种子活力的优选方法。图2表5参21 Abstract:Objective This study is aimed to establish a quick and simple method for the determination of the seed vigor of Cunninghamia lanceolata. Method With the seeds selected from three different cultivars of C. lanceolata, a comparison was conducted of the accuracy and efficiency of triphenyltetrazolium chloride (TTC) and ultraviolet spectrophotometer (UVS) methods with the standard germination test for reference. Result The standard germination test was the most accurate but most time-consuming method, which could not be performed on a large scale. TTC method was unstable and inaccurate with cumbersome operation for C. lanceolata seeds. UVS method displayed an estimated value quite close to the real germination rate and enjoyed advantages such as high reliability and simple operation. Conclusion UVS method could be taken as an efficient method for the rapid determination of seed vigor in C. lanceolata. [Ch, 2 fig. 5 tab. 21 ref.] -
十字花科Brassicaceae植物主产北温带，约375属3 200种。在中国主要集中于西南、西北、东北高山以及丘陵地区[1]，其中萝卜属Raphanus与芸薹属Brassica植物是中国最重要的蔬菜与油料作物，该科部分种类还可作为药用、观赏用、染料用或食用[2]。植物表皮蜡质是覆盖在陆生植物地上部器官表面的脂质成分，也存在于木栓的基质、愈伤组织、花粉粒以及种皮中[3]，其疏水结构在植物表面起极其重要的防卫功能，在植物与周围环境的相互作用中发挥着重要作用[4]。本研究从十字花科植物蜡质类型、结构、成分、含量、功能、遗传特性、合成与转运途径、分子机制等方面进行综述，为十字花科植物的蜡质代谢研究提供参考。
1. 十字花科植物蜡质的类型及其功能
1.1 十字花科植物蜡质的形态和成分
1.1.1 蜡质的形态结构
十字花科植物的蜡质呈片状、柱状和网状等26种形态类型，不同种类植物的蜡质形态不同[5]。徐秀萍等[6]采用扫描电镜(SEM)观察拟南芥Arabidopsis thaliana表皮蜡质，发现主要呈杆状，少量呈片状、管状、碟状和伞状。李红莲[7]发现：红菜薹Brassica campestris表皮蜡质为片状和网状构成的不规则三维结构。李帅等[8]发现：甘蓝型油菜‘中双11’Brassica napus‘Zhongshuang 11’叶表皮蜡质结构主要为杆状和颗粒状(小片状)。牟香丽等[9]发现：不同生长时期甘蓝Brassica oleracea var. capitata表皮蜡质呈现不同结构，苗期大多为颗粒状、片状和针状，结球期则较多为圆柱状和片状，成熟期以片状和针状为主。张曦[10]发现白菜Brassica pekinensis成熟叶片蜡质大多呈现出棒状且前端有圆形突起。
1.1.2 蜡质的化学成分
十字花科植物蜡质主要为超长链脂肪酸及其衍生物，包括烷烃、脂肪酸、醇、醛、酮的同系物，偶尔会出现环状化合物，如甾醇或三萜类化合物等[11]。蜡质通常使用三氯甲烷、正己烷等有机溶剂提取，采用气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术鉴定成分[12]。植物表皮蜡质各成分占比不同。如白菜[10]成熟叶片蜡质的主要成分中酮类占1.02%，醇类占8.33%，烷烃占55.09%，酯类占26.34%。不同种类植物的表皮蜡质成分含量也存在差异[13]。如甘蓝型油菜‘中双11’叶[8]表皮蜡质成分中烷烃为8.24 μg·cm−2，次级醇为1.72 μg·cm−2，酮为1.62 μg·cm−2，初级醇为0.57 μg·cm−2，脂肪酸为0.10 μg·cm−2，醛为0.79 μg·cm−2，未知成分为9.33 μg·cm−2，总量为22.37 μg·cm−2；拟南芥[14]茎秆的表皮蜡质中初级醇为0.58 μg·cm−2，脂肪酸为0.10 μg·cm−2，醛为1.90 μg·cm−2，烷烃为13.13 μg·cm−2，次级醇为3.83 μg·cm−2，酮为5.95 μg·cm−2，总含量为28.99 μg·cm−2。而普通白菜自交不亲和系13S106[15]叶片的蜡质成分中烷烃为13.60 μg·cm−2，醛为0.90 μg·cm−2，醇为3.20 μg·cm−2，酮为8.30 μg·cm−2，脂肪酸为1.20 μg·cm−2，蜡酯为2.40 μg·cm−2。在上述不同十字花科物种中，蜡质主要成分均为烷烃，次要成分则有所不同。
1.2 十字花科植物蜡质的功能
十字花科植物表皮蜡质在维持水分平衡、反射紫外线、减少外来机械损伤、降低低温伤害、抵御细菌真菌入侵、防止昆虫侵食等抵抗生物与非生物胁迫中起着重要作用[16]，同时兼具影响叶片和果实着色、防止果实开裂和植株育性等生理功能[17]。
1.2.1 抗低温胁迫
低温胁迫易引起植物酶活性降低、细胞膜结构改变、细胞失水、代谢紊乱等，对植物生长发育造成多种负面影响[18]。倪郁等[19]发现：4 ℃低温胁迫下拟南芥生长发育缓慢、叶色变深，蜡质晶体的分布密度、大小、形态等发生改变。唐帅等[20]发现：4 ℃低温胁迫下拟南芥叶片表皮蜡质成分增加，烷烃、脂肪酸、醛、初级醇和酮相对含量分别增加54.34%、29.61%、54.40%、24.07%和137.80%；荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测显示蜡质相关基因的表达水平显著提高，说明拟南芥通过提高蜡质含量来缓解低温胁迫，预防低温对植物内部组织的伤害。
1.2.2 抗紫外线胁迫
紫外线中UV-B波长为280~315 nm，可对植物表面造成损伤。PRUDNIKOVA等[21]发现：过量UV-B处理会造成植株干质量降低，叶面积减小，净光合速率下降及花期变短等。宋超[14]发现：UV-B胁迫下拟南芥蜡质相对含量明显增加，蜡质相关基因CER3、CER4、KCS1表达量显著提高，其中CER4基因的相对表达增加了13.80倍，CER1和WIN1表达量降低。此外，UV-B胁迫下拟南芥蜡质晶体结构发生熔融，晶体由杆状变成片状，蜡质覆盖面积增加，蒸腾作用减少，从而达到反射更多紫外线的效果。
1.2.3 抗干旱胁迫
植物蜡质作为疏水屏障，在限制非气孔水分散失中扮演重要角色[22-23]。柴凌燕[24]发现：拟南芥过量表达蜡质相关转录因子WIN1可提高蜡质合成量，调节表皮渗透性，增强植株耐旱性。LÜ等[25]发现：拟南芥CER9编码一种与植物抗旱性相关的决定因子，该因子缺失可以增加蜡质合成，阻塞更多的气孔，抑制蒸腾作用。周燕等[26]发现：甘蓝型油菜中BnWIN2C01的特异性表达影响了叶片蜡质合成，从而影响植株水分平衡。
1.2.4 抗败育
花粉发育异常会导致植株减产或杂交不育，蜡质是花粉表面含油层的重要成分，在植物生殖发育方面发挥重要作用。KOCH等[27]发现：蜡质不仅影响植物叶片和果实的形态、发育，还影响植株花粉的发育情况。刘艳艳等[28]发现：FAX1基因缺失会抑制拟南芥营养生长，造成植株矮小、茎纤细、花粉稀少、角果短小等，同时还影响花粉壁的发育与花粉的育性，进而影响授粉过程。徐法青[29]发现：拟南芥CER3基因参与花粉脂质的合成或转运，该脂质的缺失会影响花粉与柱头的识别，阻断水合作用，最终导致雄性不育。
1.2.5 抗病虫害
蜡质可以减少叶片表面水分，减少病菌停留和降低病菌入侵。JU等[30]发现：蜡质的晶体结构可促使水分形成水滴以便滑落，并带走叶片表面的灰尘、污染物和病菌等。SURVILA等[31]发现：相较于正常植株，拟南芥蜡质缺失植株表面细菌更多，更易发生病害。蜡质在植物抵抗虫害方面也起着重要作用，它可通过光的反射，改变植物表现出的颜色，影响昆虫视觉，减少昆虫取食和产卵。BOHINC等[32]以8种基因型甘蓝为对象进行田间试验，发现蜡质对甘蓝跳甲Phyllotreta spp.和菜椿Eurydema spp.的生存有抑制作用，且蜡质含量越高，植株上甘蓝跳甲和菜椿越少。
2. 十字花科植物蜡质遗传特性
十字花科植物蜡质缺失表型明显，表面无蜡质覆盖的植株呈现叶色亮绿等性状，包括单基因隐性遗传、单基因显性遗传和双基因隐性遗传等3种遗传特性。
2.1 单基因隐性遗传
ANSTEY等[33]在青花菜Brassica oleracea var. italica中发现了十字花科植物中第1个符合单基因隐性遗传规律的蜡质缺失突变体。刘泽洲等[34]发现：甘蓝蜡粉缺失突变体10Q-961符合单基因隐性遗传规律。李红莲等[7]对无蜡质红菜薹与有蜡质红菜薹杂交建立6世代群体并进行研究，发现蜡质缺失突变体符合隐性遗传规律。王灿洁等[15]发现红菜薹自交系13S106蜡质缺失性状受隐性单基因控制。
2.2 单基因显性遗传
蒲媛媛等[35]发现：甘蓝型油菜光叶突变体GL的蜡质缺失性状受单个显性基因控制。刘东明[36]发现：甘蓝10Q-974亮绿性状符合单基因显性遗传规律，突变基因 BoGL1位于8号染色体177 kb的区间内，与基因Bol018504的表达相关。
2.3 双基因隐性遗传
周熙荣等[37]发现：甘蓝型油菜杂交F2中出现少数蜡质缺失的植株，其无蜡质性状由2对隐性基因控制。莫鉴国等[38]对加拿大引进的无蜡质甘蓝型油菜种质材料‘Nilla’进行研究，发现其蜡质缺失性状也是受2对隐性基因控制。
3. 十字花科植物蜡质合成分子机制
3.1 蜡质合成途径
十字花科植物蜡质合成C16~C18脂肪酸合成、C20~C34超长链脂肪酸合成、超长链脂肪酸衍生物合成等3个途径(图1)。合成相关酶如表1所示。
表 1 拟南芥参与蜡质生物合成的酶Table 1 Enzymes involved in wax biosynthesis in Arabidopsis thaliana序号 酶 缩略符 基因 参考文献 1 乙酰辅酶A羧化酶 ACC ACC1，ACC2 [39] 2 酰基载体蛋白硫解酶 FAT FATA，FATB [40] 3 长链酰基辅酶A合成酶 LACS LACS1，LACS2，LACS4 [41-44] 4 β-酮酰辅酶A合成酶 KCS FAE1，CER6，KCS1，FDH [45-46] 5 β-酮酰辅酶A还原酶 KCR KCR2 [11] 6 β-羟酰-酰基辅酶A脱水酶 HCD PAS1，PAS2 [47-48] 7 反式烯酰辅酶A还原酶 ECR CER10 [49] 8 脂肪酰辅酶A还原酶 FAR CER4 [50] 9 蜡酯合成酶 WS WSD1 [51] 10 脂肪酰辅酶A还原酶 FAR CER3 [52] 11 醛脱羰酶 AD CER1 [53-54] 12 中链烷烃羟化酶 MAH MAH1 [55] 3.1.1 C16~C18脂肪酸合成
C16~C18脂肪酸在质体中合成，初始反应物乙酰辅酶A在乙酰辅酶A羧化酶(ACC)和脂肪酸合成酶的作用下，以每次增加2个碳原子的方式延长碳链，形成C16~C18的酰基载体蛋白[39]，然后在酰基载体蛋白硫酯酶(FAT)作用下水解生成C16~C18脂肪酸[40]。脂肪酸经长链酰基碳烯A合成酶(LACS)催化后以脂肪酰辅酶A的形式进入内质网中[41]，进行下一步反应。ZHAO等[42]发现：拟南芥的9个LACS基因中，LACS1和LACS2参与蜡质的合成。LÜ等[43]和JESSEN等[44]进一步发现：LACS1和LACS4参与花粉外被长链脂肪酸的合成。
3.1.2 C20~C34超长链脂肪酸合成
C20~C34超长链脂肪酸合成场所是内质网。C16~C18脂肪酰辅酶A与丙二酰辅酶A通过脂肪酸延伸酶复合物(FAE)进行合成，每次循环增加2个碳原子，多次循环延伸碳链，最终形成C20~C34超长链脂肪酸，其中丙二酰辅酶A由乙酰辅酶A于细胞质中经过乙酰辅酶A羧化酶催化形成。该反应中的FAE属于多酶复合体，包括β-酮酰辅酶A合成酶(KCS)，β-酮酰辅酶A还原酶(KCR)，反式烯酰辅酶A还原酶(ECR)和β-羟酰-酰基辅酶A脱水酶(HCD)4种酶，其中KCS是该反应的关键酶，对反应底物具有特异性。QUIST等[45]发现：拟南芥KCS基因分为FAE1类和ELO类，前者包含FAE1、CER6、KCS1和FDH等4个亚组，而ELO类基因功能还未见报道。SUH等[46]发现：拟南芥与蜡质相关的基因有KCS1、KCS2、KCS13、KCS10、KCS20和CER6等；拟南芥中的KCR基因有KCR1和KCR2等2种，KCR1没有功能，KCR2参与超长链脂肪酸的合成。ZHAO等[47]发现：相比野生型，cer10突变体器官小，蜡质少；CER10基因在表皮和种子中有ECR功能活性，参与超长链脂肪酸合成。目前对HCD的研究较少，BACH等[48]发现：pas2-1突变体的蜡质含量明显少于野生型，PAS2基因功能完全丧失会最终导致胚死亡，推测PAS2在超长链脂肪酸合成和生物发育中起到非常关键的作用。ROUDIER等[49]发现：内质网中的PAS1和PAS2，KCR和ECR存在蛋白互作，并认为PAS1在多酶复合体中扮演分子构架的角色。
3.1.3 超长链脂肪酸衍生物合成
同位素示踪和气相色谱质谱技术已经验证了超长链脂肪酸通过酰基还原途径和脱羰基途径衍生出其他蜡质成分。酰基还原途径也叫醇合成途径，超长链脂肪酰辅酶A经脂肪酰辅酶A还原酶(FAR)还原产生初级醇，初级醇与C16~C18脂肪酸辅酶A经蜡酯合成酶(WS)缩合产生蜡酯。拟南芥通过酰基还原途径产生的蜡质相对含量约为20%。 CER4基因编码的酰基辅酶A还原酶在该途径中起到关键作用，主要将拟南芥表皮和根部脂肪酸还原成初级醇。ROWLAND等[50]发现：拟南芥cer4突变体茎中醇与蜡酯含量显著降低。LI等[51]发现：拟南芥wsd1突变体蜡酯含量明显少于野生型。脱羰基途径也叫烷烃合成途径，超长链脂肪酰辅酶A经脂肪酰辅酶A还原酶(FAR)还原产生的醛经醛脱羰酶脱羰产生烷烃，经中链烷烃羟化酶(MAH)1次羟化产生次级醇，再次羟化生成酮。拟南芥约80%的蜡质组分由该途径产生。BERNARD等[52]发现：拟南芥cer3突变体中醛含量减少，说明CER3基因在产生醛的过程起着重要作用。OSHIMA等[53]和刘秀林[54]发现：拟南芥cer1突变体茎表皮蜡质组分中烷烃含量减少，而醛含量增加，说明CER1编码的酶参与烷烃产生。GREER等[55]发现：MAH1是烷烃羟化酶，拟南芥mah1突变体中次级醇和酮的含量显著减少。
3.2 蜡质转运途径
内质网上经过各种酶加工修饰合成的蜡质成分会先转运到细胞膜，再通过转运蛋白进行跨膜运输，最后经脂质转移蛋白跨细胞壁转运到角质层，转运途径及转运蛋白见图2和表2。
表 2 拟南芥参与蜡质转运的蛋白Table 2 Waxy transport proteins in Arabidopsis thaliana3.2.1 细胞内的蜡质转运
目前对蜡质从内质网转运到质膜有2种推测：①蜡质通过内质网与质膜内侧接触的部分直接进行运输；②蜡质先进入内质网分泌的囊泡，再经高尔基体转运到细胞膜内侧[56]。
3.2.2 蜡质的跨膜运输
蜡质到达质膜后利用相关转运蛋白进行跨膜运输。ABCG11和ABCG12是拟南芥中2个蜡质转运相关的半分子转运蛋白，LUO等[57]发现：ABCG11通过与另1个ABCG11结合形成同源二聚体或是与其他半分子转运蛋白结合形成异源二聚体来转运蜡质分子。BIRD等[58]发现：abcg11突变体生长速度减缓，表皮蜡质含量减少。QUILICHINI等[59]发现：ABCG12基因编码定位在质膜上的ABC转运蛋白，ABCG12基因的缺失导致拟南芥表皮部位的蜡质显著减少，而细胞内蜡质总含量并没有显著变化，说明该基因缺失只影响了质膜中的蜡质转运过程，而细胞内蜡质合成并没有受阻。
3.2.3 蜡质转移到角质层
到达细胞膜外的蜡质由脂质转移蛋白(LTPs)转运到角质层。LTPG1是一种脂质转移蛋白，包含8个保守的半胱氨酸，形成疏水囊泡。DeBONO等[60]发现：ltpg1突变体的茎和角果表皮蜡质C29烷烃含量减少，但其他蜡质成分不存在显著差异，说明突变体缺失的蛋白可能对C29烷烃转移具有专一性。孙伟[61]发现：Th-nsLTP是一个非特异性脂转移蛋白，通过参与小盐芥表皮蜡质转移过程，使表皮蜡质含量减少，晶体结构从杆状转为柱状。
4. 展望
十字花科植物蜡质形成分子机制极其复杂，今后可从以下几个方面深入探究。①当前对蜡质形态结构与成分含量的研究都是独立的，若能寻找不同蜡质成分形成晶体过程中的空间折叠规律，将有助于探明蜡质成分与蜡质结构复杂多样性背后的具体对应关系。②目前在蜡质合成与转运方面研究较多，但在外界环境条件如低温、干旱或光照强度对蜡质合成影响方面的研究较少，需要更多的相关研究阐明环境影响蜡质合成的机制。③培育蜡质过量的新品种对于研究蜡质形成分子机制及抗病育种都具有重要意义。
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图 1 不同浸泡时间下杉木种子浸出液吸光度
Figure 1 Absorbance of leaching solution of different C. lanceolata seeds at different soaking times
表 1 不同杉木种子真实萌发率
Table 1. Real germination rate of different C. lanceolata seeds
种子类型 萌发率/% 变异系数/% 普杉 41.11±2.34 b 5.69 速杉 44.88±2.25 a 5.01 杂杉 37.33±2.33 c 6.24 说明：同列不同字母表示差异显著(P＜0.05) 
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表 2 不同杉木种子胚TTC染色率
Table 2. TTC staining rate of different C. lanceolata seed embryos
种子类型 染色率/% 变异系数/% 普杉 38.89±8.88 c 22.83 速杉 49.78±3.04 a 6.10 杂杉 42.22±3.35 b 7.93 说明：同列不同字母表示差异显著(P＜0.05)
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表 3 浸泡4 h后杉木种子吸光度[D(260)]所对应的萌发率波动
Table 3. Fluctuation range of germination rate corresponding to obsorbance [D(260)] of different C. lanceolata seeds soaked for 4 h
种子类型 萌发率/% 变异系数/% 普杉 41.00±1.96 b 4.78 速杉 44.94±1.95 a 4.33 杂杉 37.39±2.10 c 5.61 说明：同列不同字母表示差异显著(P＜0.05)
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表 4 3种方法测定种子活力步骤与耗时比较
Table 4. Comparison of three methods for determining seed vigor and time-consuming
方法 步骤(耗时) 总耗时/h 标准发芽法 安替福明灭菌(15 min) 无菌水浸泡(24 h) 测定自然萌发率(15 d) 约384 TTC法 安替福明灭菌(15 min) 蒸馏水浸泡(24 h) 剥种胚恒温染色(1~3 h) 结果统计(1 h) 26~28 UVS法 种子清洗(1 h) 去离子水浸泡(4 h) OD值测定(0.5 h) 5.5
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表 5 3种测定方法的稳定性比较
Table 5. Comparison of the stability of the three methods
方法 萌发率/% 速1 新6 红47 TTC法 57.33±10.28 a 55.33±7.83 a 56.67±9.55 a 标准发芽法 49.33±3.47 b 46.67±3.67 b 50.00±3.26 b UVS法 44.81±5.71 b 45.16±3.06 b 45.27±5.51 b 说明：同列不同字母表示差异显著(P＜0.05)
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[1] 刘毓侠, 王铁固. 种子活力研究进展[J]. 玉米科学, 2012, 20(4): 90 − 94. LIU Yuxia, WANG Tiegu. Research progress of seed vigor [J]. J Maize Sci, 2012, 20(4): 90 − 94. [2] 孙群, 王建华, 孙宝启. 种子活力的生理和遗传机理研究进展[J]. 中国农业科学, 2007, 40(1): 48 − 53. SUN Qun, WANG Jianhua, SUN Baoqi. Advances on seed vigor physiological and genetic mechanisms [J]. Sci Agric Sin, 2007, 40(1): 48 − 53. [3] 颜启传, 胡伟民, 宋文坚. 种子活力测定的原理和方法[M]. 北京: 中国农业出版社, 2006. [4] 李彬, 应建恺, 赵光武, 等. 三系杂交籼稻种子活力测定及其与田间出苗率的相关性[J]. 西北农业学报, 2016, 25(11): 1615 − 1622. LI Bin, YING Jiankai, ZHAO Guangwu, et al. Seed vigor determination of three-line indica hybrid rice and their relationship with field emergence percentage [J]. Acta Agric Boreali-Occident Sin, 2016, 25(11): 1615 − 1622. [5] 王婷婷, 杨建宇, 张文明, 等. 液氮超低温贮藏对玉米种子活力的影响[J]. 种子, 2014, 33(12): 30 − 32, 36. WANG Tingting, YANG Jianyu, ZHANG Wenming, et al. Influence on vigor of maize seeds after liquid nitrogen cryopreservation [J]. Seed, 2014, 33(12): 30 − 32, 36. [6] 张文明, 郑文寅, 任冲, 等. 电导法测定大豆种子活力的初步研究[J]. 种子, 2003(2): 34 − 36, 38. ZHANG Wenming, ZHENG Wenyin, REN Chong, et al. Study on testing method of seed vigor by electrical conductivity in soybean [J]. Seed, 2003(2): 34 − 36, 38. [7] 田茜, 李群, 段乃彬, 等. 人工老化对小麦种子活力及超弱发光的影响[J]. 中国农学通报, 2017, 33(3): 15 − 18. TIAN Qian, LI Qun, DUAN Naibin, et al. Effects of artificial aging on vigour and ultra-weak luminescence of wheat seeds [J]. Chin Agricl Sci Bull, 2017, 33(3): 15 − 18. [8] POONGUZHALI S, KANAGARASU S. Standardization and identification of reliable vigour test for delineation of unknown seed lots of blackgram (Vigna mungo (l) hepper) cv. VBN 5 [J]. Res J Agric Sci, 2015, 6(4): 834 − 837. [9] 潘佳, 李荣, 郭耘欣, 等. 紫花苜蓿种子活力测定方法的比较[J]. 草业科学, 2017, 34(5): 1042 − 1048. PAN Jia, LI Rong, GUO Yunxin, et al. Comparative study of seed vigor test in Medicago sativa [J]. Pratacultural Sci, 2017, 34(5): 1042 − 1048. [10] MAO P S, ZHANG X Y, SUN Y, et al. Relationship between the length of the lag period of germination and the emergence performance of oat (Avena sativa) seeds [J]. Seed Sci Technol, 2013, 41(2): 281 − 291. [11] 王金丽. 玉米种子活力测定方法比较[J]. 农业科技与装备, 2015(7): 11 − 12. WANG Jinli. Comparisons of determination methods of maize seed activity [J]. Agric Sci Technol Equip, 2015(7): 11 − 12. [12] 段永红, 李小湘, 李卫红. 利用电导法测定杂交水稻种子活力的探讨[J]. 湖南农业科学, 2010(23): 17 − 19. DUAN Yonghong, LI Xiaoxiang, LI Weihong. Determination of seed activity of hybrid rice by conductivity method [J]. Hunan Agric Sci, 2010(23): 17 − 19. [13] 鲁黎明, 叶科媛, 安影, 等. 一种快速测定烟草种子活力的方法:紫外吸收分光光度法[J]. 种子, 2009, 28(8): 115 − 117. LU Liming, YE Keyuan, AN Ying, et al. A rapid method of determining tobacco seed vigor: uv absorption spectrophotometry method [J]. Seed, 2009, 28(8): 115 − 117. [14] MARCOS-FILHO J. Seed vigor testing: an overview of the past, present and future perspective [J]. Sci Agric, 2015, 72(4): 363 − 374. [15] COPELAND L O, McDONALD M B. Seed Vigor and Vigor Tests[M]//COPELAND L O, McDONALD M B. Principles of Seed Science and Technology. 3rd ed. New York: Springer Science and Business Media, 1999: 153–180. [16] WEN Daxing, HOU Hongcun, MENG Aiju, et al. Rapid evaluation of seed vigor by the absolute content of protein in seed within the same crop [J]. Sci Rep, 2018, 8(1): 5569. [17] VUJANOVIC V, ST-ARNAUD M, BARABÉA D, et al. Viability testing of orchid seed and the promotion of colouration and germination [J]. Annl Bot, 2000, 86(1): 79 − 86. [18] 田伟莉, 吴家森, 金水虎, 等. 3种蜡梅属植物种子活力测定方法的比较[J]. 种子, 2008, 27(4): 21 − 23. TIAN Weili, WU Jiasen, JIN Shuihu, et al. Comparative study on testing methods for seed vigor of three Chimonanthus species [J]. Seed, 2008, 27(4): 21 − 23. [19] BATTY A L, DIXON K W, BRUNDRETT M. Long-term storage of mycorrhizal fungi and seed as a tool for the conservation of endangered Western Australian terrestrial orchids [J]. Aust J Bot, 2001, 49: 619 − 628. [20] 边子星, 颜彩燕, 姚肖健, 等. 濒危华石斛种子活力测定方法研究[J]. 热带作物学报, 2017, 38(3): 403 − 407. BIAN Zixing, YAN Caiyan, YAO Xiaojian, et al. Determination of seed viability in endangered orchid of Dendrobium sinense [J]. Chin J Trop Crops, 2017, 38(3): 403 − 407. [21] 岳媛. 杜鹃花属植物种子育苗技术及耐热性研究[D]. 南京: 南京林业大学, 2013. YUE Yuan. Study on Seed Breeding Technology and Heat Tolerance of Rhododendron L.[D]. Nanjing: Nanjing Forestry University, 2013. 期刊类型引用(3)
1. 杨双娟，唐昊，赵艳艳，魏小春，王志勇，苏贺楠，张文静，李林，王坐京，原玉香，张晓伟. 大白菜蜡质缺失突变体YW71的遗传及序列变异分析. 中国瓜菜. 2024(01): 32-38 . 
百度学术2. 孟敌，焦贺，赵安琪，韩颖，何雪，李鹏霞，胡花丽. 真空预冷对采后娃娃菜流通及货架品质的影响. 食品工业科技. 2024(09): 296-308 . 百度学术3. 火兆燕，曹萍，马馨馨，王树彬，厉书豪，邵贵荣，钟凤林. 不结球白菜表皮蜡质高温胁迫生理响应. 西北植物学报. 2022(01): 89-97 . 百度学术其他类型引用(7)
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