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陆地生态系统碳循环是全球碳循环的重要部分，土壤是陆地生态系统最大的碳库。有研究表明：陆地生态系统中土壤有机碳储量比大气中高2~3倍[1]。土壤有机碳是土壤碳库的重要存在形式，也是维持陆地生态系统结构和功能的重要基础[2]。但是由于自然因素或者人为破坏造成的陆地生态系统退化已经严重影响了土壤碳库的稳定和固持能力，甚至成为仅次于化石燃料燃烧的人为二氧化碳排放源[3]。植被恢复普遍被认为是提升退化土壤有机碳固持能力的有效措施[4]，然而土壤碳库恢复往往滞后于植被，且不同植被恢复模式之间差异较大[5]。因此，研究不同植被恢复模式下土壤有机碳储量特征对正确认识退化区域土壤固碳潜力和可持续恢复具有指导意义。
在植被恢复过程中土壤有机碳的积累存在很大的不确定性，与造林前相比，植被恢复后土壤有机碳增加、减少或者无显著变化的报道均有存在[6]。这主要是由于造林打破了原生态系统土壤有机碳输入与输出的动态平衡，可能需要几十年的时间才能达到新的平衡，因此土壤有机碳主要取决于造林前储存碳的分解[7]。此外，人工造林与植被自然恢复作为退化生态系统非常重要的植被恢复模式，两者的土壤固碳能力大小也存在争议。WEI等[5]研究表明：人工造林的土壤固碳能力显著高于自然植被恢复，而JIN等[8]认为：自然植被恢复比人工造林更利于土壤固碳。这是因为2种植被恢复模式在经营管理、物种组成、微气候、根系周转及分泌物、凋落物等方面都存在很大差异[9]，从而导致土壤碳汇效应差异，因此，分析不同人工恢复模式与自然恢复模式下的土壤碳汇效应对探讨其在调节碳平衡中的作用和贡献具有重要意义。
水利部监测结果表明：南方红壤丘陵考察区共有水土流失面积13.12万km2，约占土地总面积的15%，已经成为仅次于黄土高原的第二大土壤侵蚀区[10]。目前，已有学者对南方红壤侵蚀区的土壤碳库特征做了初步研究，如李燕燕等[11]研究了红壤丘陵区不同植被恢复模式对土壤有机碳周转的影响，结果表明：马尾松Pinus massoniana林土壤有机碳来源于森林碳的比例高于木荷Schima superba林，但木荷林中土壤有机碳分解更慢；XIAO等[12]分析了赣南退化红壤区不同植被恢复年限土壤有机碳密度的动态变化特征，发现与裸地相比，经过4、14、24和34 a恢复，土壤有机碳固存能力分别为2.97、2.01、12.91和19.79 Mg·hm−2；辜翔等[13]采用时空代替法揭示了湘中红壤丘陵区植被恢复对土壤有机碳、碳密度的影响，结果表明：土壤有机碳随植被恢复的变化受到植被因子和土壤因子的共同影响。然而，红壤侵蚀区长期植被恢复后，不同植被恢复模式土壤有机碳质量分数、密度变化及其影响因素还缺乏较为系统的研究。此外，吕茂奎等[14]研究表明：红壤侵蚀地植被恢复 7~11 a，土壤非保护性有机碳质量分数显著增加，其分配比例也明显升高；恢复至 27 a后分配比例保持在较稳定水平，土壤有机碳的输入与微生物分解过程逐渐达到相对平衡状态。本研究以江西退化红壤森林植被恢复国家长期科研基地经过27 a人工植被恢复重建的6种林分为研究对象，以未加人工干扰的自然恢复地为对照，分析不同植被恢复模式土壤有机碳质量分数、密度的变化特征，探讨植物生物量及土壤性质变化对土壤有机碳储量的影响，为退化红壤区生态修复及碳库管理提供科学支撑。
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江西退化红壤森林植被恢复国家长期科研基地是典型红壤侵蚀退化丘陵区，地处江西省泰和县石山乡，26°54′~ 26°55′N，114°48′~ 114°49′E，为典型的亚热带湿润季风气候，水热资源丰富，年平均气温为18.6 ℃，年降雨量为1 726.0 mm，年平均日照时数为1 756.4 h。研究区土壤母质为第四纪红土，表层石砾含量较多，属于典型的红壤低丘岗。由于长期的乱砍滥伐、过度放牧、割灌铲草，导致土壤侵蚀严重、土地贫瘠，仅有一些干旱和半干旱草(狗牙根属Cynodon)零星分布，土壤有机质质量分数极低(6.5 g·kg−1)[5]。1991年选用湿地松P. elliottii、马尾松、晚松P. serotina、火炬松P. taeda、枫香Liquidambar formosana、樟树Cinnamomum camphora、木荷、油桐Vernicia fordii等树种，在该区采取不同配置模式开展荒山造林植被恢复试验研究，共有84个小班连片分布。目前，试验区已郁闭成林。
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在研究区内选取6种典型人工植被恢复类型(马尾松纯林、湿地松纯林、木荷纯林、湿地松-木荷混交林、马尾松补植木荷林和湿地松补植木荷林)，每种植被恢复类型设置5个20 m×20 m的标准样地。此外，在基地外选择3个未加人工干扰的自然恢复样地作为对照(表1)。于2018年7月在每个样地内沿对角线均匀挖取3个土壤剖面，共99个剖面。已有研究表明：红壤侵蚀地不同植被恢复措施对于40 cm以下土壤有机碳质量分数影响不大[15]。因此，本研究以40 cm为采样深度，按0~10、10~20、20~30、30~40 cm分层, 从下而上采集土壤样品, 同时用环刀法测定土壤容重、含水率。
表 1 7种植被恢复模式的基本情况
Table 1. General characteristics of seven vegetation restoration patterns
植被恢复模式 面积/hm2 优势种 恢复年限/a 胸径/cm 树高/m 马尾松纯林(PM) 17.16 马尾松 27 11.40±0.75 7.39±0.26 湿地松纯林(PE) 17.74 湿地松 27 17.32±2.05 8.98±0.74 木荷纯林(SS) 11.61 木荷 27 11.63±0.32 9.02±0.76 湿地松-木荷混交林(MES) 5.46 湿地松、木荷 27 13.64±0.47 9.33±0.63 马尾松补植木荷林(RMS) 19.07 马尾松、木荷 27 14.08±0.36 8.39±0.33 湿地松补植木荷林(RES) 14.81 湿地松、木荷 27 14.18±0.44 7.91±0.15 自然恢复样地(ck) 狗牙根、金樱子、狗尾草 27 说明：狗牙根Cynodon dactylon；金樱子Rosa laevigata；狗尾草Setaria viridis。马尾松补植木荷林初植为马尾松，2010年补植木荷；湿地松补植木荷林初植为湿地松，2006年补植木荷。胸径和树高数值为平均值±标准差。 对每个样地中胸径＞5 cm的林木进行每木检尺，记录胸径、树高等，其次在每个样地沿对角线均匀布置5个1 m×1 m样方，收集样方内的全部凋落物，称湿质量后，将约300 g带回实验室。野外采集的样品带回实验室处理后用于测定相关指标。有机碳采用重铬酸钾容量法-外加热法(H2SO4-K2Cr2O7)，土壤容重和孔隙度的测定采用环刀法，土壤含水率采用烘干法，pH采用电极法，全氮、全磷采用高氯酸-硫酸消煮法，全自动间断化学分析仪(Smart Chem 200 Alliance Corp.)上机测定[16]。
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土壤有机碳密度及有机碳储量参考CHEN等[17]的计算方法。土壤有机碳密度(DSOC)计算公式如下：DSOCi= CiρiHi(1−F)/10。其中：DSOCi为第i层土壤有机碳密度 (Mg·hm−2)；Ci为第i层土壤有机碳质量分数(g·kg−1)；ρi为第i层土壤容重 (g·cm−3)，Hi为剖面深度(cm)；F为粒径＞2 mm的砾石质量百分比(%)；10−1为单位转换系数。乔木生物量按照目前中国执行的立木生物量模型及碳计量参数标准[18−20]进行估算。
样品数据录入后，采用SPSS 27.0对不同植被恢复类型和不同土层深度的有机碳质量分数和有机碳密度差异进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，采用最小显著性差异(LSD) 法进行差异显著性检验(P＜0.05)；采用皮尔逊(Pearson)相关分析探究土壤有机碳密度的影响因素，使用Origin 2022和ArcGIS 10.8.1绘图。
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由图1可以看出：在0~20 cm土层中，退化红壤区6种人工植被恢复模式的土壤有机碳相较自然恢复样地均有显著增加(P＜0.05)；在20~30 cm土层中，除了马尾松纯林和湿地松纯林外，其余4种人工植被恢复模式土壤有机碳质量分数均显著高于对照(P＜0.05)；在30~40 cm土层中，仅有木荷纯林和湿地松-木荷混交林的土壤有机碳质量分数显著高于对照(P＜0.05)。比较6种人工植被恢复模式发现，土壤有机碳在0~10 cm土层中木荷纯林显著高于湿地松纯林和马尾松纯林，湿地松-木荷混交林显著高于马尾松纯林(P＜0.05)；在10~20 cm土层中仅有木荷纯林显著高于湿地松纯林和马尾松纯林(P＜0.05)；在20~30和30~40 cm土层中6种人工植被恢复模式之间无显著差异。
图 1 不同植被恢复模式间土壤有机碳质量分数特征
Figure 1. Characteristics of soil organic carbon contents among different vegetation restoration patterns
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从图2可以看出：所有植被恢复模式不同土层的土壤有机碳质量分数分布规律基本一致，均表现出较强的表聚效应，即0~10 cm表层土壤有机碳最多，且随着土壤深度的增加土壤有机碳呈现减少的趋势，但不同植被恢复模式土壤有机碳层间差异不同。其中木荷纯林的层间差异最大，0~10 cm土层土壤有机碳质量分数与30~40 cm土层相差33.26 g·kg−1，其次为湿地松-木荷混交林、湿地松补植木荷林、马尾松补植木荷林、湿地松纯林、马尾松纯林，对照不同土层之间的差异最小，仅相差4.90 g·kg−1。不同植被恢复模式0~20 cm土层土壤有机碳质量分数均占0~40 cm土层的60 %以上。
图 2 不同植被恢复模式间土壤有机碳质量分数垂直分布特征
Figure 2. Vertical distribution characteristics of soil organic carbon contents between different vegetation restoration patterns
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从图3可以看出：不同植被恢复模式之间土壤有机碳密度存在显著差异(P＜0.05)，其中在0~10、10~20和20~30 cm土层中，6种人工植被恢复模式的土壤有机碳密度均显著大于对照，在30~40 cm土层中除了湿地松纯林外，其余5种人工植被恢复模式的土壤有机碳密度均显著大于对照(P＜0.05)。比较6种人工植被恢复模式发现，在0~10 cm土层中，木荷纯林的土壤有机碳密度显著大于湿地松纯林和马尾松纯林，湿地松-木荷混交林的土壤有机碳密度显著大于马尾松纯林(P＜0.05)；在10~20 cm土层，木荷纯林、湿地松-木荷混交林和马尾松补植木荷林的土壤有机碳密度显著大于马尾松纯林(P＜0.05)；在20~30和30~40 cm土层，木荷纯林的土壤有机碳密度显著大于马尾松补植木荷林、湿地松补植木荷林、马尾松纯林和湿地松纯林(P＜0.05)。总体而言，土壤有机碳密度变化呈现出随土壤剖面深度的增加而减少的趋势。
图 3 不同植被恢复模式土壤有机碳密度分布特征
Figure 3. Distribution characteristics of soil organic carbon density in different vegetation restoration patterns
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从图4可以看出：土壤有机碳密度与土壤理化性状和植被因子之间均存在显著相关性。其中，土壤有机碳密度与土壤有机碳质量分数(r=0.932，P＜0.01)、土壤含水量(r=0.258，P＜0.01)、土壤孔隙度(r=0.533，P＜0.01)、土壤全氮质量分数(r=0.674，P＜0.01)、土壤全磷质量分数(r=0.268，P＜0.01)、凋落物现存量(r=0.254，P＜0.01)、凋落物碳质量分数(r=0.229，P＜0.05)、凋落物氮质量分数(r=0.322，P＜0.01)、凋落物磷质量分数(r=0.246，P＜0.05)、地上部分生物量(r=0.243，P＜0.01)和地下部分生物量(r=0.237，P＜0.01)呈显著或极显著正相关，与pH (r=−0.367)和土壤容重(r=−0.336)呈极显著负相关(P＜0.01)。土壤有机碳密度与土壤有机碳质量分数相关系数最大，与地下部分生物量的相关系数最小。总体上看，土壤理化性状和植被因子对土壤有机碳的影响与土壤有机碳密度基本一致。
图 4 土壤有机碳密度与土壤理化性状、植被因子间的皮尔逊相关分析
Figure 4. Pearson correlation analysis between SOCD and soil physicochemical properties and vegetation factors
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表2为研究区经过27 a植被恢复与重建后不同植被恢复模式的土壤有机碳储量。从表2可以看出：0~40 cm土层土壤有机碳储量从高到低依次为木荷纯林、湿地松-木荷混交林、马尾松补植木荷林、湿地松补植木荷林、湿地松纯林、马尾松纯林，与对照相比，土壤有机碳储量分别增加了50.12、42.73、38.20、33.03、26.93和20.85 Mg·hm−2，最大提升了2.46倍，最小提升了1.02倍，说明人工植被恢复对促进土壤有机碳积累效果显著。
表 2 退化红壤区植被恢复土壤有机碳储量
Table 2. Soil organic carbon stocks in revegetated red soil areas with degradation
土层深度/cm 土壤有机碳储量/( Mg·hm−2) 马尾松纯林 湿地松纯林 木荷纯林 马尾松补植木荷林 湿地松补植木荷林 湿地松-木荷混交林 自然恢复样地 0~10 16.56 20.28 31.19 27.18 24.92 29.03 6.06 10~20 9.68 12.16 15.00 13.78 11.88 14.11 5.51 20~30 8.30 8.63 13.62 10.01 9.11 10.96 4.98 30~40 6.72 6.27 10.72 7.64 7.53 9.04 3.86 0~40 41.26 47.34 70.53 58.61 53.44 63.14 20.41 -
研究区经过27 a人工植被恢复后，土壤有机碳质量分数为17.57 g·kg−1，土壤有机碳储量为55.72 Mg·hm−2，与闽西[21]和赣南[12]红壤侵蚀区植被恢复24 a后0~40 cm土层土壤碳密度(分别为27.28和49.45 Mg·hm−2)相比，土壤有机碳储量较高。这主要是与植被恢复类型有关，土壤有机碳主要来源于植被凋落物及地下根系的分解和周转[22]。凋落物的分解速率及地下根系的分布和周转因植被类型不同而有所差异，因此植被类型在很大程度上影响着土壤碳库。土壤有机碳储量即使在同一地区或同一气候条件下, 也可能会因植被类型不同而产生较大的差异[23]。研究结果与湘中红壤侵蚀区植被恢复26 a后0~40 cm土层土壤有机碳相比，土壤有机碳质量分数高于湘中红壤侵蚀区(12.16 g·kg−1)[24]，土壤有机碳密度却低于湘中地区(71.40 Mg·hm−2)[13]。这一方面是因为辜翔等[13]的研究中没有去除粒径＞2 mm砾石，系统地高估了有机碳储量[25]；另一方面是因为在本研究区砾石较多，平均达到35.8%，因此本研究区土壤有机碳质量分数较高，土壤有碳储量却较低。植被恢复过程中，植被层的形成和发育会改变植被层生产力及土壤有机物质积累和分解，进而影响土壤碳质量分数和储量[2]。通常的恢复模式是使用具有高存活率的先锋物种在景观中定居，然后在环境条件允许的情况下逐渐引入当地的顶极物种。本研究区直接利用当地顶极物种[5]来恢复严重侵蚀退化土壤，并取得巨大成功，这对中国南方红壤侵蚀区大规模造林和再造林工程具有一定的参考意义。
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本研究发现：对比自然恢复地，6种人工植被恢复模式0~40 cm土层土壤有机碳质量分数均有所增加，但随着土层深度的增加差异逐渐减小。这与刘苑秋等[26]对本研究区植被恢复早期(10 a)的研究结果不一致，其研究结果表明：0~40 cm土层内重建森林土壤的有机质质量分数低于对照区。这主要是因为：①自然恢复地虽然没有进行人工重建植被，但在不樵采、不放牧的保护措施下，一些阳性草本植物生长较快，地表植被盖度达90%[26]。在植被恢复初期(10 a)，地表植物凋落物量更多，凋落物及地下根系的分解与周转速率更快，土壤有机碳的固持和保护作用更强。②已有研究表明：在植被恢复早期，原先土壤碳的缓慢分解是中国南方红壤侵蚀区有机碳增加的重要原因[27]，而人工植被恢复模式对土壤有机碳的消耗远大于自然植被恢复模式，因此在植被恢复早期自然恢复地土壤有机碳质量分数高于人工重建植被。然而随着恢复年限的增加，人工植被恢复模式群落总生物量及各组分生物量增高，地表凋落物现存量逐渐增多，凋落物层质量明显改善，且被土壤微生物分解的速率更快，有机物输入量更大[28]；同时地表裸露面积减少, 地表径流侵蚀减弱，土壤环境质量逐渐改善和稳定，土壤团聚体物理保护的增强，减缓了土壤有机碳的损失，因此土壤有机碳质量分数逐渐高于自然恢复地。
研究还发现：6种人工植被恢复模式0~20 cm土层土壤有机碳质量分数也存在差异，其中木荷纯林的土壤有机碳质量分数显著高于马尾松纯林和湿地松纯林。一方面是湿地松纯林和马尾松纯林凋落物较少，且存在大量顽抗的化合物，导致其分解速率较低并且减慢了颗粒有机物向矿质土壤转化的速度。木荷纯林的凋落物产量大，分解速率较快[29]，导致木荷纯林表层土壤有机碳质量分数显著高于马尾松纯林和湿地松纯林。另一方面是由于木荷纯林的地下根系发达且向更大范围伸展，有效改善了土壤储水功能和孔隙度[30]。土壤水分得到改善后提高了植物生产力，减缓了有机碳矿化速率[31]。土壤孔隙度增大有利于土壤中水分和气体的运移与交换[32]，可以更好地固持有机碳中的颗粒物，引起颗粒有机碳的变化，促进有机碳的积累[33]。然而随着土层深度的增加，发育于同一母质的深层土壤，受植物凋落物、根系的影响程度减弱，使得不同植被恢复模式土壤有机碳质量分数之间的差异也随着土壤深度的增加而减弱[24]。6种人工植被恢复模式在20~40 cm土层土壤有机碳质量分数差异不显著，这也表明：植被恢复过程中土壤有机碳的积累需要一个过程，表层土壤碳库比深层恢复更快。单一的凋落物会降低微生物丰度与多样性，导致其分解残留率显著增高[34]，因此虽然阔叶林的凋落物量更多，但是混交林的土壤微生物活性更高，分解凋落物和地下根系的速率更快，导致湿地松-木荷混交林、马尾松补植木荷林和湿地松补植木荷林等3种恢复模式与木荷纯林的0~40 cm土层土壤有机碳质量分数均无显著差异。同一气候条件下, 相同厚度土层土壤有机碳密度的变化取决于土壤有机碳质量分数和土壤容重。受到土壤容重的影响，本研究中不同植被恢复模式土壤有机碳密度的变化规律与土壤有机碳存在些许差异，但总体变化趋势基本相同。此外，本研究区土壤有机碳质量分数分布呈现随土层深度增加而减少的特征，但不同植被恢复模式土壤有机碳的层间差异不同。这与众多研究结果一致[2, 12−13]。这是因为地表凋落物和植物根系分解所形成的土壤有机碳首先进入土壤表层，使得表层土壤有机碳明显高于深层土壤，且林分类型对凋落物产量和分解速率均有显著影响，进而造成土壤有机碳层间差异有所不同[35]。
植被恢复是一个漫长的过程。在这个过程中土壤有机碳质量分数与植被因子、土壤理化性状密切相关，但不同因子对土壤有机碳质量分数影响不尽相同。研究表明：土壤有机碳和氮、磷均存在正相关关系，这是因为土壤碳和氮之间有较强的交互作用，土壤氮的增加会促进植物向土壤中转移更多的有机碳[36]，同时有机质质量分数高的土壤中往往含有大量有机磷[32]，磷质量分数的提升可促进土壤有机质分解[37]。凋落物氮、磷能为微生物群落提供充足的养分和能源，从而提高微生物活性，促进凋落物的分解[38]，因此土壤有机碳与凋落物氮、磷也呈正相关。土壤有机碳质量分数与pH呈显著负相关。这与JIA等[39]的研究结果一致。这是由于较低的土壤pH通常会抑制微生物的活性和数量，从而减慢土壤有机碳的分解速率，有利于土壤有机碳的积累[40]。土壤有机碳密度与土壤有机碳质量分数一样，也与土壤理化性状、植被因子密切相关，且与土壤有机碳的变化规律基本一致。
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研究区人工植被恢复模式下土壤有机碳质量分数为17.57 g·kg−1，土壤有机碳储量为55.72 Mg·hm−2，显著高于自然恢复地，说明人工植被恢复与重建取得了巨大成功，可以在当地继续推广。在不同人工植被恢复模式0~20 cm 土层的土壤有机碳质量分数之间存在显著差异，其中木荷纯林显著高于马尾松纯林和湿地松纯林，但与湿地松-木荷混交林、湿地松补植木荷林和马尾松补植木荷林均无显著差异，因此在研究区今后的建设中，可通过间伐补植阔叶树等方式对针叶纯林进行改造，进而增强土壤固碳能力。研究区7种植被恢复模式不同土层的土壤有机碳质量分数分布规律基本一致，均表现出较强的表聚效应，表明土壤有机碳主要储存在土壤表层。因此, 应该加强地表植被层的保护，减少人为活动的干扰，促进植物群落恢复，维持土壤碳库的稳定。土壤有机碳密度的变化规律与土壤有机碳质量分数基本一致，是植被因子和土壤理化性状共同作用的结果，在今后的研究中应该综合考虑。
Characteristics and influencing factors of soil carbon stocks in different vegetation restoration models in red soil erosion areas
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摘要:
目的 探讨江西红壤侵蚀区植被恢复过程中不同植被恢复模式的土壤碳储量特征，为揭示植被恢复对土壤碳汇的影响机制和江西红壤侵蚀区生态修复及碳库管理提供科学支撑。 方法 以经过27 a植被恢复与重建后的6种人工植被恢复模式(马尾松Pinus massoniana纯林、湿地松P. elliottii纯林、木荷Schima superba纯林、湿地松-木荷混交林、马尾松补植木荷林、湿地松补植木荷林)为研究对象，以未加人工干扰的自然恢复地为对照，比较不同植被恢复模式土壤有机碳质量分数、储量的变化特征，并分析其影响因素。 结果 ①相较于对照，在0~20 cm土层中，6种人工植被恢复模式土壤有机碳质量分数均有显著增加(P＜0.05)；在20~30 cm土层中，除了马尾松纯林和湿地松纯林外，其余4种人工植被恢复模式土壤有机碳质量分数均显著高于对照(P＜0.05)；在30~40 cm土层中，仅有木荷纯林和湿地松-木荷混交林的土壤有机碳质量分数显著高于对照(P＜0.05)。②研究区7种植被恢复模式的土壤有机碳质量分数均表现出较强的表聚效应，但不同植被恢复模式土层间差异不同，其中木荷纯林最大，0~10 cm土层土壤有机碳质量分数与30~40 cm土层相差33.26 g·kg−1，对照最小，仅相差4.90 g·kg−1。③土壤有机碳密度变化规律与质量分数变化规律基本一致，均是植被因子与土壤理化性状共同作用的结果。植被因子中凋落物氮质量分数与土壤有机碳密度的相关系数最大(r=0.322，P＜0.01)，土壤理化性状中土壤有机碳质量分数与土壤有机碳密度的相关系数最大(r=0.932，P＜0.01)。④土壤有机碳储量从高到低依次表现为木荷纯林、湿地松-木荷混交林、马尾松补植木荷林、湿地松补植木荷林、湿地松纯林、马尾松纯林，与对照相比，分别增加了50.12、42.73、38.20、33.03、26.93和20.85 Mg·hm−2，最大提升了2.46倍，最小提升了1.02倍。 结论 人工植被恢复与重建在红壤侵蚀区效果显著，在研究区今后的建设中可继续推广，以促进植物群落恢复，提高和维持土壤碳库的稳定。图4表2参40 Abstract:Objective This study is to explore the soil carbon stock characteristics of different vegetation restoration models in the process of vegetation restoration in red soil erosion areas of Jiangxi Province, so as to provide scientific support for revealing the impact mechanism of vegetation restoration on soil carbon sinks and ecological restoration and carbon pool management in red soil erosion areas of Jiangxi Province. Method The research objects included 6 types of forest stands after 27 years of vegetation restoration and reconstruction: Pinus massoniana pure forest (PM), P. elliottii pure forest (PE), Schima superba pure forest (SS), P. elliottii and S. superba mixed forest (MES), replanting S. superba with P. massoniana (RMS), and replanting S. superba with P. elliottii (RES). Natural restoration sites without artificial disturbance (ck) were used as controls to compare the changes in soil organic carbon (SOC) content and storage under different vegetation restoration models, and analyze their influencing factors. Result (1) Compared with ck, SOC mass fraction increased significantly (P＜0.05) in the 0−20 cm soil layer in all 6 artificial vegetation restoration models. In the 20−30 cm soil layer, except for PM and PE, SOC mass fraction of the other 4 vegetation restoration models was significantly higher than that of ck (P＜0.05). In the 30−40 cm soil layer, only SS and MES had significantly higher SOC mass fractions than ck (P＜0.05). (2) SOC mass fractions of the 7 vegetation restoration models in the study area showed a strong surface aggregation effect, but the differences between soil layers of different vegetation restoration models were different, among which SS had the largest SOC mass fraction, with a difference of 33.26 g·kg−1 between 0−10 cm soil layer and 30−40 cm layer, and ck had the smallest difference, with only 4.90 g·kg−1. (3) The change rules of SOC density and SOC content were basically the same, both of which were the result of the joint action of vegetation factors and soil physicochemical properties. The correlation coefficient between litter nitrogen mass fraction (r=0.322, P＜0.01) and SOC density was the largest among vegetation factors, and the correlation coefficient between SOC mass fractions (r=0.932, P＜0.01) and SOC density was the largest among soil physicochemical traits. (4) From high to low, SOC storage increased by 50.12 Mg·hm−2 in SS, 42.73 Mg·hm−2 in MES, 38.20 Mg·hm−2 in RMS, 33.03 Mg·hm−2 in RES, 26.93 Mg·hm−2 in PE, and 20.85 Mg·hm−2 in PM, respectively, compared with ck, with a maximum enhancement of 2.46 times and a minimum enhancement of 1.02 times. Conclusion Artificial vegetation restoration and reconstruction have significant effects in red soil erosion areas and can be further promoted in future construction in the research area to promote plant community restoration and enhance and maintain the stability of soil carbon pool. [Ch, 4 fig. 2 tab. 40 ref.] -
甘油脂的从头生物合成途径(de novo glycerolipid biosynthesis)是细胞中最基本的代谢过程。3-磷酸甘油酰基转移酶(glycerol-3-phosphate acyltransferase, GPAT)催化甘油脂从头合成的初始步骤，生成的溶血磷脂酸(LPA)在LPA酰基转移酶(lysophosphatidic acid acyltransferase, LPAAT)的作用下转化为磷脂酸(PA)[1−6]。PA是调节真核生物中多种细胞过程的重要信号分子，也是极性甘油磷脂与中性三酰甘油(TAG)的生物合成前体。在磷酸酶的催化下PA转化为二酰甘油，后者可经脂酰辅酶A-依赖型二酰甘油酰基转移酶(acyl-CoA: diacylglycerol acyltransferease, DGAT)和(或)磷脂-依赖型二酰甘油酰基转移酶(phospholipid-dependent diacylglycerol acyltransferase, PDAT)作用生成TAG[7−10]。TAG合成能力是油料作物的关键性状，同时与人类肥胖症等疾病密切相关。因而，运用遗传或化学遗传方法操控TAG生物合成，提高油料作物含油量，降低与肥胖症相关联的人类疾病，具有重要实践意义[11−16]。
脂酰基转移酶在TAG生物合成过程中发挥重要作用，但目前对于这类酶的结构与功能的内在关系知之甚少，参与第1步酰化反应的GPAT亦不例外，仅有少量关于其结构与功能关系的报道[17−18]。已知GPAT、LPAAT、磷酸二羟丙酮酰基转移酶(dihydroxyacetone-phosphate acyltransferase, DHAPAT)等脂酰基转移酶均含4个高度保守的结构域，结构域Ⅰ的组氨酸(H)、天冬氨酸(D)，结构域Ⅲ的甘氨酸(G)和结构域Ⅳ的脯氨酸(P)是GPAT催化所必需的；而结构域Ⅱ的精氨酸(R)与结构域Ⅲ的谷氨酸(E)在结合底物3-磷酸甘油中起作用[18−20]。迄今为止，对于保守结构域外的其他氨基酸残基在酰基转移酶活性调控中的作用，及与保守结构域中的氨基酸残基存在的潜在互作关系的了解非常有限。
GPAT9位于植物细胞的内质网，参与膜脂和TAG的生物合成，其功能缺失会导致种子发育异常、油脂合成减弱[20−22]。本实验室前期的酵母遗传互补研究也显示：油菜Brassica napus BnGPAT9的异源表达能够恢复酵母条件致死型双敲除突变体(ZAFU1)因GPAT酶活性缺失引起的生长缺陷。然而，拟南芥Arabidopsis thaliana AtGPAT9却不具备这种互补能力[23−25]，尽管AtGPAT9与BnGPAT9的进化关系密切[26−27]，两者氨基酸序列的一致性高达 94.1%，且两者在4个酰基转移酶保守结构域的氨基酸残基完全一致。因此，可以假设保守结构域之外的某些氨基酸残基对GPAT9的活性起着重要的调节作用。本研究充分利用AtGPAT9和BnGPAT9在酵母异源系统中表现出的不同性质，并结合定点突变与酵母遗传互补技术，剖析单个和多个氨基酸残基改变对GPAT9酶活性的影响，鉴定新的关键活性位点，以深化对脂酰基转移酶结构与功能内在关系的认知，为酰基转移酶的分子改造与结构优化、真核生物中TAG合成途径的改良以及全新TAG从头合成途径的构建提供理论基础。
1. 材料与方法
1.1 序列分析
通过Vector NTI 11.5.4软件对AtGPAT9 (Genebank 登录号: ACT32031.1)和BnGPAT9 (Genebank 登录号: ANV28166.1)的氨基酸序列进行比对。使用TMHMM 2.0和Protter进行跨膜结构域和蛋白质拓扑异构模型预测[28-29]。由I-TASSER预测三维结构[30]。
1.2 基因定点突变
将AtGPAT9和BnGPAT9编码序列分别通过BamH I/XhoⅠ和BamH I/EcoR I双酶切位点克隆至pMD19-T载体，得到新的质粒pMD19-T-AtGPAT9和pMD19-T-BnGPAT9；以之为模板，对AtGPAT9和BnGPAT9进行定点突变。具体方法如下：利用包含突变位点的引物(表1)，PCR扩增整个质粒；质粒DNA经Dpn I消化与纯化后，转入大肠埃希菌Escherichia coli并进行测序分析；序列正确的质粒经BamH I和Xho Ⅰ双酶切后，连接到经相同酶切处理的pYES2-yADH1-Kan V2酵母表达载体，并对产生的重组质粒再次进行DNA测序分析，以确保突变位点的正确性。需要说明的是，选择pMD19-T质粒作为定点突变过程中的中间质粒，而非直接在pYES2-yADH1-Kan V2质粒上进行GPAT9基因的定点突变，是因为后者DNA长度(6 998 bp)是前者(2 660 bp)的2.6倍，采取这样的策略可以降低因PCR扩增时间延长导致潜在的错误碱基出现频率。
表 1 拟南芥AtGPAT9和油菜BnGPAT9定点突变所用的引物序列Table 1 Sequences of the primers used for site-directed mutagenesis of A. thaliana AtGPAT9 and B. napus BnGPAT9突变位点 引物序列 (5′→3′) 突变位点 引物序列 (5′→3′) BnGPAT9(R40S) AGCCTCGTGGCAAGCTCAGCCTGCGTGATTTGCTAGACAT AtGPAT9(N119H) TTTCATTGTTTATCCCTGTACACGCGTTGCTGAAAGGTCAAG BnGPAT9(W85Y) TCTACTTGTTTCCTTTATACTGCTGTGGTGTTGTTGTTAG AtGPAT9(D230N) TTGTAGCAAAAAAGTTAAGGAACCATGTCCAAGGAGCTGAC BnGPAT9(C87F) TTGTTTCCTTTATGGTGCTTTGGTGTTGTTGTTAGATACT AtGPAT9(A235T) TAAGGGACCATGTCCAAGGAACTGACAGTAATCCTCTTCTC BnGPAT9(I102F) TTCTCTTTCCCTTGAGGTGCTTCACTTTAGCTTTTGGATG AtGPAT9(S237N) ACCATGTCCAAGGAGCTGACAATAATCCTCTTCTCATATTTCC BnGPAT9(F109I) CATCACTTTAGCTTTTGGATGGATTATTTTCCTTTCAACG AtGPAT9(D230N/A235T) TTGTAGCAAAAAAGTTAAGGAACCATGTCCAAGGAACTGAC BnGPAT9(T114L) TGGTTTATTTTCCTTTCATTGTTTATCCCTGTACACTCTC AtGPAT9(A235T/ S237N) TAAGGGACCATGTCCAAGGAACTGACAATAATCCTCTTCTCATATTTC BnGPAT9(H119N) TTCAACGTTTATCCCTGTAAATTCTCTCCTGAAAGGTCAG AtGPAT9(D230N/A235T/
S237N)TTGTAGCAAAAAAGTTAAGGAACCATGTCCAAGGAACTGAC BnGPAT9(N230D) GTAGCAAGAAAGTTAAGGGACCATGTTCAAGGAACTGACA AtGPAT9(G332A) CATAAGGCCCGGTGAAACAGCAATTGAATTTGCAGAGAGGG BnGPAT9(T235A) TAAGGAACCATGTTCAAGGAGCTGACAATAACCCTCTTCT AtGPAT9(L335H) GGTCAGAGACATGATATCTCATCGGGCGGGTCTCAAAAAGG BnGPAT9(N237S) CATGTTCAAGGAACTGACAGTAACCCTCTTCTTATATTTC AtGPAT9(P355S) TGAAGTATTCGAGACCAAGCTCCAAGCATAGTGAACGCAAG BnGPAT9(A322G) AAGGCCTGGTGAAACAGGAATTGAGTTTGCAGAGAGGGTC AtGPAT9(T10A) GTACGGCAGGGAGGCTCGTGGCTTCAAAATCCGAGCTTGAC AtGPAT9(S40R) ATGAACCTCGCGGCAAGCTCCGCCTGCGTGATTTGCTAGA AtGPAT9(S11A) CGGCAGGGAGGCTCGTGACTGCAAAATCCGAGCTTGACCTC AtGPAT9(Y85W) ATTTACTTATTCCCACTATGGTGCTTTGGGGTTGTTGTTAG AtGPAT9(S13A) GGAGGCTCGTGACTTCAAAAGCCGAGCTTGACCTCGATCAC AtGPAT9(F87C) CTTATTCCCACTATACTGCTGTGGGGTTGTTGTTAGATACT AtGPAT9(S28A) AACATCGAAGATTACCTTCCTGCTGGTTCTTCCATCAATGAAC AtGPAT9(F102I) TCCTCTTTCCCTTGAGGTGCATCACTTTAGCTTTTGGGTGG AtGPAT9(S30A) GAAGATTACCTTCCTTCTGGTGCTTCCATCAATGAACCTCGCG AtGPAT9(I109F) TCACTTTAGCTTTTGGGTGGTTTATTTTCCTTTCATTGTTT AtGPAT9(S31A) GATTACCTTCCTTCTGGTTCTGCCATCAATGAACCTCGCGGCA AtGPAT9(L114T) GGGTGGATTATTTTCCTTTCAACGTTTATCCCTGTAAATGCG 1.3 酵母遗传转化
条件致死型酵母双突变体ZAFU1[BY4742, gat1Δgat2Δ+(pGAL1::AtGPAT1 Leu2)] [25, 31]，可在半乳糖的培养基上生长，但在葡萄糖培养基上丧失了生长能力。基于菌株ZAFU1建立的酵母遗传互补法对GPAT的鉴定具有很强的专一性[25, 31]，本研究运用它鉴定不同氨基酸残基突变对GPAT9活性的影响。
使用基于醋酸锂的标准方法将重组酵母表达质粒导入菌株ZAFU1感受态细胞[25, 31]，复苏4 h，分别涂布转化液于以葡萄糖(Glu)或半乳糖(Gal)为碳源，不含尿嘧啶、组氨酸和亮氨酸的培养基(SC-Ura-His-Leu)上， 30 ℃下培养3~5 d。为了准确地比较不同氨基酸残基突变对酶活性的影响，挑取在半乳糖培养基上生长的不同单菌落酵母进行浓度梯度稀释培养实验：从半乳糖培养基上随机挑选生长良好的单菌落至SC-Ura-His-Leu+Gal液体培养基，30 ℃振荡培养1~2 d至光密度[D(600)]为2.000 0~3.000 0，稀释菌液浓度至D(600)为1.000 0、0.200 0、0.040 0、0.008 0和0.001 6，取5 µL接种于SC-Ura-His-Leu+Glu和SC-Ura-His-Leu+Gal固体培养基上，30 ℃培养3~5 d。
1.4 酵母生长曲线测定及油脂分析
30 ℃下，将表达不同GPAT9突变基因的ZAFU1细胞在SC-Ura-His-Leu+Gal液体培养基中培养至D(600)为3.000 0~4.000 0，稀释接种于SC-Ura-His-Leu+Glu液体培养基至D(600)为0.100 0，振荡培养并定时记录D(600)。
将平台生长期收获的细胞在真空冷冻干燥机中干燥，提取酵母总脂质[32]，点样于硅胶板，通过薄层色谱法分离总脂质。喷洒质量浓度为0.05%樱草黄显色剂，在紫外灯下观察板上的脂质，从硅胶中提取TAG，并通过气相色谱法定量分析TAG含量[32]。
2. 结果与分析
2.1 AtGPAT9和BnGPAT9的结构差异
早期研究发现：在酵母中异源表达时，拟南芥AtGPAT9与油菜BnGPAT9表现出不同的活性[23-24]。为了找出潜在的关键活性调控位点，对AtGPAT9与BnGPAT9进行了序列比对。AtGPAT9和BnGPAT9均由376个氨基酸组成，两者序列一致性高达94.1%，4个保守的酰基转移酶结构域和C端内质网定位必需的疏水五肽结构域(−ILARL−)的氨基酸残基完全一致[18, 20]，且在N端都含多个潜在的磷酸化位点，主要由丝氨酸和苏氨酸组成(图1)。它们之间共有22个不同的氨基酸残基，其中11个具有相似的性质。基于TMHMM和Protter的跨膜结构域预测显示：跨膜区结构具有较高相似性，但3个跨膜区域中有7个不同的氨基酸残基(图1)。另外，基于I-TASSER的三维结构预测发现：AtGPAT9和BnGPAT9在40、109、114、119、230、235、237和322位氨基酸残基的不同，可能会引起两者三维空间结构的差异，因此它们成为本研究重点剖析的位点(图2)。
图 1 拟南芥AtGPAT9和油菜BnGPAT9氨基酸序列比对Figure 1 Alignment of the amino acid sequences of A. thaliana AtGPAT9 and B. napus BnGPAT9
图 2 AtGPAT9和BnGPAT9三维结构预测Figure 2 Prediction of three-dimensional structures of AtGPAT9 and BnGPAT92.2 AtGPAT9和BnGPAT9的定点突变
为了明确哪些氨基酸位点对GPAT酶活性起着重要调控作用，据上述AtGPAT9和BnGPAT9中存在的氨基酸残基差异，运用定点突变技术对两者相应位置的氨基酸位点进行相互替代，即将AtGPAT9中的单个或多个氨基酸残基同时替换成与BnGPAT9中相应位置完全相同的氨基酸残基，反之亦然。本研究共构建了58种不同的GPAT9突变基因(表2)。
表 2 AtGPAT9和BnGPAT9中单和多位点氨基酸残基的定点突变Table 2 Site-directed mutagenesis of amino acid residues at single and multiple sites in AtGPAT9 and BnGPAT9单个氨基酸残基突变 AtGPAT9氨基酸残基突变组合 BnGPAT9 AtGPAT9 BnR40S** AtT10A AtF102I/S237N AtY85W/D230N BnW85Y AtS11A AtI109F/S237N AtY85W/A235T BnC87F** AtS13A AtD230N/A235T AtY85W/S237N** BnI102F** AtS28A AtD230N/S237N AtY85W/D230N/A235T BnF109I** AtS30A AtA235T/S237N AtY85W/D230N/S237N BnT114L*** AtS31A AtD230N/A235T/S237N AtY85W/A235T/S237N BnH119N AtS40R AtS237N/G322A AtY85W/D230N/A235T/S237N BnN230D*** AtY85W AtY85W/N119H*** AtS40R/Y85W/S237N** BnT235A** AtF87C AtY85W/L114T/N119H* AtN119H/D230N BnN237S* AtF102I AtY85W/N119H/S237N*** AtN119H/A235T BnA322G* AtI109F AtY85W/L114T/N119H/S237N*** AtN119H/S237N*** AtL114T AtY85W/N119H/D230N** AtN119H/D230N/A235T AtN119H* AtY85W/N119H/A235T** AtN119H/D230N/S237N** AtD230N AtN119H/A235T/S237N*** AtA235T AtN119H/D230N/A235T/S237N AtS237N AtG322A AtL335H AtP355S 说明：每种突变以物种的首字母缩写和突变前后的氨基酸残基缩写表示，如AtS40R/S237N代表AtGPAT9的40位由丝氨酸(S)变为精氨酸(R)，237位由丝氨酸(S)变为天冬酰胺(N)。*代表基因的异源表达能够恢复酵母双突变体ZAFU1的生长缺陷；*数目代表恢复能力的大小，数目越多，能力越强。 2.3 单个氨基酸残基突变对GPAT9活性的影响
将不同GPAT9突变基因克隆至带有葡萄糖诱导启动子(ADH1)的质粒中，并以空载体与含野生型AtGPAT9的质粒为阴性对照，以含野生型BnGPAT9的质粒为阳性对照，将这些重组质粒导入到ZAFU1菌株中，测定不同GPAT9突变基因恢复ZAFU1在葡萄糖培养基上的生长缺陷能力。根据转化酵母细胞的生长速率，可以比较直观地评估不同突变位点对GPAT9酶活性的影响。结果显示：当ZAFU1突变体在葡萄糖培养基上培养时，W85Y或H119N的单位点替换导致BnGPAT9丧失对突变体生长缺陷的恢复能力(图3A)，说明W85和H119是BnGPAT9正常功能所必需的。另外，与野生型BnGPAT9相比，含N237S或A322G突变位点的BnGPAT9对ZAFU1菌株生长的促进作用下降(图3A)，表明这2个位点亦参与BnGPAT9活性的调节。相反，其他5个单位点替换(R40S、C87F、I102F、F109I、T235A)对BnGPAT9的活性不产生明显影响(图3A)。特别是N230D和T114L单位点替换增强了BnGPAT9活性，这种上调作用对于BnT114L而言尤为突出。如图4所示：与野生型BnGPAT9相比，含T114L突变位点的BnGPAT9在酵母突变体中的表达能促使细胞生长速率大幅度提高，表现为经2 d培养，表达BnGPAT9 (T114L)的菌落在葡萄糖培养基上生长的数量为野生型BnGPAT9的4倍，且每个单菌落表面积更大。
图 3 不同单位点突变对AtGPAT9和BnGPAT9酶活性的影响Figure 3 Effects of different single mutations on AtGPAT9 and BnGPAT9 activities
图 4 亮氨酸替换114位的苏氨酸(T114L)对BnGPAT9活性的影响Figure 4 Effects of the substitution of threonine for leucine at residue 114 (T114L) on BnGPAT9 activity类似地，对19个不同的AtGPAT9突变基因进行了酵母遗传互补鉴定，其中的6个编码蛋白分别在N端的潜在磷酸化位点发生T10A、S11A、S13A、S28A、S30A和S31A 替换，另外13个分别发生了S40R、Y85W、F87C、F102I、I109F、L114T、N119H、D230N、A235T、S237N、G322A、L335H和P355S替换。结果显示：N端6个潜在磷酸化位点分别替换成中性氨基酸残基并不能改善AtGPAT9活性(图3B)。除了N119H，其他的单位点突变亦对AtGPAT9在酵母异源系统中的活性不产生可见影响(表2)。在酵母菌浓度梯度稀释培养实验中，N119H替换能使AtGPAT9恢复ZAFU1突变体在葡萄糖上的生长缺陷，但这种作用相对较弱(表2，图5D)。
图 5 多位点突变对AtGPAT9酶活性的影响Figure 5 Effects of mutations at multiple sites on AtGPAT9 activity2.4 多个氨基酸残基突变对GPAT9活性的交互影响
基于相邻与非相邻氨基酸残基之间均可能对酶活性产生某种特定的互作效应的假设，根据AtGPAT9和BnGPAT9之间存在的氨基酸差异，进一步构建了28个含有2~4个氨基酸残基替换的AtGPAT9突变酶。与W85、H119和N237位点对BnGPAT9活性产生重要调节作用一致，同步替换AtGPAT9上2或3个相应位点的氨基酸残基(Y85W、N119H、S237N)均能大幅提高AtGPAT9酶活性，表现为携带Y85W/N119H、Y85W/S237N、N119H/S237N、Y85W/N119H/S237N突变的AtGPAT9均能互补菌株ZAFU1的生长缺陷(图5A)；不过，单位点突变对AtGPAT9活性的影响十分有限(表2)。进一步调查发现：携带Y85W/N119H或Y85W/N119H/S237N突变组合的AtGPAT9比野生型BnGPAT9更能促进菌株ZAFU1的生长，且与携带T114L突变的BnGPAT9具有相近的作用效果(图3A，图5A)。
为了更好地剖析114位氨基酸性质对GAPT9活性的调节作用以及与其他氨基酸相互作用产生的效应，将双位点突变酶AtGPAT9 (Y85W/N119H)和三位点突变酶AtGPAT9 (Y85W/N119H/S237N)的114位亮氨酸(L114)替换为BnGPAT9相应位置存在的苏氨酸(T)。结果显示：生成的三位点突变酶AtGPAT9 (Y85W/L114T/N119H)的活性明显弱于AtGPAT9 (Y85W/N119H)，但四位点突变酶AtGPAT9(Y85W/L114T/N119H/S237N)仍与AtGPAT9 (Y85W/N119H/S237N)的活性相当(图5B)。对这种现象的可能解释是，当2个潜在磷酸化位点即T114和S237同时出现于AtGPAT9 (Y85W/L114T/N119H) (其中含S237)或BnGPAT9 (N237S)(其中含T114)时，GPAT9的磷酸化程度可能加剧，从而抑制酶的活性。因此，推测植物GPAT9活性可能受磷酸化和非磷酸化机制调节，野生型GPAT9中存在的2个潜在磷酸化位点T114和S237可能对酰基转移酶活性产生负面效应。
进一步研究发现：230位氨基酸残基能与85、119位氨基酸残基产生互作效应而影响GPAT活性。虽然D230N本身或与A235T、S237N组合突变未能对AtGPAT9酶活性产生明显影响(表2)，但当与N119H、Y85W/N119H或Y85W/S237N结合时， D230N突变能对AtGPAT9活性产生抑制作用。这是因为，与表达含N119H、Y85W/N119H或Y85W/S237N突变位点的酶的菌株相比，表达AtGPAT9 (N119H/D230N)、AtGPAT9 (Y85W/N119H/D230N)或AtGPAT9 (Y85W/D230N/S237N)的菌株ZAFU1在葡萄糖培养基上呈现生长速率明显减弱或不能生长的现象，暗示着D230N的替换不利于AtGPAT9活性(表2，图5B~D)。这一推测得到下述结果的支持，即N230D替换能提高BnGPAT9活性(图3A)。但是AtGPAT9(N119H/D230N/S237N)与AtGPAT9 (N119H/S237N)的活性相当，这说明D230N的负效应依赖于其他氨基酸的互作关系(表2，图5D)。
另外，N119H/D230N/S237N和N119H/A235T/S237N三突变组合均能提高AtGPAT9活性，使之具有拯救ZAFU1生长缺陷的能力，但在前者和后者中分别添加A235T和D230N得到的N119H/D230N/A235T/S237N四突变组合，能使相应蛋白丧失GPAT活性，如野生型AtGPAT9一样，无法恢复ZAFU1的生长缺陷(表2，图5D)。此外，无论是S237N和G322A单或双替换，均不能增强AtGPAT9在酵母中表达时的活性(表2)，这与N237S或A322G的替换导致BnGPAT9活性下降现象不一致。由此可见，尽管在237位保留非磷酸化氨基酸(天冬酰胺，N)对BnGPAT9活性有利，但其效应取决于其他位置的氨基酸性质。
综上所述，GPAT9的酶活性受85、114、119、230、237和322位氨基酸残基性质的影响，它们之间存在互作效应；当这些位置的氨基酸残基分别为色氨酸(W)、亮氨酸(L)、组氨酸(H)、天冬氨酸(D)、天冬酰胺(N)和丙氨酸(A)时，酰基转移酶的活性较高。上述多位点突变增强AtGPT9酶活性的事实说明：运用分子设计能有效地改造和优化酰基转移酶的结构，并使之产生新的特性，这对将来人为操控甘油脂的从头合成十分有益。
2.5 异源表达突变酶对酵母油脂合成的影响
为进一步探究氨基酸位点突变对GPAT9功能的影响，选取了3个活性程度不同的AtGPAT9突变酶，分别含N119H、Y85W/N119H 和Y85W/N119H/S237N突变，使其进行异源表达，测定其表达对酵母细胞中TAG合成的影响；阳性对照为野生型BnGPAT9。当相应酵母细胞的生长进入平台生长期时，提取总脂质，经薄层层析分离后，采用气相色谱法测定TAG含量。
需要指出的是，因不同突变酶活性的差异，相应酵母菌到达平台生长期所需的培养时间不一，且平台生长期时的细胞密度也不完全相同。譬如，表达BnGPAT9、AtGPAT9 (Y85W/N119H)和AtGPAT9 (Y85W/N119H/S237N)的酵母细胞在平台生长期时的细胞密度，以D(600)表示，分别为3.72、4.40、5.32 (图6)。总体而言，酶活性愈大，细胞生长越快、密度越高。
图 6 含不同突变位点的AtGPAT9表达对不同生长期酵母菌株ZAFU1的细胞密度影响Figure 6 Effects of expression of AtGPAT9 bearing different mutation sites on cell density of the yeast strain ZAFU1 in different periods of growth脂质分析显示：AtGPAT9 (Y85W/N119H/S237N)的表达使突变体酵母ZAFU1细胞中的TAG含量达0.51%，而BnGPAT9和AtGPAT9 (Y85W/N119H)的表达则分别产生0.35%和0.39%的含油量，前者比后两者分别增加了45.7%和 30.8% (图7)。与AtGPAT9 (N119H)具有相对较低的活性一致，表达此酶的酵母细胞，其TAG含量仅为0.22%，显著低于表达BnGPAT9的酵母细胞(0.35%)。以上结果表明：酵母细胞中TAG的合成能力受GPAT活性的调节，而GPAT活性大小与特定位置的氨基酸性质密切相关，因此通过分子设计优化GPAT9的氨基酸组成将有助于修饰细胞中TAG的合成能力。
图 7 含不同突变位点的AtGPAT9表达对平台生长期酵母菌株ZAFU1的TAG含量影响Figure 7 Effects of expression of AtGPAT9 bearing different mutation sites on TAG content of the yeast strain ZAFU1 at the stationary phase3. 讨论
提高油料作物油脂的合成对于保障食用油的供需平衡至关重要；相反，人类细胞中油脂合成能力的增强并非对健康有利，因为这会诱发肥胖症和心血管疾病等。目前人们试图运用遗传或化学遗传方法操控TAG的生物合成[11-16]，但仍存在诸多因素影响，如人们对TAG合成途径中酶的结构与功能的内在关系知之甚少，这阻碍了酶结构的优化，并限制了基于翻译后修饰机制调控酶活性的技术开发。本研究充分利用GPAT专一的酵母遗传互补法[25, 31]，鉴定控制植物GPAT9酶活性的关键氨基酸位点以及不同位点之间存在的互作效应，以深化对酰基转移酶结构与功能内在关系的认知，为将来运用合成生物学等手段有效操控真核生物中TAG的合成提供基础。
植物GPAT9与哺乳动物GPAT3结构相似，两者均参与极性膜脂和中性三酰甘油的生物合成[20-22]。尽管AtGPAT9和BnGPAT9序列相似性大于90%，它们在酵母异源表达时呈现的活性却相去甚远[23-24]，这一特性有助于有效寻找调控酶活性的候选位点。在此基础上，本研究首次明确了酰基转移酶保守结构域外的6个氨基酸位点对植物GPAT酶活性的重要调节作用。
3.1 W85和H119对GPAT9膜结合性质的影响
AtGPAT9的N端和C端均暴露于细胞质，意味着该蛋白应有偶数个跨膜结构域[20]，然而这与生物信息学预测结果不一致，即AtGPAT9含3个潜在的跨膜结构域。对于这一现象的可能解释是，位于N端的几个脯氨酸残基可能会形成一个铰链状结构，使得疏水结构域Ⅰ不能跨膜，而是附着在内质网的表面[20]。基于85和119位氨基酸残基分别位于预测的第Ⅰ和Ⅱ个疏水结构域这一特点推测，将85位的疏水色氨酸替换成亲水的酪氨酸(Y)或将119位带正电荷的组氨酸替换成中性的天冬酰胺，可能会改变GPAT9在膜中的组装方式[33]，这可能是构成AtGPAT9的酶活性低于BnGPAT9的原因之一。
3.2 磷酸化机制调节对GPAT9活性的影响
本研究结果表明：尽管AtGPAT9的N端的6个磷酸化位点单独突变(T10A、S11A、S13A、S28A、S30A和 S31A)不能增强AtGPAT9在酵母异源表达时的活性，但T114L替换能增强BnGPAT9酶活性，而N237S替换则降低其活性。当114和237位氨基酸残基为非磷酸化氨基酸，即亮氨酸和天冬酰胺，而不是潜在的磷酸化位点苏氨酸(T)和丝氨酸(S)时，AtGPAT9和BnGPAT9突变酶保持较高活性。因此，推测GPAT9的活性受磷酸化机制调节，在114和237位点的磷酸化程度升高不利于维持酰基转移酶的活性。这种假设可以在某种程度上得到过去研究的支持。蛋白质磷酸化与非磷酸化修饰是酶活性的一种重要调节方式，已有研究报道哺乳动物线粒体GPAT (mtGPAT1)通过其C端S632和S639残基的磷酸化修饰调节其活性，酵母GPAT (Gat1p和Gat2p)的C端氨基酸残基发生磷酸化后也能使酶活性下调[34-35]。
3.3 多个氨基酸位点的互作效应对酰基转移酶活性的影响
当多个氨基酸残基同时突变时，它们之间的物理相互作用会导致蛋白质分子内的上位效应[36]。某些氨基酸残基突变组合可以产生协同作用，即产生正向上位效应，如Y85W、N119H和S237N任意突变组合均能增强AtGPAT9活性。相反，其他突变组合可能形成拮抗作用，导致负向上位效应，下调酶活性或彻底损伤蛋白质功能，正如AtGPAT9 (N119H/D230N/A235T/S237N)突变酶中4个氨基酸残基相互间的某种拮抗作用导致该突变酶在酵母ZAFU1中无法发挥功能。230、235和237位氨基酸残基位置相近，且位于酰基转移酶保守结构域Ⅱ中的精氨酸(R215)和Ⅲ中的谷氨酸(E245)之间；鉴于R215和E245这2个氨基酸残基对GPAT的底物结合至关重要[18]，推测230、235和237位氨基酸残基与其他位点之间存在的复杂互作效应对酶活性的影响可能与其干扰3-磷酸甘油底物结合区域的三维结构有关[37]。
尽管N237S或A322G单位点突变均能降低BnGPAT9的活性，但无论是S237N和G322A单或双替换均不能增强AtGPAT9的活性，这从一个侧面说明237和322位氨基酸的作用均极大地受到其他氨基酸的理化性质影响。但需要指出的是，两者的作用方式可能不一。如前所述，237位氨基酸的磷酸化状态可能对酶活性产生某种调节作用，而322位的丙氨酸被甘氨酸取代可能会影响蛋白构象的稳定性，这是因为甘氨酸侧链小，仅有1个氢原子，这不利于α-螺旋结构的稳定。与此一致，三维空间结构预测显示：BnGPAT9中的A322与AtGPAT9中的G322相比，前者在空间上更靠近114、119、230、235、237位氨基酸残基(它们可能与酶活性中心形成有关)，这可能对GPAT9活性产生正面效应。鉴于237与322位氨基酸的重要作用，将来有必要进一步探究在这2个氨基酸位点的何种替换有利于增强酰基转移酶的活性。
4. 结论
本研究首次报道了6个位于酰基转移酶保守区域外的GPAT9酶活性调控位点及其复杂的互作效应，从而深化了对酰基转移酶结构与功能内在关系的认知，为酰基转移酶的分子改造与结构优化提供了理论基础。另外，构建的GPAT9变异基因可用于探索植物中TAG的生物合成机制，特别是磷酸化-非磷酸化调控机制对GPAT酶活性的调节作用。
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图 1 不同植被恢复模式间土壤有机碳质量分数特征
Figure 1 Characteristics of soil organic carbon contents among different vegetation restoration patterns
图 2 不同植被恢复模式间土壤有机碳质量分数垂直分布特征
Figure 2 Vertical distribution characteristics of soil organic carbon contents between different vegetation restoration patterns
图 3 不同植被恢复模式土壤有机碳密度分布特征
Figure 3 Distribution characteristics of soil organic carbon density in different vegetation restoration patterns
图 4 土壤有机碳密度与土壤理化性状、植被因子间的皮尔逊相关分析
Figure 4 Pearson correlation analysis between SOCD and soil physicochemical properties and vegetation factors
表 1 7种植被恢复模式的基本情况
Table 1. General characteristics of seven vegetation restoration patterns
植被恢复模式 面积/hm2 优势种 恢复年限/a 胸径/cm 树高/m 马尾松纯林(PM) 17.16 马尾松 27 11.40±0.75 7.39±0.26 湿地松纯林(PE) 17.74 湿地松 27 17.32±2.05 8.98±0.74 木荷纯林(SS) 11.61 木荷 27 11.63±0.32 9.02±0.76 湿地松-木荷混交林(MES) 5.46 湿地松、木荷 27 13.64±0.47 9.33±0.63 马尾松补植木荷林(RMS) 19.07 马尾松、木荷 27 14.08±0.36 8.39±0.33 湿地松补植木荷林(RES) 14.81 湿地松、木荷 27 14.18±0.44 7.91±0.15 自然恢复样地(ck) 狗牙根、金樱子、狗尾草 27 说明：狗牙根Cynodon dactylon；金樱子Rosa laevigata；狗尾草Setaria viridis。马尾松补植木荷林初植为马尾松，2010年补植木荷；湿地松补植木荷林初植为湿地松，2006年补植木荷。胸径和树高数值为平均值±标准差。 
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表 2 退化红壤区植被恢复土壤有机碳储量
Table 2. Soil organic carbon stocks in revegetated red soil areas with degradation
土层深度/cm 土壤有机碳储量/( Mg·hm−2) 马尾松纯林 湿地松纯林 木荷纯林 马尾松补植木荷林 湿地松补植木荷林 湿地松-木荷混交林 自然恢复样地 0~10 16.56 20.28 31.19 27.18 24.92 29.03 6.06 10~20 9.68 12.16 15.00 13.78 11.88 14.11 5.51 20~30 8.30 8.63 13.62 10.01 9.11 10.96 4.98 30~40 6.72 6.27 10.72 7.64 7.53 9.04 3.86 0~40 41.26 47.34 70.53 58.61 53.44 63.14 20.41
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