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由于经济快速发展和环境基础设施建设滞后，中国水体污染较为严重[1-2]。利用水生植物及其根系负载生物膜的吸收、吸附和降解作用，并通过收获植物移除水中污染物，是一种简单易行、成本低廉且极具景观效应的技术，在污染水体治理中得到了广泛应用[3-4]。然而，实践表明，该技术运维过程中需定期对水生植物进行修剪、收割，否则植物残体腐烂后，植物体内吸收的物质将重新释放进入水体，造成二次污染[5-6]。近年来，由于植物养护不到位，许多河道出现生态修复效果不稳定，水质反弹等现象。近几年生态环境状况公报表明，中国大部分水体主要污染物为氮磷营养物质，主要污染源为生活污水[7]。污染水体实为营养过剩的场所，在水域上种植生物量大、营养吸收能力强的经济作物，一方面降低水中氮磷等营养物质的浓度，另一方面也能产生可观的经济效益，刺激植物的养护工作，保障植物治理效果的长效稳定。根茎类淀粉在世界淀粉产量中占有重要的比例。由于淀粉植物资源丰富、价廉、生物可降解，各国一直十分重视淀粉植物资源的开发、利用和研究[8-9]。美人蕉Canna indica、黄菖蒲Iris pseudacorus和水芋Calla palustris为污染水体修复中常见的挺水植物，生物量大、具块茎。目前，关于此类植物块茎的资源化开发和利用鲜见报道。本研究以这3种挺水植物为研究对象，考察其对污染水体中氮、磷营养物质的净化能力，分析植物块茎淀粉产量，探讨块茎资源化利用的可行性和潜在风险，以期为块茎类水生植物的应用和资源化利用提供基础数据，也为污染水体治理提供一种新的思路。
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块茎类水生植物美人蕉、黄菖蒲和水芋均取自浙江温州河道，采用自来水清洗去除泥土后，自来水预培养2周待用。
霍格兰营养液：硫酸镁493 mg·L−1，铁盐2.5 mL，微量元素5 mL。其中铁盐：七水硫酸亚铁2.78 g，乙二胺四乙酸二钠3.73 g，溶于500 mL去离子水。微量元素：碘化钾0.830 mg，硼酸6.200 mg，硫酸锰22.300 mg，硫酸锌8.600 mg，钼酸钠0.250 mg，硫酸铜0.025 0 mg，氯化钴0.025 0 mg，溶于1 L去离子水。
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试验装置采用上部内径30.5 cm、下部内径25.5 cm、高32 cm、容积17 L的塑料桶。选择生长良好，高度基本一致的3种植物(高20 cm)，称取鲜质量后移栽于直径20 cm、厚5 cm的泡沫板上。采用磷酸二氢钾(KH2PO4)、氯化铵(NH4Cl)和质量分数为1% Hoagland营养液配制试验用水，体积为14 L，初始氨氮(NH4+-N)、总磷(TP)质量浓度分别为7.37~7.53和0.41~0.45 mg·L−1。每种植物3个重复，并设不种植物的空白对照。试验开始后，隔4 d添加少量蒸馏水至刻度线，补充蒸发水量。试验在温州大学简易温室进行，温度为21~31 ℃，周期为20 d。
隔4 d采集水样，当天测定氨氮(NH4+-N)、硝态氮(NO3−-N)、总氮(TN)和总磷(TP)质量分数。试验结束，取出植物，蒸馏水清洗后称鲜质量，将植株根、茎、叶、块茎分开，放入烘箱，105 ℃杀青0.5 h，75 ℃烘干至恒量，称取植物干质量，测定植物各部组织中磷、氮质量分数。
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选择生长良好，高度基本一致的3种植物(高20 cm)各3株，分别放入塑料桶(大小与1.2.1中的相同)，以污染水体中常见的重金属Cu2+、Zn2+、Cr3+、Pb2+为研究对象，与质量分数1% Hoagland营养液{上述配方中添加硝酸钙[Ca(NO3)2·4H2O] 945 mg·L−1，硝酸钾(KNO3) 506 mg·L−1，硝酸氨(NH4NO3) 80 mg·L−1，磷酸二氢钾(KH2PO4) 136 mg·L−1}配制重金属污染水体，体积为14 L，Cu2+、Zn2+、Cr3+、Pb2+初始质量浓度分别为2.01~2.08、2.56~2.87、0.22~0.26、0.24~0.26 mg·L−1。周期为20 d，每种植物设置3个重复，以不加重金属处理为对照。
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将块茎切块后放入搅碎机，搅至泥状，置于烧杯。加水搅拌混匀，用纱布过滤，加水洗涤3次。滤液于阴凉处静置24 h，倾去3/4左右上层液体，余下部分放入离心机，2 000 r·min−1离心10 min，倾去上层液体，沉淀物置于烘箱中，30 ℃烘干至恒量，冷却至室温，称量。
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水中总磷和氨氮质量浓度参照《水和废水监测分析方法》(第4版)[10]，总氮质量浓度采用TOC/TN分析仪测定，重金属质量浓度通过火焰原子吸收光谱仪测定。植物组织中氮质量分数通过浓硫酸(H2SO4)-混合催化剂法消解后，用全自动凯氏定氮仪测定；磷质量分数采用浓H2SO4-H2O2法消解后，通过钒钼黄比色法测定[11]。块茎中淀粉质量分数采用酒石酸铜滴定法分析，淀粉中重金属质量浓度采用电感耦合等离子体发射光谱仪ICP-OES测定。
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数据采用SPSS 17.0软件处理，数据比较采用单因素方差分析(Turkey HSD)，Origin 8.0绘图。
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从图1可见：3种植物对氮均具有良好的净化能力。试验期间，植物处理组氨氮和总氮去除率均显著高于对照(P＜0.05)，且前期差异更为显著。美人蕉和水芋组氨氮去除率以12 d为节点，分为快速增长和趋于平缓2个阶段。处理12 d，美人蕉和水芋组氨氮去除率分别达100%和95.9%。处理期间，黄菖蒲组氨氮去除率随时间增加而增大，未出现明显的节点。对照组氨氮去除率变化与美人蕉及水芋组相反，处理12 d内，氨氮去除率增加缓慢，后去除率增加显著。20 d时，植物处理氨氮质量浓度由7.37~7.53 mg·L−1降至0.01~0.07 mg·L−1，满足GB 3838−2002《地表水环境质量标准》之Ⅲ类水标准限值要求，去除率达99.1%~99.9%，对照组氨氮去除率为34.1%。
图 1 3种植物对水中氮去除效能
Figure 1. Nitrogen removal by three plant species
3种植物对总氮的去除率变化趋势基本一致，均可分为快速增加和缓慢增加2个阶段。试验结束时，植物处理组总氮降至0.61~0.91 mg·L−1，去除率达91.7%~94.5%。对照组总氮去除率随时间呈上升趋势，20 d时，总氮降至9.45 mg·L−1，去除率为16.5%。3种植物对氮的净化能力无显著差异。
研究表明：水中氮的去除途径为植物同化吸收、根系吸附、氨挥发及硝化反硝化[12]。当pH＜8.5时，氨挥发作用较小[13]。从图1可见：3种植物处理组氨氮去除率均大于总氮。分析认为可能存在微生物作用，一部分氨氮经微生物的作用转化为硝态氮。但3种植物根系表面生物膜量较少，水中硝态氮质量浓度较低(硝态氮质量浓度＜0.05 mg·L−1)，故氮的去除主要为植物的吸收作用，这与其他研究结果一致[14-15]。静止水体易滋生藻类。后期对照水面出现少量藻类，藻类的吸收作用可能为对照氨氮和总氮去除的主要原因。
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植物处理促进水中磷的去除。处理4 d，美人蕉、黄菖蒲和水芋处理组总磷去除率分别为36.9%、38.8%和49.6%，较对照高32.4%、34.3%和45.1%(图2)。与氮变化相似，植物处理总磷去除率也呈现2个阶段：快速增加和缓慢变化。试验结束时，植物处理总磷质量浓度降至0.025~0.031 mg·L−1，满足GB 3838−2002《地表水环境质量标准》之Ⅱ类水标准限值要求，去除率为90.2%~94.0%。3种植物总磷去除率从大到小依次为美人蕉、黄菖蒲、水芋。试验8 d后，对照处理总磷去除率快速升高，20 d时，总磷质量浓度降至0.14 mg·L−1，去除率为68.9%。对照组总磷去除率较高有2个原因，一是藻类吸收，二是水中部分磷酸根离子与Hoagland营养液中Mg2+、Fe2+、Mn2+、Zn2+等金属离子形成沉淀。
图 2 3种植物对水中总磷去除效能
Figure 2. Phosphorus removal by three plant species
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3种植物生长良好，没有出现叶片枯黄、腐烂等现象，植物生物量有不同程度的增加。20 d时，黄菖蒲、美人蕉和水芋平均生物量分别由136.0、138.1、140.0 g增至168.9、242.2、176.8 g，增幅分别为24.2%、75.3%和26.3%。可见，3种植物中，美人蕉的生物量增量最高，黄菖蒲和水芋则没有显著差异。吴建强等[16]和洪瑜等[17]采用浮床植物吸收水体氮磷时，也发现美人蕉的生物量增量远大于黄菖蒲。
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20 d时，植物组织中氮、磷质量分数如图3所示。黄菖蒲无法分离茎和块茎，故而无茎数据。从图3可见，不同植物，氮磷的组织分布差异显著(P＜0.05)，同一植物，氮和磷在组织中的分布也不相同。美人蕉组，根、茎、叶、块茎中氮和磷质量分数均无显著差异，各组织中氮、磷质量分数分别为14.58~20.19和3.04~3.54 mg·kg−1。黄菖蒲块茎中氮质量分数较高，为30.30 mg·kg−1，分别比根、叶高15.2%和30.6%；磷则根中较高，叶和块茎中无显著差异。水芋中氮主要在叶中积累，氮质量分数达39.4 mg·kg−1，高于其他组织62.1%~79.9%；茎、叶和块茎中磷质量分数无显著差异，但均显著(P＜0.05)高于根组织。对比3种植物块茎，黄菖蒲中氮质量分数显著(P＜0.05)高于其他2种植物；黄菖蒲与水芋的磷质量分数无显著差异，但均高于美人蕉。
图 3 3种植物组织中氮和磷质量分数分布
Figure 3. Contents of phosphorus and nitrogen in the tissues of three plant species
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黄菖蒲、美人蕉和水芋块茎中，提取淀粉量分别为61.3、14.1和64.0 g·kg−1。考虑到试验周期较短，块茎产量较低。在温州某河道内划定3个相邻的100 m2水域，分别种植黄菖蒲、美人蕉和水芋，8个月后收获植株，取块茎，得到3种植物的块茎产量分别为23.3、8.5和4.1 kg。因而，黄菖蒲、美人蕉和水芋块茎中可回收的淀粉量分别为14.3、1.2、2.6 kg·m−2。由此可见，种植黄菖蒲可得到相对较高的淀粉产量。
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3种植物对重金属具有良好的净化能力。20 d时，植物处理组Cu2+、Zn2+、Cr3+和Pb2+质量浓度分别降至0.13~0.43、0.09~0.15、0.04~0.07和0.05~0.06 mg·L−1(图4)，优于GB 3838−2002《地表水环境质量标准》之Ⅴ类水标准。3种植物对4种重金属的净化能力各异，黄菖蒲处理组4种重金属的去除率从大到小依次为Zn2+(96.8%)、Cr3+(83.8%)、Cu2+(79.1%)、Pb2+(77.5%)；美人蕉组依次为Zn2+(94.3%)、Cu2+(93.7%)、Pb2+(74.9%)、Cr3+(69.7%)；水芋组则依次为Zn2+(96.2%)、Cu2+(84.7%)、Pb2+(80.5%)、Cr3+(74.4%)。20 d时，黄菖蒲块茎淀粉中铜、锌、铬和铅平均质量分数分别为10.30、46.7、12.03和1.74 mg·kg−1，美人蕉块茎淀粉中4种重金属质量分数依次为12.68、44.67、8.15和1.32 mg·kg−1，水芋块茎淀粉中4种重金属质量分数则依次为19.28、66.91、9.63和3.97 mg·kg−1。这与水中重金属的去除率数据一致。由此可见，植物块茎中具有较高的重金属富集量。因此，污染水体中共存重金属时，不建议对植物块茎进行资源化利用。
图 4 3种植物处理组水中重金属质量浓度
Figure 4. Concentrations of heavy metals in the water of three plant treatments
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黄菖蒲、美人蕉、水芋3种块茎类挺水植物对水中氮磷具有良好的净化能力。氨氮、总磷初始质量浓度分别为7.37~7.53、0.41~0.45 mg·L−1时，试验20 d时，植物处理组氨氮、总氮、总磷质量浓度分别降至0~0.10、0.61~0.91、0.025~0.031 mg·L−1。满足GB 3838−2002《地表水环境质量标准》之Ⅲ类水标准限值要求。3种植物生长良好，未出现叶片枯黄、腐烂等现象。20 d时，黄菖蒲、美人蕉和水芋生物量(平均值)分别增加24.2%、7.3%和26.3%，块茎组织中氮质量分数分别为30.30、24.26，14.73 mg·kg−1，磷质量分数分别为4.14、3.04和4.74 mg·kg−1。黄菖蒲、美人蕉和水芋块茎中淀粉提取量分别为61.3、14.1和64.0 g·kg−1。河道100 m2植物种植区，8个月后，黄菖蒲、美人蕉和水芋块茎可回收淀粉量分别为14.3、1.2、2.6 kg·m−2。
3种植物对水中Cu2+、Zn2+、Cr3+、Pb2+具有良好的净化效果。黄菖蒲处理组4种重金属的去除率从大到小依次为Zn2+(96.8%)、Cr3+(83.8%、Cu2+(79.1%)、Pb2+(77.5%)；美人蕉组依次为Zn2+(94.3%)、Cu2+(93.7%)、Pb2+(74.9%)、Cr3+(69.7%)；水芋组则依次为Zn2+(96.2%)、Cu2+(84.7%)、Pb2+(80.5%)、Cr3+(74.4%)。黄菖蒲块茎淀粉中铜、锌、铬和铅质量分数分别为10.30、46.7、12.03和1.74 mg·kg−1，美人蕉依次为12.68、44.67、8.15和1.32 mg·kg−1，水芋则为19.28、66.91、9.63和3.97 mg·kg−1。污染水体中共存重金属时，不建议对植物块茎进行资源化利用。
Water purification efficiency and resource utilization of three tuberous emergent aquatic plants
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摘要:
目的 研究常见块茎类水生植物对污染水体营养物质的净化能力及植物块茎淀粉产量，探明淀粉资源化利用的可行性及潜在风险。 方法 通过水培试验，对比黄菖蒲Iris pseudacorus、美人蕉Canna indica、水芋Calla palustris对污染水体的净化性能，以不种植物处理作空白对照，每组设3个重复。考察水中氨氮、总氮和总磷的去除效率，分析氮磷在植物根、茎、叶和块茎中的积累及分配，测定植物块茎中淀粉质量分数及重金属铜(Cu)、锌(Zn)、铬(Cr)和铅(Pb)的富集量。 结果 水中氨氮和总磷初始质量浓度为7.37~7.53、0.41~0.45 mg·L−1时，试验20 d，植物处理组氨氮、总氮和总磷质量浓度分别降至0.01~0.07、0.61~0.91和0.025~0.031 mg·L−1，满足GB 3838−2002《地表水环境质量标准》之Ⅲ类水标准限值要求。黄菖蒲、美人蕉和水芋块茎淀粉提取量分别为61.3、14.1和64.0 g·kg−1。100 m2植物种植试验区，黄菖蒲、美人蕉和水芋区分别回收淀粉量14.3、1.2、2.6 kg。植物块茎可富集重金属，当水中Cu2+、Zn2+、Cr3+和Pb2+初始质量浓度为2.01~2.08、2.56~2.87、0.22~0.26、0.24~0.26 mg·L−1时，黄菖蒲块茎淀粉中铜、锌、铬和铅质量分数分别为10.30、46.7、12.03和1.74 mg·kg−1，美人蕉依次为12.68、44.67、8.15和1.32 mg·kg−1，水芋则为19.28、66.91、9.63和3.97 mg·kg−1。 结论 3种块茎类水生植物对氮磷等营养物质具有较强的净化能力，可回收较为可观的淀粉量，但若污染水体中共存重金属时，不建议对植物块茎进行资源化利用。图4参17 Abstract:Objective This study aims to investigate the purification capacity for nutrients in polluted water and the yield of tuber starch of three common tuberous aquatic plants, and estimate the feasibility and potential risk of starch resource utilization. Method Purification efficiency of Iris pseudacorus, Canna indica and Calla palustris for polluted water body was compared using hydroponic experiment, and three replicates were set for each group. No plant treatment was used as control group. Removal efficiency of ammonium nitrogen, total nitrogen and total phosphorus in water was investigated. The contents of nitrogen and phosphorus in plant roots, stems, leaves and tubers were analyzed. The content of starch and heavy metals including Cu, Zn, Cr and Pb in plant tubers were measured. Result When initial concentrations of ammonium nitrogen and total phosphorus were 7.37−7.53 and 0.41−0.45 mg·L−1, concentrations of ammonium nitrogen, total nitrogen and total phosphorus in plant treatment groups decreased to 0.01−0.07, 0.61−0.91, and 0.025−0.031 mg·L−1 respectively after 20 days of treatment, which met the Class Ⅲ standard for surface water environmental quality (GB 3838−2002). The starch extracted from tubers of I. pseudacorus, C. indica and C. palustris was 61.3, 14.1 and 64.0 g·kg−1, respectively. Starch yields of these plant species were 14.3, 1.2 and 2.6 kg·m−2 respectively in the 100 m2 trial plot. The tuber could accumulate heavy metals. As initial concentrations of Cu2+, Zn2+, Cr3+ and Pb2+ in water were 2.01−2.08, 2.56−2.87, 0.22−0.26, and 0.24−0.26 mg·L−1, the contents of Cu, Zn, Cr and Pb in tuber starch of I. pseudacorus were 10.30, 46.7, 12.03, and 1.74 mg·kg−1, respectively and those of C. indica were 12.68, 44.67, 8.15 and 1.32 mg·kg−1, respectively, while those of C. palustris were 19.28, 66.91, 9.63 and 3.97 mg·kg−1, respectively. Conclusion The three tuberous aquatic plants can effectively purify nutrients such as nitrogen and phosphorus, and recover a considerable amount of starch. However if heavy metals coexist in the polluted water, plant tubers are not recommended for resource utilization. [Ch, 4 fig. 17 ref.] -
Key words:
- tuberous plant /
- starch /
- heavy metal /
- nitrogen /
- phosphorus /
- polluted water /
- purification efficiency
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硝化和反硝化是土壤中氮素损失的潜在途径。随着人类活动的加剧，土壤中的硝化和反硝化作用会向大气中释放更多的温室气体氧化亚氮。由人为活动所产生的氧化亚氮中，耕地土壤的释放量贡献了65%左右[1]。反硝化作用（denitrification）是指把硝酸盐等较复杂的含氮化合物转化为氮气、一氧化氮和二氧化氮的过程，这是厌氧条件下（ > 60%的土壤孔隙水含量）陆地氧化亚氮产生的主要生物过程。在过去的1个多世纪里，人们通常认为反硝化过程都是由进行无氧呼吸的细菌进行的，但近年来的研究发现，真菌也可以进行反硝化作用[2]。在分离获得的真菌中，已经发现很多种具有产生氧化亚氮的能力。虽然在纯培养条件下，真菌产生氧化亚氮活性与细菌相比要低几个数量级[3]，但是对土壤氧化亚氮产生能力的测定结果表明，真菌产氧化亚氮的能力远超细菌[4-5]。Laughlin等[4]研究表明：在草地及耕作泥炭土中使用放线菌酮抑制真菌活性时，土壤氧化亚氮排放通量减少了80%，而用链霉素抑制土壤细菌活性后，土壤氧化亚氮排放通量仅减少30%左右。真菌在土壤氧化亚氮排放中的重要贡献可能是由于其生物量在土壤微生物中占据着非常大的优势。土壤原位氧化亚氮排放通量与土壤真菌生物量呈显著正相关，而与反硝化细菌及其他土壤性质没有明显的相关[6]。已经有一些关于草地、湿地以及耕地等生态系统土壤真菌氧化亚氮排放的研究，但是对于林地土壤的研究尚不多见[4-5, 7-8]。部分经济林的集约经营程度越来越高，它们对土壤微生物，特别是对土壤真菌的干扰也非常剧烈。由于真菌可以耐受更低的pH值，且在林地土壤中的生物量也往往高于细菌，因此真菌在南方酸性森林土壤氧化亚氮排放过程中可能具有更大的贡献[9-10]。毛竹Phyllostachy edulis是中国南方的主要竹种[11]，地下根鞭发达，穿透能力极强，可以帮助毛竹不断向周边森林蔓延并替代原有森林。此外，毛竹林的经济价值较高，目前农户对其的集约经营程度也在不断提高。由于真菌对人为干扰较为敏感，原有天然林改变为毛竹林必将导致土壤真菌群落结构的变化，进而导致土壤氧化亚氮排放通量的改变。本研究利用选择性抑制方法，研究毛竹林及阔叶林土壤细菌及真菌对氧化亚氮排放的贡献率，揭示不同微生物在林地土壤温室气体排放中的作用及其影响机制，从而对阔叶林演变成毛竹林进行生态风险评估，为合理经营毛竹林，减少温室气体排放提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 样品采集
在浙江省临安市天目山国家级自然保护区进行野外调查，在相似地形地貌条件下分别选取4块毛竹林地（moso bamboo forest，MB）和4块阔叶林地（broad-leaved forest, BL）。所有样地土壤均为花岗岩发育的红壤，毛竹林地土壤为粉黏土（黏粒43.27%，粉粒40.34%，砂粒16.39%），阔叶林地土壤为粉黏壤土（黏粒38.50%，粉粒48.68%，砂粒12.82%）。采用5点采样法采取土样，采集表层（0~20 cm）土壤，装入自封袋带回实验室。去除大的动植物残体及石砾后，样品过2 mm钢筛混匀，四分法后弃去多余样品。样品分为2份，1份立即进行室内培养试验和磷脂脂肪酸分析，另1份风干后测定土壤pH值、有机质、全氮质量分数等基本理化性质。
1.2 试验设置
混合后的新鲜土样用于室内培养试验，测定细菌及真菌对土壤氧化亚氮排放通量的贡献率。试验共分为4个处理：①对照（control），不添加任何抗生素；②链霉素（streptomycin，strep），土壤中添加1.0 mg·g-1的链霉素；③放线菌酮（cycloheximide，cyclo），土壤添加2.0 mg·g-1放线菌酮；④链霉素+放线菌酮（both），土壤中同时添加1.0 mg·g-1的链霉素和2.0 mg·g-1放线菌酮。重复3次·土样-1。
1.3 试验方法
1.3.1 土样培养试验
称取相当于20.0 g干质量的新鲜土壤放进150 mL棕色试剂瓶中，加入4.0 mL不同抗生素溶液（对照仅加去离子水）使土壤抗生素质量分数达到试验设计要求。试剂瓶装好土样后，先在4 ℃条件下过夜预培养，以使抗生素逐渐扩散至整个土壤空隙中。之后，将试剂瓶移至室温培养，向土壤中分别加入100 mmol· L-1葡萄糖和100 mmol· L-1硝酸钾，使土壤含水量达到田间最大持水量的90%左右。将试剂瓶用塞上橡胶塞后，向其中充体积分数为10%的乙炔以抑制氧化亚氮继续还原成氮气。将土样与溶液充分混合后，放在培养箱中18 ℃培养7 h后，开始用针筒抽取试剂瓶内气体，岛津（GC-2014）气相色谱测定氧化亚氮通量。
1.3.2 磷脂脂肪酸分析
新鲜样品带回实验室后，立即进行冷冻干燥，测定土壤磷脂脂肪酸摩尔质量浓度。磷脂脂肪酸测定参照Wu等[12]方法。称取3.0 g冻干土样，采用氯仿提取总磷脂后，将样品装载硅胶柱（SPE-Si），分别用氯仿、丙酮和甲醇洗脱中性脂、糖脂和极性磷脂。将所有组分进行甲基化，氯仿回收，氮气吹干后气相色谱（安捷伦6890N）测定。总磷脂脂肪酸摩尔质量浓度用于表征土壤总微生物量。细菌的代表性组分为：i15:0, a15:0, 15:0, i16:0, 16:1w7c, i17:0, a17:0, cy17:0, 17:0, 18:1w7c, cy19:0w8c；真菌特征性脂肪酸为18:2w6, 9c[13]。磷脂脂肪酸摩尔质量浓度以nmol·g-1干土表示。
1.3.3 土壤理化性质分析
土壤有机质采用重铬酸钾外加热法测定；全氮采用凯氏法测定；硝态氮和铵态氮采用氯化钾浸提，流动分析仪测定；有效磷采用Bray法测定，盐酸-氟化铵溶液浸提，比色法测定；速效钾采用乙酸铵提取-火焰光度法测定；pH值采用1:2.5土水比，酸度计测定[14]。
1.4 数据分析
采用Excel 2007和SPSS 18.0处理数据，Duncan单因素方差分析法比较各处理之间的差异显著性（P < 0.05），配对样本t检验比较毛竹林与阔叶林土壤理化性质及土壤细菌与真菌反硝化能力的差异显著性，采用Pearson相关系数检验不同微生物氧化亚氮排放能力与土壤理化性质的相关关系。
2. 结果与分析
2.1 土壤理化性质
所有样地土壤均表现出不同程度的酸性，而不同毛竹林及阔叶林样地之间土壤pH值差异也较大。分析结果表明：毛竹林不同样地土壤有机质、全氮、有效磷及硝态氮质量分数均没有显著差异，而阔叶林不同样地之间土壤有机质、全氮及速效钾也没有显著差异，说明不同林分土壤有机质及全氮质量分数分布总体较为均一。对比2种林分，阔叶林土壤pH值显著低于毛竹林（P < 0.05），而有机质与有效磷质量分数显著高于毛竹林土壤（P < 0.05）。相反，毛竹林土壤速效钾质量分数显著高于阔叶林（P < 0.05，表 1）。毛竹林入侵阔叶林或阔叶林人工演替为毛竹林后，由于地上植被以及凋落物输入的改变，土壤理化性质也发生了相应的变化。此外，毛竹林人为干扰程度也在不断增加，如劈灌、翻耕、施肥以及伐竹等，都会导致养分含量的改变，如土壤有机质质量分数。肖复明等[15]研究表明：长期集约经营后，毛竹林土壤有机碳逐渐下降。而毛竹林土壤速效钾高于阔叶林，可能是由于人为施肥所造成的。
表 1 毛竹林及阔叶林土壤理化性质Table 1. Soil parameters of Phyllostachy edulis and broad-leaved forest样地 pH值 有机质/（g·kg-1） 全氮/（g·kg-1） 有效磷/（mg·kg-1） 速效钾/（mg·kg-1） 铵态氮/（mg·kg-1） 硝态氮/（mg·kg-1） 毛竹林 MB-1 5.22±0.01 a 10.60±1.17 a 1.24±0.12 a 29.60±6.38 a 60.50±4.77 a 41.83±2.34 a 10.81±0.05 a MB-2 5.02±0.01 b 11.40±0.23 a 1.16±0.09 a 28.89±7.53 a 60.17±6.66 a 54.07±2.51 b 11.32±1.81 a MB-3 5.22±0.02 a 10.72±0.48 a 1.18±0.14 a 30.23±11.21 a 49.17±4.25 b 42.61±1.13 a 10.95±0.91 a MB-4 4.96±0.01 c 11.71±1.08 a 1.33±0.11 a 25.12±6.44 a 57.67±0.58 ab 55.11±2.78 b 11.68±1.81 a 阔叶林 BL-1 4.45±0.01 a 12.39±0.16 a 1.25±0.24 a 38.70±8.36 a 52.00±3.61 a 54.07±2.51 a 12.65±0.61 a BL-2 4.60±0.01 b 14.40±0.72 a 1.33±0.10 a 46.93±10.25 a 44.50±5.89 a 38.44±2.51 b 13.51±1.96 a BL-3 4.66±0.01 c 12.10±0.11 a 1.29±0.06 a 47.72±7.13 ab 42.00±12.17 a 43.39±3.41 ab 11.25±1.12 ab BL-4 4.79±0.01 d 13.41±2.18 a 1.26±0.13 a 55.40±4.97 b 38.17±3.06 a 44.95±1.78 ab 9.58±0.81 b 配对t检验P值 0.032 0.012 0.377 0.023 0.023 0.641 0.608 说明：表中数据为平均值，同列不同字母表示样地间差异达到显著水平（P < 0.05）。毛竹林与阔叶林之间的差异经配对样本t检验其显著性。 2.2 土壤微生物量
磷脂脂肪酸是几乎所有活体微生物细胞膜的主要成分，周转速率极快且随细胞死亡而迅速降解[16]。因此，本试验采用土壤微生物总磷脂脂肪酸摩尔质量浓度作为土壤微生物量的指标，可以最大限度地测定土壤中的活性微生物。结果表明：无论是总微生物量、细菌及真菌生物量以及真菌/细菌比值，毛竹林与阔叶林2种林分之间均没有显著差异。同样，毛竹林的不同样地之间也没有显著差异。阔叶林土壤中，BL-4样地总微生物量与细菌生物量均显著高于BL-1样地（P < 0.05，表 2）。Pearson相关分析表明：真菌生物量与土壤pH值呈显著负相关（R2=-0.752，P < 0.05），而与土壤有机质呈极显著正相关（R2=0.965，P < 0.01）；细菌生物量与土壤速效磷显著相关（R2=0.830，P < 0.05），而土壤真菌/细菌比值与硝态氮显著相关（R2=0.815，P < 0.05）。与细菌相比，真菌可以适应更广的pH值范围，且酸性pH值有利于真菌而不利于细菌的生长[17]。因此，在酸性的毛竹林和阔叶林土壤中，真菌的活性相对较强。有机质也是影响真菌的一个重要因素。研究表明：森林转换为耕地之后导致土壤有机质降低，进而降低林地土壤真菌生物量[18]。与土壤有机质相似的是，毛竹林真菌生物量与阔叶林相比有下降的趋势，尽管没有显著差异。
表 2 毛竹林及阔叶林土壤微生物量Table 2. Soil microbial biomass of Phyllostachy edulis and broad-leaved forest样地 土壤微生物量/（nmol·g-1） 真菌生物量/（nmol·g-1） 细菌生物量/（nmol·g-1） 真菌/细菌 毛竹林 MB-1 31.06±4.80 a 3.52±0.25 a 12.13±0.88 a 0.29±0.02 a MB-2 24.75±3.96 a 3.80±0.45 a 11.80±2.54 a 0.33±0.07 a MB-4 23.50±4.25 a 3.75±0.26 a 12.94±1.35 a 0.29±0.05 a MB-3 26.67±4.76 a 4.12±0.55 a 11.56±2.00 a 0.37±0.11 a 阔叶林 BL-1 26.98±2.23 a 4.83±0.55 a 12.99±0.82 ab 0.37±0.04 a BL-2 34.27±4.93 ab 4.10±0.30 a 14.65±0.71 b 0.28±0.03 a BL-3 36.05±3.34 b 4.26±0.29 a 14.91±0.56 b 0.29±0.02 a BL-4 27.22±1.75 a 4.04±0.63 a 11.41±1.19 a 0.36±0.08 a 说明：表中数据为平均值，同列不同字母表示同一林分不同样地之间差异达到显著水平（P < 0.05）。 2.3 细菌及真菌氧化亚氮排放贡献
不同林分土壤以及同一种林分不同样地之间氧化亚氮的排放通量都存在较大差异，其中毛竹林MB-1样地土壤氧化亚氮排放通量最高，其次是MB-4，BL-3及BL-4等样地，MB-2和BL-1，BL-2等样地的氧化亚氮排放通量最低（图 1）。相关分析结果表明：土壤氧化亚氮排放通量与本研究所选择测定的部分土壤理化性质没有显著相关性。土壤氧化亚氮排放与许多因素有关，如土壤含水量、容重、pH值、有机质质量分数、氮肥施用量等等[19]。因此，本研究中不同林分甚至同一林分不同样地之间存在的巨大差异，可能是由多种土壤环境因素共同决定的，其影响因素还有待于进一步的研究。统计结果表明：毛竹林和阔叶林土壤氧化亚氮排放通量没有显著差异（t=-0.574, P=0.606）。在以往对森林土壤氧化亚氮排放通量的研究过程中，往往将土壤温度和湿度作为关键因子[20]，但近年来的研究则发现：氮素水平是一个关键因素[21]。对比2种不同林分，无论是土壤全氮还是矿质态氮均没有显著差异（表 1），这可能是2种林分氧化亚氮排放通量没有差异的主要原因。
图 1 毛竹林及阔叶林土壤氧化亚氮排放通量Figure 1. N2O fluxes in Phyllostachy edulis and broad-leaved forest soils无论是单独添加放线菌酮、链霉素还是同时添加2种抗生素，均显著抑制了土壤氧化亚氮排放通量（P < 0.05）。同时添加2种抗生素对土壤氧化亚氮排放通量的抑制率在73%~83%，但是同一林分的不同样地之间没有显著差异，而单独添加链霉素或者放线菌酮的处理对土壤氧化亚氮排放通量的抑制率变化较大。图 2结果表明：在2种林分的样地中，除了个别样地外（MB-2，BL-1），其他所有土壤真菌氧化亚氮排放通量均显著高于细菌（P < 0.05）。如在毛竹林土壤中，真菌对土壤氧化亚氮排放的贡献率为40.8%~56.2%，远高于细菌（9.0%~33.4%）。阔叶林土壤中也呈现同样的规律，真菌对土壤氧化亚氮排放贡献率为38.0%~62.8%，而细菌的贡献率为12.6%~32.4%（图 2）。目前，已有研究表明，在森林生态系统中的真菌群落对土壤氧化亚氮排放的贡献要大于草地以及人为耕作的生态系统[4-5, 8]。同时，真菌与细菌对土壤氧化亚氮排放的贡献比在不同的生态系统中存在着较大的差异[22]。毛竹林与阔叶林由于其地上植被以及人为干扰程度不一样，真菌与细菌对土壤氧化亚氮排放的贡献率也就存在着一定的差异。
图 2 毛竹林及阔叶林土壤真菌及细菌的氧化亚氮排放通量Figure 2. Contributions of fungi and bacteria on N2O fluxes in Phyllostachy edulis and broad-leaved forest soils与此类似的是，在2种林分的不同样地之间，土壤真菌及细菌对氧化亚氮排放通量的贡献率也有着显著的差异（P < 0.05）。如在毛竹林土壤中，尽管氧化亚氮排放通量显著低于样地MB-1（P < 0.05），但是MB-3样地的土壤真菌氧化亚氮排放贡献率达到56.2%，显著高于MB-1样地真菌排放贡献率（49.7%，P < 0.05）。而在阔叶林土壤中，BL-3和BL-4样地土壤总氧化亚氮排放通量显著高于（P < 0.05）另外2个样地的同时，其真菌氧化亚氮排放贡献率也显著高于样地BL-1和BL-2（P < 0.05）。
将土壤氧化亚氮排放通量与所有土壤理化性质及微生物生物量进行Pearson相关分析。结果表明：真菌与细菌的氧化亚氮排放贡献之间存在极显著的相关性（P < 0.01），可能与2种微生物群落反硝化的环境条件要求较为相似有关。值得注意的是，真菌及细菌氧化亚氮排放通量与其生物量之间没有显著相关性，说明生物量并非是决定氧化亚氮排放通量的关键因素。由于只有一些特定的真菌即细菌种类可以进行反硝化作用，如真菌中的镰刀菌属Fusarium spp.具有较强的氧化亚氮释放能力[23]。因此，真菌的氧化亚氮排放贡献主要与真菌群落及特定种群的反硝化活性相关。今后仍然需要从微生物物种多样性以及功能基因丰度等方面来进一步研究土壤反硝化作用的主要贡献者及其关键影响因素。以往有研究结果表明：真菌与细菌的氧化亚氮产生活性与土壤pH值关系较大，这可能是由于pH值对这2种微生物数量及活性均有着重要的影响[22, 24]。由于真菌可以适应非常宽的pH值范围，其受土壤pH值改变的影响相对细菌小，而细菌生物量在酸性条件下可能会受到抑制，因此在酸性土壤中真菌对氧化亚氮排放的贡献就会大于细菌。然而与以往结果不同的是，本研究发现土壤真菌即细菌氧化亚氮排放通量与土壤pH值没有显著相关关系，这可能与不同样地之间pH值较为接近有关。但是，真菌氧化亚氮排放通量与土壤硝态氮含量有较强的负相关关系，尽管并不显著（R2=-0.673，P=0.067）。通常，氧化亚氮通量与NO3-N呈负相关关系。随着反硝化作用的进行，NO3-N作为电子受体含量下降，还原成氧化亚氮释放出来[25]。
3. 结论与展望
抗生素选择性抑制试验结果表明：①无论是毛竹林还是阔叶林，真菌都是土壤氧化亚氮排放的主要贡献者；②阔叶林演替为毛竹林既没有改变土壤氧化亚氮排放通量，也没有影响真菌及细菌对土壤氧化亚氮排放通量的相对贡献率；③真菌和细菌氧化亚氮排放特征相似，但与生物量没有相关性。
近年来，毛竹林不断替代阔叶林的同时，经营强度也在不断增加。据统计，有40%~50%的毛竹林实行集约化栽培。与天然状态的粗放经营毛竹林相比，集约经营毛竹林的典型特点表现为清除林下杂草，土壤翻耕以及施用大量化肥等。尽管集约经营措施可以一定程度上增加毛竹地上部的生物量，提高碳储量[26]，但也有研究表明，使用化肥显著增加了毛竹林土壤二氧化碳和氧化亚氮的排放通量，且毛竹林土壤温室气体的排放速率随着化肥施用量增加呈显著增加趋势[27]，但是其内在机制仍不清楚。人为干扰如翻耕、放牧以及氮肥施用等都会影响土壤真菌群落结构和功能[28]，继而对土壤氧化亚氮排放产生潜在影响。本研究中，我们只是针对阔叶林和毛竹林进行了研究，但是不同经营年限以及经营强度对毛竹林土壤真菌氧化亚氮相对排放贡献的影响尚未涉及，今后仍需在更加广泛的范围内针对人工经营毛竹林进行采样，并结合稳定性同位素标记手段来研究真菌在森林，特别是人工经营森林生态系统氧化亚氮排放中的贡献。明确土壤真菌氧化亚氮排放相对贡献及其对毛竹林人为经营的响应特征，对于合理经营毛竹林，控制全球气候变化将具有十分重要的意义。
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图 1 3种植物对水中氮去除效能
不同小写字母表示不同处理间差异显著(P＜0.05)
Figure 1 Nitrogen removal by three plant species
图 2 3种植物对水中总磷去除效能
不同小写字母表示不同处理间差异显著(P＜0.05)
Figure 2 Phosphorus removal by three plant species
图 3 3种植物组织中氮和磷质量分数分布
不同小写字母表示不同处理间差异显著(P＜0.05)
Figure 3 Contents of phosphorus and nitrogen in the tissues of three plant species
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