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生物量作为反映森林生态系统结构优劣和功能高度最直接的指标之一，其大小是植物群落与周围环境共同作用的结果[1]，分析森林生物量变化的驱动因素，可为林业可持续经营提供理论依据[2]。目前，以物种丰富度为代表的物种多样性是最简单的多样性衡量标准，通常被应用于生物量和生产力的预测指标[3-4]。有研究认为：生物多样性对生态系统功能的影响，不仅归因于物种数量，还依赖于物种所具有的功能特征[5]。具有较高功能多样性的生态系统常被认为拥有较高的生产力、恢复力和抗干扰能力，因此，通过比较群落间物种多样性与功能多样性的高低，可分析生态系统的好坏[6-7]。除此之外，林分密度也是控制林木生长与生物量积累的关键因素[8]，而且作为最常见的林分经营措施，调整林分密度，可以有效促进纯林向天然林过渡的进程[9]。马尾松Pinus massoniana具有速生、丰产等优良特性，一直被作为中国南方重要的用材树种和荒山绿化造林的先锋树种。然而，由于长期采取单一的纯林经营模式，立地质量降低，生产力下降，严重威胁了林地的可持续经营。目前，通过疏伐补植的措施将针叶纯林改造成针阔混交的近自然林，正逐渐成为替代大面积人工针叶纯林最有希望的途径之一[10]。周东雄[11]以采用疏林结构培育马尾松大径材兼营苦竹Pleioblastus amarus的复合林分为研究对象得出：混交经营有利于马尾松大径材的培育；邹文魁[12]调查分析了40年生马尾松-木荷Schima superba混交林的生物量结构，发现混交乔木层的总生物量高于纯林。综上所述，虽然混交林对马尾松林生物量的积累有一定促进作用，但是存在非自然、非随机的缺点，而且大部分观测对象的周期较短。与此同时，在研究影响生物量变化机制的问题上，一些学者通过研究林下植被生物多样性间接说明生物量的变化[13-14]，但忽视了乔木层生物多样性对其生物量变化的影响。作为生态系统中森林地上部分生物量的主体[15]，乔木层的生物量在群落中占有很大比例[16-17]，研究其生物量与生物多样性的关系具有重要意义[18]。针对混交林与纯林生物多样性以及林分密度之间的变化规律，如何探究出因地制宜的改造措施依然存在很多难点。鉴于此，本研究通过对比不同演替阶段的马尾松人工林生物多样性以及林分密度变化规律，为不同生长阶段的马尾松纯林改造提供有效的数据支持。
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太子山林场位于湖北省荆门市京山县西南部(30°48′35″~31°02′40″N，112°49′05″~113°03′40″E)，北倚大洪山，南接江汉平原。其地貌为低山丘陵区，属中亚热带季风气候，夏秋多雨，冬春干旱，年平均降水量1 094.8 mm，年平均气温16.4 ℃。太子山土壤呈酸性，境内土壤主要为黄褐土、黄棕壤、山地黄棕壤、黄褐色石灰土，其中分布面积最大的是黄棕壤和黄褐色石灰土，矿质养分、有机质状况总体良好。太子山林场内资源丰富，分布着地球上仅能在此成片生长的国家级保护植物对节白蜡Fraxinus hupehensis在内的常绿或落叶针叶林、阔叶林、林下植被等138科、204属近400种。既有秃杉Taiwania flousiana、鹅掌楸Liriodendron chinense、杜仲Eucommia ulmoides、厚朴Magnolia officinalis、楠木Phoebe zhennan、刺楸Kalopanax septemlobus等国家级保护植物，还有第三纪孑遗植物银杏Ginkgo biloba、水杉Metasequoia glyptostroboides等。其中，典型林分有栓皮栎Quercus variabili、麻栎Quercus acutissima、杉木Cunninghamia lanceolata、马尾松Pinus massoniana、柏木Cupressus funebris、湿地松Pinus elliottii、枫香Liquidambar formosana、樟树Cinnamomum camphora等。
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在2018年7月和2019年6月，依据太子山林场马尾松人工林近自然经营方案，针对早期疏伐后的纯林，采用空间代替时间的方法，分别选择自然演替30年生、40年生以及50年生的马尾松林作为调查对象。其中30年生马尾松林共调查12块样地，这些样地还处于演替早期阶段，并且在原有树种基础上新增了1~2个树种；40年生马尾松林共调查18块样地，这一演替程度的马尾松林包含的演替树种已经达3~4个；50年生的马尾松林共调查18块样地，此阶段的马尾松林在自然演替下新增了5~7个树种。所有样地共计48块，每个样地设置20 m
$ \times $ 20 m样方，记录坡度、坡向、林龄，并对胸径≥5 cm的木本植物每木检尺。 -
生物量计算过程是在统计样地林分组成概况之后，对样地的所有树种进行划分，主要包括马尾松、麻栎、樟树、柏木、杉木、其他阔叶树种。每种树种的生物量计算公式见表1。
表 1 生物量计算方法
Table 1. Biomass calculation methods
树种 生物量计算公式 参考文献 马尾松 ${ W=0.105\;6 ({D}^{2}H{)}^{0.824\;7}} $ [19] 麻栎 $ {W=1.137\;96 \times {10}^{-3}{D}^{2.082\;5}{H}^{2.115\;4} }$ [20] 樟树 $ {W=0.112\;502 \left({D}^{2}H\right)} $ [20] 柏木 $ {W=0.027\;241 ({D}^{2}H{)}^{1.008\;7}} $ [20] 杉木 $ {W=0.257 ({D}^{2}H{)}^{0.697\;0}} $ [21] 其他阔叶树种 $\;\;{ {\ln}W=-1.982+1.209{\ln}{D}^{2}} $ [22] 说明：W为生物量；D为胸径；H为树高 -
引用了亚热带气候带下马尾松与阔叶树种的林木材积生长率方程，并通过林分生物量扩展因子方程将每个样地在10 a的总材积生长量转换为生物量[23-25]。由于柏木与杉木都分布在40年生的样地中，不需要对其进行转换，所以本研究没有考虑其转换的材积生长率公式，只引入了马尾松和其他阔叶树种的生产率方程来计算每木材积生长率(表2)，最后通过生物量扩展因子方程将材积换算为生物量(表3)。
表 2 单木材积生长率方程
Table 2. Wood growth rate equation of P. massoniana and broad-leaved trees
树种 单木材积生长率方程 马尾松 ${ Y=5.528+99.865 {\rm{exp} }(-0.101 D-0.086 A)}$ 其他阔叶树种 ${Y=0.088+0.007 D}$ 说明：Y为单木材积生长率；D为单木胸径；A为年龄 表 3 生物量扩展因子方程
Table 3. Biomass expansion factor equation of P. massoniana and mixed coniferous forests
林分 生物量扩展因子方程 马尾松纯林 ${B=0.503\;4 V+20.547\;0 }$ 针阔混交林 ${ B=0.516\;8 V+33.237\;8}$ 说明：B为单木生物量；V为单木材积 -
为了描述群落内物种多样性的分布特征，借助R语言中vegan包的diversity函数计算了Shannon-Wiener指数、Simpson指数以及Pielou指数，计算公式参考文献[26]。
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功能多样性参数测量采用R的FD包计算每个样地的功能丰富度(FRic)、功能均匀度(FEve)、功能离散度(FDis)、功能多样性(RaoQ)，计算公式及含义参见文献[27]。
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为了排除生物量随着年龄增加而变化的影响，在分析生物量与各因素之间的关系之前，通过林木生长模型将各演替阶段的生物量统一换算为40年生。同时，为了避免立地条件对生物量的影响，选择在相同土壤条件下位于同一坡向以及相近坡度的林分进行研究。通过单因素方差分析探究了不同演替程度下各参数的差异(显著性水平为α=0.05)。使用普通最小二乘(OLS)多元回归模型来检验多样性、林分密度对森林生物量的影响。在拟合模型前所有数据都进行了标准化处理。各参数的计算以及相关性分析主要借助R 3.5.1来实现。
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生物量在30年生和40年生、50年生的马尾松林之间均具有显著差异(P＜0.05)，然而40年生与50年生马尾松林差异不显著(图1A)。在物种多样性指数中，Shannon-Wiener指数在3种不同演替程度下差异显著(P＜0.05)(图1B)；Simpson指数的变化与Shannon-Wiener指数一致，在不同演替程度下差异显著(P＜0.05)(图1C)；Pielou指数也随着演替程度的增加呈递增趋势，30年生与40年生、50年生的马尾松林之间均差异显著(P＜0.05)，40年生与50年生马尾松林差异不显著(P＞0.05)(图1D)。功能多样性指数中，功能丰富度在50年生马尾松林中最高，40年生马尾松林次之，30年生马尾松林最低，30年生与40年生、50年生的马尾松林之间均差异显著(P＜0.05)，40年生与50年生马尾松林差异不显著(P＞0.05)(图1E)；功能离散度在50年生马尾松林中明显高于其他，40年生与30年生、50年生的马尾松林之间均差异不显著(P＞0.05)，30年生与50年生马尾松林显著差异(P＜0.05)(图1F)；功能均匀度随着演替的进行不断提高，且在3种不同演替程度下具有显著差异(P＜0.05)(图1G)；功能多样性30年生与40年生、50年生马尾松林之间均差异显著(P＜0.05)，40年生与50年生马尾松林无显著差异(P＞0.05)(图1H)。林分密度随着演替的进行不断提高，40年生与30年生、50年生马尾松林之间均无显著差异(P＞0.05)，30年生与50年生马尾松林差异显著(P＜0.05)(图1I)。
图 1 不同演替程度下生物量、生物多样性和林分密度的变化
Figure 1. Change of biomass, biodiversity and stand density of different remolding modes
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以生物量作为响应变量，多样性指数、林分密度为解释变量构建线性逐步回归模型，筛选出对生产力解释率最高的最佳子集。从表4可知：虽然多元线性模型R2=0.468并不高，但拟合结果差异极显著(P＜0.001)。对生物量影响的重要性从高到低依次为功能离散度(42.71%，P＜0.001)、Simpson指数(21.65%，P＜0.001)、Pielou指数(19.58%，P＜0.01)、Shannon-Wiener指数(16.05%，P＜0.01)。
表 4 逐步回归模型筛选结果
Table 4. Stepwise regression model fitting results
变量 估算值 标准差 t P 重要性/% Shannon-
Wiener指数−208.114 67.232 −3.095 ＜0.01 16.05 Simpson指数 1 021.108 276.740 3.690 ＜0.001 21.65 Pielou指数 −365.918 107.731 −3.397 ＜0.01 19.58 功能离散度 −89.342 23.988 −3.724 ＜0.001 42.71 -
本研究发现：40年生马尾松林生物量相较于30年生马尾松林有明显增加，与50年生马尾松林相比并没有较大差距；但Shannon-Wiener指数、Simpson指数以及Pielou指数随着演替的进行在不断提高。表明演替前期拥有不同性状的树种，可以提升资源的利用效率，这将对生物量的增加产生积极效应[28]。而演替后期，生态系统趋于稳定，树种的增加对林分生物量的影响逐渐减弱。本研究表明：不同演替程度之间功能多样性变化也较为显著。其中功能丰富度递增，说明群落所占据的功能空间有所提高[29]。而且从功能离散度和功能多样性的分布特征也不难看出，树种多的群落中不仅其生态位的互补程度较高，而且具有不同功能特性的树种相对增加，这为群落间个体生产力的提升提供了可能，并增加生态系统的功能。功能均匀度可以体现群落内树种对有效资源全方位的利用效率[29]。功能均匀度随着演替的进行不断提高，这有利于群落对资源利用效率的提高。随着演替的进行，林分密度开始增加，但在演替50年生的样地里也存在林分密度较小的情况，总体分布范围较30年生的有所增大，树种的增加使得单位面积上的树种数量增加。
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在逐步回归模型筛选的最佳子集中，功能离散度对于生物量的影响占有重要权重。相较于物种多样性，功能多样性指标可以更有效地解释生态系统功能变化[30]。本研究显示：Shannon-Wiener指数、Simpson指数、Pielou指数都对生物量有显著影响，这与温带针叶林、亚热带人工林和热带森林的研究结果相似[31]，与TILMAN等[32]的物种多样性对生态系统生物量存在正效应相符，说明在一定研究尺度下，马尾松人工林物种多样性的适度提高会对生物量的增加有促进作用。就功能多样性与生物量之间的关系而言，功能丰富度与碳储量显著相关[33]，也有人只证明了功能离散度与碳储量的相关性[34]，本研究得出了相似的结论。综合分析模型中，林分密度对生物量没有表现出影响，这可能是生物多样性指标掩饰了林分密度的效应。
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马尾松人工林在演替进程中，随着树种的增加，物种多样性与功能多样性也随之增加，这使得群落能够占据更多的生态位，从而为获得更多的资源创造条件；同时由于树种间生长特性的不同，增加了群落利用资源的多样性，为个体生物量的积累提供了条件。回归模型结果表明：功能离散度可以更有效地解释生物量的变化，林分中的功能特性的离散化有利于减小群落内的竞争效应，为个体生物量的积累创造有利条件。
Effects of biodiversity on biomass of Pinus massoniana plantation under different succession degrees
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摘要:
目的 为了解决长期纯林经营模式下马尾松Pinus massoniana林地力衰退、生物多样性降低、生物量下降等问题，探究马尾松人工林在自然演替程度下生物量与生物多样性变化规律以及相关关系。 方法 以湖北省荆门市京山县太子山3种不同自然演替程度下的马尾松人工林为研究对象，采用典型样地法探究其生物量与生物多样性、林分密度之间的关系。 结果 ① 40年生林分与50年生林分的生物量相对于30年生林分具有显著差异(P＜0.05)，其中40年生林分的平均生物量最高。②多样性指数随着演替的进行不断增加，但在不同演替阶段有所差异。其中Shannon-Wiener指数与Simpson指数在各个演替阶段之间都具有显著差异(P＜0.05)；Pielou指数在40年生林分与50年生林分之间差异不显著(P＞0.05)，但都与30年生林分差异显著(P＜0.05)；功能丰富度、功能多样性与Pielou指数变化一致；功能离散度在40年生林分与其他演替阶段的林分都差异不显著(P＞0.05)，30年生林分与50年生林分差异显著(P＜0.05)；功能均匀度在各个演替阶段林分之间都具有显著差异(P＜0.05)。③林分密度在40年生林分与其他演替阶段的林分都差异不显著(P＞0.05)，30年生林分与50年生林分之间差异显著(P＜0.05)，其变化趋势随着演替程度的进行有所增加。④最佳解释模型中，解释变量包含功能离散度、Shannon-Wiener指数、Simpson指数以及Pielou指数，其中功能离散度相较于其他物种多样性指数更能有效地解释生物量的变化。 结论 生物多样性因子对生物量的变化具有一定可解释性，其中功能参数中的功能离散度对于生物量的影响最大。图1表4参34 Abstract:Objective The purpose of this study is to explore the change law of biomass and biodiversity of Pinus massoniana plantations under natural succession degree and the relationship between them, so as to solve the problems of fertility decline, biodiversity reduction, and biomass decline of P. massoniana forest under the long-term pure forest management mode. Method Taking 3 P. massoniana plantations with different degrees of natural succession in Taizi Mountain, Jingshan County, Jingmen City of Hubei Province as the research object, the typical plot method was used to explore the relationship between biomass, biodiversity and stand density. Result (1) The biomass of 40-year-old and 50-year-old stands was significantly different from that of 30-year-old stand (P＜0.05), and the average biomass of 40-year-old stand was the highest. (2) The diversity index increased with the succession, but it was different in different succession stages. Among them, Shannon-Wiener index and Simpson index had significant differences among different succession stages(P＜0.05). There was no significant difference in Pielou index between 40-year-old and 50-year-old stands (P＞0.05), but both were different from 30-year-old stands. The changes of functional richness and diversity were consistent with Pielou index. There was no significant difference in functional dispersion between 40-year-old stands and stands of other succession stages (P＞0.05), but significant difference between 30-year-old stands and 50-year-old stands (P＜0.05). There was significant difference in functional evenness among different succession stages (P＜0.05). (3) There was no significant difference in stand density between 40-year-old stand and the stands of other succession stages (P＞0.05), but significant difference between 30-year-old stand and 50-year-old stand (P＜0.05), and the change trend increased with the succession degree. (4) In the best explanation model, the explanatory variables included functional dispersion, Shannon-Wiener index, Simpson index and Pielou index, among which functional dispersion was more effective than other species diversity indexes in explaining biomass changes. Conclusion Biodiversity factors can explain the changes of biomass to some degree, and the functional dispersion of functional parameters has the greatest impact on biomass. [Ch, 1 fig. 4 tab. 34 ref.] -
Key words:
- forest ecology /
- Pinus massoniana /
- biodiversity /
- biomass /
- succession
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甘油脂的从头生物合成途径(de novo glycerolipid biosynthesis)是细胞中最基本的代谢过程。3-磷酸甘油酰基转移酶(glycerol-3-phosphate acyltransferase, GPAT)催化甘油脂从头合成的初始步骤，生成的溶血磷脂酸(LPA)在LPA酰基转移酶(lysophosphatidic acid acyltransferase, LPAAT)的作用下转化为磷脂酸(PA)[1−6]。PA是调节真核生物中多种细胞过程的重要信号分子，也是极性甘油磷脂与中性三酰甘油(TAG)的生物合成前体。在磷酸酶的催化下PA转化为二酰甘油，后者可经脂酰辅酶A-依赖型二酰甘油酰基转移酶(acyl-CoA: diacylglycerol acyltransferease, DGAT)和(或)磷脂-依赖型二酰甘油酰基转移酶(phospholipid-dependent diacylglycerol acyltransferase, PDAT)作用生成TAG[7−10]。TAG合成能力是油料作物的关键性状，同时与人类肥胖症等疾病密切相关。因而，运用遗传或化学遗传方法操控TAG生物合成，提高油料作物含油量，降低与肥胖症相关联的人类疾病，具有重要实践意义[11−16]。
脂酰基转移酶在TAG生物合成过程中发挥重要作用，但目前对于这类酶的结构与功能的内在关系知之甚少，参与第1步酰化反应的GPAT亦不例外，仅有少量关于其结构与功能关系的报道[17−18]。已知GPAT、LPAAT、磷酸二羟丙酮酰基转移酶(dihydroxyacetone-phosphate acyltransferase, DHAPAT)等脂酰基转移酶均含4个高度保守的结构域，结构域Ⅰ的组氨酸(H)、天冬氨酸(D)，结构域Ⅲ的甘氨酸(G)和结构域Ⅳ的脯氨酸(P)是GPAT催化所必需的；而结构域Ⅱ的精氨酸(R)与结构域Ⅲ的谷氨酸(E)在结合底物3-磷酸甘油中起作用[18−20]。迄今为止，对于保守结构域外的其他氨基酸残基在酰基转移酶活性调控中的作用，及与保守结构域中的氨基酸残基存在的潜在互作关系的了解非常有限。
GPAT9位于植物细胞的内质网，参与膜脂和TAG的生物合成，其功能缺失会导致种子发育异常、油脂合成减弱[20−22]。本实验室前期的酵母遗传互补研究也显示：油菜Brassica napus BnGPAT9的异源表达能够恢复酵母条件致死型双敲除突变体(ZAFU1)因GPAT酶活性缺失引起的生长缺陷。然而，拟南芥Arabidopsis thaliana AtGPAT9却不具备这种互补能力[23−25]，尽管AtGPAT9与BnGPAT9的进化关系密切[26−27]，两者氨基酸序列的一致性高达 94.1%，且两者在4个酰基转移酶保守结构域的氨基酸残基完全一致。因此，可以假设保守结构域之外的某些氨基酸残基对GPAT9的活性起着重要的调节作用。本研究充分利用AtGPAT9和BnGPAT9在酵母异源系统中表现出的不同性质，并结合定点突变与酵母遗传互补技术，剖析单个和多个氨基酸残基改变对GPAT9酶活性的影响，鉴定新的关键活性位点，以深化对脂酰基转移酶结构与功能内在关系的认知，为酰基转移酶的分子改造与结构优化、真核生物中TAG合成途径的改良以及全新TAG从头合成途径的构建提供理论基础。
1. 材料与方法
1.1 序列分析
通过Vector NTI 11.5.4软件对AtGPAT9 (Genebank 登录号: ACT32031.1)和BnGPAT9 (Genebank 登录号: ANV28166.1)的氨基酸序列进行比对。使用TMHMM 2.0和Protter进行跨膜结构域和蛋白质拓扑异构模型预测[28-29]。由I-TASSER预测三维结构[30]。
1.2 基因定点突变
将AtGPAT9和BnGPAT9编码序列分别通过BamH I/XhoⅠ和BamH I/EcoR I双酶切位点克隆至pMD19-T载体，得到新的质粒pMD19-T-AtGPAT9和pMD19-T-BnGPAT9；以之为模板，对AtGPAT9和BnGPAT9进行定点突变。具体方法如下：利用包含突变位点的引物(表1)，PCR扩增整个质粒；质粒DNA经Dpn I消化与纯化后，转入大肠埃希菌Escherichia coli并进行测序分析；序列正确的质粒经BamH I和Xho Ⅰ双酶切后，连接到经相同酶切处理的pYES2-yADH1-Kan V2酵母表达载体，并对产生的重组质粒再次进行DNA测序分析，以确保突变位点的正确性。需要说明的是，选择pMD19-T质粒作为定点突变过程中的中间质粒，而非直接在pYES2-yADH1-Kan V2质粒上进行GPAT9基因的定点突变，是因为后者DNA长度(6 998 bp)是前者(2 660 bp)的2.6倍，采取这样的策略可以降低因PCR扩增时间延长导致潜在的错误碱基出现频率。
表 1 拟南芥AtGPAT9和油菜BnGPAT9定点突变所用的引物序列Table 1 Sequences of the primers used for site-directed mutagenesis of A. thaliana AtGPAT9 and B. napus BnGPAT9突变位点 引物序列 (5′→3′) 突变位点 引物序列 (5′→3′) BnGPAT9(R40S) AGCCTCGTGGCAAGCTCAGCCTGCGTGATTTGCTAGACAT AtGPAT9(N119H) TTTCATTGTTTATCCCTGTACACGCGTTGCTGAAAGGTCAAG BnGPAT9(W85Y) TCTACTTGTTTCCTTTATACTGCTGTGGTGTTGTTGTTAG AtGPAT9(D230N) TTGTAGCAAAAAAGTTAAGGAACCATGTCCAAGGAGCTGAC BnGPAT9(C87F) TTGTTTCCTTTATGGTGCTTTGGTGTTGTTGTTAGATACT AtGPAT9(A235T) TAAGGGACCATGTCCAAGGAACTGACAGTAATCCTCTTCTC BnGPAT9(I102F) TTCTCTTTCCCTTGAGGTGCTTCACTTTAGCTTTTGGATG AtGPAT9(S237N) ACCATGTCCAAGGAGCTGACAATAATCCTCTTCTCATATTTCC BnGPAT9(F109I) CATCACTTTAGCTTTTGGATGGATTATTTTCCTTTCAACG AtGPAT9(D230N/A235T) TTGTAGCAAAAAAGTTAAGGAACCATGTCCAAGGAACTGAC BnGPAT9(T114L) TGGTTTATTTTCCTTTCATTGTTTATCCCTGTACACTCTC AtGPAT9(A235T/ S237N) TAAGGGACCATGTCCAAGGAACTGACAATAATCCTCTTCTCATATTTC BnGPAT9(H119N) TTCAACGTTTATCCCTGTAAATTCTCTCCTGAAAGGTCAG AtGPAT9(D230N/A235T/
S237N)TTGTAGCAAAAAAGTTAAGGAACCATGTCCAAGGAACTGAC BnGPAT9(N230D) GTAGCAAGAAAGTTAAGGGACCATGTTCAAGGAACTGACA AtGPAT9(G332A) CATAAGGCCCGGTGAAACAGCAATTGAATTTGCAGAGAGGG BnGPAT9(T235A) TAAGGAACCATGTTCAAGGAGCTGACAATAACCCTCTTCT AtGPAT9(L335H) GGTCAGAGACATGATATCTCATCGGGCGGGTCTCAAAAAGG BnGPAT9(N237S) CATGTTCAAGGAACTGACAGTAACCCTCTTCTTATATTTC AtGPAT9(P355S) TGAAGTATTCGAGACCAAGCTCCAAGCATAGTGAACGCAAG BnGPAT9(A322G) AAGGCCTGGTGAAACAGGAATTGAGTTTGCAGAGAGGGTC AtGPAT9(T10A) GTACGGCAGGGAGGCTCGTGGCTTCAAAATCCGAGCTTGAC AtGPAT9(S40R) ATGAACCTCGCGGCAAGCTCCGCCTGCGTGATTTGCTAGA AtGPAT9(S11A) CGGCAGGGAGGCTCGTGACTGCAAAATCCGAGCTTGACCTC AtGPAT9(Y85W) ATTTACTTATTCCCACTATGGTGCTTTGGGGTTGTTGTTAG AtGPAT9(S13A) GGAGGCTCGTGACTTCAAAAGCCGAGCTTGACCTCGATCAC AtGPAT9(F87C) CTTATTCCCACTATACTGCTGTGGGGTTGTTGTTAGATACT AtGPAT9(S28A) AACATCGAAGATTACCTTCCTGCTGGTTCTTCCATCAATGAAC AtGPAT9(F102I) TCCTCTTTCCCTTGAGGTGCATCACTTTAGCTTTTGGGTGG AtGPAT9(S30A) GAAGATTACCTTCCTTCTGGTGCTTCCATCAATGAACCTCGCG AtGPAT9(I109F) TCACTTTAGCTTTTGGGTGGTTTATTTTCCTTTCATTGTTT AtGPAT9(S31A) GATTACCTTCCTTCTGGTTCTGCCATCAATGAACCTCGCGGCA AtGPAT9(L114T) GGGTGGATTATTTTCCTTTCAACGTTTATCCCTGTAAATGCG 1.3 酵母遗传转化
条件致死型酵母双突变体ZAFU1[BY4742, gat1Δgat2Δ+(pGAL1::AtGPAT1 Leu2)] [25, 31]，可在半乳糖的培养基上生长，但在葡萄糖培养基上丧失了生长能力。基于菌株ZAFU1建立的酵母遗传互补法对GPAT的鉴定具有很强的专一性[25, 31]，本研究运用它鉴定不同氨基酸残基突变对GPAT9活性的影响。
使用基于醋酸锂的标准方法将重组酵母表达质粒导入菌株ZAFU1感受态细胞[25, 31]，复苏4 h，分别涂布转化液于以葡萄糖(Glu)或半乳糖(Gal)为碳源，不含尿嘧啶、组氨酸和亮氨酸的培养基(SC-Ura-His-Leu)上， 30 ℃下培养3~5 d。为了准确地比较不同氨基酸残基突变对酶活性的影响，挑取在半乳糖培养基上生长的不同单菌落酵母进行浓度梯度稀释培养实验：从半乳糖培养基上随机挑选生长良好的单菌落至SC-Ura-His-Leu+Gal液体培养基，30 ℃振荡培养1~2 d至光密度[D(600)]为2.000 0~3.000 0，稀释菌液浓度至D(600)为1.000 0、0.200 0、0.040 0、0.008 0和0.001 6，取5 µL接种于SC-Ura-His-Leu+Glu和SC-Ura-His-Leu+Gal固体培养基上，30 ℃培养3~5 d。
1.4 酵母生长曲线测定及油脂分析
30 ℃下，将表达不同GPAT9突变基因的ZAFU1细胞在SC-Ura-His-Leu+Gal液体培养基中培养至D(600)为3.000 0~4.000 0，稀释接种于SC-Ura-His-Leu+Glu液体培养基至D(600)为0.100 0，振荡培养并定时记录D(600)。
将平台生长期收获的细胞在真空冷冻干燥机中干燥，提取酵母总脂质[32]，点样于硅胶板，通过薄层色谱法分离总脂质。喷洒质量浓度为0.05%樱草黄显色剂，在紫外灯下观察板上的脂质，从硅胶中提取TAG，并通过气相色谱法定量分析TAG含量[32]。
2. 结果与分析
2.1 AtGPAT9和BnGPAT9的结构差异
早期研究发现：在酵母中异源表达时，拟南芥AtGPAT9与油菜BnGPAT9表现出不同的活性[23-24]。为了找出潜在的关键活性调控位点，对AtGPAT9与BnGPAT9进行了序列比对。AtGPAT9和BnGPAT9均由376个氨基酸组成，两者序列一致性高达94.1%，4个保守的酰基转移酶结构域和C端内质网定位必需的疏水五肽结构域(−ILARL−)的氨基酸残基完全一致[18, 20]，且在N端都含多个潜在的磷酸化位点，主要由丝氨酸和苏氨酸组成(图1)。它们之间共有22个不同的氨基酸残基，其中11个具有相似的性质。基于TMHMM和Protter的跨膜结构域预测显示：跨膜区结构具有较高相似性，但3个跨膜区域中有7个不同的氨基酸残基(图1)。另外，基于I-TASSER的三维结构预测发现：AtGPAT9和BnGPAT9在40、109、114、119、230、235、237和322位氨基酸残基的不同，可能会引起两者三维空间结构的差异，因此它们成为本研究重点剖析的位点(图2)。
图 1 拟南芥AtGPAT9和油菜BnGPAT9氨基酸序列比对Figure 1 Alignment of the amino acid sequences of A. thaliana AtGPAT9 and B. napus BnGPAT9
图 2 AtGPAT9和BnGPAT9三维结构预测Figure 2 Prediction of three-dimensional structures of AtGPAT9 and BnGPAT92.2 AtGPAT9和BnGPAT9的定点突变
为了明确哪些氨基酸位点对GPAT酶活性起着重要调控作用，据上述AtGPAT9和BnGPAT9中存在的氨基酸残基差异，运用定点突变技术对两者相应位置的氨基酸位点进行相互替代，即将AtGPAT9中的单个或多个氨基酸残基同时替换成与BnGPAT9中相应位置完全相同的氨基酸残基，反之亦然。本研究共构建了58种不同的GPAT9突变基因(表2)。
表 2 AtGPAT9和BnGPAT9中单和多位点氨基酸残基的定点突变Table 2 Site-directed mutagenesis of amino acid residues at single and multiple sites in AtGPAT9 and BnGPAT9单个氨基酸残基突变 AtGPAT9氨基酸残基突变组合 BnGPAT9 AtGPAT9 BnR40S** AtT10A AtF102I/S237N AtY85W/D230N BnW85Y AtS11A AtI109F/S237N AtY85W/A235T BnC87F** AtS13A AtD230N/A235T AtY85W/S237N** BnI102F** AtS28A AtD230N/S237N AtY85W/D230N/A235T BnF109I** AtS30A AtA235T/S237N AtY85W/D230N/S237N BnT114L*** AtS31A AtD230N/A235T/S237N AtY85W/A235T/S237N BnH119N AtS40R AtS237N/G322A AtY85W/D230N/A235T/S237N BnN230D*** AtY85W AtY85W/N119H*** AtS40R/Y85W/S237N** BnT235A** AtF87C AtY85W/L114T/N119H* AtN119H/D230N BnN237S* AtF102I AtY85W/N119H/S237N*** AtN119H/A235T BnA322G* AtI109F AtY85W/L114T/N119H/S237N*** AtN119H/S237N*** AtL114T AtY85W/N119H/D230N** AtN119H/D230N/A235T AtN119H* AtY85W/N119H/A235T** AtN119H/D230N/S237N** AtD230N AtN119H/A235T/S237N*** AtA235T AtN119H/D230N/A235T/S237N AtS237N AtG322A AtL335H AtP355S 说明：每种突变以物种的首字母缩写和突变前后的氨基酸残基缩写表示，如AtS40R/S237N代表AtGPAT9的40位由丝氨酸(S)变为精氨酸(R)，237位由丝氨酸(S)变为天冬酰胺(N)。*代表基因的异源表达能够恢复酵母双突变体ZAFU1的生长缺陷；*数目代表恢复能力的大小，数目越多，能力越强。 2.3 单个氨基酸残基突变对GPAT9活性的影响
将不同GPAT9突变基因克隆至带有葡萄糖诱导启动子(ADH1)的质粒中，并以空载体与含野生型AtGPAT9的质粒为阴性对照，以含野生型BnGPAT9的质粒为阳性对照，将这些重组质粒导入到ZAFU1菌株中，测定不同GPAT9突变基因恢复ZAFU1在葡萄糖培养基上的生长缺陷能力。根据转化酵母细胞的生长速率，可以比较直观地评估不同突变位点对GPAT9酶活性的影响。结果显示：当ZAFU1突变体在葡萄糖培养基上培养时，W85Y或H119N的单位点替换导致BnGPAT9丧失对突变体生长缺陷的恢复能力(图3A)，说明W85和H119是BnGPAT9正常功能所必需的。另外，与野生型BnGPAT9相比，含N237S或A322G突变位点的BnGPAT9对ZAFU1菌株生长的促进作用下降(图3A)，表明这2个位点亦参与BnGPAT9活性的调节。相反，其他5个单位点替换(R40S、C87F、I102F、F109I、T235A)对BnGPAT9的活性不产生明显影响(图3A)。特别是N230D和T114L单位点替换增强了BnGPAT9活性，这种上调作用对于BnT114L而言尤为突出。如图4所示：与野生型BnGPAT9相比，含T114L突变位点的BnGPAT9在酵母突变体中的表达能促使细胞生长速率大幅度提高，表现为经2 d培养，表达BnGPAT9 (T114L)的菌落在葡萄糖培养基上生长的数量为野生型BnGPAT9的4倍，且每个单菌落表面积更大。
图 3 不同单位点突变对AtGPAT9和BnGPAT9酶活性的影响Figure 3 Effects of different single mutations on AtGPAT9 and BnGPAT9 activities
图 4 亮氨酸替换114位的苏氨酸(T114L)对BnGPAT9活性的影响Figure 4 Effects of the substitution of threonine for leucine at residue 114 (T114L) on BnGPAT9 activity类似地，对19个不同的AtGPAT9突变基因进行了酵母遗传互补鉴定，其中的6个编码蛋白分别在N端的潜在磷酸化位点发生T10A、S11A、S13A、S28A、S30A和S31A 替换，另外13个分别发生了S40R、Y85W、F87C、F102I、I109F、L114T、N119H、D230N、A235T、S237N、G322A、L335H和P355S替换。结果显示：N端6个潜在磷酸化位点分别替换成中性氨基酸残基并不能改善AtGPAT9活性(图3B)。除了N119H，其他的单位点突变亦对AtGPAT9在酵母异源系统中的活性不产生可见影响(表2)。在酵母菌浓度梯度稀释培养实验中，N119H替换能使AtGPAT9恢复ZAFU1突变体在葡萄糖上的生长缺陷，但这种作用相对较弱(表2，图5D)。
图 5 多位点突变对AtGPAT9酶活性的影响Figure 5 Effects of mutations at multiple sites on AtGPAT9 activity2.4 多个氨基酸残基突变对GPAT9活性的交互影响
基于相邻与非相邻氨基酸残基之间均可能对酶活性产生某种特定的互作效应的假设，根据AtGPAT9和BnGPAT9之间存在的氨基酸差异，进一步构建了28个含有2~4个氨基酸残基替换的AtGPAT9突变酶。与W85、H119和N237位点对BnGPAT9活性产生重要调节作用一致，同步替换AtGPAT9上2或3个相应位点的氨基酸残基(Y85W、N119H、S237N)均能大幅提高AtGPAT9酶活性，表现为携带Y85W/N119H、Y85W/S237N、N119H/S237N、Y85W/N119H/S237N突变的AtGPAT9均能互补菌株ZAFU1的生长缺陷(图5A)；不过，单位点突变对AtGPAT9活性的影响十分有限(表2)。进一步调查发现：携带Y85W/N119H或Y85W/N119H/S237N突变组合的AtGPAT9比野生型BnGPAT9更能促进菌株ZAFU1的生长，且与携带T114L突变的BnGPAT9具有相近的作用效果(图3A，图5A)。
为了更好地剖析114位氨基酸性质对GAPT9活性的调节作用以及与其他氨基酸相互作用产生的效应，将双位点突变酶AtGPAT9 (Y85W/N119H)和三位点突变酶AtGPAT9 (Y85W/N119H/S237N)的114位亮氨酸(L114)替换为BnGPAT9相应位置存在的苏氨酸(T)。结果显示：生成的三位点突变酶AtGPAT9 (Y85W/L114T/N119H)的活性明显弱于AtGPAT9 (Y85W/N119H)，但四位点突变酶AtGPAT9(Y85W/L114T/N119H/S237N)仍与AtGPAT9 (Y85W/N119H/S237N)的活性相当(图5B)。对这种现象的可能解释是，当2个潜在磷酸化位点即T114和S237同时出现于AtGPAT9 (Y85W/L114T/N119H) (其中含S237)或BnGPAT9 (N237S)(其中含T114)时，GPAT9的磷酸化程度可能加剧，从而抑制酶的活性。因此，推测植物GPAT9活性可能受磷酸化和非磷酸化机制调节，野生型GPAT9中存在的2个潜在磷酸化位点T114和S237可能对酰基转移酶活性产生负面效应。
进一步研究发现：230位氨基酸残基能与85、119位氨基酸残基产生互作效应而影响GPAT活性。虽然D230N本身或与A235T、S237N组合突变未能对AtGPAT9酶活性产生明显影响(表2)，但当与N119H、Y85W/N119H或Y85W/S237N结合时， D230N突变能对AtGPAT9活性产生抑制作用。这是因为，与表达含N119H、Y85W/N119H或Y85W/S237N突变位点的酶的菌株相比，表达AtGPAT9 (N119H/D230N)、AtGPAT9 (Y85W/N119H/D230N)或AtGPAT9 (Y85W/D230N/S237N)的菌株ZAFU1在葡萄糖培养基上呈现生长速率明显减弱或不能生长的现象，暗示着D230N的替换不利于AtGPAT9活性(表2，图5B~D)。这一推测得到下述结果的支持，即N230D替换能提高BnGPAT9活性(图3A)。但是AtGPAT9(N119H/D230N/S237N)与AtGPAT9 (N119H/S237N)的活性相当，这说明D230N的负效应依赖于其他氨基酸的互作关系(表2，图5D)。
另外，N119H/D230N/S237N和N119H/A235T/S237N三突变组合均能提高AtGPAT9活性，使之具有拯救ZAFU1生长缺陷的能力，但在前者和后者中分别添加A235T和D230N得到的N119H/D230N/A235T/S237N四突变组合，能使相应蛋白丧失GPAT活性，如野生型AtGPAT9一样，无法恢复ZAFU1的生长缺陷(表2，图5D)。此外，无论是S237N和G322A单或双替换，均不能增强AtGPAT9在酵母中表达时的活性(表2)，这与N237S或A322G的替换导致BnGPAT9活性下降现象不一致。由此可见，尽管在237位保留非磷酸化氨基酸(天冬酰胺，N)对BnGPAT9活性有利，但其效应取决于其他位置的氨基酸性质。
综上所述，GPAT9的酶活性受85、114、119、230、237和322位氨基酸残基性质的影响，它们之间存在互作效应；当这些位置的氨基酸残基分别为色氨酸(W)、亮氨酸(L)、组氨酸(H)、天冬氨酸(D)、天冬酰胺(N)和丙氨酸(A)时，酰基转移酶的活性较高。上述多位点突变增强AtGPT9酶活性的事实说明：运用分子设计能有效地改造和优化酰基转移酶的结构，并使之产生新的特性，这对将来人为操控甘油脂的从头合成十分有益。
2.5 异源表达突变酶对酵母油脂合成的影响
为进一步探究氨基酸位点突变对GPAT9功能的影响，选取了3个活性程度不同的AtGPAT9突变酶，分别含N119H、Y85W/N119H 和Y85W/N119H/S237N突变，使其进行异源表达，测定其表达对酵母细胞中TAG合成的影响；阳性对照为野生型BnGPAT9。当相应酵母细胞的生长进入平台生长期时，提取总脂质，经薄层层析分离后，采用气相色谱法测定TAG含量。
需要指出的是，因不同突变酶活性的差异，相应酵母菌到达平台生长期所需的培养时间不一，且平台生长期时的细胞密度也不完全相同。譬如，表达BnGPAT9、AtGPAT9 (Y85W/N119H)和AtGPAT9 (Y85W/N119H/S237N)的酵母细胞在平台生长期时的细胞密度，以D(600)表示，分别为3.72、4.40、5.32 (图6)。总体而言，酶活性愈大，细胞生长越快、密度越高。
图 6 含不同突变位点的AtGPAT9表达对不同生长期酵母菌株ZAFU1的细胞密度影响Figure 6 Effects of expression of AtGPAT9 bearing different mutation sites on cell density of the yeast strain ZAFU1 in different periods of growth脂质分析显示：AtGPAT9 (Y85W/N119H/S237N)的表达使突变体酵母ZAFU1细胞中的TAG含量达0.51%，而BnGPAT9和AtGPAT9 (Y85W/N119H)的表达则分别产生0.35%和0.39%的含油量，前者比后两者分别增加了45.7%和 30.8% (图7)。与AtGPAT9 (N119H)具有相对较低的活性一致，表达此酶的酵母细胞，其TAG含量仅为0.22%，显著低于表达BnGPAT9的酵母细胞(0.35%)。以上结果表明：酵母细胞中TAG的合成能力受GPAT活性的调节，而GPAT活性大小与特定位置的氨基酸性质密切相关，因此通过分子设计优化GPAT9的氨基酸组成将有助于修饰细胞中TAG的合成能力。
图 7 含不同突变位点的AtGPAT9表达对平台生长期酵母菌株ZAFU1的TAG含量影响Figure 7 Effects of expression of AtGPAT9 bearing different mutation sites on TAG content of the yeast strain ZAFU1 at the stationary phase3. 讨论
提高油料作物油脂的合成对于保障食用油的供需平衡至关重要；相反，人类细胞中油脂合成能力的增强并非对健康有利，因为这会诱发肥胖症和心血管疾病等。目前人们试图运用遗传或化学遗传方法操控TAG的生物合成[11-16]，但仍存在诸多因素影响，如人们对TAG合成途径中酶的结构与功能的内在关系知之甚少，这阻碍了酶结构的优化，并限制了基于翻译后修饰机制调控酶活性的技术开发。本研究充分利用GPAT专一的酵母遗传互补法[25, 31]，鉴定控制植物GPAT9酶活性的关键氨基酸位点以及不同位点之间存在的互作效应，以深化对酰基转移酶结构与功能内在关系的认知，为将来运用合成生物学等手段有效操控真核生物中TAG的合成提供基础。
植物GPAT9与哺乳动物GPAT3结构相似，两者均参与极性膜脂和中性三酰甘油的生物合成[20-22]。尽管AtGPAT9和BnGPAT9序列相似性大于90%，它们在酵母异源表达时呈现的活性却相去甚远[23-24]，这一特性有助于有效寻找调控酶活性的候选位点。在此基础上，本研究首次明确了酰基转移酶保守结构域外的6个氨基酸位点对植物GPAT酶活性的重要调节作用。
3.1 W85和H119对GPAT9膜结合性质的影响
AtGPAT9的N端和C端均暴露于细胞质，意味着该蛋白应有偶数个跨膜结构域[20]，然而这与生物信息学预测结果不一致，即AtGPAT9含3个潜在的跨膜结构域。对于这一现象的可能解释是，位于N端的几个脯氨酸残基可能会形成一个铰链状结构，使得疏水结构域Ⅰ不能跨膜，而是附着在内质网的表面[20]。基于85和119位氨基酸残基分别位于预测的第Ⅰ和Ⅱ个疏水结构域这一特点推测，将85位的疏水色氨酸替换成亲水的酪氨酸(Y)或将119位带正电荷的组氨酸替换成中性的天冬酰胺，可能会改变GPAT9在膜中的组装方式[33]，这可能是构成AtGPAT9的酶活性低于BnGPAT9的原因之一。
3.2 磷酸化机制调节对GPAT9活性的影响
本研究结果表明：尽管AtGPAT9的N端的6个磷酸化位点单独突变(T10A、S11A、S13A、S28A、S30A和 S31A)不能增强AtGPAT9在酵母异源表达时的活性，但T114L替换能增强BnGPAT9酶活性，而N237S替换则降低其活性。当114和237位氨基酸残基为非磷酸化氨基酸，即亮氨酸和天冬酰胺，而不是潜在的磷酸化位点苏氨酸(T)和丝氨酸(S)时，AtGPAT9和BnGPAT9突变酶保持较高活性。因此，推测GPAT9的活性受磷酸化机制调节，在114和237位点的磷酸化程度升高不利于维持酰基转移酶的活性。这种假设可以在某种程度上得到过去研究的支持。蛋白质磷酸化与非磷酸化修饰是酶活性的一种重要调节方式，已有研究报道哺乳动物线粒体GPAT (mtGPAT1)通过其C端S632和S639残基的磷酸化修饰调节其活性，酵母GPAT (Gat1p和Gat2p)的C端氨基酸残基发生磷酸化后也能使酶活性下调[34-35]。
3.3 多个氨基酸位点的互作效应对酰基转移酶活性的影响
当多个氨基酸残基同时突变时，它们之间的物理相互作用会导致蛋白质分子内的上位效应[36]。某些氨基酸残基突变组合可以产生协同作用，即产生正向上位效应，如Y85W、N119H和S237N任意突变组合均能增强AtGPAT9活性。相反，其他突变组合可能形成拮抗作用，导致负向上位效应，下调酶活性或彻底损伤蛋白质功能，正如AtGPAT9 (N119H/D230N/A235T/S237N)突变酶中4个氨基酸残基相互间的某种拮抗作用导致该突变酶在酵母ZAFU1中无法发挥功能。230、235和237位氨基酸残基位置相近，且位于酰基转移酶保守结构域Ⅱ中的精氨酸(R215)和Ⅲ中的谷氨酸(E245)之间；鉴于R215和E245这2个氨基酸残基对GPAT的底物结合至关重要[18]，推测230、235和237位氨基酸残基与其他位点之间存在的复杂互作效应对酶活性的影响可能与其干扰3-磷酸甘油底物结合区域的三维结构有关[37]。
尽管N237S或A322G单位点突变均能降低BnGPAT9的活性，但无论是S237N和G322A单或双替换均不能增强AtGPAT9的活性，这从一个侧面说明237和322位氨基酸的作用均极大地受到其他氨基酸的理化性质影响。但需要指出的是，两者的作用方式可能不一。如前所述，237位氨基酸的磷酸化状态可能对酶活性产生某种调节作用，而322位的丙氨酸被甘氨酸取代可能会影响蛋白构象的稳定性，这是因为甘氨酸侧链小，仅有1个氢原子，这不利于α-螺旋结构的稳定。与此一致，三维空间结构预测显示：BnGPAT9中的A322与AtGPAT9中的G322相比，前者在空间上更靠近114、119、230、235、237位氨基酸残基(它们可能与酶活性中心形成有关)，这可能对GPAT9活性产生正面效应。鉴于237与322位氨基酸的重要作用，将来有必要进一步探究在这2个氨基酸位点的何种替换有利于增强酰基转移酶的活性。
4. 结论
本研究首次报道了6个位于酰基转移酶保守区域外的GPAT9酶活性调控位点及其复杂的互作效应，从而深化了对酰基转移酶结构与功能内在关系的认知，为酰基转移酶的分子改造与结构优化提供了理论基础。另外，构建的GPAT9变异基因可用于探索植物中TAG的生物合成机制，特别是磷酸化-非磷酸化调控机制对GPAT酶活性的调节作用。
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图 1 不同演替程度下生物量、生物多样性和林分密度的变化
不同字母表示各指数在不同演替程度间差异显著(P＜0.05)
Figure 1 Change of biomass, biodiversity and stand density of different remolding modes
表 1 生物量计算方法
Table 1. Biomass calculation methods
树种 生物量计算公式 参考文献 马尾松 ${ W=0.105\;6 ({D}^{2}H{)}^{0.824\;7}} $ [19] 麻栎 $ {W=1.137\;96 \times {10}^{-3}{D}^{2.082\;5}{H}^{2.115\;4} }$ [20] 樟树 $ {W=0.112\;502 \left({D}^{2}H\right)} $ [20] 柏木 $ {W=0.027\;241 ({D}^{2}H{)}^{1.008\;7}} $ [20] 杉木 $ {W=0.257 ({D}^{2}H{)}^{0.697\;0}} $ [21] 其他阔叶树种 $\;\;{ {\ln}W=-1.982+1.209{\ln}{D}^{2}} $ [22] 说明：W为生物量；D为胸径；H为树高 
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表 2 单木材积生长率方程
Table 2. Wood growth rate equation of P. massoniana and broad-leaved trees
树种 单木材积生长率方程 马尾松 ${ Y=5.528+99.865 {\rm{exp} }(-0.101 D-0.086 A)}$ 其他阔叶树种 ${Y=0.088+0.007 D}$ 说明：Y为单木材积生长率；D为单木胸径；A为年龄
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表 3 生物量扩展因子方程
Table 3. Biomass expansion factor equation of P. massoniana and mixed coniferous forests
林分 生物量扩展因子方程 马尾松纯林 ${B=0.503\;4 V+20.547\;0 }$ 针阔混交林 ${ B=0.516\;8 V+33.237\;8}$ 说明：B为单木生物量；V为单木材积
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表 4 逐步回归模型筛选结果
Table 4. Stepwise regression model fitting results
变量 估算值 标准差 t P 重要性/% Shannon-
Wiener指数−208.114 67.232 −3.095 ＜0.01 16.05 Simpson指数 1 021.108 276.740 3.690 ＜0.001 21.65 Pielou指数 −365.918 107.731 −3.397 ＜0.01 19.58 功能离散度 −89.342 23.988 −3.724 ＜0.001 42.71
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