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竹材人造板是以竹材为原料，经过一系列的机械和化学加工，在一定的温度和压力下，借助胶黏剂或竹材自身结合力的作用，胶合而成的板状材料[1]。20多年来，中国竹材的开发得到了很大的发展[2]。出现了如竹材胶合板、竹蔑帘复合板、竹帘人造板等一批有代表性的工业化产品[3]，在一定程度上缓解了木材供应的短缺，弥补了木材制品的不足。但是，以上3种竹材人造板的单元材料都是竹条(竹篾)，特别是竹帘胶合板生产企业的原料(竹帘)收购质量控制仅仅局限于竹帘编织的疏密，而对同一竹帘中竹片的厚度均匀性、形态特征、缺陷等问题不够重视，生产过程中只是根据经验粗略的组坯，导致产品质量参差不齐，既浪费原料，又使产品内应力增加，稳定性较差。为了解决上述问题，研究了在同一层中采用不同质量(包括厚度均匀性、形态特征、缺陷等)的竹片制造竹帘胶合板，通过对其纵向静曲强度和弹性模量的测试和分析，寻求竹片的厚度误差允许值以及缺陷和形态特征要求，以便于在相同密度下生产出具有较高强度的竹帘胶合材。
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竹片由浙江省江山市某竹业有限公司提供，规格：厚竹片450.0 mm × 18.0 mm (14.0~25.0 mm) × 3.0 mm；薄竹片450.0 mm × 15.0 mm × 1.2 mm。不同类型竹片的形态特征见表 1。胶黏剂为固含量为28%的水溶性酚醛树脂浸渍胶，由浙江省江山市某竹业有限公司供应。
表 1 不同类型竹片的形态特征
Table 1. Morphological characteristics of different types of bamboo
类别 厚度误差/mm 表面状况及缺陷 有无竹黄层 不规则弯曲情况/mm A类 < ±0.2 表面光洁无缺损 无竹黄 ≤0.5 B类 ±0.2~±0.4 表面光洁无缺损 无竹黄 0.5~1.5 C类 ±0.4~±0.6 表面粗糙无缺损 有少量竹黄 1.5~2.5 D类 ±0.6~±0.8 表面粗糖少量缺损 有大量经碾压竹黄 2.5~3.5 E类 > ±0.8 表面粗糙有缺损 有大量未经碾压竹黄 3.5~4.5 -
XLB-D500×D500×1平板硫化机，JA2003电子天平，MWD-50微机控制式木材万能试验机，推台锯，烘箱，游标卡尺，卷尺，厚度规等。
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试验制板工艺流程为竹片选材→干燥→称量→施胶→凉干(干燥)→铺装→胶合→取样→检测。
试验设计密度为850~880 kg·m-3的竹帘胶合板，厚、薄竹片浸胶时间都为5 min，铺装时采用以中间层对称的原则，自下而上为：纵向3层薄竹片，纵向3层厚竹片，横向1层厚竹片，纵向1层厚竹片(芯层)，横向1层厚竹片，纵向3层厚竹片，纵向3层薄竹片(图 1)。在上下各盖1层脱膜纸，然后再覆盖上钢板。采用厚度为32.0 mm的厚度规。
图 1 铺装结构
Figure 1. Laying-structure
热压参数为：热压温度为(140±5) ℃，压力为3.5~4.0 MPa。等待上下压板温度达到要求后将板坯放入热压机进行45 min热压，然后冷却到70 ℃以下取出，自然存放48 h[4-7]。
每一种竹片各制得4块竹帘胶合板，用推台锯机锯成350.0 mm × 210.0 mm × 32.0 mm(长×宽×厚)的样品块，再将样品块锯成350.0 mm × 50.0 mm × 32.0 mm(长×宽×厚)的条形竹胶板4块，即同类竹片制得的板材检测试样共16块，用于检测静曲强度(MOR)与弹性模量(MOE)。将同一块板上的4个试样数据取平均值，记录试验结果如表 2(表 2中同一块竹胶板上的4个试件只列出性能平均值，如E：1-1表示E类竹片制得的1-1号竹胶板上4个试件的纵向静曲强度及弹性模量的平均值，以此类推)。
表 2 试验结果数据
Table 2. Tentative data
试件序号 纵向静曲强度/MPa 弹性模量/MPa E：1-1 39.1 5 051.0 E：1-2 45.7 5 555.8 E：1-3 41.8 4 680.2 E：1-4 38.4 5 366.9 D：2-1 62.6 5 442.2 D：2-2 70.0 5 804.6 D：2-3 66.9 5 243.6 D：2-4 61.3 5 307.4 C：3-1 62.5 5 621.1 C：3-2 82.9 6 051.0 C：3-3 93.9 6 483.3 C：3-4 81.1 5 795.3 B：4-1 115.6 7 295.3 B：4-2 118.2 7 547.7 B：4-3 122.1 8 055.1 B：4-4 113.3 6 945.4 A：5-1 122.8 7 457.8 A：5-2 129.8 7 623.2 A：5-3 121.7 7 498.9 A：5-4 123.8 7 293.3 -
E类竹片单元的形态特征图以及制得的竹胶板厚度方向上的竹片在横向与纵向的排列情况见图 2~3。
图 2 E类竹片形态特征图
Figure 2. Form characteristic of E kind bamboo slices
图 3 横向与级向
Figure 3. Transverse and longitudinally
根据表 2可知：采用E类竹片单元制得的竹胶板的静曲强度为41.3 MPa，弹性模量为5 163.5 MPa。采用E类竹片单元制得的竹胶板的静曲强度和弹性模量数值都较低，从图 3的横向端面中可以清晰地看到，在铺装过程中厚层竹片有明显的厚薄不均的现象，导致薄的竹片在压力不足的情况下无法得到完全胶合。另外，竹片上存在竹黄，而竹黄组织疏松，质地脆弱，强度低，难以劈篾，因此也导致了胶合后强度不高[8-10]。在图 3中横向的竹片有非常明显的拱形现象，主要由于竹片厚度不均，从而使得在热压过程中需要的压力极高，否则极易产生竹片之间接触不良导致无法胶合的情况。在横向和纵向的竹片排列中，竹片之间不够紧密，空隙比较大。结合以上的几点原因，静曲强度和弹性模量与实际想要的结果相差甚大。
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D类竹片单元的形态特征图以及制得的竹胶板厚度方向上的竹片在横向与纵向的排列情况见图 4~5。
图 4 D类竹片形态特征图
Figure 4. Form characteristic of D kind bamboo slices
图 5 横向与级向
Figure 5. Transverse and longitudinally
根据表 2可知：采用D类竹片单元制得的竹胶板的静曲强度为65.2 MPa，弹性模量为5 449.5 MPa。采用D类竹片单元制得的竹胶板的静曲强度和弹性模量数值与采用E类竹片单元制得的竹胶板的静曲强度和弹性模量数值相比有所提高，主要是在竹片铺装方面有了改进，排列得比较紧密，并且对竹片竹黄部分进行了碾压，有利于热压过程中的胶合。在图 5中，竹片不平整，成拱形，有明显的竹黄层，且发现厚层竹片的厚薄差异较大，而且有的竹片中间厚，两边薄，增加了胶合的难度。由于竹片厚度误差仍然很高，因此，可以在在图 5纵向图中看出，横向排列的竹片与纵向的竹片仍未完全胶合，存在缝隙。但纵向与纵向的竹片胶合完全，较为平整。因此，静曲强度和弹性模量相比于E类有一定程度的提高。
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C类竹片单元的形态特征图以及制得的竹胶板厚度方向上的竹片在横向与纵向的排列情况见图 6~7。
图 6 C类竹片形态特征图
Figure 6. Form characteristic of C kind bamboo slices
图 7 横向与级向
Figure 7. Transverse and longitudinally
根据表 2可知：采用C类竹片单元制得的竹胶板的静曲强度为80.1 MPa，弹性模量为5 987.7 MPa。采用C类竹片单元制得的竹胶板的静曲强度和弹性模量数值在前2个试件的基础上都有所提高。在选择竹片方面尽可能地避免了那些弯曲变形、表面不平整、有竹黄层的竹片，使得每块试件性能的差值小。不过从图 7中可以看出：竹胶合板的上半部分和下半部分的厚竹片层差异比较大，就直接导致了试件上、下部分竹胶合板的密度不均匀，使得产品的性能变差。
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B类竹片单元的形态特征图以及制得的竹胶板厚度方向上的竹片在横向与纵向的排列情况见图 8~9。
图 8 B类竹片形态特征图
Figure 8. Form characteristic of B kind bamboo slices
图 9 横向与级向
Figure 9. Transverse and longitudinally
根据表 2可知：采用B类竹片单元制得的竹胶板的静曲强度为117.3 MPa，弹性模量为7 460.9 MPa。采用B类竹片单元制得的竹胶板的静曲强度和弹性模量数值有了大幅度的提高，主要是对竹片进行了优选，选择的竹片表面较为平整、尽量弯曲度小，而且在铺装上对竹片优化排列，减少了厚薄差异，如图 8~9。不过试件B4-4性能与其他3个差异较大，分析原因主要是有个别竹片成拱形状态(图 9)，在热压过程中，中间裂开，导致了竹材胶合板性能的下降。
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A类竹片单元的形态特征图以及制得的竹胶板厚度方向上的竹片在横向与纵向的排列情况见图 10~11。
图 10 A类竹片形态特征图
Figure 10. From characteristic of A kind bamboo slices
图 11 横向与纵向
Figure 11. Transverse and longitudinally
根据表 2可知：采用A类竹片单元制得的竹胶板的静曲强度为124.5 MPa，弹性模量为7 468.3 MPa。采用A类竹片单元制得的竹胶板可以说是比较成功的，静曲强度和弹性模量也是所有试件中最高的，因为在选择竹片方面、铺装上都尽可能的做到最好。
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通过对不同质量的竹片单元制得的竹材胶合板的性能进行研究分析，可以得出：竹片的单元质量，
包括竹片取材部位、竹片弯曲度、竹片厚度均匀性、缺陷以及铺装方式对竹材胶合板的性能都具有一定的影响。另外，部分竹片中存在缺陷，节子突出，而竹子中竹节的维管束走向和分叉严重，影响竹材的韧性强度和均匀度，加工中由于竹节与节间材料的性能不一致，常引起表面不平，从而胶合强度不一致[11-12]，因此，在挑选最佳竹片形态时，应尽量避免竹节。
最佳制板竹片形态：挑选的竹片原料表面平整、无弯曲变形现象；各层的竹片厚度接近一致；以中心层对称，上下相应的各层厚度也接近一致；无竹黄层，无虫蛀无腐蚀现象；竹节平滑，不能有大幅度的突出。
最佳竹片单元的形态特征图以及制得的竹胶板厚度方向上的竹片在横向与纵向的排列情况见图 12~13。
图 12 最佳竹片形态特征图
Figure 12. Form characteristic of best kind bamboo slices
图 13 横向与级向
Figure 13. Transverse and longitudinally
采用最佳竹片单元制得的竹帘胶合板的性能数据见表 3。
表 3 竹材胶合板重复性试验结
Table 3. Bamboo-based plywood repeated tentative data
试件序号 纵向静曲强度/MPa 弹性模量/MPa 6月1日 131.2 10 278.4 6月2日 131.0 10 523.9 6月3日 127.8 10 476.3 6月4日 128.9 10 720.8 -
最佳制板竹片形态：竹片原料表面平整、无弯曲拱起的变形现象；各层的竹片厚度均匀性高；以中心层对称，上下相应的各层厚度也接近一致；尽量避免竹黄层，且无腐蚀及虫蛀现象；竹节平滑，无大幅度的突出。
厚度误差、不规则弯曲程度越小，表面质量越好，则产品的纵向静曲强度与弹性模量越高；在试验范围内，厚度误差小于0.2 mm的竹片制成的竹帘胶合板，其纵向静曲强度与弹性模量达到最高值，分别为124.5 MPa和7 468.3 MPa。
今后只有制造出高精度的劈篾机，才能提高竹片单元质量，从而提高竹材胶合板的性能。
Quality of pieces for bamboo curtain plywood using MOR and MOE
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摘要: 采用不同质量的竹片(竹篾), 按产品特定的结构与工艺要求, 制造用于车箱底板的32.0 mm竹帘胶合板。通过对其纵向静曲强度与弹性模量的测试与分析, 研究制造车箱底板用的竹片(竹篾)的质量优化方案。结果表明:①竹片厚度误差、不规则弯曲程度越小, 表面质量越好, 缺陷越少, 产品的纵向静曲强度与弹性模量越高; ②厚度误差小于0.2 mm的A类竹片制成的竹帘胶合板, 其静曲强度与弹性模量达到较高值, 分别为124.5 MPa和7 468.3 MPa; ③竹片厚度误差与表面质量对竹帘胶合板强度影响显著, 竹片质量较好的A类竹片制成的竹帘胶合板的静曲强度为竹片质量一般的E类竹片制成的竹帘胶合板静曲强度的3倍, 弹性模量则提高了45%。Abstract: To find the optimize scheme of bamboo piece quality for specific product, making 32 mm bamboo curtain plywood by using different quality of bamboo pieces. Comparisons and analyses of their longitudinal modulus of rupture (MOR) and modulus of elasticity (MOE) were conducted. Results for the range of comparisons showed:1) A smaller thickness error and higher surface quality of bamboo pieces significantly increased the strength of bamboo curtain plywood; 2) The smaller the thickness error, defect, and degree of irregular bending, and the better the surface quality; the higher the numerical value of the longitudinal MOR and MOE; 3) With thickness error < 0.2 mm, longitudinal MOR and MOE were greatest:MOR=124.5 MPa and MOE=7 468.3 MPa. It means that high-precision bamboo split machine is necessary to make high quality of bamboo pieces in order to improve the performance of the bamboo curtain plywood.
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香榧Torreya grandis ‘Merrillii’是红豆杉科Taxaceae榧树属Torreya的优质品种，其种子可食用，是著名的特色干果[1]；种仁含油率较高[2]，具有很高的经济价值[3]。随着各类栽培技术的开发，中国的香榧种植产业规模也在不断扩大，对于香榧植株及干果[4]的有关研究已经比较成熟，但对于香榧愈伤组织培养的研究还处在相对落后的阶段。
植物愈伤细胞的悬浮培养是一种通过调控细胞生长，快速获得大量细胞以及目的产物的技术，不受各类局限进行周年生产。建立好的培养体系以及优化培养条件，可以超过原有的生产方式[5]。王沐兰等[6]通过建立红豆杉Taxus chinensis高产悬浮细胞系，提高了紫杉醇的产量；赵文佳[7]诱导青钱柳Cyclocarya paliurus红色愈伤系，并利用细胞悬浮培养技术建立了花青素的生产体系。此外，国槐Sophora japonica[8]、南方红豆杉Taxus wallichiana[9]和落叶松Larix gmelinii[10]等植物的悬浮培养体系也已经建立。然而在香榧悬浮培养体系中，细胞生长动力学规律及最佳培养条件尚不清晰。
悬浮细胞的培养过程中需添加各类激素以促生长。赤霉素(GAs)是植物体内的一种重要激素，已被发现较多的种类，并按顺序命名为赤霉素A1 (GA1)、赤霉素A3 (GA3)等，在植物生长的各个环节都不可缺少[11−12]。在非生物胁迫或生物刺激下，外施赤霉素可以增加防御酶的数量或活性，进而影响植物抗性[13]。赤霉素还可对植物愈伤组织增殖过程中的褐化情况进行抑制，促进愈伤组织增殖[14]。
鉴于此，本研究通过优化香榧胚性愈伤组织悬浮培养基，探究其动力学特性，筛选最适合的培养条件，同时探究GA3处理下香榧胚性愈伤组织生长及差异基因表达的规律，为香榧愈伤组织的生长和遗传转化体系的构建提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 材料及培养条件
以浙江农林大学省部共建亚热带森林培育国家重点实验室培育的香榧胚性愈伤组织为试验材料。使用SH液体培养基，其中添加脱落酸(ABA) 1.0 mg·L−1、水解酪蛋白(CH) 500.0 mg·L−1、蔗糖30.0 g·L−1、活性炭2.0 g·L−1和GA3 0.5 mg·L−1，设置pH 5.7，摇床转速为110 r·min−1，25 ℃暗培养。
1.2 悬浮培养细胞生长曲线及活力测定
在100 mL的锥形瓶中添置30 mL的SH液体培养基(配方同1.1)，香榧胚性愈伤组织接种量为30 g·L−1，设置pH 5.7，转速为110 r·min−1，每3 d取样测定细胞鲜质量及细胞活力(氯化三苯四氮还原法，TTC)，即波长为485 nm处的吸光度。
1.3 悬浮培养条件优化
1.3.1 培养条件筛选
在100 mL锥形瓶中添置30 mL的SH液体培养基(配方及培养条件同1.1)，设置转接愈伤组织接种量为10、20、30、40、50 g·L−1；pH为5.5、5.6、5.7、5.8、5.9；摇床转速为70、90、110、130、150 r·min−1。25 ℃摇床中振荡暗培养。每个处理设置3个重复，21 d时统计鲜质量，计算细胞增长率，细胞增长率=(收获量−接种量)/接种量×100%。
1.3.2 抗氧化酶活性测定
超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮蓝四唑光化还原法测定；过氧化物酶(POD)活性采用愈创木酚法测定；过氧化氢酶(CAT)活性采用紫外吸收法测定[15]。
1.4 测序RNA提取
将香榧胚性愈伤组织接种于SH液体培养基中(配方及培养条件同1.1)，设置对照组(ck)和实验组(GA3+)，对照组培养基中不添加GA3，实验组培养基中施加GA3。18 d后收集材料，使用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)，按说明书提取RNA，分别设置3个生物学重复，使用分光光度计检测浓度与纯度。
1.5 转录组测序
测序工作由北京诺禾致源科技有限公司完成，采用Illumina HiSeqTM 2000测序平台进行测序。由于香榧没有参考基因组，将聚类分析结果中最长的转录本作为参考序列单基因簇进行后续分析。
1.6 差异表达基因的筛选及功能注释
采用RSEM软件将每个样品过滤后的数据(clean reads)在参考序列上做比对。采用DESeq分析差异表达基因(DEG)，以|log2Fc|＞1 (Fc为表达量的差异倍数)且P＜0.005为筛选条件[16]。将差异表达基因注释到基因本体论数据库(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)，并进行GO和KEGG富集分析。
1.7 实时荧光定量PCR (RT-qPCR)验证
使用Primer 3.0 input在线软件设计引物(表1)，以TgActin为内参基因[16]。用Takara生物科技有限公司的反转录试剂将提取的RNA反转录成cDNA进行RT-qPCR验证，每个样品3个生物学重复。反应体系为10.0 μL，包括5.0 μL的TB GREEN，0.2 μL的上下游引物，0.4 μL的模板cDNA，4.2 μL的ddH2O。PCR反应程序为：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s共39个循环。
表 1 差异表达基因RT-qPCR的特异性引物信息Table 1 Gene-specific primer information for RT-qPCR引物名称 正向引物(5′→3′) 反向引物(5′→3′) XM_024662224.1 TCCAAGGGAAGGGGAACATC TCCCCGGATTGCAGAAGATT XM_027242615.1 TGTACCCTCCACCCTTTTCC TCTATCAGGGAGGGAGCAGA XM_020665027.1 TACGACCAGTCAGAGGCTTG AAACACCCACCGTCTTTGAC XM_002991298.2 CACGCCCAATTTTCACGAGA CGAAAACTAGGCAGGGCATC XM_022920293.1 TCGACCTTGAGACCTGGAAC TGATGGTGCAGCAAATCAGG TgActin TGGCATCTCTCAGCACATTCCA TGCCAACATCTCAAGCAAGCAC 1.8 数据分析
使用Excel处理数据，采用SPSS 26进行单因素方差分析(one-way ANOVA)和多重比较(邓肯法)，显著性水平为0.05，使用GraphPad Prism 9软件作图。
2. 结果与分析
2.1 香榧胚性愈伤组织悬浮培养的动力学
香榧胚性愈伤组织悬浮培养时，细胞鲜质量变化呈“S”型曲线。在0~6 d鲜质量增加缓慢；7~18 d鲜质量快速增加；18 d时达到最高值，为44.81 g；18~21 d进入稳定期，鲜质量基本不再增加；21 d后细胞进入衰退期，鲜质量下降。同时，在培养周期内香榧胚性细胞活力在0~3 d时快速增长，并在3 d时达到最高值(0.32)，之后持续下降，并且随着培养时间的延长，变化趋势趋向平缓(图1)，表明9~12 d为香榧胚性愈伤组织悬浮培养的最佳继代时期。
图 1 培养过程中细胞鲜质量和活力的变化Figure 1 Changes in fresh weight and viability of cells during incubation2.2 香榧胚性愈伤组织悬浮培养条件优化
2.2.1 接种量对香榧悬浮细胞的影响
随着接种量的增加，胚性愈伤组织增长率呈先上升后下降的趋势。当愈伤组织接种量为10 g·L−1时，细胞增长率最低(21.78%)；当接种量为30 g·L−1时，细胞增长率显著升高(P＜0.05)，达到最高值，为49.94%。SOD、POD和CAT活性均随接种量的增加而呈先升高后降低的趋势。当接种量为30 g·L−1时，SOD、POD和CAT活性均最高，显著高于其他接种量时的酶活性(P＜0.05)(图2A)。
图 2 不同培养条件对香榧胚性愈伤组织液体悬浮培养的影响Figure 2 Effect of different culture conditions on the liquid suspension culture of embryogenic callus of T. grandis ‘Merrillii’2.2.2 pH对香榧悬浮细胞的影响
随着pH的增加，香榧悬浮细胞增长率呈先上升后下降的趋势。当培养基pH为5.7时，细胞鲜质量增殖效果最佳，细胞增长率最大，为22.95%，显著高于其他处理(P＜0.05)。SOD、POD和CAT活性均随接种量的增加而呈先升高后降低的趋势。在pH为5.7时，悬浮细胞SOD、POD和CAT活性均最大，显著高于其他处理(P＜0.05)(图2B)。
2.2.3 转速对香榧悬浮细胞的影响
随着转速的增加，香榧悬浮细胞增长率呈逐渐上升的趋势，当转速为70 r·min−1时，细胞增长率较低，为20.33%；当转速达110 r·min−1时，细胞增长率最大，为50.84%，显著高于其他处理(P＜0.05)。SOD、POD和CAT活性均随摇床转速的增加而呈先升高后降低的趋势。当转速为110 r·min−1时，SOD、POD和CAT活性最大，显著高于其他处理(P＜0.05)(图2C)。
2.3 外源GA3对香榧胚性愈伤组织的影响
2.3.1 外源GA3处理下香榧胚性愈伤组织的转录组测序分析
所有检测样品纯净碱基数均达6.66 Gb以上，质量为Q20 (每项碱基质量大于20的碱基数占总碱基数的比例)的碱基比例均大于97.47%，达Q30 (每项碱基质量大于30的碱基数占总碱基数的比例)以上的碱基比例大于92.70%，每个样本碱基GC含量为43.53%~44.45%，较为一致，且测序碱基平均错误率均在0.1%以下，表明转录组数据较为准确。
2.3.2 差异表达基因分析
本研究共筛选到428个差异表达基因，其中236个基因上调表达，192个基因下调表达(图3A)。对照组与实验组共有表达的基因数为46 831个，对照组特有表达的基因数为10 580个，实验组特有表达的基因数为8 308个(图3B)。
2.3.3 差异基因GO注释及富集分析
GO功能注释与分类统计发现：差异表达基因被归类到2个功能分类组中，其中：分子功能中有17个基因涉及水解邻糖基化合物的水解酶活性；生物过程中细胞壁组织或生物合成过程注释到10个差异基因(图3C)。
2.3.4 差异基因KEGG注释及富集分析
将差异表达基因进行KEGG通路富集分析，对富集较多的前20个通路进行散点图绘制。差异基因富集最多的通路为苯丙烷生物合成；其次为淀粉和蔗糖代谢；再次为角质、木栓质和蜡的生物合成。而氰基氨基酸代谢、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化、丙酮酸代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢等通路富集较少(图3D)。
本研究有8个与苯丙烷生物合成相关的差异基因被富集到且呈上调表达，4个与过氧化物酶(POX)相关；2个与莽草酸-O-羟基肉桂酰转移酶(HCT)相关；2个与咖啡酸-O甲基转移酶(COMT)相关(图4)。本研究表明：GA3处理会使得香榧胚性愈伤组织细胞增加对苯丙氨酸的合成与利用，调控HCT、COMT、POX活性的基因上调表达，促进了对香豆酰辅酶A参与合成咖啡酰莽草酸、愈创木酰木质素等产物的过程，同时生成酚类物质参与其他途径物质合成。该过程产生的酚类物质还可能参与清除部分愈伤组织和培养基产生的有害活性氧，提高香榧胚性愈伤组织的抗性[17−19]。
图 4 苯丙烷生物合成与木栓质合成相关通路及差异表达基因Figure 4 Pathways and differentially expressed genes related to phenylpropanoid biosynthesis and suberin synthesis本研究有3个与木栓质生物合成相关的差异基因被富集到且呈上调表达，其中1个与脂肪酸ω-羟化酶(CYPB6B1)相关，2个与脂肪酰辅酶A还原酶(FAR)相关(图4)。与对照组相比，GA3处理会使FAR与CYPB6B1上调表达，参与ω-羟基脂肪酸下游α,ω-二羧酸和α,ω-二醇合成途径，促进下游单酰基甘油酯的合成，共同参与形成木栓质单体或低聚物，同时产生酚类物质[20]。该过程可结合苯丙烷合成途径产生的酚类物质，促进木栓质单体或低聚物的合成，应对环境变化并进行调整[21−22]。
2.3.5 GA3处理下香榧胚性愈伤组织差异表达基因RT-qPCR验证
RT-qPCR验证结果(图5)表明：5个基因与转录组测序结果呈现相同的表达趋势，2个基因上调表达，3个基因下调表达，说明转录组测序结果可靠。
3. 讨论
植物细胞悬浮培养是一个持续变化的过程。在悬浮细胞培养过程中，接种量直接影响细胞的生长。细胞需要足够的空间和营养物质支持其增殖，选择适当的接种量对于细胞的生长至关重要。已有研究表明：落叶松胚性愈伤组织的最佳接种量为4 g·L−1[6]。油茶Camellia oleifera愈伤细胞悬浮培养的最佳初始接种量为33 g· L−1[23]。本研究中，胚性愈伤组织接种量为30 g·L−1，有利于香榧悬浮细胞的生长，此时细胞增长率最大。在细胞生长过程中，细胞内部很多起关键调控作用的酶对pH有一定的要求。陈继光等[24]研究表明：青钱柳在pH为5时细胞活力较强，细胞质量增量达最大，当pH达6时，细胞活力和质量增量都开始下降。本研究中，pH为5.7时，香榧胚性愈伤组织悬浮细胞抗逆性最强，细胞增长率最大。悬浮培养中摇床转速对细胞生长也有较大的影响。较低的转速会使愈伤组织堆积导致褐化[4]；转速较高时会使细胞间产生碰撞导致破裂死亡，只有合适的转速才能使得细胞快速增殖生长[25]。本研究表明：转速为110 r·min−1时，香榧悬浮细胞生长最快。悬浮培养过程中对多种条件进行优化，能显著提升细胞的生长能力及抗性。
植物细胞在离体悬浮培养过程中，还须通过外施激素来促进细胞的生长。赤霉素在植物体的生命过程中起着重要的作用。当植物体处于胁迫条件时，外源赤霉素可以有效缓解胁迫的危害[26]。有研究表明：加入外源GA3可以有效缓解牡丹Paeonia × suffruticosa愈伤组织的褐化，并且提高愈伤组织诱导率[14]。本研究表明：在差异基因的GO富集分析中，GA3处理后上调表达基因主要参与催化活性、氧化还原过程、氧化还原酶活性等过程，说明活性氧的清除是香榧胚性愈伤组织增殖发育时的一个重要过程。在代谢通路中，差异表达基因主要富集在苯丙烷生物合成、淀粉和蔗糖代谢、木栓质合成等途径中。KEGG通路富集结果表明：苯丙烷生物合成途径中注释的差异表达基因最多，说明GA3处理后，香榧胚性愈伤组织的次级代谢途径产生了一定的变化。
苯丙烷代谢途径是植物体内多种防御性次生代谢产物(如黄酮类、木质素及水杨酸等)的主要来源[27]。有关木栓质相关合成途径的研究集中于植株根系以及部分受创伤部位[28]，对于其在植物愈伤组织内的合成与作用研究较少。本研究中，木栓质合成途径也有7个差异基因被显著富集，且呈上调表达。已有研究表明：细胞色素P450单加氧酶(CYP)家族与FAR主要参与木栓质的合成[29]。木栓质大分子的酚类组分已证明主要有阿魏酸、香豆酸等物质，通过苯丙烷生物合成途径产生，可继续生成木栓质单体中相应的底物物质，在一定程度上促进了木栓质单体的合成，影响细胞生长，以应对环境的胁迫[30]。这与本研究结果相似，推测外源GA3处理下香榧愈伤组织苯丙烷生物合成途径所产生的酚类物质不仅参与了活性氧的清除，还参与了木栓质单体的合成，对愈伤组织的生长及胁迫适应性产生一定的影响[31]。
4. 结论
香榧胚性愈伤组织悬浮细胞生长曲线呈“S”型，接种后9~12 d为最佳继代时期，设置接种量为30 g·L−1，pH为 5.7，摇床转速为110 r·min−1，可获得生长良好的香榧胚性愈伤组织细胞，同时也可以提高悬浮细胞的抗氧化能力。通过转录组分析发现：外源GA3处理下香榧胚性愈伤组织细胞苯丙烷生物合成、木栓质生物合成等相关代谢通路为差异基因的主要参与部分，且其中部分调空愈伤组织形成、生长和发育的关键基因表达量产生变化，可能在香榧愈伤组织的生长发育、适应环境变化以及应对胁迫相关过程中发挥重要作用。
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表 1 不同类型竹片的形态特征
Table 1. Morphological characteristics of different types of bamboo
类别 厚度误差/mm 表面状况及缺陷 有无竹黄层 不规则弯曲情况/mm A类 < ±0.2 表面光洁无缺损 无竹黄 ≤0.5 B类 ±0.2~±0.4 表面光洁无缺损 无竹黄 0.5~1.5 C类 ±0.4~±0.6 表面粗糙无缺损 有少量竹黄 1.5~2.5 D类 ±0.6~±0.8 表面粗糖少量缺损 有大量经碾压竹黄 2.5~3.5 E类 > ±0.8 表面粗糙有缺损 有大量未经碾压竹黄 3.5~4.5 
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表 2 试验结果数据
Table 2. Tentative data
试件序号 纵向静曲强度/MPa 弹性模量/MPa E：1-1 39.1 5 051.0 E：1-2 45.7 5 555.8 E：1-3 41.8 4 680.2 E：1-4 38.4 5 366.9 D：2-1 62.6 5 442.2 D：2-2 70.0 5 804.6 D：2-3 66.9 5 243.6 D：2-4 61.3 5 307.4 C：3-1 62.5 5 621.1 C：3-2 82.9 6 051.0 C：3-3 93.9 6 483.3 C：3-4 81.1 5 795.3 B：4-1 115.6 7 295.3 B：4-2 118.2 7 547.7 B：4-3 122.1 8 055.1 B：4-4 113.3 6 945.4 A：5-1 122.8 7 457.8 A：5-2 129.8 7 623.2 A：5-3 121.7 7 498.9 A：5-4 123.8 7 293.3
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表 3 竹材胶合板重复性试验结
Table 3. Bamboo-based plywood repeated tentative data
试件序号 纵向静曲强度/MPa 弹性模量/MPa 6月1日 131.2 10 278.4 6月2日 131.0 10 523.9 6月3日 127.8 10 476.3 6月4日 128.9 10 720.8
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链接本文:
https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.2014.05.015
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