木兰属Magnolia植物分布范围广, 多为高大乔木或灌木, 抗性强, 株型优美, 早春季节开花, 花色艳丽, 具有较高的观赏价值, 在园林绿化中应用广泛^[1], 具有广阔的市场价值。目前, 杂交育种是木兰属新品种选育的主要手段之一, 大部分种间杂交均表现为亲和^[2]。花粉活力的高低直接影响杂交育种工作的成败。花粉活力的测定方法有直接授粉、离体萌发、染色法等^[3]。直接授粉花粉生活力易受柱头可授性、授粉时期、花粉与柱头亲和性等因素影响^[4]。根据染色原理不同, 染色法分为氯化三苯基四氮唑(TTC)、碘-碘化钾法、联苯胺法、醋酸洋红染色法等, 该方法虽简单易操作, 但所测得的花粉活力受花粉自身特性的影响较大, 如花粉壁的厚度、花粉内各种酶活性的强弱等^[5], 未成熟、衰老或败育的花粉仍能染色^[6]。离体培养法为花粉提供的条件与花粉在柱头内萌发的条件相似^[7], 所得花粉活力与花粉在柱头上的活力最接近, 是检测花粉活力的最佳方法。近年来, 已有许多木兰属植物花粉形态、生活力及其储藏特性的相关研究, 如二乔玉兰Magnolia soulangeana^[8], 天女木兰Magnolia sieboldii^[9], 紫玉兰Magnolia liliflora^[10], 景宁木兰Magnolia sinostellata^[11]等, 研究表明不同植物适宜的培养基组分及质量浓度要求不同, 花粉离体培养中所需的萌发条件也不同。本研究在综合前人研究的基础上, 以望春玉兰Magnolia biondii, 长花玉兰Magnolia ‘Changhua’, 丹馨玉兰Magnolia ‘Danxin’, 黄山木兰Magnolia cylindrica等为试验材料, 研究不同培养基组分、培养温度及时间对花粉萌发的影响。旨在筛选出各植物材料适宜的培养基及花粉萌发最佳条件, 为木兰属植物的育种工作提供依据。

1.   材料与方法

1.1   试验材料

望春玉兰、长花玉兰、丹馨玉兰、黄山木兰等4种木兰属植物均来自于浙江农林大学苗圃地, 将所采集花药置于硫酸纸上, 自然干燥24~36 h, 待花药开裂后收集花粉, 并放置于硅胶中干燥, -80 ℃条件下储藏备用。

1.2   试验设计

1.2.1   单因子试验

采用离体培养法。蔗糖质量浓度梯度为0, 50, 100, 150, 200 g·L^-1; 硼酸质量浓度梯度为0, 50, 100, 200, 300 mg·L^-1; PEG-4000质量浓度梯度为0, 150, 200, 250, 300 g·L^-1。

1.2.2   正交试验

在单因子试验的基础上, 选取对试验材料影响较大的培养基组分及质量浓度, 进行L₉(3³)正交试验(表 1), 以得到最佳培养基组分。

表  1  4种木兰属植物花粉正交试验的萌发率

Table  1.  Pollen germination rate of four Magnolia species in orthogonal design experiment

编号	P蔗糖/(g·L-1)	P硼酸/ (mg·L-1)	PPEG-4000/(g·L-1)	花粉萌发率/%
				望春玉兰	长花玉兰	丹馨玉兰	黄山木兰
1	0	50	150	61.16 ± 4.05 abc	29.55 ± 3.89 bcd	12.24 ± 0.93 de	29.20 ± 4.73 c
2	0	100	200	58.34 ± 1.69 abc	20.74 ± 0.52 cd	11.95 ± 1.92 e	30.43 ± 2.14 c
3	0	200	250	54.95 ± 4.84 bc	18.78 ± 2.55 d	19.26 ± 2.83 bcd	18.36 ± 1.19 c
4	50	50	200	69.23 ± 5.48 a	35.85 ± 6.55 bc	21.09 ± 1.80 bc	50.02 ± 2.75 b
5	50	100	250	58.68 ± 1.38 abc	31.79 ± 3.63 bcd	16.50 ± 2.45 cde	69.54 ± 5.06 a
6	50	200	150	65.37 ± 0.62 abc	29.43 ± 4.89 bcd	18.12 ± 0.75 cde	64.64 ± 5.92 ab
7	100	50	250	68.50 ± 8.40 ab	37.66 ± 6.81 ab	25.58 ± 3.46 ab	56.37 ± 4.11 ab
8	100	100	150	52.86 ± 2.35 c	34.73 ± 6.68 bcd	29.79 ± 0.99 a	51.76 ± 9.96 b
9	100	200	200	65.86 ± 0.83 abc	51.47 ± 4.27 a	28.56 ± 2.80 a	50.85 ± 2.09 b
R(望春玉兰)	6.28	9.67	4.68
R（长花玉兰）	18.27	1.13	6.61
R（丹馨玉兰）	13.50	2.57	0.09
R（黄山木兰）	35.40	5.96	4.77
说明：同列数据后不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)

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1.2.3   最佳培养条件的确定

利用最佳培养基, 把4种试验材料分别置于15, 20, 25, 30, 35 ℃下进行离体培养, 培养12 h后, 根据实验结果, 确定最适萌发温度。在最适温度条件下, 分别培养3, 6, 9, 12, 15 h, 确定最佳培养条件。

1.3   试验方法

采用离体培养法, 在双凹载玻片内滴入培养液, 将充分混匀后的花粉均匀点入培养液中, 将载玻片置于铺有湿润滤纸的培养皿内, 25 ℃, 8 400 lx人工气候培养箱中培养12 h。在显微镜下观察统计, 花粉管长度等于或超过花粉粒直径的花粉即视为已萌发。重复3次·处理^-1，观察视野3个·重复^-1, 所统计的花粉粒不少于50粒·视野^-1。花粉萌发率=(萌发的花粉粒数/视野中花粉粒总数)×100%。

1.4   数据处理

使用Excel 2010对数据进行统计, 利用SPSS 22.0对原始数据进行反正弦转换并进行单因素方差分析(Duncan’s), 各处理间差异显著性水平为0.05。

2.   结果与分析

2.1   不同培养基组分对4种木兰属植物花粉萌发的影响

2.1.1   蔗糖对花粉萌发的影响

试验结果表明:不同质量浓度蔗糖对4种木兰属植物花粉萌发率影响显著(图 1A)。随着蔗糖质量浓度的增加, 4种花粉萌发率均呈先增加后减小的变化趋势。不同植物最大萌发率及最适蔗糖质量浓度有所不同, 望春玉兰花粉适宜的蔗糖质量浓度为50和100 g·L^-1, 花粉萌发率分别为62.56%和68.87%, 显著高于其他质量浓度处理下的萌发率(P＜0.05);当蔗糖质量浓度超过100 g·L^-1时, 望春玉兰花粉萌发率下降, 但蔗糖溶液中花粉萌发率均高于对照。长花玉兰在100 g·L^-1的蔗糖溶液中, 萌发率达最大, 为18.02%, 显著高于其他质量浓度处理(P＜0.05);蔗糖质量浓度为200 g·L^-1时, 花粉萌发率最低, 为9.90%, 比对照低1.92%。在各质量浓度蔗糖培养基上, 丹馨玉兰花粉萌发率均低于10%, 蔗糖质量浓度为0~100 g·L^-1时, 花粉萌发率差异不显著(P＞0.05);而高质量浓度蔗糖溶液对丹馨玉兰花粉萌发起抑制作用, 150和200 g·L^-1蔗糖质量浓度下, 花粉萌发率显著低于对照, 分别降低了3.47%和4.42%。黄山木兰花粉适宜的蔗糖质量浓度为50~100 g·L^-1, 在此范围内花粉萌发率显著高于对照(P＜0.05), 在200 g·L^-1蔗糖溶液中, 黄山木兰花粉萌发率最低, 为2.46%, 低于对照22.95%。

图  1  不同因素对4种木兰属植物花粉萌发率的影响

Figure  1.  Effects of different factors on pollen germination rate of four Magnolia species

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2.1.2   硼酸对花粉萌发的影响

硼酸对4种木兰属植物花粉萌发均有显著作用(图 1B)。其中, 望春玉兰花粉在200 mg·L^-1硼酸的培养液中萌发率高达79.63%, 显著高于其他质量浓度下花粉的萌发率(P＜0.05), 且比对照萌发率高46.89%, 高质量浓度的硼酸培养液中花粉萌发率与对照无显著差异(P＞0.05)。在0~200 mg·L^-1硼酸范围内, 长花玉兰花粉萌发率均随质量浓度的增加而上升, 其最适质量浓度为200 mg·L^-1, 萌发率为25.57%, 显著高于对照; 在300 mg·L^-1硼酸条件下, 萌发率开始下降。丹馨玉兰花粉在各质量浓度硼酸条件下萌发率差异均不显著(P＞0.05), 当硼酸质量浓度为50和100 mg·L^-1时, 花粉萌发率达最大, 分别为13.22%和14.93%, 对照萌发率最低, 为7.27%。黄山花粉萌发率随着硼酸质量浓度增大而增加, 在100 mg·L^-1时, 其花粉萌发率达最大, 为47.09%, 显著高于200 mg·L^-1下的萌发率(28.47%), 与其他质量浓度培养液中的花粉萌发率差异不显著(P＞0.05)。

2.1.3   PEG-4000对花粉萌发的影响

随着PEG-4000质量浓度的增加, 4种木兰属植物花粉萌发率均呈先增加后减小的变化趋势(图 1C)。PEG-4000的质量浓度为200和250 g·L^-1时, 望春玉兰花粉萌发率达最大, 分别为53.92%和51.21%, 显著高于其他质量浓度处理(P＜0.05)。长花玉兰花粉萌发的最适PEG-4000质量浓度为150 g·L^-1, 之后随着PEG-4000质量浓度的增加, 花粉萌发率降低; 当质量浓度为300 g·L^-1时, 花粉萌发率仅为2.41%, 显著低于对照萌发率(13.60%)。可见高质量浓度的PEG-4000抑制长花玉兰花粉萌发。丹馨玉兰花粉在PEG-4000质量浓度为150~250 g·L^-1时, 萌发率差异不显著(P＞0.05), 显著高于其他处理(P＜0.05);质量浓度为200 g·L^-1时萌发率最大, 为17.29%;300 g·L^-1 PEG-4000抑制花粉萌发, 萌发率仅为2.41%, 且低于对照(4.39%)。在150g·L^-1PEG-4000培养液中黄山木兰花粉萌发率达最大(42.39%), 显著高于其他质量浓度下花粉萌发率, 随着质量浓度增大, 萌发率呈逐渐递减趋势。

2.2   4种木兰属植物花粉最佳萌发培养基的选择

在单因子试验的基础上, 进行L₉(3³)正交试验, 寻找最佳培养基组合。试验结果表明(表 1):4种木兰属植物花粉萌发对液体培养基组分的质量浓度存在差异, 这可能因不同基因型花粉自身的萌发特性而异。望春玉兰在50 g·L^-1蔗糖+50 mg·L^-1硼酸+200 g·L^-1PEG-4000培养基下萌发率高于其他培养基, 高达69.23%, 极差分析表明各因素对其花粉萌发率的影响依次为:硼酸＞蔗糖＞PEG-4000。长花玉兰在100 g·L^-1蔗糖+200 mg·L^-1硼酸+200 g·L^-1 PEG-4000培养基下萌发率最高, 为51.47%, 极差分析显示对其花粉萌发率的影响因素依次为:蔗糖＞PEG-4000＞硼酸。丹馨玉兰在100 g·L^-1蔗糖+100 mg·L^-1硼酸+150 g·L^-1 PEG-4000培养基下萌发率最高, 为29.79%, 极差分析显示对其花粉萌发率的影响因素依次为:蔗糖＞硼酸＞PEG-4000。黄山木兰在50 g·L^-1蔗糖+100 mg·L^-1硼酸+250 g·L^-1 PEG-4000培养基下萌发率最高, 为69.54%, 极差分析表明各因素对其花粉萌发率的影响依次为蔗糖＞硼酸＞PEG-4000。

2.3   4种木兰属植物花粉萌发最适条件

2.3.1   最适培养温度

不同温度对望春玉兰、长花玉兰、丹馨玉兰及黄山木兰花粉萌发率均有一定的影响(图 3A)。15~25 ℃内, 随着温度的升高, 萌发率随之增加, 25 ℃时各植物花粉萌发率显著高于其他温度处理萌发率(P＜0.05), 依次为75.85%, 31.85%, 18.94%, 61.14%;在25~35 ℃内, 随着温度的上升, 萌发率受到抑制, 即温度过高或过低均不适合4种花粉萌发。由此可见:虽然4种不同遗传背景的花粉萌发率有较大差异, 但其最适萌发温度相同。

图  2  不同培养条件下4种木兰属植物花粉萌发率的变化

Figure  2.  Changes of different culture conditions on pollen germination rate of four Magnolia species

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2.3.2   最适培养时间

由试验结果可知(图 3B):培养3 h时, 4种木兰属植物花粉均已萌发, 6~9 h萌发率迅速上升, 12~15 h萌发率趋于稳定。其中培养9 h时, 望春玉兰和黄山木兰花粉萌发率达到最大, 分别为71.19%和59.82%, 而长花玉兰和丹馨玉兰花粉萌发率在培养12 h时达到最大, 分别为44.50%, 23.43%。4种植物花粉虽最适培养时间有所不同, 但其萌发趋势几乎一致。

3.   结论与讨论

蔗糖和硼酸是组成花粉离体培养基的基本成分, 蔗糖为花粉代谢、跨膜运输等过程提供必要的能量, 同时也是维持花粉内环境稳定的渗透调节物质^[12]。本研究结果表明, 蔗糖对4种木兰属植物花粉萌发的影响水平不同, 蔗糖在长花玉兰、丹馨玉兰及黄山木兰花粉萌发中具有主导作用, 但对望春玉兰花粉萌发率影响水平次于硼酸, 这可能与不同植物生物学特性相关。4种木兰属植物花粉萌发最适蔗糖质量浓度(50~100 g·L^-1)与二乔玉兰^[8], 天女木兰^[9]结果相符。

硼元素在植物体内作为微量营养生长调节剂, 以花器官内含量居多, 且主要分布于柱头及子房, 硼对糖分的吸收具有促进作用, 参与果胶物质的合成, 且促进花粉管壁的形成, 从而加快花粉萌发生长^[13]。本研究中, 4种木兰属植物所需最适硼酸质量浓度不同, 但在含有硼酸的培养基中花粉萌发率均高于对照, 即花粉萌发需要硼元素的参与。正交试验结果表明:望春玉兰花粉萌发所需硼酸质量浓度低于其他3种花粉, 可能由于蔗糖和PEG-4000的添加, 望春玉兰花粉对硼酸的需求量减少。长花玉兰在200 mg·L^-1硼酸溶液中萌发率达最大, 与景宁木兰研究结果相同^[11]; 丹馨玉兰、黄山木兰均在100 mg·L^-1硼酸溶液中萌发率达最大, 与二乔玉兰、天女木兰结果一致^[8-9]。由此可知:100~200 mg·L^-1硼酸可促进木兰属植物花粉萌发生长。

PEG-4000作为高分子渗透剂, 在花粉萌发过程中, 通常改变花粉内膜结构, 提高内膜通透性, 从而促进花粉粒萌发^[14]。单因素试验表明:4种木兰属植物最适PEG-4000质量浓度为150~250 g·L^-1, 对蜡梅Chimonanthus praecox^[15]的研究发现, 低质量浓度PEG-4000对花粉离体萌发作用不显著, 而高浓度下, 花粉萌发率显著受到抑制, 本研究结果与此相一致。正交试验结果表明:PEG-4000在4种花粉萌发中均不是主导因子, 而若蜡梅花粉离体培养基内不含PEG-4000, 其花粉不萌发^[15], 可能由于不同科植物花粉萌发过程中所需营养不同。PEG-4000是首次应用于木兰属植物花粉离体萌发, 对同属其他植物花粉萌发有待进一步研究。

多数花粉萌发的最适温度为25 ℃^[16], 本研究结果与此相同。也有研究发现^[17]:由于植物分布区不同, 其花粉萌发对温度的响应有所差异。望春玉兰和黄山木兰花粉在培养9 h时萌发率达最大, 而长花玉兰和丹馨玉兰花粉最佳培养时间为12 h, 在各自最适培养时间下, 对花粉其进行观察, 花粉管互不交错，清晰，便于统计。