类胡萝卜素是广泛分布于自然界的一类色素，迄今已发现了近800种^[1]，主要存在于植物的叶、花、果实和根等器官中，在吸引昆虫、鸟类传播花粉和种子中发挥作用^[2]。类胡萝卜素可作为多种生物活性物质的前体，经过氧合酶或非酶裂解作用可以形成阿朴类胡萝卜素^[3]，后者及其衍生物可生成β-紫罗兰酮（β-ionone）等香气物质及脱落酸（abscisic acid，ABA）等植物生长调节剂^[4]。作为类胡萝卜素裂解氧合酶（carotenoid cleavage oxygenases，CCO）中的重要成员，类胡萝卜素裂解双加氧酶1（carotenoid cleavage dixoygenase 1，CCD1）在不同的植物中所裂解的底物、作用位点不尽相同。研究发现^[5]，CCD1在C9~C10（C9′~C10′）位时剪切番茄红素、胡萝卜素、玉米黄质或脱辅基类胡萝卜素等，形成β-紫罗兰酮，β-环柠檬醛（β-cyclocitral），香叶基丙酮（geranylacetone）和假紫罗兰酮（pseudoionone）等芳香类物质；在番茄红素C5~C6（C5′~C6′）位裂解时则形成6-甲基-5-庚烯-2-酮^[6]，认为CCD1对基于类胡萝卜素代谢途径的香气物质合成发挥着重要作用。桂花Osmanthus fragrans在中国栽培历史悠久，集绿化、美化和香化为一体，花香和花色是其重要观赏性状。类胡萝卜素裂解双加氧酶1（OfCCD1）^[7]降解桂花中的着色物质——α-胡萝卜素和β-胡萝卜素^[8]，合成主要香气物质α-紫罗酮和β-紫罗酮^[9]。基因启动子控制着基因在特定的组织^[10]、特定的发育阶段^[11]以及一定的环境条件下表达^[12]；分离相关基因启动子，分析其序列及其作用元件，并研究其功能，可明确该基因的调控因子及其作用机制。本研究利用染色体步移技术克隆了OfCCD1启动子，通过启动子序列分析、载体构建和瞬时表达分析，初步明确了其功能，为揭示OfCCD1基因调控花色花香代谢机制奠定基础。

1.   材料与方法

1.1   植物材料

供试材料为6~8年生地栽丹桂品种‘堰虹桂’‘Yanhong Gui’，栽植于浙江农林大学桂花资源圃。

1.2   主要试剂

Taq聚合酶、限制酶（DraⅠ，EcoRⅤ，PvuⅡ，StuⅠ），质粒载体PMD18-T，大肠埃希菌Escherichia coli DH5α，胶回收试剂盒，DNA片段纯化试剂盒和无缝连接试剂盒均购自Takara公司（大连）。

1.3   方法

1.3.1   DNA提取

参照十六烷基三甲基溴化铵法（CTAB）提取‘堰虹桂’基因组DNA^[13]。

1.3.2   引物设计与合成

根据‘堰虹桂’转录组数据库中的CCD1序列（GenBank登录号MG138152）^[14]和BALDERMANN等发表的OfCCD1（GenBank登录号AB526197.1）序列^[9]，用Primer Primer 5.0设计下游特异性引物1（GSP1），特异性引物2（GSP2）和特异性引物4（GSP4）；利用上述2段序列的重复序列设计特异性引物3（GSP3）；利用接头引物1（AP1）与GSP1，接头引物2（AP2）与GSP2经2轮聚合酶链式反应（PCR）获得的启动子片段设计特异性引物5（GSP5）。利用pBI121质粒上的β-葡萄糖苷酸酶（β-Glucosidase，GUS）基因序列设计上游引物GUS-F和下游引物GUS-R。引物及接头均由上海生工合成（表 1）。

表  1  OfCCD1启动子克隆所用引物

Table  1.  Primer sequences used in the cloning of OfCCD1 promoters

引物名	称序列(5'→3')
GSP1	CTTCACAAACAGCCATTCCAACCAGTCTAT
GSP2	TCGGGCTTTACTGCCACCACACCATTTTC
GSP3	GAGGAGGAGTCTCATCAACTGGAGCAAAAT
GSP4	GCATCATTTTCACAAACAGCCATTCCAAC
GSP5	AGCCTCAAGTTTTGTCCTATTGCCAC
AP1	GTAATACGACTCACTATAGGGC
AP2	ACTATAGGGCACGCGTGGT
GWA	GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGT
CCD1P-L-F	TGATTACGCCAAGCTAAAGGAAGAGTATTCACTTTTGGC
CCD1P-L-R	CCGGGGATCCTCTAGCTGTTGATCCTAATTGAACTCTCAC
CCD1P-S-F	TGATTACGCCAAGCTGAAGCACATGTCTCCCA
CCD1P-S-R	CCGGGGATCCTCTAGCTCTTGGTTCTGAATTGA
GUS-F	TGATTACGCCAAGCTGATCAGTTCGCCGATGCAG
GUS-R	CCGGGGATCCTCTAGAAGTGCGCTTGCTG

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1.3.3   DNA文库的构建、扩增

① DNA文库的构建。分别用Dra Ⅰ，EcoR Ⅴ，Pvu Ⅱ，Stu Ⅰ 4种限制性内切酶对提取到的DNA进行酶切。酶切体系为基因组DNA 25.0 μL（100 mg·L^-1），限制内切酶8.0 μL，10×限制酶buffer 10.0 μL，灭菌水57.0 μL，总体积100.0 μL，37 ℃过夜。取5.0 μl酶切产物用质量分数0.6%琼脂糖进行检测。按照DNA纯化试剂盒的说明书对酶切产物进行纯化后加接头。分别取4组酶切纯化的DNA各4.8 μL，染色体步移接头GWA 1.9 μL，10×连接缓冲液0.8 μL，T4 DNA连接酶0.5 μL，16.0 ℃过夜；70.0 ℃水浴5 min，加入32.0 μL去离子水。②聚合酶链式反应（PCR）扩增。取AP1，引物GSP1/GSP3，模板各1.0 μL，预混合Taq酶10.0 μL，去离子水补至20.0 μL进行第1轮PCR。扩增程序为94.0 ℃ 5 min；94.0 ℃ 25 s，72.0 ℃ 3 min，7循环；94.0 ℃ 25 s，65.0 ℃ 3 min，32循环；67.0 ℃ 7 min。取第1轮产物1.0 μL并稀释50倍作为第2轮PCR的模板。第2轮PCR体系为：AP2，GSP2/GSP4/GSP5，模板各1.0 μL，预混合Taq酶10.0 μL，去离子水补至20.0 μL。扩增程序为94.0 ℃ 5 min；94.0 ℃ 25 s，72.0 ℃ 3 min，5循环；94.0 ℃ 25 s，65.0 ℃ 3 min，20循环；67.0 ℃ 7 min。取GUS-F，GUS-R和pBI121质粒各1.0 μL，预混合Taq酶10.0 μL，去离子水补至20.0 μL进行GUS序列扩增。扩增程序为95.0 ℃ 5 min；95.0 ℃ 30 s，69.8 ℃ 30 s，72.0 ℃ 1 min，35循环；72.0 ℃ 10 min；4.0 ℃ 10 min。质量分数为1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3.4   PCR产物回收、连接、转化鉴定及序列测定与分析

切胶回收按照MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0（TaKaRa，大连）的说明书进行。载体连接按照PMD18-T载体说明书（Takara，大连）进行，连接后的重组质粒导人大肠埃希菌DH5α感受态细胞中，在50 mg·L^-1氨苄青霉素的固体LB培养基上进行蓝白斑筛选，挑取白色单菌落菌液PCR检测后将阳性克隆送公司测序。序列初步分析采用DNAMAN软件进行。启动子序列作用元件分析采用在线网站PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）进行。

1.3.5   表达载体的构建及瞬时表达分析

根据获得的OfCCD1的启动子序列，利用Takara（http://www.clontech.com）无缝连接引物设计软件设计3对无缝连接引物CCD1P-S-F和CCD1P-S-R，CCD1P-L-F和CCD1P-L-R，GUS-F和GUS-R。具体操作步骤按照Takara无缝连接试剂盒的说明书进行。将重组好的表达载体利用冻融法转入农杆菌Agrobacterium tumefaciens GV3101感受态。随后将烟草Nicotiana tabacum叶片剪切成0.5 cm × 0.5 cm的叶块，在农杆菌菌液吸光度D（600）为0.6的侵染液中浸染10 min；无菌滤纸吸干叶片表面的菌液，将侵染的外植体移至于无菌水浸润的滤纸上培养24 h并进行GUS染色，37 ℃下保温16~24 h。V（乙酸）：V（乙醇）＝3：1的混合液脱色后取出，对染色结果进行拍照。

图  1  OfCCD1启动子克隆电泳图

Figure  1.  PCR products of OfCCD1 promoters

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2.   结果与分析

2.1   启动子克隆

以‘堰虹桂’DNA为模板，分别利用引物GSP1和GSP2，接头引物AP1和AP2进行2轮PCR，在EcoR文库扩增得到条带；经比对和拼接得到长度为511 bp的序列（图 1A）。利用引物GSP3和GSP4，接头引物AP1和AP2经过2轮PCR，在DraⅠ文库中得到约2 000 bp的条带（图 1B）。测序后，经比对和拼接得到长度为2 747 bp的条带，命名为OfCCD1P-L（图 2）。利用GSP3和GSP5经过2轮PCR后在Pvu Ⅱ文库中得到750 bp左右的条带（图 1B），经过拼接比对得到OfCCD1上游981 bp的启动子序列，命名为OfCCD1P-S（图 3）。

图  2  OfCCD1P-L序列

Figure  2.  Sequence of OfCCD1P-L

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图  3  OfCCD1P-S序列

Figure  3.  Sequence of OfCCD1P-S

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2.2   启动子序列分析

利用PlantCARE网站对启动子序列进行序列分析发现，OfCCD1P-L有TATA-box和CAAT-box等基本作用元件，同时有7个响应元件，响应茉莉酸甲酯、赤霉素、水杨酸、乙烯的元件，以及热激元件，鸟类成髓细胞性白血病病毒癌基因同源物（MYB）结合位点，并有4个响应脱落酸（ABA）的核心序列ACGT（表 2）。OfCCD1P-S中含有TATA-box和CAAT-box等基本作用元件，同时有3个光响应元件，1个热激响应元件以及1个ABA响应元件（表 3），并有4个ABA响应元件（ABRE）核心序列ACGT。

表  2  OfCCD1P-L中顺式作用元件

Table  2.  Cis-acting elements in OfCCD1P-L

顺式作用元件名称	位置	序列(5′→3′)	功能
G-Box	-326, -664, -2 584	CACGTA	光响应元件
GA-motif	-257, -2 738	AAAGATGA	光响应元件的一部分
ATCT-motif	-2 564	AATCTAATCT	参与光响应的部分保守DNA序列
Box I	-429, -l 649	TTTCAAA	光响应元件
AE-box	-737	AGAAACAT	光响应元件的一部分
Box 4	-733	ATTAAT	参与光响应的部分保守DNA序列
GAG-motif	-300	AGAGATG	光响应元件的一部分
CAAT-box	-ll5, -569	CAAT	一般元件
CAT-box	-l 839	GCCACT	与分生组织相关的顺式元件
CGTCA-motif	-2 580	CGTCA	茉莉酸甲酯响应元件
TGACG-motif	-486	TGACG	茉莉酸甲酯响应元件
HSE	-2 066	AAAAAATTTC	热激响应元件
LTR	-l 4ll	CCGAAA	低温响应元件
MBS	-96l, -l 256	TAACTG	MYB结合位点
P-box	-2 002	CCTTTTG	赤霉素响应元件
Skn-l_motif	-968, -l 3l0, -l 544, -2 33l	GTCAT	胚乳中表达的必备元件
TATA-box	-268, -356, -879, -894, -909	TATA	一般元件
TC-rich repeats	-l l49, -2 5l9	ATTTTCATCA	参与防御和胁迫的元件
TCA-element	-42l, -l 340	TCAGAAGAGGA	水杨酸响应元件
GCN4_motif	-402	TGTGTCA	胚乳中表达的必备元件
ERE	-428	ATTTCAAA	乙烯响应元件
GCN4_motif	-402	TGTGTCA	胚乳中表达的必备元件

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表  3  OfCCD1P-S中顺式作用元件

Table  3.  Cis-acting elements in OfCCD1P-S

顺式作用元件名称	位置	序列（5'→3')	功能
3-AF1 binding site	-911	AAGAGATATTT	光响应元件
GATA-motif	-102	AAGATAAGATT	光响应元件的一部分
ACE	-316	ACGTGGA	光响应元件
AAGAA-motif	-443	GAAAGAA
ABRE	-324	ACGT	脱落酸响应元件
CAAT-box	-12, -267, -530, -547, -566, -659, -723	CAAT(T)	一般元件
HSE	-901	AAAAAATTTC	热激响应元件
Skn-1_motif	-278, -503	GTCAT	在胚乳中表达所必须的元件
TATA-box	-54, -158, -472, -623	TAATA/TATA	基本元件
TC-rich repeats	-673	ATTTTCTTCA	参与防御和胁迫的元件

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2.3   植物表达载体构建与瞬时表达分析

将克隆得到的启动子和GUS片段分别与pBI121质粒进行重组（图 4），以含GUS：：GUS表达载体的菌株为阴性对照（ck1），以含pBI 121载体菌株为阳性对照（ck2），对构建的OfCCD1P-L：：GUS和OfCCD1P-S：：GUS表达载体进行瞬时表达分析（图 5）。从图 5可以看出，阴性对照没有着色，阳性对照着色范围和程度最好，OfCCD1P-L：：GUS表达载体和OfCCD1P-S：：GUS表达载体均有着色，但着色都比阳性对照要弱。

图  4  OfCCD1的2个启动子重组质粒图

Figure  4.  Recombinant vectors of two OfCCD1

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图  5  瞬时表达检测

Figure  5.  Detection of transient expression

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3.   讨论

桂花OfCCD1基因有2个拷贝^[14]。在启动子克隆过程中，第1次步移并未得到足够长的序列。目前，已报道的OfCCD1序列有2个：ZHANG等^[14]发现的CCD1序列（GenBank登录号MG138152）和BALDERMANN发表的OfCCD1序列（GenBank登录号AB526197.1）^[9]。本研究利用上述2个序列的重复序列设计了引物GSP3，并在GSP3 5′上游设计了GSP4，利用已获得的部分OfCCD1启动子序列设计了引物GSP5，分别步移从而获得了OfCCD1P-S和OfCCD1P-L的启动子序列。其中OfCCD1P-L长度为2 747 bp，OfCCD1P-S长度为981 bp。原因是OfCCD1启动子区域的2个拷贝所含酶切位点不同，构建文库时OfCCD1P-L启动子区域被内切酶截断的区域短，步移得到的启动子就较长；而OfCCD1P-S启动子区域大部分被截断，所得的启动子序列就较短。类似地，已报道的CCD家族其他成员的启动子长度也有差异，如拟南芥Arabidopsis thaliana的AtCCD7^[10]和AtNCED2^[15]，花生Arachis hypogaea的AhNCED1^[16]启动子都有2 000 bp左右，而菊花Chrysanthemum morifolium的CmCCD4a-5^[17]和桂花的OfCCD4^[18]启动子则分别为1 094 bp和1 337 bp。上述文献中进行启动子克隆所用方法不尽相同，这也是造成获得启动子长度不一的因素。

本研究所获得的2个OfCCD1启动子所含元件种类是具有一致性的，都含有光响应元件、热激响应元件和ABA响应元件，其中较多的是光响应元件。在桂花中，OfCCD1的表达受光照影响^[9]，证实了OfCCD1启动子中的光响应元件的存在。同一个亚家族的其他成员，如CCD4^[19]和CCD2^[20]的启动子中也发现了光响应元件。这表明光响应元件在CCD家族的启动子中可能是普遍存在的。不过功能上可能有差异，因为在藏红花Crocus sativus中，CsCCD2的表达是受光抑制的^[20]。

此外，克隆得到的2个启动子中含有4个ACGT序列^[21]。ACGT是启动子中一个重要的顺式作用元件，该序列可以响应水杨酸（salicylic acid，SA），紫外线，ABA和茉莉酸（jasmonic acid，JA）^[22]的处理。有研究表明：响应ABA至少需要2个ACGT序列，且2个ACGT之间的碱基数不同，响应的激素种类也不同。MEHROTRA等^[23]的研究发现：当2个ACGT序列之间的距离是5 bp时，这段序列响应SA的处理；当距离是25 bp时，该序列响应ABA处理。在碱蓬Suaeda salsa^[24]和大豆Glycine max^[25]中ABA处理会使CCD1的表达量升高，因此，桂花中OfCCD1的表达极有可能响应ABA的诱导，具体的响应机制还需要进一步研究。