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毛竹Phyllostachys edulis林是中国南方重要的森林类型，具有生长快、周期短、产量高、用途广等特点，对稳定调节碳平衡和护坡也有积极作用[1-2]。空间结构是森林生长过程的驱动因子，对森林未来的发展具有决定性作用[3]。毛竹林的空间结构指毛竹个体之间的相互关系，包括毛竹空间分布格局、竞争指数和年龄隔离度等[4]。近年来，对毛竹林空间结构的研究日益增多[5-8]。研究表明：与距离有关的空间结构指数可以精确描述毛竹林的结构特征，对分析和调控毛竹林结构与功能关系至关重要[9]。目前，对毛竹林空间结构的研究主要集中于某地如浙江省龙游县溪口镇、浙江省天目山自然保护区等地的典型毛竹林的空间结构特征[5-6]、动态变化分析[8-10]及非空间结构因子的关系[10-12]等，对大尺度上不同地区的毛竹林空间结构差异性研究尚少有报道。浙江省是中国毛竹主产区。根据第8次全国森林资源连续清查结果（2009-2013），全国毛竹林面积443.01万hm2，浙江省毛竹林面积71.6万hm2，占全国的16.16%，全国排名第3位。开展浙江省毛竹林空间结构特征研究，对精准掌握毛竹林的结构信息，提高全省毛竹林经营决策水平具有重要意义。
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浙江省位于27°01′~31°10′N，118°01′~123°08′E，面积10.55万km2。年均气温为16.0~19.0 ℃，四季分明，光照充足，雨水充沛，是亚热带湿润季风气候。浙江有“七山一水二分田”之说，山地和丘陵占74.63%，比较适合毛竹林的生长。毛竹广泛分布于海拔为400~800 m的丘陵、低山山麓地带。
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为增强调查样地的代表性，根据浙江省森林资源一类调查的系统抽样样地中毛竹林样地分布较多的区域，确定调查地点为浙江省南部的丽水市庆元县和温州市泰顺县、西部的衢州市常山县，中部的金华市武义县和绍兴市诸暨市，东部的宁波市宁海县、余姚市和台州市黄岩区，北部的湖州市安吉县、杭州市临安区共10个县市（区），选择少受人为干扰的近自然毛竹林典型地段，在不同坡向（东、南、西、北）和不同坡位（上坡、中坡、下坡）设置样地，样地面积为10 m × 10 m，共设置54个样地。其中，在庆元县、泰顺县、黄岩区、安吉县各设置了4个样地，在常山县、武义县、临安区、诸暨市、宁海县各设置了6个样地，余姚市设置了8个样地。各样地用全球定位系统（GPS）进行定位，用罗盘仪测量样地边界，调查每株毛竹的x和y坐标（m）、年龄、胸径、竹高、冠幅、生长状态等因子；同时，记录样地内的诸如海拔、坡向、坡度、坡位、腐殖质厚度、土层厚度等立地因子。
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聚集指数是检验种群空间分布格局的常用指数[3]。计算公式为：
$$ R = \frac{{\frac{1}{N}\sum\limits_{i = 1}^N {{r_i}} }}{{\frac{1}{2}\sqrt {\frac{F}{N}} }}。 $$ (1) 式（1）中：ri表示第i株毛竹到其最近邻毛竹的距离；F表示样地面积；N表示样地内毛竹总株数；R是林分聚集指数。若R＞1，那么这块样地的毛竹林属于均匀分布；R=1，则属于随机分布；R＜1，则属于聚集分布。
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采用基于Voronoi图的Hegyi竞争指数[14]。计算公式为：
$$ {I_{{\rm{C}}i}} = \sum\limits_{j = 1}^{{n_i}} {\frac{{{d_i}}}{{{d_i}{L_{ij}}}}}。 $$ (2) 式（2）中：di是第i株对象竹的胸径；dj是第j株相邻竹的胸径；Lij是第i株对象竹到第j株相邻竹的距离；ni是基于Voronoi图的所有相邻竹株数；ICi是第i株对象竹的竞争指数。取样地内全部竹子竞争指数的平均值作为林分竞争指数。计算公式为：
$$ {I_{\rm{C}}} = \frac{1}{N}\sum\limits_{i = 1}^N {{I_{{\rm{C}}i}}}。 $$ (3) 式（3）中：IC为林分竞争指数；N为样地内毛竹总株数；ICi为第i空间结构单元中对象竹的竞争指数。
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本研究采用全混交度描述毛竹林的年龄隔离度[15]。全混交度的计算公式为:
$$ {M_{{{\rm{C}}_i}}}{\rm{ = }}\frac{1}{2}\left( {{D_i} + \frac{{{c_i}}}{{{n_i}}}} \right){M_i}。 $$ (4) 式（4）中：MCi表示第i空间结构单元中对象竹的全混交度；Di表示空间结构单位的Simpson指数，${D_i} = 1 - \sum\limits_{j = 1}^{{S_i}} {{p^2}_j} $，Di的取值范围为[0, 1]；ci表示对象竹的最近邻竹中成对相邻竹不是同一竹龄的个数；ni表示最近邻竹的株数；$\frac{{{c_i}}}{{{n_i}}}$表示最近邻竹的年龄隔离度；Mi表示简单混交度，${M_i} = \frac{1}{{{n_i}}}\sum\limits_{j = 1}^{{n_i}} {{V_{i, j}}} $，如果第i对象竹和第j最近邻竹年龄相同，vi, j=0，否则等于1。取样地内全部竹子年龄隔离度平均值作为林分年龄隔离度，计算公式为：
$$ M = \frac{1}{N}\sum\limits_{i = 1}^N {{M_{{{\rm{C}}_i}}}} 。 $$ (5) 式（5）中：M表示林分年龄隔离度；N表示样地内毛竹总株数；MCi表示第i空间结构单元中对象竹的年龄隔离度。
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由于毛竹内部中空，本研究采用可测量不规则形状物体体积的排水法测定毛竹竹秆材积。首先，将水注入定制水桶内至水龙头齐平处，排出桶内多余的水。然后，将竹秆劈成40 cm左右长的竹条，缓慢放入桶内，用铁桶收集由水龙头排出的水，用电子提秤称取总竹条排水量。最后计算毛竹竹秆材积。公式如下：
$$ {V_秆} = \frac{{{M_水}}}{\rho }。 $$ (6) 式（6）中：V秆为竹秆材积（dm3），M水为排水质量（kg）；ρ为水的比重（ρ=1 g·cm-3）。
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对10个县市（区）毛竹林空间结构因子进行单因素方差分析，并对差异显著（P＜0.05）的空间结构因子进行多重比较。方差分析采用SPSS 20.0完成。空间结构因子的区域变化分析采用ArcGIS 10.2完成。
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浙江省毛竹林空间结构指数的统计指标如表 1所示。以不同地区空间结构指数统计指标的平均值作为全省毛竹林空间结构指数。可以看出，3个空间结构指数中，竞争指数的均值为5.62，最大值为8.81，最小值为2.88；年龄隔离度的均值为0.58，最大值为0.84，最小值为0.30；聚集指数的均值为0.94，最大值为1.24，最小值为0.73。竞争指数的变异系数最大，达0.25，聚集指数的变异系数最小，为0.13。
表 1 浙江省毛竹林空间结构指数描述统计特征
Table 1. Descriptive statistical characteristics of spatial structure index of moso bamboo forest in Zhejiang Province
地区 空间结构指数 样地数 均值 中值 极小值 极大值 标准差 峰度 偏度 变异系数 竞争指数 8 6.47 6.71 4.75 8.68 1.20 0.74 0.48 0.19 余姚 年龄隔离度 8 0.62 0.62 0.52 0.73 0.07 -0.97 0.18 0.12 聚集指数 8 0.84 0.84 0.73 1.00 0.09 -0.47 0.46 0.11 竞争指数 6 6.40 6.56 5.52 7.35 0.65 -0.11 0.00 0.10 临安 年龄隔离度 6 0.51 0.51 0.34 0.65 0.11 0.57 -0.38 0.21 聚集指数 6 0.97 0.96 0.92 1.07 0.06 2.52 1.49 0.06 竞争指数 6 6.36 6.25 5.57 7.57 0.68 2.15 1.16 0.11 诸暨 年龄隔离度 6 0.60 0.64 0.36 0.71 0.12 4.58 -2.01 0.21 聚集指数 6 0.97 0.97 0.89 1.03 0.05 -0.59 -0.25 0.05 竞争指数 4 5.96 5.81 5.18 7.03 0.90 -3.53 0.43 0.15 安吉 年龄隔离度 4 0.47 0.47 0.44 0.50 0.03 -5.98 0.00 0.07 聚集指数 4 0.88 0.86 0.83 0.97 0.07 2.24 1.49 0.07 竞争指数 6 5.89 5.43 3.82 8.81 2.04 -1.63 0.54 0.35 宁海 年龄隔离度 6 0.56 0.53 0.47 0.68 0.09 -1.62 0.58 0.16 聚集指数 6 0.97 0.97 0.76 1.24 0.18 -0.38 0.38 0.18 竞争指数 4 4.97 4.73 4.54 5.88 0.61 3.64 1.88 0.12 黄岩 年龄隔离度 4 0.71 0.72 0.55 0.84 0.14 -3.25 -0.37 0.19 聚集指数 4 0.98 0.99 0.94 1.00 0.03 3.47 -1.82 0.03 竞争指数 6 4.97 5.12 3.37 6.72 1.16 0.07 0.13 0.23 武义 年龄隔离度 6 0.55 0.59 0.30 0.66 0.13 3.97 -1.90 0.24 聚集指数 6 0.92 0.89 0.76 1.20 0.15 3.38 1.57 0.16 竞争指数 6 4.89 4.72 2.95 7.44 1.64 -0.52 0.54 0.34 常山 年龄隔离度 6 0.60 0.61 0.45 0.71 0.10 -1.11 -0.43 0.16 聚集指数 6 0.96 0.93 0.80 1.17 0.13 -0.25 0.65 0.14 竞争指数 4 5.23 5.51 3.50 6.40 1.23 2.39 -1.26 0.24 泰顺 年龄隔离度 4 0.64 0.66 0.55 0.70 0.07 1.12 -1.21 0.11 聚集指数 4 0.94 0.92 0.90 1.02 0.05 3.37 1.80 0.05 竞争指数 4 3.99 3.59 2.88 5.91 1.32 2.94 1.60 0.33 庆元 年龄隔离度 4 0.53 0.54 0.38 0.64 0.11 0.50 -0.72 0.21 聚集指数 4 1.03 1.02 0.83 1.24 0.19 -4.30 0.11 0.19 竞争指数 54 5.62 5.57 2.88 8.81 1.38 -0.30 0.00 0.25 平均 年龄隔离度 54 0.58 0.58 0.30 0.84 0.11 0.20 -0.29 0.19 聚集指数 54 0.94 0.93 0.73 1.24 0.12 0.59 0.64 0.13 -
根据表 1可知：庆元的毛竹林聚集指数最大，为1.03，属于均匀分布。其他地区的聚集指数均小于1，属于聚集分布。全省毛竹林聚集指数平均值为0.94，属于聚集分布。从图 1可见：全省毛竹林聚集指数分布趋势不明显。聚集指数方差分析结果表明：不同地区毛竹林聚集指数没有显著性差异（P＞0.05）（表 2）。
图 1 不同地区毛竹林聚集指数
Figure 1. Aggregation index of moso bamboo forests in different regions
表 2 不同地区毛竹林空间结构指数方差分析
Table 2. Analysis of variance of spatial structure index of moso bamboo forest in different regions
方差来源 离差平均和 自由度 均方 F 显著性水平 地区间 0.155 9 0.017 1.31 0.259 聚集指数 地区内 0.578 44 0.013 总数 0.733 53 地区间 0.191 9 0:021 2:069 0.054 年龄隔离度 地区内 0.450 44 0:01 总数 0.641 53 地区间 32:376 9 3.597 2:296 0:033 竞争指数 地区内 68:943 44 1.567 总数 101:319 53 -
根据表 1和图 2可知：年龄隔离度最大的地区是位于浙江省东部区域的黄岩地区；年龄隔离度最小的地区是位于浙江省北部区域的安吉地区，全省毛竹林年龄隔离度分布趋势不明显。年龄隔离度方差分析的结果表明：不同地区毛竹林年龄隔离度没有显著性差异（P＞0.05）（表 2）。
图 2 不同地区毛竹林年龄隔离度
Figure 2. Age mingling of moso bamboo forests in different regions
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由表 1和图 3可知：竞争指数最小的是位于浙江省南部区域的庆元地区，竞争指数最大的是位于浙江省北部区域的余姚地区。从地理位置上看，浙江省南北部区域的竞争指数存在一定的差异，北部区域的竞争指数大于南部区域。
图 3 不同地区毛竹林竞争指数
Figure 3. Competition index of moso bamboo forests in different regions
竞争指数方差分析结果如表 2所示。不同地区毛竹林竞争指数存在显著差异（P＜0.05）。因此，进一步对10个县（市、区）毛竹林竞争指数进行多重比较。多重比较的结果如图 4所示：余姚与庆元、常山、武义毛竹林竞争指数存在显著差异（P＜0.05），与黄岩、泰顺、宁海、安吉、诸暨、临安毛竹林竞争指数差异不显著。临安、诸暨与庆元、常山毛竹林竞争指数存在显著差异（P＜0.05），与黄岩、武义、泰顺、宁海、安吉毛竹林竞争指数差异不显著。诸暨与庆元、常山毛竹林竞争指数存在显著差异（P＜0.05），与黄岩、武义、泰顺、宁海、安吉毛竹林竞争指数差异不显著。安吉、宁海与庆元毛竹林竞争指数存在显著差异（P＜0.05），与常山、黄岩、武义、泰顺、宁海毛竹林竞争指数差异不显著。泰顺与庆元、常山、黄岩、武义毛竹林竞争指数差异不显著。武义与庆元、常山、黄岩毛竹林竞争指数差异不显著。黄岩与庆元、常山毛竹林竞争指数差异不显著。常山与庆元毛竹林竞争指数差异不显著。
图 4 不同地区毛竹林竞争指数多重比较
Figure 4. Multiple comparison of competition index of moso bamboo forests in different regions
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SHI等[15]研究发现：年均降水量和年均气温对毛竹林结构具有一定的影响。由图 5和图 6可知：不同地区竞争指数与年均降水量和年均气温显著相关（P＜0.01），随着年均降水量和年均气温的增加，竞争指数减小。周文伟[16]研究表明：降水量的增加能促进毛竹的生长，水热条件较高的庆元比水热条件较低的安吉的毛竹产量高。实际上，较好的水热条件可以降低毛竹之间的竞争，从而促进毛竹的生长。可见，年均降水量和年均气温是影响空间结构的重要因素。
图 5 竞争指数与年均降水量的关系
Figure 5. Relationship between competition index and mean annual precipitation of moso bamboo forest in Zhejiang Province
图 6 竞争指数与年均气温的关系
Figure 6. Relationship between competition index and mean annual temperature of moso bamboo forest in Zhejiang Province
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为提高毛竹林经营水平，研究者通常关注立竹度、年龄结构和树种组成等结构因子[7]。本研究表明：浙江省不同地区的毛竹林竞争指数存在较大差异。不同地区毛竹竹秆材积与竞争指数存在相反的变化趋势（图 4和图 7）。因此，调控毛竹林的竞争关系在毛竹林经营中具有不可忽视的作用。为提高竹秆材积产量，在北部地区更需要采取合理的空间结构调控措施，降低毛竹林竞争强度，以促进毛竹生长，提高毛竹产量。
图 7 不同地区毛竹林竹秆材积
Figure 7. Stem volume of moso bamboo forest in different regions
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本研究以浙江省少受人为干扰的近自然毛竹林为研究对象，研究浙江省不同地区毛竹林空间结构特征及其差异性。得出以下主要结论：①浙江省近自然毛竹林空间结构因子的统计特征表明，10个地区毛竹林竞争指数为2.88~8.81，平均为5.62，余姚毛竹林竞争指数最大，临安毛竹林竞争指数次之，庆元毛竹林竞争指数最小；毛竹林年龄隔离度为0.30~0.84，平均为0.58，黄岩毛竹林年龄隔离度最高，余姚次之，武义最低；毛竹林聚集指数为0.73~1.24，平均为0.94，宁海毛竹林聚集指数最大，庆元次之，余姚最小。浙江省近自然毛竹林空间分布格局以聚集分布为主。②浙江省近自然毛竹林空间结构因子的差异性分析结果表明：浙江省不同地区毛竹林竞争指数存在显著差异，聚集指数和年龄隔离度不存在显著差异。空间结构指数存在一定的区域变化趋势，从北到南竞争指数存在逐渐减小的趋势。
Spatial structure characteristics of close-to-nature Phyllostachys edulis forests in Zhejiang Province
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摘要:
目的 研究浙江省不同地区毛竹Phyllostachys edulis林空间结构特征及其差异性。 方法 以浙江省不同地区近自然生长的毛竹林为研究对象，共设置54个样地，采用聚集指数、竞争指数和年龄隔离度3个空间结构指数。 结果 浙江省不同地区毛竹林竞争指数为2.88~8.81，其中余姚地区最大，庆元地区最小；年龄隔离度为0.30~0.84，其中黄岩地区最大，武义地区最小；聚集指数为0.73~1.24，其中宁海地区最大，余姚地区最小。浙江省不同地区毛竹林年龄隔离度和聚集指数没有显著差异，而不同地区间竞争指数存在显著差异（P < 0.05）。 结论 浙江省毛竹林空间分布格局以聚集分布为主。空间结构指数存在一定的区域变化趋势，从北到南竞争指数逐渐减小。 Abstract:Objective Spatial structure characteristics and differences of moso bamboo (Phyllostachys edulis) forests in different regions of Zhejiang Province were studied. Method The close-to-nature moso bamboo forests in different regions of Zhejiang Province were taken as the research objects, 54 sample plots were set up, and spatial structure indices (aggregation index, competition index and age mingling) were used to analyze spatial structure characteristics and differences of moso bamboo forests in different regions of Zhejiang Province. Result The mean competition index of moso bamboo forest in different regions of Zhejiang Province is 2.88-8.81, among which Yuyao is the largest and Qingyuan is the smallest. The mean age mingling is 0.30-0.84, the largest in Huangyan and the smallest in Wuyi. The mean aggregation index is 0.73-1.24, the largest in Ninghai area and the smallest in Yuyao area. There was no significant difference in age mingling and aggregation index among different regions in Zhejiang Province, whereas there was significant difference in competition index among different regions in Zhejiang Province(P < 0.05). Conclusion The spatial distribution pattern of moso bamboo forests in Zhejiang Province was mainly aggregated distribution. The spatial structure index has a certain regional variation trend, and the competition index decreases gradually from north to south. -
Key words:
- forest ecology /
- Zhejiang Province /
- Phyllostachys edulis /
- aggregation index /
- competition index /
- age mingling
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城市园林绿化事业的快速发展导致园林废弃物的数量日益增多[1]。堆肥已成为园林废弃物资源化利用的主要方式之一[2-5]。园林废弃物中的木本植物残体存在大量难降解的木质素。这些木质素溶解性差，没有任何易被水解的键，分子结构复杂且不规则，含有各种稳定的复杂键型，微生物及其分泌的酶不易与之结合[6]。这些木质素还包裹着纤维素，即使微生物可分解单独存在的纤维素，但细胞壁中木质素对纤维素起到保护作用，纤维素的降解仍受到限制[7-8]，严重影响堆肥进程，因此促进木质素降解是加快堆肥进程和提高堆肥产品品质的重要环节[9]。自然界中的真菌、细菌及相应微生物群落可通过产生分解木质素的酶系统(漆酶、锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶)将木质素完全降解，且大多数真菌降解效果强于细菌[6, 10]。堆肥中添加微生物菌剂可显著提高木质素降解率，加快堆肥进程[8, 11]。YU等[12]通过二次回归正交设计研制出了一种园林废弃物专用复合菌剂，其木质素降解能力强于有效微生物复合菌(EM菌)。何慧中等[13]开发出一种复合功能菌剂，添加到桉树Eucalyptus皮堆肥中，木质素降解效果显著，与对照相比木质素含量下降了78.78%。目前，有关木质素降解的菌剂研究多集中在液体菌剂，但液体菌剂存在生产工序复杂，易污染，易失活，不便于保存等缺点。因此，有必要将木质素降解菌制成固体菌剂，弥补液体菌剂的不足。微生物固定化技术是指通过物理或化学的手段将游离的微生物限定在一定的空间区域，保持其生物活性并能反复利用的方法[14]。将菌株运用固定化方式制成的固体菌剂，具有生产成本低，耐储存，不易失活，便于运输等优点，有利于菌剂在更大范围内推广和应用[15]。然而，固体菌剂的产品质量受多种因素影响，如接菌量、保护剂浓度和含水率可直接影响菌剂产品的稳定性和应用效果，而且国内外关于木质素降解菌固定化的研究尚不充分，有关园林废弃物堆肥的报道更为鲜见。鉴于此，本研究将1株木质素降解菌通过固定化的方式制成固体菌剂，以有效活菌数为评价指标，对菌剂制作过程中的主要影响因素进行优化，再通过正交试验获得最佳固体菌剂的制备条件，将其应用到园林废弃物堆肥中进行效果检验，以期为该类菌剂的研制与应用提供理论依据。
1. 材料和方法
1.1 材料
菌种为曲霉属Aspergillus sp.真菌No.11[1]，目前保存于北京林业大学林学院土壤生物学实验室。堆肥原料来源于北京植物园，主要为花草树木的人工修剪物和自然生长产生的枯枝落叶，粉碎成1~2 cm粒径。培养基：马铃薯葡萄糖肉汤(PDB)培养基和马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基。载体与保护剂：通过预实验确定生物质炭和米糠为固定化载体，海藻糖为保护剂，载体混合质量比为1∶1。
1.2 方法
1.2.1 种子液的制备
将4 ℃保存的菌株No.11接种到PDA培养基上，28 ℃下培养3 d完成活化。将活化后的菌株No.11挑取至装有100 mL PDB培养基的摇瓶中，置于28 ℃、200 r·min−1的摇床中培养48 h(对数生长期末)获得种子液备用。
1.2.2 单因素优化试验
接菌量试验：按照载体质量的5%、10%、15%、20%和25%接种种子液，调节料水质量比为1.0∶0.8，搅拌均匀，28 ℃培养48 h。培养完成后放在40 ℃烘箱中完全烘干，在室温下干燥密封保存30 d后，测定有效活菌数。
保护剂体积分数试验：种子液中分别添加体积分数为0、4%、8%、12%、16%和20%的保护剂，按载体质量的10%接种到载体中，调节料水质量比为1.0∶0.8，混匀后，28 ℃培养48 h。培养完成后放在40 ℃烘箱中完全烘干，在室温下干燥密封保存30 d后，测定有效活菌数。
含水率试验：向载体中接种质量分数为10%的种子液，调节料水质量比为1.0∶0.8，混合均匀，28 ℃培养48 h之后，放在40 ℃烘箱中烘至含水率为5%、10%、15%、20%和25%，在室温下干燥密封保存30 d后，测定有效活菌数。
1.2.3 正交试验设计
根据1.2.2节试验结果确定优化范围，其中接菌量为5%、10%、15%，保护剂体积分数为0、4%、8%，含水率为10%、15%、20%，进行3因素3水平正交试验设计。具体方案见表1。根据表1，向载体中接种相应水平的种子液和保护剂，调节料水质量比为1.0∶0.8，混合均匀，28 ℃培养48 h，之后放在40 ℃烘箱中烘至该处理对应的含水率。将制备好的固体菌剂在室温环境下干燥密封保存30 d，测定有效活菌数，确定最佳菌剂的制备条件。
表 1 正交试验设计Table 1 Design of the orthogonal experiment水平 因素 接菌量/% 保护剂/% 含水率/% 1 5 0 10 2 10 4 15 3 15 8 20 1.2.4 固体菌剂堆肥效果验证
堆肥模拟试验。将粉碎后的园林废弃物分别装入500 mL锥形瓶，装80 g·瓶−1，调节含水率达60%，共4组处理，分别为不添加菌剂(ck)、添加质量分数为0.5%市售EM菌剂(T1)、添加质量分数为0.5%自制固体菌剂(T2)、添加质量分数为1.0%自制固体菌剂(T3)。各组处理3次重复。搅拌均匀后用8层纱布封好瓶口，置于恒温培养箱中避光培养。为模拟堆肥过程中的升温、高温和降温阶段，弥补堆肥模拟试验中因堆体较小，无法自主升温的缺陷，人工进行培养箱温度的调节：温度从25 ℃逐渐上升至50 ℃，再逐渐降至30 ℃。各阶段经历时间分别为5、30、5 d。
样品采集。采集第1、8、16、24、32、40 天的堆肥样品鲜样1 g，测定木质素降解相关酶的酶活力；采集第1 天和第40 天堆肥样品测定pH、电导率(EC)、D(465)/D(665)[样品滤液在465 nm处吸光度D(465)和665 nm处吸光度D(665)的比值]、种子发芽指数(IG)、木质素质量分数和纤维素质量分数等指标。
木质素降解相关酶活力测定。漆酶、锰过氧化物酶和木素过氧化物酶活力测定参照田林双[16]的木质素降解相关酶类测定标准方法。
堆肥腐熟指标测定。pH和EC测定：称取待测样品5 g，置于100 mL塑料瓶中，加入50 mL蒸馏水，200 r·min−1振荡1 h，过滤其上清液，用pH 400防水型笔式pH计和EC 400防水型笔式电导率/TDS/盐度计分别测定各样品的pH和EC；样品滤液在465 nm处吸光度D(465)和665 nm处吸光度D(665)测定：用UV-6100紫外可见分光光度计 (上海元析仪器有限公司)测定样品滤液在465 nm处吸光度D(465)和665 nm处吸光度D(665)；IG测定：取5 g鲜样置于100 mL塑料瓶中，加入50 mL蒸馏水，振荡1 h后获取上清液，将2张滤纸平铺到直径为9 cm的培养皿中，滤纸上加入5 mL上清液，以蒸馏水为空白对照，播撒白菜Brassica chinensis种子20粒·皿−1，置于25 ℃培养箱中培养48 h后记录发芽率和根长。计算IG，IG=(上清液处理的发芽率×根长)/(空白组的发芽率×根长)×100%。木质素、纤维素降解率测定：木质素、纤维素质量分数分别用硝酸-乙醇法和72%硫酸法进行测定[17]。
1.2.5 数据分析
采用Excel 2010 和SPSS 22.0 软件对数据进行分析处理。
2. 结果与讨论
2.1 单因素优化试验结果
接菌量可直接影响固体菌剂的质量。接菌量过少会延长菌株的生长停滞期，过大会增加生产成本，也会增强微生物之间的竞争作用[18]。由图1A可知：固体菌剂中的有效活菌数随接菌量的增加呈先增加后减少的趋势，接菌量为10%时有效活菌数最高，达3.73×1010 CFU·g−1；其次是接菌量为5%和15%时，有效活菌数达2.50×1010 CFU·g−1以上；当接菌量超过15%时，菌剂中的有效活菌数逐渐降低，低于2.50×1010 CFU·g−1。因此，选用接菌量5%、10%和15%作为正交试验的3个水平。
图 1 接菌量、保护剂体积分数和含水率对有效活菌数的影响Figure 1 Effect of inoculation amount, protective agent concentration and water content on living bacteria count微生物菌剂中添加一定量的保护剂可以增强其耐储藏性和稳定性，能直接影响菌剂的产品质量与应用效果[19]。由图1B可看出：当保护剂体积分数为8%时，活菌数最高达7.10×1010 CFU·g−1，保护剂体积分数＜8%时，有效活菌数随保护剂体积分数升高而增多；当保护剂体积分数＞8%后，随着保护剂体积分数的升高，有效活菌数显著(P＜0.05)降低，低于4.00×1010 CFU·g−1。因此，选用0、4%和8%作为正交试验的3个水平。
含水率对固体菌剂的储存有很大影响。含水率过高容易滋生杂菌，使固体菌剂受到污染影响应用效果，含水率过低不利于菌株的生存，一段时间后有效活菌数会大幅度降低[20]。由图1C可知：随着含水率的提高，固体菌剂中有效活菌数呈先升高后降低的趋势，含水率为15%时有效活菌数最高，可达5.17×1010 CFU·g−1；含水率为10%和20%时，固体菌剂中有效活菌数可达4.00×1010 CFU·g−1以上；含水率为5%和25%时，固体菌剂的储存效果最差，有效活菌数仅为2.00×1010 CFU·g−1左右。综上可知，当固体菌剂含水率为10%~20%时，有效活菌数较高，因此，选用10%、15%、20%作为正交试验中的3个水平。
2.2 正交设计试验结果
由表2可知：在接菌量、保护剂体积分数和含水率等3种因素中，影响程度最大的是接菌量，其次是含水率，影响程度最小的是保护剂体积分数。固体菌剂制备的最佳配方为A2B3C2，即：接菌量10%、保护剂体积分数8%、含水率15%。该条件下，菌剂中有效活菌数达1.26×1011 CFU·g−1，符合GB 20287−2006《农用微生物菌剂》的标准(＞0.50×108 CFU·g−1)。
表 2 正交试验的极差分析Table 2 Range analysis of orthogonal test处理 接菌量
(A)/%保护剂
(B)/%含水率
(C)/%有效活菌数/
(×1010 CFU·g−1)1 5 0 10 5.87±0.17 b 2 5 4 15 1.03±0.09 d 3 5 8 20 2.23±0.12 c 4 10 0 20 0.53±0.05 e 5 10 4 10 6.23±0.17 b 6 10 8 15 12.57±0.05 a 7 15 0 15 2.30±0.36 c 8 15 4 20 0.50±0.08 e 9 15 8 10 1.17±0.31 d K1 9.13 8.70 13.27 K2 19.33 7.76 15.90 K3 3.97 15.97 3.26 平均K1 3.04 2.90 4.42 平均K2 6.44 2.59 5.30 平均K3 1.32 5.32 1.09 极差R 5.12 2.74 4.21 说明：不同小写字母表示不同处理间差异显著(P＜0.05) 2.3 堆肥试验结果
2.3.1 堆肥腐熟指标
pH是评价堆肥腐熟程度的指标之一。堆肥腐熟后，pH一般为7.0~8.5[21]。由表3可知：堆肥结束时各处理pH均在8.0左右，符合NY 525−2002《有机肥料》标准。
表 3 堆肥腐熟指标测定结果Table 3 Determination results of composting maturity index处理 pH EC/(mS·cm−1) D(465)/D(665) IG/% ck 7.89±0.04 a 0.35±0.00 a 5.85±0.53 a 106.00±15.31 a T1 8.01±0.13 a 0.34±0.02 a 6.22±0.06 a 114.00±21.44 a T2 8.01±0.03 a 0.34±0.01 a 6.26±0.11 a 118.00±3.55 a T3 7.97±0.06 a 0.32±0.01 a 6.46±0.09 a 112.00±10.93 a 说明：相同小写字母表示不同处理间差异不显著(P＞0.05) EC可以表示堆肥中可溶性总盐的含量，其大小能影响植物的生长，EC过高的堆肥产品可以影响土壤理化性质，使植物生长受到毒害。EC小于4.00 mS·cm−1，表明堆肥已达到腐熟，对植物生长无毒害[22]。由表3可知：ck处理EC为0.35 mS·cm−1，各处理的EC相近，均小于4.00 mS· cm−1，在腐熟标准之内。
D(465)/D(665)能反映出胡敏酸分子的稳定程度，D(465)/D(665)较大说明胡敏酸相对稳定，较小说明胡敏酸结构简单，因此可用来分析评价堆肥的腐殖化作用大小[9]。由表3可知：堆肥结束时，各处理的D(465)/D(665)均为6.0左右。
IG是判断堆肥产品是否腐熟的生物学指标。堆肥产品未腐熟时会产生对植物生长有毒有害的物质，抑制植物的生长。一般情况下，当IG大于80%就可认为产品已达到腐熟[23]。由表3可知：各处理的IG均超过80%，堆肥产品对植物无毒。
综上可知，堆肥进行40 d后，各处理的pH和EC均达到腐熟标准且无显著差异，但添加菌剂后可以缩短堆肥腐熟的时间[24]。各处理的D(465)/D(665)均为6.0左右，说明其缩合度和芳构化仍很低，这也从另一方面表明腐殖质活性较强[9]。各处理的IG均超过80%，这与ZHANG等[25]测定的园林废弃物堆肥产品IG一致。
2.3.2 木质素酶活力测定结果
堆肥过程中微生物会分泌各种酶，从而将木质素类大分子物质转化成腐殖质等促进植物生长的物质[26]。与木质素降解相关的生物酶主要包括漆酶、锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶[27]。
在堆肥过程中，漆酶对木质素的降解起着非常重要的作用，研究漆酶活力的变化对评价堆肥进程及微生物活动强度至关重要[28]。由图2A可看出：除T3外，其余处理漆酶活力在初始阶段相差不大，呈现先降后升趋势，与陈建军等[29]研究结果一致。可能是堆肥材料中某些小分子物质先降解，之后微生物再降解木质素类难降解的大分子物质。T3酶活力先升后降，可能与其开始微生物数量较多，分解速率较高有关。堆肥进行到24 d时，T1、T2和T3漆酶活力远超过ck，说明添加自制菌剂与市售菌剂都可大大增强堆肥中微生物的活动强度，随着微生物菌落增多，产酶能力也增加。第24 天之后，T3酶活力下降，ck酶活力上升，T1与T2酶活力变化不大，且大小相当，均达80 U·L−1(1 U=16.67 nkat)左右。菌株No.11的研究结果也显示：与可高效降解木质素的黄孢原毛平革菌Phanerochaete chrysosporium相比，此菌株有更强的产酶能力，也进一步说明自制固体菌剂有更大的应用潜力。
图 2 堆肥过程中漆酶、锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶酶活力变化Figure 2 Changes of laccase, manganese peroxidase and lignin peroxidase activity during composting锰过氧化物酶是一种酚氧化物酶，可与其他酶共同作用提高对木质素的降解作用[10]。由图2B可看出：添加菌剂的处理组锰过氧化物酶活力均高于ck，说明添加菌剂可以提高堆肥中锰过氧化物酶的酶活力。堆肥初始阶段，所有处理组的锰过氧化物酶活力均出现先降后升趋势，可能与堆肥中的氮素含量有关，氮素含量会影响微生物分泌锰过氧化物酶[27]。第8 天后所有处理组酶活力又出现了上升趋势，说明微生物代谢活动增强，开始分泌锰过氧化物酶，T2与T3在第16天时达到峰值，T1的峰值出现在第24天左右。这表明添加自制固体菌剂后菌株可较快适应环境分泌锰过氧化物酶。有研究表明：锰过氧化物酶在限氮高锰培养基中产量较高[10]，因此制备此类菌剂时，可通过优化含氮量提高产锰过氧化物酶的能力。
木质素过氧化物酶是一种含亚铁血红素的过氧化物酶，可直接与芳香底物发生反应，也可通过氧化低分子量的中介体而间接地发挥作用[30]。由图2C可看出：所有处理组木质素过氧化物酶活力均呈现先升后降趋势，添加菌剂的处理组酶活力的峰值出现时间均早于ck，且峰值高于ck，表明加入菌剂后可明显提高微生物分泌木质素过氧化酶的速率[31]。堆肥的后期，木质素过氧化酶显著降低，分析原因可能与此时碳氮比的变化有关。
2.3.3 木质素和纤维素降解率测定结果
木质素是一种在自然界中广泛存在的有机高分子化合物，多存在于植物的细胞壁中[32]。木质素的完全降解由细菌、放线菌和真菌共同参与，其中真菌起重要作用[33]。由图3可看出：添加菌剂的处理木质素与纤维素降解率均高于ck，T3木质素降解率达46.65%，其次是T2，木质素降解率为30.43%，而T1的木质素降解率仅为21.74%。
图 3 不同处理的木质素和纤维素降解率Figure 3 Degradation rate of lignin and cellulose in different treatments纤维素是植物细胞壁的主要结构成分，通常与半纤维素和木质素结合在一起[34]。自然界中有许多微生物可以通过酶的作用分解植物残体中的纤维素，但细胞壁中木质素对纤维素起到保护作用，所以木质素和纤维素的分解都受到限制[6]。由图3可知：添加菌剂后可提高园林废弃物堆肥中纤维素降解率，其中T1降解率为18.33%，T2降解率为16.67%，T3纤维素降解率最高，达30.00%。
综上可知，T2木质素降解率高于T1，说明自制固体菌剂对园林废弃物中木质素的降解效果较好。纤维素降解率结果显示：T1略强于T2，这可能是因为市售菌剂中的菌株对纤维素降解能力较好，而自制固体菌剂中的菌株主要产生木质素降解相关酶，对木质素的降解效果较好。T3的木质素降解率与纤维素降解率均高于T2，说明在考虑成本的前提下，需进一步研究自制固体菌剂的添加量，以获得最大经济效益。与王顺利等[35]制备出堆肥菌剂CC-1相比，接菌量相当的情况下添加自制固体菌剂可使纤维素降解率提高11.68%，木质素降解率提高46.65%。这可能与菌株No.11的特殊菌丝结构有关，同时说明自制固体菌剂可高效降解木质素和纤维素。与尹爽等[36]研制的复合菌剂相比，添加自制固体菌剂木质素降解率较高，可能是因为自制固体菌剂更易于微生物在堆肥中均匀生长，能极大程度地发挥降解作用。自制固体菌剂可以较好地分解园林废弃物中的木质素，并能提高纤维素降解率。
3. 结论
木质素降解菌No.11的最佳固定化条件为：接菌量10%、保护剂体积分数8%、含水率15%。在此条件下，获得的固体菌剂成品保存30 d后，其有效活菌数达1.26×1011 CFU·g−1，符合GB 20287−2006《农用微生物菌剂》的要求。
添加自制固体菌剂的堆肥产品pH为8.01，达到NY 525−2002《有机肥料》标准，EC为0.34 mS·cm−1，D(465)/D(665)为6.26，IG达118%，对植物无毒。
堆肥中添加自制木质素降解固体菌剂有利于木质素降解酶系的产生，漆酶、锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶的酶活力均得到提升。与不添加菌剂相比，木质素降解率提高23.91%，纤维素降解率提高8.34%；0.5%接种比例下，与EM菌相比，纤维素降解率未提高，木质素降解率提高8.69%。
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图 1 不同地区毛竹林聚集指数
Figure 1 Aggregation index of moso bamboo forests in different regions
图 3 不同地区毛竹林竞争指数
Figure 3 Competition index of moso bamboo forests in different regions
图 4 不同地区毛竹林竞争指数多重比较
Figure 4 Multiple comparison of competition index of moso bamboo forests in different regions
图 5 竞争指数与年均降水量的关系
Figure 5 Relationship between competition index and mean annual precipitation of moso bamboo forest in Zhejiang Province
图 6 竞争指数与年均气温的关系
Figure 6 Relationship between competition index and mean annual temperature of moso bamboo forest in Zhejiang Province
表 1 浙江省毛竹林空间结构指数描述统计特征
Table 1. Descriptive statistical characteristics of spatial structure index of moso bamboo forest in Zhejiang Province
地区 空间结构指数 样地数 均值 中值 极小值 极大值 标准差 峰度 偏度 变异系数 竞争指数 8 6.47 6.71 4.75 8.68 1.20 0.74 0.48 0.19 余姚 年龄隔离度 8 0.62 0.62 0.52 0.73 0.07 -0.97 0.18 0.12 聚集指数 8 0.84 0.84 0.73 1.00 0.09 -0.47 0.46 0.11 竞争指数 6 6.40 6.56 5.52 7.35 0.65 -0.11 0.00 0.10 临安 年龄隔离度 6 0.51 0.51 0.34 0.65 0.11 0.57 -0.38 0.21 聚集指数 6 0.97 0.96 0.92 1.07 0.06 2.52 1.49 0.06 竞争指数 6 6.36 6.25 5.57 7.57 0.68 2.15 1.16 0.11 诸暨 年龄隔离度 6 0.60 0.64 0.36 0.71 0.12 4.58 -2.01 0.21 聚集指数 6 0.97 0.97 0.89 1.03 0.05 -0.59 -0.25 0.05 竞争指数 4 5.96 5.81 5.18 7.03 0.90 -3.53 0.43 0.15 安吉 年龄隔离度 4 0.47 0.47 0.44 0.50 0.03 -5.98 0.00 0.07 聚集指数 4 0.88 0.86 0.83 0.97 0.07 2.24 1.49 0.07 竞争指数 6 5.89 5.43 3.82 8.81 2.04 -1.63 0.54 0.35 宁海 年龄隔离度 6 0.56 0.53 0.47 0.68 0.09 -1.62 0.58 0.16 聚集指数 6 0.97 0.97 0.76 1.24 0.18 -0.38 0.38 0.18 竞争指数 4 4.97 4.73 4.54 5.88 0.61 3.64 1.88 0.12 黄岩 年龄隔离度 4 0.71 0.72 0.55 0.84 0.14 -3.25 -0.37 0.19 聚集指数 4 0.98 0.99 0.94 1.00 0.03 3.47 -1.82 0.03 竞争指数 6 4.97 5.12 3.37 6.72 1.16 0.07 0.13 0.23 武义 年龄隔离度 6 0.55 0.59 0.30 0.66 0.13 3.97 -1.90 0.24 聚集指数 6 0.92 0.89 0.76 1.20 0.15 3.38 1.57 0.16 竞争指数 6 4.89 4.72 2.95 7.44 1.64 -0.52 0.54 0.34 常山 年龄隔离度 6 0.60 0.61 0.45 0.71 0.10 -1.11 -0.43 0.16 聚集指数 6 0.96 0.93 0.80 1.17 0.13 -0.25 0.65 0.14 竞争指数 4 5.23 5.51 3.50 6.40 1.23 2.39 -1.26 0.24 泰顺 年龄隔离度 4 0.64 0.66 0.55 0.70 0.07 1.12 -1.21 0.11 聚集指数 4 0.94 0.92 0.90 1.02 0.05 3.37 1.80 0.05 竞争指数 4 3.99 3.59 2.88 5.91 1.32 2.94 1.60 0.33 庆元 年龄隔离度 4 0.53 0.54 0.38 0.64 0.11 0.50 -0.72 0.21 聚集指数 4 1.03 1.02 0.83 1.24 0.19 -4.30 0.11 0.19 竞争指数 54 5.62 5.57 2.88 8.81 1.38 -0.30 0.00 0.25 平均 年龄隔离度 54 0.58 0.58 0.30 0.84 0.11 0.20 -0.29 0.19 聚集指数 54 0.94 0.93 0.73 1.24 0.12 0.59 0.64 0.13 
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表 2 不同地区毛竹林空间结构指数方差分析
Table 2. Analysis of variance of spatial structure index of moso bamboo forest in different regions
方差来源 离差平均和 自由度 均方 F 显著性水平 地区间 0.155 9 0.017 1.31 0.259 聚集指数 地区内 0.578 44 0.013 总数 0.733 53 地区间 0.191 9 0:021 2:069 0.054 年龄隔离度 地区内 0.450 44 0:01 总数 0.641 53 地区间 32:376 9 3.597 2:296 0:033 竞争指数 地区内 68:943 44 1.567 总数 101:319 53
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https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.2020.02.005
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