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由于经济快速发展和环境基础设施建设滞后，城市河流受到了不同程度的污染，黑臭已成为城市河流的一种普遍现象，严重影响了城市的可持续发展[1]。雨水管和污水管的混接和搭接，导致污水经由雨水管排入河流，为大部分城区河流黑臭的主要原因[2]。原位生物修复技术通过曝气增氧、投加微生物菌剂、构建生态浮床等技术对河水进行治理，因具有经济安全、对水生态系统扰动小、利于提高水体自净能力等优点，在污染河流修复中得到了广泛的应用[3-5]，但对于污水排入量大、黑臭严重的河流，常规原位修复技术因注重于整体治理，实际投资过大，且效果不甚显著[6]。以河流空间为处理场所，对排入河道的主要污染源进行就地治理与控制将有效降低其对主河段的污染程度，其技术与方法逐渐成为河流原位修复的研究热点[7-8]。上庄河地处温州市蒲州街道，西北向与屿田河交界，东南向与石坦河和三郎桥河相交，全长1 300.0 m，平均宽度58.0 m，平均深度1.8 m。河水一般不流动，由于大量生活污水和工业废水及其尾水经雨水管网排入，导致河水发黑发臭，且水面泡沫较多，严重影响了两岸居民的正常生产生活；2009年上半年上庄河化学需氧量和氨氮平均为78.3 mg·L-1和16.7 mg·L-1。经污染源排查，上庄河与屿田河交汇处有一直径为1 200.0 mm的雨水管，污水流量约为900.0 m3·d-1，为上庄河最大的污染源。为了控制该雨水管所排污水对河水的污染，本试验在雨水管出水口周围构建了软隔离原位生物修复区，研究了污水经原位生物修复处理后，污水及河水溶解氧、化学需氧量、氨氮、总氮及总磷的动态变化，以期为污染河水原位生物修复提供参考和借鉴。
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浮水植物李氏禾Leersia hexandr和粉绿狐尾藻Myriophyllum aquaticum均采自浙江温州。聚乙烯经编无结渔网，网目为0.5 cm。NOZZLE-A2200强力造流曝气机，功率为2.2 kW，循环通量为615.0 m3·h-1，溶氧（O2）能力为4.1 kg·h-1。生物漂带[9]宽5.0 cm，长度与河水深度一致。
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试验区河宽为65.0 m，均深2.5 m。采用2层渔网将直通河道的雨水管出水口围隔在内（图 1），构成原位生物修复区（120.0 m×20.0 m）；近岸5.0 m区域内种植浮水植物李氏禾，构成浮水植物区；浮水植物+生物漂带区内，生物漂带间距为15.0 cm，水面种植粉绿狐尾藻。采用4支直径为150 mm的聚氯乙烯（PVC）管将雨水管中的污水引至a，b，c，d等4个点，间距均为24.0 m，使雨水管中的污水均匀分配至原位修复区域。原位处理区外10.0 m左右平行安装3台强力造流曝气机，间距均为50.0 m，曝气机运行12.0 h·d-1，工作时间为20:00至次日8:00。渔网围隔、浮水植物种植、生物漂带安装于2011年4月实施完毕，待李氏禾和粉绿狐尾藻长满隔离区后，开始实施水质监测。
图 1 上庄河污染源原位生物修复示意图
Figure 1. Diagram of in situ remediation of pollution source in Shangzhuang River
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水质监测位点如图 1所示。其中：Ⅰ为雨水管出水口水样；Ⅱ代表雨水管所排污水经隔离区修复处理后水样，位于近河中心渔网内侧0.5 m处；Ⅲ代表原位修复处理后水样；Ⅳ和Ⅴ代表河水水质，分别位于监测位点Ⅲ两侧150.0 m处；Ⅲ，Ⅳ和Ⅴ监测位点均处于河道中心线。水质监测于2011年7月10日开始，连续监测100 d；隔5 d于上午10:00采用500.0 mL采样瓶采集水面下30.0 cm处水样，并于当天测定各项指标。化学需氧量、氨氮、总氮和总磷参照废水监测分析方法（第4版）；溶解氧采用HI9147-04便携式溶解氧测定仪现场测定；硝态氮采用美国戴安ICS1500型离子色谱仪测定。
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所有实验数据均为3个平行样均值。采用Excel 2007对数据进行分析和作图。
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上庄河两岸分布着人造革厂、制笔厂、钢管厂等多家企业，部分生活污水、工业废水及其尾水经雨水管排入上庄河，由于有机污染物的耗氧作用，导致河水溶解氧接近于0而出现黑臭。由于浮水植物的根际泌氧作用[10]，试验期间测得浮水植物区水面下30.0 cm处溶解氧平均为0.87 mg·L-1，高于雨水管所排污水溶解氧平均值0.26 mg·L-1（图 2）。原位修复区溶解氧较低，说明水生植物虽然能一定程度上提高水体的溶解氧，但其提高量有限，宜结合人工增氧。污水经浮水植物区和浮水植物+生物漂带区处理后，经软隔离渔网进入河道，在强力曝气增氧机的作用下，河水溶解氧升高至4.40~5.98 mg·L-1。曝气增氧机的运行时间为20:00至次日8:00，溶解氧测定于10:00进行。因此，2.0 h内溶解氧并未显著下降，仍平均可达5.50 mg·L-1，表明河水中大部分有机污染物为耗氧速率慢的难降解污染物质[11]。监测位点Ⅳ和Ⅴ周围溶解氧值平均为1.93 mg·L-1和1.89 mg·L-1，接近GB 3838-2002《地表水环境质量标准》之Ⅴ类水标准的2.0 mg·L-1。
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污水化学需氧量为100.20~178.80 mg·L-1时，经浮水植物区和浮水植物+生物漂带区处理后，化学需氧量降为43.40~62.70 mg·L-1，平均去除率为63.8%（图 3）。浮水植物区近岸约1.8 m宽区域水深较浅，李氏禾扎根于底泥中，构成了120.0 m × 1.8 m的近岸植物带，由于李氏禾根茎及其上负载的生物膜的过滤截留及吸附吸收作用[12]，污水中大部分悬浮物得以截留，部分难溶化学需氧量为生物膜所吸附。污水经浮水植物区处理后，进入浮水植物+生物漂带区，其上层为粉绿狐尾藻，下层为比表面积达5 000.0 m2·m-3的软性悬浮载体即生物漂带，上部由于粉绿狐尾藻的根际泌氧作用及河中心高浓度溶解氧的扩散作用，表层处于好氧和兼氧状态；下部则由于生物漂带负载生物膜的耗氧作用处于厌氧状态；污水经浮水植物区的过滤截留、吸附吸收作用及浮水植物+生物漂带区的上部好氧、兼氧和下部厌氧的共同作用[13]，化学需氧量降低显著。若将隔离区看作污水处理设施，则水力停留时间为6.67 d时，对于化学需氧量为100.20~178.80 mg·L-1的污水，采用水生植物和微生物联合处理后，化学需氧量平均降至50.36 mg·L-1。
在河水的稀释作用及河水中土著细菌的作用下，位点Ⅲ处化学需氧量进一步降低为29.70~38.80 mg·L-1，稳定达到GB 3838-2002《地表水环境质量标准》之Ⅴ类水标准，即化学需氧量＜40.00 mg·L-1。监测位点Ⅳ和Ⅴ 化学需氧量分别为28.50~36.70 mg·L-1和31.60~41.30 mg·L-1，表明雨水管排出污水基本得到有效控制，并未对主体河段水质产生显著影响。监测位点Ⅴ处化学需氧量略高于位点Ⅳ，说明位点Ⅴ周围河段存在其他潜在污染源或底泥对上覆水体的污染较为严重。
图 2 溶解氧的动态变化
Figure 2. Dynamic varation of dissolved oxygen
图 3 化学需氧量的动态变化
Figure 3. Dynamic varation of chemical oxygen demand
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污水氨氮和总氮分别为10.50~17.89 mg·L-1和12.15~21.47 mg·L-1时，由于李氏禾和粉绿狐尾藻的吸收作用及其根系负载生物膜的硝化作用，氨氮和总氮分别降低为3.12~7.21 mg·L-1和3.19~6.16 mg·L-1（图 4~5），平均去除率分别达70.26%和71.41%。监测位点Ⅱ处硝态氮平均为0.42 mg·L-1，由于隔离区表层溶解氧较低，说明氨氮的去除并非微生物的好氧硝化作用；氨氮/总氮平均达91.06%，表明污水中氮的去除主要为植物的吸收作用[14]。监测位点Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ和Ⅴ氨氮平均分别为4.29，3.41，3.10和3.34 mg·L-1，总氮平均分别为4.70，4.43，4.37和4.41 mg·L-1，位点Ⅴ氨氮和总氮均较位点Ⅳ略高；位点Ⅲ氨氮和总氮分别较位点Ⅱ降低了20.51%和5.74%，氨氮降低的比例较大，而监测位点Ⅲ溶解氧较高，说明该河段氨氮的去除主要为微生物的硝化作用[15]。由于河水的稀释及扩散作用，位点Ⅳ和Ⅴ氨氮和总氮略有降低，进一步说明位点Ⅴ周围河段存在其他潜在污染源或底泥对上覆水体的污染较为严重。污水经原位修复处理后，同GB 3838-2002《地表水环境质量标准》之Ⅴ类水标准要求的氨氮和总氮均小于2.00 mg·L-1相比，仍存在一定差距，表明污水经本试验原位修复处理氨氮和总氮尚不能达到Ⅴ类水标准，有待采取其他措施进行强化。
图 4 氨氮的动态变化
Figure 4. Dynamic variation of ammonium nitrogen
图 5 总氮的动态变化
Figure 5. Dynamic variation of total nitrogen
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污水经隔离区处理后，总磷由2.24~2.62 mg·L-1降低为0.24~0.43 mg·L-1，平均为0.36 mg·L-1（图 6），达GB 3838-2002《地表水环境质量标准》之Ⅴ类水标准，即总磷＜0.40 mg·L-1；总磷的去除主要有微生物同化和植物吸收2种途径，隔离区溶解氧较低，故该区中总磷的去除主要为植物的吸收作用[16]。监测位点Ⅲ，Ⅳ和Ⅴ总磷平均为0.29，0.28和0.25 mg·L-1；位点Ⅲ周围河水中溶解氧较高，由于微生物的同化作用，位点Ⅲ较位点Ⅱ平均降低了19.44%；在河水的稀释作用下，位点Ⅳ和Ⅴ较位点Ⅲ总磷有所降低，均小于0.30 mg·L-1，表明经雨水管排入河道的总磷得到了有效控制，主体河段水质未受直接经由软隔离渔网进入的总磷所污染。
图 6 总磷的动态变化
Figure 6. Dynamic variation of total phosphorus
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对于经由雨水管排入温州上庄河的化学需氧量、氨氮、总氮和总磷分别为100.2~178.8，10.50~17.89，12.15~21.47和2.19~3.17 mg·L-1的污水，采用渔网、浮水植物和生物漂带构建软隔离区结合人工增氧进行原位修复处理，主体河段溶解氧、化学需氧量和总磷平均为5.50，33.05和0.29 mg·L-1，达GB 3838-2002《地表水环境质量标准》之Ⅴ类水标准；氨氮和总氮平均为3.41 mg·L-1和4.43 mg·L-1。
隔离区内河水溶解氧由0.26 mg·L-1升至0.87 mg·L-1。隔离区外在强力曝气增氧机的作用下，河水溶解氧升至4.40~5.98 mg·L-1。因此，单一依靠植物作用不能有效提高河水溶解氧，仍需借助人工增氧；通过浮水植物根系过滤截留、吸附吸收和微生物降解作用，化学需氧量平均降至50.36 mg·L-1，去除率达63.8%。
隔离区氮的去除主要为植物吸收氨氮，氨氮和总氮的平均去除率达70.26%和71.41%，经曝气区好氧微生物硝化作用，氨氮和总氮进一步降低20.51%和5.74%；隔离区内总磷的去除也主要为植物的吸收作用，处理后总磷平均降为0.36 mg·L-1，去除率达85.1%，曝气区微生物的同化作用使总磷平均降低19.44%。
An in situ remediation test for polluted water in the Shangzhuang River
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摘要: 采用渔网、浮水植物(李氏禾Leersia hexandr,粉绿狐尾藻Myriophyllum aquaticum)和生物漂带构建软隔离区,结合人工增氧对浙江省温州市上庄河经雨水管排放污水进行原位处理。结果表明:污水化学需氧量、氨氮、总氮和总磷分别为100.20~178.80,10.50~17.89,12.15~21.47和2.19~3.17 mg·L-1,处理后主体河段溶解氧、化学需氧量和总磷平均为5.50,34.3和0.29 mg·L-1,达GB 3838-2002《地表水环境质量标准》之Ⅴ类水标准;氨氮和总氮平均为3.41和4.43 mg·L-1。软隔离区内氮的去除主要为植物吸收氨氮,氨氮和总氮的平均去除率达70.26%和71.41%,曝气区好氧微生物的硝化作用使氨氮和总氮进一步下降20.51%和5.74%;总磷的去除主要通过软隔离区内植物的吸收作用和曝气区微生物的同化作用,原位修复处理后总磷平均降至0.29 mg·L-1,去除率达88.1%。Abstract: The objective of this work is to find a feasible approach for in situ remediation of main sources of river pollution. An isolated research area constructed of fishing nets, floating plants (Leersia hexandra,and Myriophyllum aquaticum),and biological belts coupled with artificial aeration was used for in situ remediation of sewage from rainwater pipes in the Shangzhuang River,Zhejiang Province. Water samples were collected every day and analyzed for water quality properties including dissolved oxygen (DO),chemical oxygen demand (COD),ammonium nitrogen (NH4+-N),total nitrogen (TN),and total phosphorus (TP) over a 100-day period. Results showed that when sewage concentrations were COD (100.20-178.80 mg·L-1), NH4+-N (10.50-17.89 mg·L-1),TN (12.15-21.47 mg·L-1),and TP (2.19-3.17 mg ·L-1),average after-treatment concentrations (in mg·L-1) for the main section dropped to DO of 5.50,COD of 34.3,and TP of 0.29,which were the fifth class for the national surface water quality standard;whereas NH4+-N was 3.41 mg·L-1 and TN was 4.43 mg·L-1. In the isolated research area,floating plants were directly responsible for N losses due to uptake of NH4+-N with the removal efficiencies of NH4+-N reaching 70.26% and TN being 71.41%. However,in the aerated field,N loss was mainly attributed to nitrification of bacteria,which accounted for 20.51% removal of NH4+-N and 5.74% removal of TN;uptake of floating plants and assimilation of bacteria removed TP with concentrations dropping to 0.29 mg·L-1 and removal efficiency reaching 88.1%. Thus,the isolated area constructed of fishing nets,floating plants,and biological belts coupled with artificial aeration could be an alternative for in situ remediation of main sources of river pollution.
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Key words:
- ecology /
- Shangzhuang River /
- polluted river water /
- in situ remediation /
- Leersia hexandra /
- Myriophyllum aquaticum
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换锦花Lycoris sprengeri为石蒜属Lycoris球根花卉，春初出叶，叶片为带状，宽约1.0 cm，长约30.0 cm，叶顶钝圆；秋初开花，花茎高约60.0 cm，伞形花序4~6朵，6片倒披针形花瓣，长约4.5 cm，宽约1.0 cm；花多淡紫红色，花被顶端蓝色，花色花型丰富，是石蒜属特殊的复色花卉[1]。
目前，换锦花的花色性状改良主要以传统的种间杂交和选择育种为主，分子标记育种为辅的育种模式。徐炳声等[2]利用杂交授粉技术，以换锦花为母本，中国石蒜L. chinensis为父本，选育出粉白色的秀丽石蒜L.× elegans；张定成等[3]在安徽和淮南发现三倍体和二倍体野生换锦花资源，表明换锦花可能是由其他石蒜属植物杂交而来。然而换锦花生长周期长，在自然状态下授粉率低且结实少，种子萌发率低，制约了换锦花传统育种研究。为了克服传统杂交育种的缺陷，不少研究者利用现代分子生物学技术探索换锦花花色分子育种性状改良的有效手段[4−6]。花色苷生物合成途径是类黄酮生物合成的一个分支途径，主要由结构基因和调控基因共同调控，花色苷积累受光照、温度和水分等多种因素的影响，植物受到强光、低温、氮亏缺等逆境协迫时会大量合成花色苷以增强自身抗性[7]，花色苷的生物合成也受到植物体自身生长发育过程的影响[8]。大量研究表明：R2R3-MYB 是花色苷生物合成的重要调控因子，常与bHLH和WD40形成MBW复合体结合到结构基因启动子序列上共同调控葡萄Vitis vinifera、风信子Hyacinthus orientalis、苹果Malus pumila花色素苷的生物合成[9]。许振渊等[10]和侯朔等[11]克隆了换锦花R2R3-MYB转录因子LsMYB4和LsMYB5基因，周洋丽等[12]通过病毒介导的基因沉默(VIGS)技术研究发现LsMYB4和LsMYB5是换锦花花青素合成的抑制性转录因子。周洋丽[13]和薛惠敏等[14]成功克隆了换锦花LsANS、LsF3'H、LsUFGT1和LsUFGT2基因启动子序列，为研究换锦花花色形成的调控机制和遗传改良提供基础。为进一步探讨换锦花花色形成的调控网络，本研究根据换锦花花瓣(红色部分和蓝色部分)转录组信息筛选到与换锦花花色形成相关的差异R2R3-MYB转录因子LsMYB7并进行生物信息学分析，通过病毒介导的基因沉默(VIGS)技术研究该基因调控花色苷积累的相关功能，结果可为通过基因工程手段改良换锦花的花色奠定理论基础。
1. 材料与方法
1.1 材料
2019年8—9月于浙江农林大学石蒜属植物种质资源圃采集换锦花花瓣，取换锦花小花苞(2.0~3.5 cm)、大花苞(4.5~6.0 cm)、盛花期和败花期4个不同花发育时期(图1A)和不同花色无性系H1、H2、H3、H4和H5盛花期花瓣(图1B)，液氮速冻后于−80 ℃冰箱保存备用。
图 1 换锦花不同花发育时期(A)和不同花色无性系盛花期(B)Figure 1 Different stages of flower development (A) and peak flowering stage in different clonal plants (B)1.2 方法
1.2.1 换锦花花瓣总RNA提取和cDNA第1链的合成
采用RNAiso plus法提取换锦花花瓣总RNA[15]，参照PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(Takara)方法合成cDNA 第1链。
1.2.2 换锦花LsMYB7基因cDNA序列的PCR扩增
根据转录组测序信息设计LsMYB7基因 cDNA序列特异引物LsMYB7-F：CAAGCAGTGGTCTCAACA和LsMYB7-R：AGAACAGCACTACTAAAGGT，参照Premix PrimeSTAR HS的PCR扩增体系扩增目的基因cDNA序列，PCR扩增反应程序为94 ℃变性30 s；58 ℃ 退火30 s；72 ℃延伸90 s，32个循环，72 ℃延伸10 min，质量浓度为1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，于凝胶成像系统(Bio-RAD)观察拍照；采用Hingene琼脂糖凝胶回收试剂盒(杭州麦克德勒科技有限公司)回收目的DNA，于−20 ℃保存备用。
1.2.3 目的基因连接和转化
参照pEASY-Blunt Zero Cloning Kit说明书将目的基因LsMYB7序列连接到pEASY-Blunt载体，转化大肠埃希菌Escherichia coli DH5α感受态细胞；在含有氨苄青霉素(Amp)、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和5-溴-4-氯-3-吲哚 β-D-半乳糖苷(X-Gal)的LB培养基(Luria-Bertani medium)上培养过夜，挑取阳性克隆于LB液体(含50 mg·L−1 Amp)培养基中，37 ℃振荡培养，PCR检测呈阳性的菌液送浙江有康生物科技有限公司测序；采用质粒DNA提取试剂盒(杭州创试生物科技有限公司)提取目的序列重组质粒DNA，于−20 ℃保存。
1.2.4 LsMYB7及花色形成相关基因的表达
采用Primer 5.0设计LsMYB7基因和花色形成相关基因(LsCHS、LsF3H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2)的RT-qPCR引物(表1)，使用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(Takara)方法合成cDNA 第1链。参照SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ(Takara)方法，于CFX96TM荧光定量 PCR 仪(BIO-RAD)进行RT-qPCR验证。RT-qPCR体系(20.0 uL)：cDNA(＜100 ng) 1.6 uL，正反引物各0.8 uL，TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 10.0 uL，RNase Free ddH2O 6.8 uL。RT-qPCR程序为95 ℃ 30 s，95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，循环40次。以LsGADPH为内参基因[15]，2−ΔΔCt方法计算实时荧光各基因的相对表达量，重复3次。
表 1 RT-qPCR所用引物Table 1 Primers for fluorescence RT-qPCR引物 正向(5′→3′) 反向(5′→3′) LsGADPH AGGGTTTGATGACCACCGTGCA ACAGCCTTGGCAGCTCCAGTAC LsMYB7 GCGCGGAGTTCTTGGCTCTGAT TCTGGCACCGTTCTCATCACGC LsCHS CAAGACATGGTGGTGGTCGAGGTC CGAGGAGTTTGGTGAGCTGGTAGTC LsF3H AACCGAGGACGCAACGGAATGC ACCATCTTCATCGCAGCCACCA LsANS CGTGCCAGGTCTCCAGGTCTTCTA TCGAGAGTGTCACCGACGTGAACTA LsUFGT1 GGTGGTGAAGGATGAGGAAGGTAGG GTTGAACCGCTCGAACCGCAATC LsUFGT2
LsF3'HGCGTAGCCTTCTCCTTCCTCACCT
TTGTACAGCCATGCACAGAATCCGCCATGAATCGCTTCACCTCCTC
GCAACCAAGGCAAGAAATCA说明：引物参考文献[16]。 1.2.5 换锦花花瓣花色苷的HPLC测定
参照刘跃平等[17]方法提取并用高效液相色谱(HPLC)测定换锦花花瓣花色苷质量浓度。精密称量换锦花花瓣干粉0.040 0 g，加入2 mL体积分数为1%甲醇/HCl提取溶液，振荡混匀；20 ℃超声提取30 min；12 000 r·min−1，离心15 min，取上清液；0.45 μm滤膜过滤；梯度洗脱：流动相为甲醇(A)-体积分数为1%的甲酸水(B)，0~20 min(A体积分数从5%升至60%)，20~25 min(A体积分数从60%升至100%)，25~30 min(A体积分数保持100%)，流速1 mL·min−1，检测波长280 nm，柱温30 ℃，进样量10 uL；以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷、飞燕草素-3-O-葡萄糖苷等3个花色苷为标准品。每样3个生物学重复。
1.2.6 亚细胞定位
采用XbaⅠ和BamHⅠ分步酶切法酶切亚细胞定位载体pAN580，再采用ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit (杭州霆喜生物科技有限公司)将LsMYB7基因序列连接到pAN580上，并转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞，在含有50 g·L−1Amp的LB培养基上进行筛选，挑选阳性克隆进行菌液PCR检测，成功构建pAN580-LsMYB7亚细胞定位载体，采用无内毒素质粒提取试剂盒(AxyPrep)提取pAN580-LsMYB7重组载体质粒DNA；聚乙二醇法(PEG 4000)转化烟草Nicotiana tabacum原生质体，用激光共聚焦荧光显微镜观察拍照。
1.2.7 VIGS沉默载体构建
采用双酶切法构建VIGS沉默载体pTRV2-LsMYB7：利用Primer 5.0设计长为400 bp的LsMYB7基因cDNA序列插入片段引物pTRV-LsMYB7-F: TACCGAATTCTCTAGAGAGGACAACATGCTACAATCCC和pTRV-LsMYB7-R：GCTCGGTACCGGATCCGCTCGAATCGCTAACATCCG；用限制性内切酶XbaI和BamHI分别双酶切VIGS载体(pTRV2)与LsMYB7基因的插入序列，T4 DNA连接酶连接载体与目的序列，转化大肠埃希菌DH5α，并在含有50 g·L−1 卡那霉素(Kan)的LB固体培养基筛选，提取pTRV2-LsMYB7重组质粒DNA。
1.2.8 换锦花花瓣瞬时转化
采用微量注射法转化换锦花花苞[12]，将重组质粒pTRV2-LsMYB7、pTRV2和pTRV1质粒DNA转化根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens GV3101，于YEP液体培养基(50 mg·L−1 Rif和50 mg·L−1 Kan)中，28 ℃，220 r·min−1振荡培养12~14 h；4 000 r·min−1, 离心10 min，去上清液；加入侵染液(10 mmol·L−1 MES + 200 μmol·L−1 AS + 10 mol·L−1 MgCl2，pH 5.6±0.03)重悬后的菌液D(600)=0.8~1.0；将pTRV1与pTRV2空载体、pTRV2-LsMYB7农杆菌液按照体积比1∶1混合均匀，室温黑暗静置4~6 h；使用1 mL注射器，吸取1 mL混合农杆菌菌液。选取3~4 d的换锦花花苞，在花苞基部缓慢注射混合根癌农杆菌菌液，充分侵染换锦花花苞，侵染5 d后采集花瓣用于LsMYB7和花色形成相关结构基因的表达分析(见1.2.4和表1)。
1.2.9 数据统计分析与作图
采用Excel 2020 统计和整理数据，采用SPSS 20.0 对数据进行差异显著性分析，采用Graphpad 8.0作图。
2. 结果与分析
2.1 LsMYB7 基因的克隆和序列分析
以换锦花花瓣的cDNA为模板，采用RT-qPCR技术扩增获得长度为951 bp 的LsMYB7 cDNA序列(图2)。该cDNA序列含有1个825 bp的开放阅读框(ORF)，编码274个氨基酸，分子量为6.84 kD，蛋白分子式为C2402H3981N825O982S258，理论等电点(pI)为5.04，不稳定系数为43.43，总体亲水性(GRAVY)为0.936。
2.2 LsMYB7氨基酸序列同源性分析
通过与美国国家生物技术信息中心(NCBI)搜索的其他植物MYB氨基酸同源序列进行比对，发现换锦花LsMYB7蛋白含有2个R2R3-MYB典型的SANT结构域R2和R3[18](图3)，属于R2R3-MYB类转录因子。与茶Camellia sinensis KAF5956278.1、狭叶油茶Camellia lanceoleosa KAI8015846.1、粗柄象腿蕉Ensete ventricosum RRT35038.1/RWV93016.1、椰子Cocos nucifera XP_KAG1363931.1、番红花Crocus sativus QBF29477.1、香根鸢尾Iris pallida KAJ6804060.1/KAJ6829988.1、河岸葡萄Vitis riparia XP_034676575.1和拟南芥Arabidopsis thaliana等其他植物的同源性为44.52%~60.57%，其中，与茶KAF5956278.1的同源性最高达60.57%，其次是香根鸢尾 KAJ6804060.1/KAJ6829988.1(59.32%)，与拟南芥AtMYB44(Q9FDW1.1)、AtMYB70(AEC07437.1)、AtMYB73(O23160.1)和AtMYB77(Q98N12.1)的同源性为44.52%~47.44%，且同源部分均集中在N端的R2R3 DNA结合结构域，而C端的同源性较低。
图 3 LsMYB7与其他植物的R2R3-MYB氨基酸同源序列比对Figure 3 Comparison of R2R3-MYB amino acid homologous sequences between LsMYB7 and other plants, R2R3-MYB2.3 LsMYB7系统进化与功能预测
从NCBI数据库下载拟南芥(AtMYB 16条)、换锦花(LsMYB 2条)和石蒜L. radiata (LrMYB 2条) R2R3-MYB氨基酸序列进行比对并构建系统进化树(图4)。参考拟南芥MYB基因家族的分类方法[19]，LsMYB7与拟南芥R2R3-MYB S22亚家族的AtMYB44、AtMYB70、AtMYB73和AtMYB77 聚为一类，由于拟南芥S22亚家族参与调控拟南芥的生长和发育过程，响应高盐、干旱低温等非生物胁迫反应，同一亚族基因的功能相似，结合花色基因表达分析，推测LsMYB7可能通过响应干旱和高温等调控换锦花花瓣花色苷的形成。
图 4 LsMYB7与拟南芥R2R3-MYB蛋白系统进化树Figure 4 Phylogenetic tree between LsMYB7 and R2R3-MYB from A. thaliana2.4 换锦花花瓣花色苷质量浓度
利用HPLC分别测定换锦花4个花发育时期和5个不同花色无性系(H1、H2、H3、H4和H5)盛花期花瓣的花色苷质量浓度(图5A和5B)，结果表明：换锦花花瓣花色苷的主要成分为矢车菊素，含有少量的天竺葵素和飞燕草素，说明花色苷的种类和质量浓度决定换锦花花色的多样性。随着换锦花花器官的生长发育，花瓣花色苷总质量浓度和矢车菊素质量浓度呈逐渐下降的趋势，小花苞时期矢车菊素质量浓度大约是败花期的3倍，说明换锦花花瓣花色苷的积累可能主要在花瓣发育的早期完成(图1A和5A)；在浅色换锦花无性系H4和H5中，矢车菊素质量浓度明显低于深色换锦花无性系H1、H2和H3(图1B和5B)。因此，从换锦花不同花发育时期和不同花色无性系花瓣颜色和花色苷质量浓度来看，矢车菊素对换锦花花瓣的颜色影响最大，矢车菊素质量浓度越高，换锦花花瓣的颜色就越深。
图 5 换锦花不同花发育时期(A)和不同花色无性系(B)花瓣的花色苷质量浓度Figure 5 Anthocyanin contents in petals of different stages of flower development (A) and different clones (B) of L. sprengeri2.5 换锦花LsMYB7和花色形成相关基因的表达
2.5.1 在换锦花不同发育时期的表达
利用RT-qPCR对LsMYB7和换锦花花色形成相关基因(LsC4H、LsCHS、LsF3H、LsF3'H、LsANS和LsUFGT1、LsUFGT2)在换锦花不同发育时期花瓣中的表达进行分析，结果(图6)表明：LsMYB7与LsCHS和LsF3'H基因的表达随着换锦花花苞发育呈逐渐上升趋势，LsC4H、LsCHS、LsUFGT1、LsUFGT2、LsF3'H和LsMYB7在败花期大量表达，LsF3H则在花苞发育前期几乎无表达，盛花期开始大量表达，而在败花期表达量开始下降；LsANS、LsUFGTs等花色苷合成的后期基因在盛花期的表达最低。其中LsCHS和LsF3'H基因的表达与花色苷总质量浓度和矢车菊素质量浓度正好相反(图5A)。
图 6 换锦花LsMYB7和花色形成结构基因在不同花发育时期的表达Figure 6 Expression of LsMYB7 and structure genes related to anthocyanin biosythesis in different flower development stages2.5.2 在换锦花不同花色无性系花瓣中的表达
LsMYB7和换锦花花色形成关键基因LsC4H、LsCHS、LsF3H、LsF3'H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2在换锦花不同花色无性系中的表达差异显著(图7)。2个花色苷合成的前期基因LsC4H和LsCHS及后期基因LsANS在淡色的无性系换锦花花瓣中表达量高。LsF3H在蓝色为主的H3无性系中表达量达到最高。LsMYB7在H1和H4中表达量比较高。LsMYB7基因的表达与LsCHS和LsF3'H基因的表达正好相反，而与不同花色无性系花色苷总质量浓度和矢车菊素质量浓度基本一致，这一结果与不同花发育时期的基因表达结果一致。因此，LsMYB7可能对LsCHS和LsF3'H基因的表达有一定的调控作用。
图 7 换锦花LsMYB7和花色形成结构基因在不同无性系中的表达Figure 7 Expression of LsMYB7 and structure genes related to anthocyanin biosythesis in different flower clones2.6 换锦花LsMYB7基因的亚细胞定位
通过双酶切法构建亚细胞定位载体pAN580-LsMYB7，转化烟草原生质体，于激光共聚焦荧光显微镜观察，LsMYB7荧光信号定位在细胞核中(图8)，说明LsMYB7基因为转录因子基因，在细胞核中起转录调控的作用。
2.7 LsMYB7基因沉默后对换锦花花瓣花色苷形成相关基因表达的影响
构建LsMYB7的VIGS基因沉默载体pTRV2-LsMYB7，通过微量注射法转化换锦花花苞，LsMYB7 基因沉默后，换锦花同朵花中一半花瓣明显变短，且颜色变深(图9A)；对LsMYB7和花色苷形成相关基因在换锦花花瓣中的表达进行分析(图9B和C)，与ck (空载)相比，LsMYB7基因换锦花花瓣中的表达量明显下降，同时，花色苷形成相关基因LsCHS、LsF3'H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2的表达量极显著下降(P＜0.01)，而LsF3H基因的表达量反而上升，LsC4H基因表达变化不大，说明LsMYB7转录因子可能参与调控花瓣的生长发育，且对LsCHS、LsF3'H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2的表达起正调控作用，而对LsF3H基因的表达起负调控作用。
图 9 LsMYB7基因沉默后表型变化及花色苷形成相关基因的表达Figure 9 Phenotype and relative expression levels of LsMYB7 and genes related to anthocyanin biosynthesis after LsMYB7 silencedA.表型变化；B. LsMYB7基因的表达；C. 花色苷形成相关基因的表达**表示差异极显著(P＜0.01)3. 讨论
植物R2R3-MYB转录因子广泛参与调控次生代谢、细胞形态发生、激素刺激、环境胁迫应答、分生组织形成和细胞周期等过程[20]。根据C-末端的不同，拟南芥R2R3-MYB基因家族可分成22个不同的亚族，其中，拟南芥S4、S5、S6和S7亚族基因参与花青素和类黄酮类化合物生物合成途径的结构基因的转录调控[18, 21−22]，换锦花LsMYB4、LsMYB5和拟南芥S4亚族基因聚为一类。通过花青素形成相关基因表达和VIGS基因沉默技术研究表明，LsMYB4和LsMYB5对花青素生物合成基因的表达有负调控的作用[10−12]。
S22亚族基因AtMYB44、AtMYB77、AtMYB73和AtMYB70主要参与拟南芥响应高盐、干旱、低温等非生物胁迫反应，其中，AtMYB73基因启动子中含有ABA响应元件ABRE及干旱胁迫和热胁迫顺式作用元件。AtMYB73突变体atmyb73在干旱胁迫处理下，ABA 下游基因ABI2、ABI5 的表达水平均较野生型明显增强。外源 ABA 处理野生型和突变体种子、幼苗，获得了与干旱胁迫处理类似的结果[23−24]。本研究结果表明：LsMYB7蛋白含有2个R2R3-MYB典型的SANT结构域R2和R3，属R2R3-MYB类转录因子，且R2和R3的保守结构域与其他植物高度同源，系统进化树分析结果显示LsMYB7和S22亚族基因AtMYB44、AtMYB77、AtMYB73和AtMYB70聚为一类，推测LsMYB7可能与S22亚族基因有相似的功能。
本研究中，LsMYB7基因的表达与换锦花花色苷形成相关基因LsCHS、Ls4CL2和LsUFGT2的表达趋势一致，推测LsMYB7可能参与换锦花花瓣花色苷的生物合成。而LsMYB7属于拟南芥S22亚族，未见该亚族基因AtMYB44、AtMYB77、AtMYB73和AtMYB70参与花色苷的生物合成的转录调控。已有报道认为AtMYB73/44能够参与调控拟南芥对干旱胁迫的响应[25−26]，而干旱胁迫可诱导植物细胞合成和积累花色苷。花色苷的光化学性质、亚细胞积累位点及在植物器官、组织中的空间分布决定了花色苷能强化植物的耐旱性，其中，花色苷提高植物细胞在干旱胁迫下的抗氧化能力可能是花色苷强化植物耐旱性的主要原因[27]。有研究表明：干旱胁迫可激活紫麦Triticum aestioum ‘Guizi 1’、甘薯Ipomoes batats等植物花色苷合成相关基因表达，通过提高花青素含量抵御干旱胁迫[28−29]。本研究中LsMYB7 基因沉默后，花色苷形成相关基因LsCHS、LsF3'H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2的表达明显下降，说明LsMYB7可能直接或间接调控花色苷的积累，而LsMYB7与S22亚族基因聚为一类，由于换锦花开花季为夏末秋初的8—9月，此时多为高温和干旱季节，因此推测LsMYB7可能通过对干旱胁迫响应来调控花色苷形成相关基因的表达，大量积累花色苷。这一研究结果与云南文山辣椒Capsicum annuum、番茄Lycopersicon esculentum的研究[30−31]相似，因此，植物可以通过干旱胁迫激活与花色苷合成相关基因的表达水平促进花色苷积累，进而提高抗旱能力。
4. 结论
本研究通过RT-qPCR获得长为951 bp 的LsMYB7 cDNA序列，开放阅读框(ORF) 825 bp，编码274个氨基酸，LsMYB7为R2R3-MYB转录因子家族，定位于细胞核，与其他植物R2R3-MYB有较高的同源性。系统进化分析表明LsMYB7和参与调控干旱等非生物胁迫响应的S22亚族基因聚为一类；LsMYB7基因主要在败花期和花色苷含量较高的H1无性系中表达，与花色苷合成相关基因的表达趋势一致；LsMYB7基因沉默后，换锦花部分花瓣明显变短，颜色变深，LsCHS、LsF3'H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2等花色苷形成相关基因的表达显著下调，因此，LsMYB7参与调控换锦花花瓣的生长发育，且通过对LsCHS、LsF3'H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2花色苷形成相关基因的表达调控花色苷的积累。此外，LsMYB7可能通过响应干旱胁迫激活花青素合成相关基因表达促进花色苷积累，进而提高换锦花的抗旱能力，LsMYB7调控花色苷积累抵御干旱的机制需要进一步研究。
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图 1 上庄河污染源原位生物修复示意图
Figure 1 Diagram of in situ remediation of pollution source in Shangzhuang River
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[1] HENRY C P,AMOROS C,ROSET N. Restoration ecology of river in wetlands:a 5 year post-operation survey on the Rhone River,France[J]. Ecol Eng,2002,18:543-554. [2] 李青,孙夏平,陈晓宏,等. 广州市石井河受污染水体修复中试研究[J]. 中山大学学报:自然科学版,2008,47(2):131-135. LI Qing,SUN Xiaping,CHEN Xiaohong,et al. Pilot-scale study on restoring polluted river water in the Shijing River, Guangzhou City[J]. Acta Sci Nat Unive Sunyatseni,2008,47(2):131-135. [3] 卢晓明,张勇,陈建军. 连续曝气下河水水质及睡莲生理响应的季节变化[J]. 环境工程学报, 2010,4(9):1978-1984. LU Xiaoming,ZHANG Yong,CHEN Jianjun. Seasonal variation of river water qualities and physiological responses of Nymphaea tetragona L. under continuous aeration[J]. Chin J Environml Eng,2010,4(9):1978-1984. [4] 黎贞,卫晋波,任随周,等. 生物制剂对城市黑臭河涌的原位修复技术[J]. 环境科学与技术, 2010,33(12F):435-439. LI Zhen,WEI Jinbo,REN Suizhou,et al. Recent progress of biological preparations for in situ remediation of urban black-odor river[J]. Environ Sci & Technol,2010,33(12F):435-439. [5] 李先宁,宋海亮,朱光灿,等. 组合型生态浮床的动态水质净化特性[J]. 环境科学,2007,28(11):2448-2452. LI Xianning,SONG Hailiang,ZHU Guangcan,et al. Characteristic of combined floating bed ecosystem for water purification under dynamic condition[J]. Environ Sci,2007,28(11):2448-2452. [6] PEDERSEN M L, ANDERSEN J M, NIELSEN K,et al. Restoration of Skjern River and its valley:project description and general ecological changes in the project area[J]. Ecol Eng,2007,30(2):131-144. [7] FARIA M S,LOPES R J,MALCATO J,et al. In situ bioassays with Chironomus riparius larvae to biomonitor metal pollution in rivers and to evaluate the efficiency of restoration measures in mine areas[J]. Environ Pollut,2008,151(1):213-221. [8] 肖继波,王慧明,褚淑祎,等. 生态槽净化污染河水的动态试验研究[J]. 水土保持学报,2012, 26(2):220-223. XIAO Jibo,WANG Huiming,CHU Shuyi,et al. Dynamic test-study of eco-tank on polluted river purification[J]. J Soil Water Conserv,2012,26(2):220-223. [9] 肖继波,蒋凯凤,吴加伟. 生物漂带接触氧化处理废纸造纸废水[J]. 中国造纸,2009,28(9):38-42. XIAO Jibo,JIANG Kaifeng,WU Jiawei. Study on bio-contact oxidation reactor treatment of wastewater from recycled paper mill[J]. China Pulp & Paper,2009,28(9):38-42. [10] 吴海明,张建,李伟江,等. 人工湿地植物泌氧与污染物降解耗氧关系研究[J]. 环境工程学报,2010,4(9):1974-1977. WU Haiming,ZHANG Jian,LI Weijiang,et al. Relationship between oxygen release from plants in constructed wetland and oxygen demand for pollutant degradation[J]. Chin J Environ Eng, 2010,4(9):1974-1977. [11] 高尚,黄民生,吴林林,等. 生物净化槽对黑臭河水净化的中试研究[J]. 中国环境科学,2008,28(5):433-437. GAO Shang,HUANG Minsheng,WU Linlin,et al. The control test-study of biological purification tank on malodorous river water purification[J]. China Environ Sci,2008,28(5):433-437. [12] 李睿华,管运涛,何苗,等. 河岸混合植物带处理受污染河水中试研究[J]. 环境科学,2006, 27(4):651-654. LI Ruihua,GUAN Yuntao,HE Miao,et al. Pilot-scale study on riparian mixed plant zones treating polluted river water[J]. Environ Sci,2006,27(4):651-654. [13] 向律成,郝虎林,杨肖娥,等. 多年生漂浮植物对富营养化水体的响应及净化效果研究[J]. 水土保持学报,2009,23(5):152-155,194. XIANG Lücheng,HAO Hulin, YANG Xiaoe,et al. Response and purification of perennial floating plants in eutrophic waterbody[J]. J Soil Water Conserv,2009,23(5):152-155,194. [14] 吴湘,杨肖娥,李廷强,等. 漂浮植物对富营养化景观水体的净化效果研究[J]. 水土保持学报,2007,21(5):128-132. WU Xiang,YANG Xiaoe,LI Tingqiang,et al. Study on purified efficiency of phosphorus and nitrogen from eutrophicated sight water by several floating macrophytes[J]. J Soil Water Conserv,2007,21(5):128-132. [15] 赵丰,卢晓明,黄民生,等. 净化槽水质改善与植物生理日变化关系的研究[J]. 华东师范大学学报:自然科学版,2010(2):50-57. ZHAO Feng,LU Xiaoming,HUANG Minsheng,et al. Study on the relationship between water quality improvement and Nymphaea tetragona physiological diurnal variation in purification tanks[J]. J East China Norm Univ Nat Sci, 2010(2):50-57. [16] 刘士哲,林东教,唐淑军,等. 利用漂浮植物修复系统栽培风车草、彩叶草和茉莉净化富营养化污水的研究[J]. 应用生态学报,2004,15(7):1261-1265. LIU Shizhe,LIN Dongjiao,TANG Shujun,et al. Purification of eutrophic wastewater by Cyperus alternfolius,Coleus blumei and Jasminum sambac planted in a floating phytoremediation system[J]. Chin J Appl Ecol,2004,15(7):1261-1265. -
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链接本文:
https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.2014.01.016
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