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生物的总初级生产力（gross primary productivity）是指单位时间内生物（主要是指绿色植物）通过光合作用途径所固定的光合产物量或有机碳总量，又称为总第一性生产力或总生态系统生产力(gross ecosystem productivity)[1-2]。随着遥感技术的发展，对总初级生产力的区域模拟成为可能。近年来，已经展开了基于遥感数据的总初级生产力模型模拟研究并建立了一系列模型，如全球生产率模型（GLO-PEM），区域尺度遥感参数模型（C-Fix），通量观测的水分利用率模型（EC-LUE），中分辨率成像光谱仪（MODIS-PSN），植被光合模型（VPM），总初级生产力（TG）和植被指数（VI）模型。植被光合作用模型（VPM）作为一种改进的光能利用效率模型已成功地被用来估算森林和高寒草地等生态系统总初级生产力并取得了很好的效果[3-7]。毛竹Phyllostachys edulis是中国最重要的竹林资源类型，占全国竹林面积的70%左右，以其生长快、周期短等特有的结构和功能特性使其有别于其他类型的森林生态系统，在维护生态平衡方面发挥了重要作用[8]。在全球森林面积急剧下降的情况下，竹林却以每年3%左右的速度在递增。这意味着竹林将是一个不断增加的碳汇[9]，对其总初级生产力的研究具有重要的意义。2010年，全球首座毛竹林碳通量观测塔在浙江省安吉县山川乡建成，这为毛竹林碳通量的准确估计提供了基础，并为遥感估测和涡度相关数据计算碳通量的交叉验证提供了可能。本研究拟运用VPM模型对浙江省安吉县山川毛竹林2011年的总初级生产力进行估算，同时分析其季相变化，以便探讨模型的适用性，了解毛竹林的物质循环和能量流动过程。
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安吉县位于浙江省西北部，30°23′～30°53′N，119°14′～119°35′E，县域三面环山，中部为谷底平原，西南高东北低。属亚热带季风气候，年平均气温12.2～15.6 ℃，年降水量1 100～1 900 mm。土壤主要有红壤、黄壤、岩性土、潮土、水稻土等5类，山地土壤主要为红壤、黄壤、岩性土，其中以红壤面积最大。安吉县植被在区域上划属亚热带常绿阔叶林亚区，中亚热带常绿阔叶林北部亚地带。安吉县是“中国竹子之乡”，竹林面积居全国前列、浙江首位，特别是毛竹林资源丰富，毛竹林覆盖率达29.3%，面积占全县森林面积的41.2%，占全省毛竹林面积近十分之一[10]。研究区位于安吉县山川乡，全球首座毛竹林碳通量观测塔在此建成，通量塔总高40 m，主要通过辐射传感器、光三维超声风速仪、二氧化碳（CO2）水汽分析仪等科学仪器，全自动、全天候采集竹林不同冠层的二氧化碳浓度等竹林生态系统的宏观信息，以此观测、记录毛竹林的固碳功能
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毛竹林的碳通量以及相关数据由数据采集器自动、连续采集存储，并在线计算30 min的汇总或平均数据。在实际的涡度通量观测中，由于传感器物理属性的局限性、坐标系选择不恰当以及夜间湍流混合不均匀等会造成观测数据的丢失或误差，因此需要对通量数据进行质量控制。本研究主要采用了二维坐标旋转和WPL校正，在EdiRe软件中完成。
在通量观测中，由于仪器、降水等原因影响，引起数据无效，因此须剔除不合格数据，包括：①二氧化碳通量观测数据通常在一个阈值范围内，据研究，森林生态系统的阈值为-3～3 mg·m-2·s-1[11]。本研究沿用该数据；?譺?訛剔除湍流不充分情况下的数据，即摩擦风速u*＜0.2 m·s-1，并对处理后的资料进行数据插补。
经过以上数据处理后，全年完整的经过数据插补的0.5 h通量数据（ENE）被用来进行下一步的处理。净生态系统碳交换量ENE是总初级生产力（PGP）与生态系统呼吸（Re）之差。一般假设夜间涡度相关技术观测的ENE等于Re，利用夜间的ENE与夜间温度Ta之间的关系，以及Van’t Hoff方程得到ENE和Ta的关系，结合白天的温度数据估计白天的Re。PGP等于白天的Re减去ENE。
$${{\text{P}}_{\text{GP}}}\text{=}{{\text{R}}_{\text{e}}}\text{-}{{\text{E}}_{\text{NE}}}\text{ }$$ (1) 本研究中使用的温度数据Ta和光合有效辐射数据PAR从通量观测系统的梯度系统获得。这些数据同样以0.5 h 1次的频率进行测定并记录。其中，PAR数据由梯度系统测得的短波有效辐射数据乘以系数0.5获得[12]。为了匹配模型使用的MODIS（8 d时间分辨率）数据，逐日光合有效辐射被累积成8 d的总和值，对温度数据求8 d的平均值。
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遥感数据使用美国宇航局/中分辨率影像辐射度计（National Aeronautics and Space Administration/Moderate Resolution Imaging Spectroradiometer，NASA/MODIS）陆地产品组按照统一算法开发的2011年共计46幅8 d最大值合成的陆地表面反照率产品（MOD09A1），空间分辨率为500 m，空间位置在全球正弦曲线投影SIN（sinusoidal project）系统中的编号为h28v05，数据格式为EOS-HDF。该数据可以从USGS（United States Geological Survey）上下载。对于下载的MODIS数据，用ENVI软件将坐标转换为UTM坐标系下WGS84坐标，并使用其中的蓝（459~479 nm），红（620~670 nm），NIR（841~875 nm）和SWIR（1 628~1 652 nm）4个波段的数据进行植被指数的计算。研究表明：使用单个像元和使用3×3，5×5像元进行反照率数据提取对于计算植被指数影响差异不显著[13]。因此，基于研究地点的经纬度信息，从MOD09A1产品中提取通量塔所在位置的单个像元的反照率数据，参照以下公式进行植被指数归一化（normalized difference vegetation index，INDV），增强植被指数（enhance vegetation index，IEV）和陆地表面水分指数（land surface water index，ILSW）的计算：
$$\begin{align} & {{I}_{NDV}}=\frac{{{P}_{NIR}}-{{\operatorname{P}}_{red}}}{{{P}_{NIR}}-{{\operatorname{P}}_{red}}}; \\ & {{I}_{EV}}=2.5\times \frac{{{P}_{NIR}}-{{\operatorname{P}}_{red}}}{{{P}_{NIR}}+1+6.0\times {{\operatorname{P}}_{red}}+7.5\times {{P}_{blue}}}; \\ & {{I}_{LSW}}={{P}_{NIR}}-{{P}_{SWIR}}{{P}_{NIR}}+{{P}_{SWIR}} \\ \end{align}$$ (2) 其中：ρ表示相应波段的地表反照率，下标NIR，red，blue和SWIR分别代表近红外、红、蓝和短波红外波段。INDV在高植被区易饱和、低植被区易受土壤背景影响，为了克服这种缺点，IEV引入蓝光波段来降低大气影响，同时，气溶胶对IEV的影响也不如对INDV的影响显著[14]。IEV对植被冠层变化敏感，包括冠层叶面积指数ILA，冠层类型和冠层结构；而INDV对叶绿素变化比较敏感； ILSW对于叶片含水量变化比较敏感，短波红外光谱波段对植物含水量和土壤湿度的变化敏感，而近红外光谱波段对这种变化表现的敏感性较小，通过两者的联系来反演植被叶片含水量[15]。
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通过遥感手段获取的植被指数数据表征植被的生长状态。MOD09A1数据虽然已用最大值合成法（MVC）进行8 d数据合成，可以消除部分噪音污染，保证合成结果为周期内最接近现实情况的影像，但是由于算法本身的缺陷，仍然会受“云”等不良大气噪声的影响。这些残留噪声造成植被指数总趋势“衰退”[16]。本研究采用时间序列谐波分析法（harmonic analysis of time series，HANTS）对INDV和IEV数据进行异常值处理（主要是消除云层的影响）。由于ILSW受云层影响较小，且ILSW数值波动较大，异常值判别比较困难，因此未对ILSW进行异常值处理。通过HANTS对INDV和IEV数据进行处理后，使得全年46个数据呈现一定的周期性，保持全年数据的平滑状态。
图 1 HANTS方法处理前后INDV和IEV时间序列对比图
Figure 1. Comparison of normalized difference vegetation index,enhance vegetation index sequence before and after HANTS
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Xiao等[17]提出了植被光合作用模型（vegetation photosynthesis model，VPM）用来估算植被生长季节——植被光合有效周期总初级生产力。VPM模型适用于站点尺度上单一植被类型的生态系统[18]，一些专家和学者应用VPM模型实现了对于高寒草甸、温带草原、森林、高寒、高寒沼泽生态系统8 d时间分辨率、500 m空间分辨率总初级生产力的准确估测[3-7, 18]。模型中使用了2个改进的遥感植被指数，即增强植被指数IEV和陆地表面水分指数ILSW来反映冠层（PAV）吸收的有效辐射和叶子的年龄，模型基本构成如下：
$$\begin{align} & {{\text{P}}_{\text{GP}}}\text{=}{{\varepsilon }_{g}}\times {{F}_{PARPAV}}\times {{P}_{AR}}; \\ & \varepsilon ={{\varepsilon }_{0}}\times {{T}_{scalar}}\times {{W}_{\sec lar}}\times {{P}_{scalar}} \\ \end{align}$$ (3) 其中：PAR是光合有效辐射，FPARPAV代表光合有效辐射被冠层叶绿素吸收的部分，εg是光能利用效率。参数ε0表示表观量子效率或最大光能利用效率，Tscalar，Wscalar，Pscalar分别是温度、水分和物候对最大光能利用效率的影响函数。
在VPM模型中，FPAR被分为2个部分，一部分是冠层中含有叶绿素可以进行光合作用的部分FPARPAV，另一部分是不能进行光合作用的部分FPARnPAV（如枯叶、树枝等）[19]。在FPAR中只有FPARPAV部分对碳通量的估算起决定作用。在植被生长期间FPARPAV可以被看作是IEV的线性函数，且系数α被设置为1。表达式如下：
$${{\text{F}}_{\text{PARPAV}}}\text{=}\alpha \times {{I}_{EV}}$$ (4) Tscalar是温度对最大光能利用率的影响函数，采用陆地生态系统模型（TEM）的算法[6]：
$${{T}_{scalar}}=\frac{(T-{{T}_{max}})(T-{{T}_{max}})}{(T-{{T}_{min}})(T-{{T}_{max}})-{{(T-{{T}_{opt}})}^{2}}}$$ (5) 其中：Tmin，Tmax，Topt分别是植物进行光合作用的最低、最高和最适温度，T为某一时刻的气温。当空气温度低于最低光合作用时，Tscalar为0。在本文中，参考生长季IEV达到最大值时的温度以及研究资料，最适温度取值为25 ℃，研究发现当温度超过25 ℃时生长最快，超过25 ℃，光合累积减少；Tmin，Tmax分别设为-5 ℃和40 ℃[20]。
Wscalar表征水分对光合作用的影响，在VPM模型中被表示为地表水分指数的函数：
$${{W}_{scalar}}=\frac{1+{{I}_{LSW}}}{1+{{I}_{LSW}}_{\max }}$$ (6) 其中： ILSWmax是单个像元内植被生长季的最大ILSW值。本研究中ILSW最大值为0.282 25。
Pscalar表征物候状况对光合作用的影响，其计算与叶片的寿命有关，具有物种特异性[7]。由于毛竹林整年均有叶片覆盖，所以Pscalar被设置为1。
最大的光能利用效率因植被类型的不同而呈现显著的差异[21]。对于特定的植被类型可以通过文献调查或利用瞬时净生态系统碳交换数据（NEE）和光量子通量密度数据（PPFD）的关系获得。本研究毛竹林最大光能利用效率取值来源于杨爽的硕士论文，和本研究为同一数据源，其值为0.002 8 mg·μmol-1，由Michaelis-Menten模型拟合得出[19]。
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将由通量塔获取的温度和光合有效辐射整合成8 d数据，结合由MODIS影像计算获得的植被指数数据来驱动VPM模型，获得2011年、时间分辨率为8 d的毛竹林总初级生产力的估测值（PGPVPM），并和由通量塔数据获取的总初级生产力（PGPobs）进行对比验证。由图 2可以看出：利用VPM模型估测的总初级生产力和涡度相关通量观测的总初级生产力在研究时间段内季节动态一致。
VPM模型估算的2011年毛竹林总初级生产力为1 848.54 g·m-2，通量塔数据获得的2011年毛竹林总初级生产力为1 899.69 g ·m-2，相对误差为2.69%。尽管VPM模型估算的总初级生产力和通量塔获得的总初级生产力在总量上相对误差较小，在季节动态上趋势一致，但是VPM模型估算的总初级生产力（PGPVPM）并不能很好地与涡度协方差技术获得的总初级生产力（PGPobs）在细节上相匹配。在整个生长季节，PGPVPM与PGPobs的差异随着温度升高以及植被生长，逐渐增大，在夏天达到峰值，之后逐渐降低。PGPVPM与PGPobs线性关系的决定系数为0.747，低于同一模型在森林、农田以及草原上的估算准确度[3-7]。
图 2 利用VPM模型估算的基于MODIS的总初级生测量的总初级生产力(PGPobs)
Figure 2. Comparison of season changes in gross primary production from carbon flux site (PGPobs) and
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图 3是2011年山川站毛竹林INDV，IEV和ILSW的季节动态。在数值上INDV最大，其次是IEV，ILSW的值最小。这3个植被指数都在7月达到峰值，全年变化趋势与总初级生产力保持一致。植被指数与总初级生产力的判定系数为： IEV（R2=0.69）＞INDV（R2=0.62）＞ILSW（R2=0.12）。非生长季ILSW的显著升高源于研究区域冬季的积雪覆盖，积雪覆盖改变了地表反射率[22]。IEV与INDV相比，与通量塔数据获取的总初级生产力有更好的线性关系，IEV与总初级生产力的决定系数（R2）在0.69，而INDV为0.62，因此对总初级生产力的解释程度来看，IEV比INDV具有更好的解释结果。
图 3 毛竹林植被指数（IEV,INDV,ILSW）和通量塔获得的总初级生产力
Figure 3. Vegetation indices(IEV,INDV,ILSW)and the gross primary profuctionof the carbon flux site
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本研究应用集成MODIS卫星影像数据和地面通量站点的观测数据的VPM模型来估算毛竹林总初级生产力。估测结果表明，对于毛竹林生态系统，IEV和总初级生产力（PGP）仍然具有更强的相关性，而INDV和PGP的相关性则相对较弱，表明IEV在表征地表植被覆盖状况方面优于INDV，进一步说明使用IEV代替INDV进行PGP估测的优势。VPM模型估测的PGP在季节变化趋势上和通量站点数据获得的PGP保持一致，在全年累积总量上接近，但是估测值和观测值之间仍然存在一定的差异，尤其是在生长季节。
尺度扩展问题是通量研究的热点和难点问题，通量塔的测量范围是有限的，通常为通量塔高度的100倍[23]。遥感模型的应用能帮助我们将单个站点的研究推导到区域尺度，遥感模型估算结果和实测数据的比较是验证和校正模型的第1步。限于时间等因素，本研究仅应用VPM模型对毛竹林的总初级生产力进行了估测和检验，并没有将模型进行尺度外推，且对模型的误差来源没有进行深入探讨，研究中的一些结论和观点还有待于进一步验证。根据目前在研究过程中遇到问题的一些理解和思考，认为在以下一些问题上需要进一步的完善和发展。
本研究仅利用VPM模型对毛竹林的总初级生产力（PGP）进行了估测，和通量塔观测数据进行了交叉验证，分析了毛竹林总初级生产力在2011年的季节和年际变化规律，但是并未对模型进行扩展研究。对VPM模型有效性的验证仅利用了2011年的观测资料，基于毛竹林生长的一些特殊性，叶龄、竹龄、叶位等均对毛竹的光合作用能力和碳汇能力有巨大的影响，并且毛竹存在大小年之分，对毛竹林生态系统碳通量的监测应充分考虑这些因素，需要长期数据的检验和分析，才能对毛竹林生态系统的碳循环有更深刻的认识。
在整个模型的应用中，关键参数只有IEV和ILSW，结合了温度和光合有效辐射数据，忽略了毛竹林生长过程中的一些其他因素；虽然植被指数能很好地反映植被的生长状况和季节变化趋势，但是并不能很好地解释物理过程，如：植被的光合作用过程、生态系统呼吸过程、横向碳交换等，需要进一步增加相关解释因子。
VPM模型中，最大光能利用率是一个最重要的参数，由植被类型确定，且在植被生长的不同阶段，最大光能利用率不是固定不变的。本研究参照杨爽的研究结果，将最大光能利用率取为一个固定值，且该值在计算过程中并没有考虑海拔、温度和坡度等因素对最大光能利用率的影响，可能导致估算结果的误差。在模型中仅用温度和水分因子对最大光能利用效率进行了线性调节，最大光能利用率和调节因子的误差会带来总初级生产力估算的不确定性。 由于数据观测和采样误差、相关数据的缺乏，模型在模拟生态系统过程中的偏差，以及模拟技术和算法的不确定性，使得在观测、模拟区域或全球尺度的陆地生态系统生产力过程中存在着一定的不确定性。在本研究中并没有对误差来源进行分析、量化和定量化表达，如何对这些误差来源和不确定性进行分析将是进一步研究的重点。
总之，毛竹林作为森林生态系统一个重要类型和组成部分，对其碳汇能力的研究应进一步深化。VPM模型虽然已在森林、草地、农田等生态系统中得到很好的应用和验证，在毛竹林生态系统中也有一定的精度，但是要精确估测毛竹林的总初级生产力仍需要进一步的发展和细化参数。VPM模型的最终目的是以更高的时间和空间分辨率实现对于区域或全球不同生态系统总初级生产力的准确估测。
Gross primary production in Phyllostachys edulis based on MODIS
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摘要: 通过集成中分辨率成像光谱仪(MODIS)卫星影像数据与地面通量台站的观测数据,基于遥感的植被光合模型(VPM),估测了浙江省安吉县山川乡2011年的毛竹Phyllostachys edulis林总初级生产力(PGP)。研究表明:VPM模型估测的PGP(PGPVPM)在季节变化趋势上和通量站点数据获得的PGP(PGPobs)保持一致,VPM模型估算的2011年毛竹林总初级生产力为1 848.54 g·m-2,通量塔数据获得的2011年毛竹林总初级生产力为1 899.69 g·m-2,相对误差为2.69%。在全年累积总量上接近,但是估测值和观测值之间仍然存在一定的差异,尤其是在生长季节,PGPVPM的值要高于PGPobs;VPM模型估测的PGP和通量塔数据获取的PGP之间的决定系数为0.747,相关系数为0.864;且时间序列的增强植被指数(IEV)比PGP的相关关系强于归一化植被指数(INDV)与PGP的关系。研究表明:VPM对于站点和区域尺度的毛竹林生态系统PGP的模拟具有很大的潜力。Abstract: To analyze gross primary production(PGP) of Phyllostachys edulis from Shanchuan Village in Anji County,Zhejiang Province in 2011,the vegetation photosynthesis model (VPM) which was developed by integrating MODIS(Moderate-resolution Imaging Spectroradiometer)and flux measurements was used. Results showed that PGPVPM(1 848.54 g·m-2)was consistent with results from Shanchuan carbon flux site(1 899.69 g·m-2) having a relative tolerance of 2.69%. Though total PGP was similar,some differences occurred especially in the growing season,PGPVPM were higher than PGPobs. The correlation of PGPVPM to PGPobs was 0.747 and the correlation coefficient was 0.864. Further,time-series data for the IEV have a stronger linear relationship with the PGP than those for the Normalized Difference Vegetation Index. Results of this study demonstrate that the satellite-driven VPM has been potential for estimating site-level or regional Phyllostachys edulis PGP.
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桂花Osmanthus fragrans为木犀科Oleaceae木犀属Osmanthus，是中国十大传统名花之一，也是园林造景常用植物。根据开花时间不同，桂花可以分为秋桂和四季桂；根据花色差异，秋桂又可以分为丹桂、金桂和银桂。已有研究分析了桂花不同花色品种呈色物质成分，证实类胡萝卜素的种类及其质量分数是决定桂花花色的最主要因素[1−2]。目前，桂花类胡萝卜素的定性定量及其代谢途径中相关催化酶基因已被陆续分离得到[3−5]。桂花不同花色品种花瓣所含的类胡萝卜素中，β-胡萝卜素相对含量最高[1]。桂花番茄红素β-环化酶OfLCYB具备使番茄红素两端环化转化为β-胡萝卜素的能力，且OfLCYB对番茄红素的底物亲和性强于其他番茄红素环化酶，是桂花类胡萝卜素代谢途径中的关键催化酶[6−7]。沈子又等[8]分离得到了OfLCYB基因启动子，发现其启动子序列均包含有TATA-box、CAAT-box响应元件及水杨酸、赤霉素、脱落酸等激素响应元件等，但目前有关桂花OfLCYB基因上游转录因子的筛选及鉴定鲜见报道。
已有研究认为：ERF[9]、MYB[10]、NAC[11]等转录因子参与调控植物类胡萝卜素代谢。AP2/ERF转录因子家族具有众多的家族成员。根据AP2/ERF结构域的数目和序列特征，AP2/ERF家族转录因子分为AP2、ERF、CBF/DREB、RAV和Soloist这5个亚组，其中ERF类转录因子仅含有1个AP2/ERF结构域。ERF转录因子通过结合下游靶基因的GCC (GCCGCC)或DRE (CCGAC)序列[12]调节基因的表达，参与调节植物生长发育、生物或非生物胁迫应答、调控果实成熟等。此外，在拟南芥Arabidopsis thaliana[9]、番茄Solanum lycopersicum[13]和苹果Malus domestica[14]中还发现B2亚组的ERF转录因子具有调控植物类胡萝卜素合成的功能。拟南芥B2亚组ERF转录因子包括At3g16770.1(AtERF72/AtRAP2.3)、At1g72360.2 (AtERF73)、At1g53910.1 (AtERF74/AtRAP2.2)等5个成员。AtRAP2.2蛋白可以结合到拟南芥AtPSY启动子和AtPDS启动子的ATCTA元件上，从而调控相关基因的表达[15]。在苹果MdPSY1和MdPSY2基因启动子中也存在多个ATCTA顺式作用元件，能被AtRAP2.3的同源基因蛋白AP2D15强烈激活表达[14]。在黄龙胆Gentiana lutea[16]中，GlLCYB、GlLCYE、GlZEP、GlPDS、GlZDS、GlBCH基因的启动子上均存在ATCTA作用元件，说明ATCTA元件广泛存在于类胡萝卜素合成基因启动子上，表明B2亚组的ERF转录因子可能对一系列类胡萝卜素代谢基因具有调控作用。
本研究以桂花丹桂品种‘堰虹桂’O. fragrans ‘Yanhong Gui’为材料，首先对OfLCYB基因启动子的ATCTA顺式作用元件进行分析，再对桂花B2亚组的ERF转录因子基因进行序列分析和表达分析，利用酵母单杂交技术筛选和鉴定与OfLCYB互作的关键B2亚组的OfERF转录因子，不仅可以扩展桂花花色研究领域，同时为揭示桂花类胡萝卜素代谢的调控网络提供理论依据，为桂花品种培育和种质创新提供新的思路。
1. 材料与方法
1.1 材料
选择浙江农林大学桂花资源圃生长状况良好的地栽桂花品种‘堰虹桂’为材料，分别采集‘堰虹桂’的新鲜嫩叶以及顶壳期(S1)、铃梗期(S2)、初花期(S3)、盛开期(S4)的花瓣样品[17]，每个样品3次生物学重复，取样时间均为10:00。上述叶片与花瓣样品快速采集后放入液氮冷冻，随后保存于−80 ℃超低温冰箱，供后续使用。
1.2 方法
1.2.1 OfLCYB启动子序列分析、克隆及OfLCYB基因表达分析
根据诺禾致源的Ultraclean plant DNA purification Kit试剂盒操作说明提取‘堰虹桂’的嫩叶鲜样DNA。借助PlantCARE数据库(
http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/ )分析启动子顺式作用元件。根据OfLCYB的启动子序列信息[8]设计引物，以‘堰虹桂’嫩叶DNA为模板扩增得到其启动子。以‘堰虹桂’不同时期的花瓣cDNA为模板，以OfLCYB基因序列设计表达引物，以桂花OfACT基因[18]为内参基因，按照TB Green® Premix Ex TM TapⅡ说明进行实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)分析。引物序列见表1。利用参照基因的2−ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。表 1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences引物名称 引物序列(5′→3′) LCYB-PRO-GW-F ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcCTGCTTCTTGTTGTTGTACG LCYB-PRO-GW-R ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcCAATTTTGGCATGTTCTTAG OfLCYB-qF GAAAGGAGACGCCAAAGGGAG OfLCYB-qR GGAAGAAATAGCCGAGATGATAAGA 说明：小写字母表示部分attB序列。 1.2.2 B2亚组OfERFs生物信息学分析
使用天根公司RNA perp Pure Plant Kit试剂盒，根据产品说明提取‘堰虹桂’不同时期的花瓣RNA。随后用紫外分光光度计和质量分数为1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA浓度和质量。按照PrimeScriptTM RT Master Mix说明书将检验合格的盛花期RNA进行反转录。
应用Prot-Param在线软件 (
http://web.expasy.org/protparam/ ) 预测所编码蛋白的分子量、理论等电点、不稳定系数等；采用MEGAX软件中的邻位相邻法(NJ)进行同源聚类，建立系统发育树，并采用Bootstrap法(重复1 000次) 评估检测系统进化树。运用DNAMAN 7.0对4个OfERF基因推测所得的序列进行多序列比对分析。1.2.3 B2亚组OfERFs表达分析
以‘堰虹桂’不同时期的花瓣cDNA为模板，以筛选得到的桂花B2亚组OfERFs序列设计引物，以桂花OfACT为内参基因。分析方法参照1.2.1。引物序列见表2。
表 2 OfERFs基因RT-qPCR引物序列Table 2 RT-qPCR primer sequences of OfERFs引物名称 引物序列(5′→3′) 引物名称 引物序列(5′→3′) OfERF73a-qF CTGAAGAGAAACCGCCAACAA OfERF72a-qR GGGTAGTAAACTTCTTGTTGCTGCGTA OfERF73a-qR TTAACGCCATCAGAAGACACAAGT OfERF72b-qF CAAATATCCTATGTTCAGAGG OfERF73b-qF AATTGGGATGCCGCCTCA OfERF72b-qR ATAGCATACCATAACATACCA OfERF73b-qR TTAAATCCCACCAAACATAGCACT OfACT-qF CCCAAGGCAAACAGAGAAAAAAT OfERF72a-qF CCAACCCCACCGGCTC OfACT-qR ACCCCATCACCAGAATCAAGAA 1.2.4 OfERFs与OfLCYB启动子酵母互作验证
通过Gateway方法构建pAbAi-OfLCYB-pro载体，之后利用限制性内切酶BstB I线性化质粒pAbAi-OfLCYB-pro、阳性对照p53-AbAi以及阴性对照pAbAi载体。按照Yeastmaker™ Yeast Transformation System 2 User Manual产品说明制备酵母感受态，并将线性化的质粒转入感受态细胞中，涂布于尿嘧啶缺陷培养基(SD/-Ura)酵母板筛选培养基上，28 ℃倒置培养2~3 d。挑取单菌落扩大培养，提取酵母DNA。以粗提酵母DNA为模板，进行PCR检验。用质量分数为0.9% 的无菌氯化钠溶液稀释菌液，D(600)=0.002时，均匀涂布于金担子素A (AbA)不同浓度的SD/-Ura固体培养基上，倒置于28 ℃培养箱内培养2~3 d，以检测AbAr基因本底表达水平。将pGADT7-OfERF72a、pGADT7-OfERF72b、pGADT7-OfERF73a、pGADT7-OfERF73b和pGADT7-53、pGADT7分别转入诱饵菌株pAbAi-OfLCYB-pro和阳性对照p53-AbAi、阴性对照pAbAi的酵母感受态细胞，悬浮液均匀涂布于SD/-Leu缺陷培养基上，倒置于30 ℃培养箱内培养3~5 d，再将长出的单菌落分别在亮氨酸缺陷培养基(SD/-Leu)与含300 μg·L−1的亮氨酸缺陷培养基[SD/-Leu/AbA(300 μg·L−1)]点斑检测其互作情况。
2. 结果与分析
2.1 OfLCYB启动子序列分析及表达分析
由图1可见：桂花OfLCYB基因启动子序列含有2个ATCTA顺式作用元件。
图 1 OfLCYB启动子的ATCTA顺式作用元件分析Figure 1 Analysis of ATCTA cis-acting elements of the OfLCYB promoter通过荧光定量检测‘堰虹桂’不同发育时期花瓣中OfLCYB的表达水平(图2)，发现OfLCYB的表达量从顶壳期到盛开期逐渐升高，在盛开期表达量最高。
图 2 OfLCYB在‘堰虹桂’不同花期的表达Figure 2 Expression of OfLCYB at different flowering stages in O. fragrans ‘Yanhong Gui’2.2 B2亚组OfERFs生物信息学分析
通过对桂花转录组数据库分析，筛选获得4个B2亚组ERF有关的Unigene序列。利用MEGAX软件对4个桂花OfERFs氨基酸全长和拟南芥ERF家族的122个成员的氨基酸序列构建系统进化树，结果显示：4个桂花OfERFs与5个拟南芥ERF序列聚集在B2亚组(图3)。其中CL2088.Contig2和CL2088.Contig3聚为一小支，与拟南芥At3g16770.1 (AtERF72)的关系最为接近，将CL2088.Contig2和CL2088.Contig3分别命名为OfERF72a和OfERF72b。此外，CL550.Contig3、Unigene4342与拟南芥At1g72360.2 (AtERF73)关系较近，将CL550.Contig3和Unigene4342分别命名为OfERF73a和OfERF73b。
图 3 桂花B2亚组OfERFs系统发育分析Figure 3 Phylogenetic analysis of OfERFs in subgroup B2 of O. fragrans多序列比对分析发现(图4) ：4个OfERF基因均包含1个AP2保守结构域。4个OfERFs蛋白序列的基本理化性质(表3)分析发现：OfERF72a基因的氨基酸数量为232个，分子量为26 144 Da；OfERF72b基因的氨基酸数量为228个，分子量为25 841 Da；OfERF73a基因的氨基酸数量为386个，分子量为43 632 Da；OfERF73b基因的氨基酸数量为375个，分子量为41 607 Da。4个OfERF的理论等电点为4.63~5.33，均属于偏酸性蛋白质；总平均亲水指数均为负值，都属于亲水性蛋白。OfERF72a、OfERF72b、OfERF73a不稳定系数分别为43.67、54.42、43.21，判断为不稳定的蛋白质；OfERF73b不稳定系数为38.40，判断为稳定的蛋白质。
图 4 B2亚组OfERFs氨基酸序列比对分析Figure 4 Amino acid multiple sequence alignment analysis of OfERFs of subgroup B2表 3 B2亚组OfERFs基本理化性质分析Table 3 Analysis of basic physicochemical properties OfERFs of subgroup B2基因名称 氨基酸数量/个 分子量/Da 理论等电点 不稳定系数 总平均亲水指数 OfERF72a 232 26 144 5.33 43.67 −0.744 OfERF72b 228 25 841 5.30 54.42 −0.796 OfERF73a 386 43 632 4.63 43.21 −0.739 OfERF73b 375 41 607 5.01 38.40 −0.710 2.3 B2亚组OfERFs表达分析
利用RT-qPCR技术分析‘堰虹桂’不同发育时期花瓣中OfERF72a、OfERF72b、OfERF73a与OfERF73b相对表达量(图5)发现：从顶壳期到盛开期，OfERF72a、OfERF72b的相对表达量基本呈现逐渐下降的趋势，OfERF73a的相对表达量在顶壳期、铃梗期与盛花期之间差异较小，在初花期相对表达量略有下降。OfERF73b的相对表达量在顶壳期、铃梗期较高，随后在初花期相对表达量显著下降(P＜0.05)。
图 5 B2亚组OfERF在‘堰虹桂’不同花期的表达Figure 5 Expression of OfERF genes of subgroup B2 at different flowering stages in O. fragrans ‘Yanhong Gui’为了验证OfERFs与OfLCYB之间的关系，用y表示OfERFs的相对表达量取以10为底的对数，用x表示OfLCYB相对表达量取以10为底的对数进行相关性分析(图6)。其中，OfERF72a直线回归方程为y= − 0.987 6x − 0.010 0，决定系数(R2)为0.933 6，P=0.033 8；OfERF72b直线回归方程为y= − 1.208 0x − 0.077 9，R2=0.941 6，P=0.029 6。OfLCYB的表达水平与OfERF72a、OfERF72b呈显著负相关。
图 6 OfERFs与OfLCYB相对表达量的相关性分析Figure 6 Correlation analysis of relative expression levels of OfERFs with OfLCYB2.4 酵母单杂交分析B2亚组OfERFs与OfLCYB启动子互作
为了探究B2亚组OfERFs与OfLCYB启动子之间是否存在物理互作，同时将阴性对照pAbAi+pGADT7、阳性对照p53-AbAi+pGADT7-Rec-p53以及实验组pAbAi-OfLCYB-Pro+AD-OfERF分别接种于SD/-Leu与SD/-Leu/AbA (300 μg·L−1)的酵母培养基上，于30 ℃倒置培养3~5 d。结果发现(图7)：在SD/-Leu培养基上，酵母均能正常生长，而在SD/-Leu/AbA (300 μg·L−1)培养基上，只有阳性对照与pAbAi-OfLCYB-Pro+AD-OfERF72b正常生长，其余酵母菌均不能生长，表明OfERF72b可以与OfLCYB启动子物理结合。
图 7 OfERF蛋白与OfLCYB启动子互作验证Figure 7 Verification of physical interaction between OfERF proteins and OfLCYB promoter3. 讨论
本研究得到4个桂花‘堰虹桂’B2亚组的OfERFs基因，编码区长度为687~1 161 bp，编码228~386个氨基酸残基。拟南芥B2亚组ERF At1g53910.1、At1g72360.2、At2g47520.1、At3g14230.1以及At3g16770.1分别编码358、262、171、397和248个氨基酸残基[15]。牡丹Paeonia suffruticosa ERF家族中B2亚组基因PsERF1编码区长度为1 158 bp，编码385个氨基酸残基[19]。在番木瓜Carica papaya中，属于B2亚组的基因CpERF4、CpERF6、CpERF9则分别编码431、253、234个氨基酸残基[20]。而在番茄ERF中，其B2亚组的SlERF6、SlERF.E.1、SlERF90、SlERF91、SlERF.A.3分别编码255、260、386、1 454和372个氨基酸残基[21]。由此可以发现：同一物种B2亚组ERF基因编码不同长度的氨基酸序列，推测其不同成员的功能存在差异。
对4个桂花OfERFs基因的氨基酸序列进行系统进化分析，发现OfERFs与拟南芥B2亚组ERF聚集在一起，说明它们的同源性较高。其中2个基因与At3g16770.1 (AtERF72/AtRAP2.3)聚为一支，2个基因与At1g72360.2 (AtERF73/AtRAP2.2)聚为另一小支。据此将4个OfERFs基因分别命名OfERF72a与OfERF72b、OfERF73a与OfERF73b。桂花OfERF72与OfERF73均存在2个拷贝，说明桂花OfERF基因家族成员在进化和扩张过程中与基因重复事件有着紧密联系。在拟南芥中，AtERF72能够与缺铁反应基因IRT1、HA2和CLH1的启动子区域结合，负调控拟南芥的缺铁响应。与野生型植株相比，AtERF72突变体中铁和镁质量分数显著增加[22]。AtRAP2.3的同源基因SlERF6被证实是番茄中类胡萝卜素合成的负调控因子[13]。此外，在苹果中也有研究证明：AtRAP2.3的同源基因AP2D15可以负调控苹果PSY1和PSY2基因启动子序列中的ATCTA顺式作用元件[14]。拟南芥AtRAP2.2可以结合到拟南芥AtPSY启动子和AtPDS启动子的ATCTA元件上调控基因的表达，过表达AtRAP2.2后导致植物体内类胡萝卜素降低[15]。
桂花花瓣中主要类胡萝卜素为β-胡萝卜素，其生物合成由OfLCYB直接催化生成，是桂花花瓣中类胡萝卜素代谢的重要催化酶[23]。OfLCYB基因启动子中存在2个ATCTA顺式作用元件，推测其响应B2亚组ERF转录因子的调控。AtRAP2.2蛋白可以结合到拟南芥AtPSY启动子和AtPDS启动子的ATCTA元件上，从而调控相关基因的表达[15]。在苹果MdPSY1和MdPSY2基因启动子中也存在多个ATCTA顺式作用元件，能被AtRAP2.3的同源基因蛋白AP2D15强烈激活表达[14]。进一步研究发现：OfERF72a和OfERF72b的表达趋势与OfLCYB基因呈显著负相关。酵母单杂交结果表明：OfERF72b与OfLCYB启动子存在物理结合，表明B2亚组的OfERF72b可能通过结合OfLCYB基因启动子ATCTA顺式作用元件调控其表达。ATCTA元件也存在于桂花OfPSY[24]和OfCCD1[25]等其他类胡萝卜素代谢基因的启动子上，其是否响应B2亚组的ERF转录因子的调控需要进一步研究。
4. 结论
本研究基于桂花‘堰虹桂’转录组数据筛选了4个OfERF基因，OfERF72a与OfERF72b基因表达量均随着开花进程逐渐下降，与OfLCYB基因的表达量显著负相关。OfLCYB基因启动子含有2个ATCTA顺式作用元件，OfERF72b与OfLCYB启动子之间存在互作，表明OfERF72b可能参与调控OfLCYB的表达。
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图 1 HANTS方法处理前后INDV和IEV时间序列对比图
Figure 1 Comparison of normalized difference vegetation index,enhance vegetation index sequence before and after HANTS
图 2 利用VPM模型估算的基于MODIS的总初级生测量的总初级生产力(PGPobs)
Figure 2 Comparison of season changes in gross primary production from carbon flux site (PGPobs) and
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