陆地棉Gossypium hirsutum是主要的经济作物之一，在经济发展过程中占有重要地位。而今因优质耕地面积减少导致的粮棉争地问题日益突出，中国陆地棉产区又整体呈现西北内陆棉区面积不断扩大，黄河、长江棉区面积持续减少的趋势^[1]。在西北内陆地区栽培早熟棉能充分发挥其可晚播的特点，减少因早春干燥、降温，以及晚霜等原因造成的育苗病虫害，降低杀虫剂施用量^[2]，增加霜前开花率并改善陆地棉品质^[3]。因此，筛选早熟棉对提高耕地利用效率具有重要意义^[4]。

植物从生理生长转向生殖生长的过程为开花^[5]，受环境激素影响^[6]，目前较为广泛的调控开花途径是光周期途径、春化途径、自主途径及年龄途径等^[7]。自主及春化途径主要通过开花抑制基因FLC位点进行^[8]，FLC调控FT和SOC1抑制开花^[9]，受光周期途径正向调控^[10]，可被FLD等通路抑制^[11]。光周期靠CO/FT表达改变模式^[12]。CO是光周期的核心基因^[13]，其蛋白有2个锌指结构域正向调控FT^[14−15]，N端蛋白控制光稳定，C端CCT区域用于核定位^[16]。对拟南芥Arabidopsis thaliana研究表明：CCA1/LHY在TOC1上游调控光形态建成抑制其节律^[17−18]。激活CCA1/LHY和TOC1翻译组蛋白可调控昼夜节律^[19]。RVE8/LCL5也可通过结合TOC1启动子调节昼夜节律^[20]，节律核心基因限制TOC1的降解^[21]。TOC1和CCA1的mRNA转录水平受Hesp调控^[22]。

PRR亚家族成员是生物钟重要组分。中心环CCA1和LHY通过结合启动子负调控TOC1(APRR1)^[23]。CCA1和LHY是PRR9、PRR7的正调控因子^[24]，也可能是PRR5的正调控因子。3个PRR基因通过结合启动子负调控CCA1和LHY^[25]。PRR5促进TOC1积累使其稳定^[26]，PRR3和PRR5阻断TOC1与ZTL互作使其稳定^[24]。对玉米Zea mays研究表明：PRR家族成员参与包括光响应在内的多种信号传导^[27]。对大豆Glycine max研究表明：PRR家族CCT结构缺失与无意义突变影响开花时间^[28]。对大白菜Brassica pekinensis^[29]、大豆突变体^[30]研究也表明：TOC1可控制早花，参与非生物胁迫应答^[31]。

陆地棉中开花相关基因大多数属于光周期和生物钟相关途径^[32]。前人对陆地棉中光周期通路CO^[33]、FT^[34]，赤霉素途径FPF1^[35]、SPL3^[36]和部分MADS-box^[37−38]家族基因进行研究，说明研究开花通路相关基因具有重要意义。结合生物信息学分析的基因功能研究有助于更好地理解基因功能^[39−40]。本研究将从陆地棉群体高密度遗传图谱^[41]及数量性状基因座(QTL)定位^[42]中发掘陆地棉中拟南芥TOC1(APRR1)的同源基因GhPRR9进行家族分析和功能验证，预测GhPRR9的结构及可能行使的功能，并对GhPRR9功能加以验证，为培育早熟棉提供一定的理论参考。

1.   材料与方法

1.1   生物信息学分析

陆地棉全基因组数据下载于Cottongen^[43]，拟南芥全基因组数据下载于TAIR^[44]，水稻Oryza sativa、草棉Gherbaceum、可可Theobroma caca、玉米、大豆、毛果杨Populus trichocarpa基因组数据下载于Phytozome^[45]。

根据拟南芥PRR亚家族的定义，在Pfam上获得CCT (PF06203)和REC (PF00072)结构域隐马模型，用HMMER扫描整个陆地棉基因组取交集，利用在线工具^[46]鉴别所筛选出的基因是否同时包含CCT和REC结构域，最终得到GhPRR家族基因成员。使用ExPASY网站^[47]分析工具和WoLF对家族成员进行蛋白理化性质分析。

用MEGA^[48]对8个物种的PRR亚家族蛋白进行多序列比对，邻接法JJT模型构建系统进化树，校验重复100次。用DNAMAN进行保守序列比对和绘制。

利用TBtool^[49]软件制作染色体定位图和domain结构；使用MEME^[50]网站分析家族成员所含Motif并进行可视化。使用Plant Care^[51]分析GhPRR亚基因家族上游2 000 bp顺式启动子元件，使用TBtools进行可视化。在美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中下载陆地棉相关的表达数据(序列号：PRJNA490626，编号：490626)，用TBtools绘制热图。

1.2   拟南芥阳性植株构建

提取陆地棉标准系‘TM-1’花蕾RNA，并用试剂盒(CAT#037A)反转录得到底物。使用Primer 5设计引物并扩增目标片段。使用TaKaRa纯化试剂盒(9761)纯化片段，pMD18-T Vector Cloning Kit (CAT# 6011)连接T载。热激法转化DH5α感受态菌株，活化涂板后挑单菌落进行菌液PCR分析，选取合理条带单克隆测序。

以T载为模板克隆片段并连接至过表达载体，热激转化农杆菌Agrobacterium tumefaciens GV3101，筛选阳性单克隆后取带花序的健康拟南芥提前剪下角果。浸入活化农杆菌液侵染1 min，沥干后黑暗1 d正常培养，收集种子为T₀代。消毒播种T₀代种子至相应抗性培养基上，其中，正常生长幼苗转入正常条件培养。筛选并验证拟南芥的阳性植株，成熟后收取T₁代种子，如此培养至T₃代。

1.3   启动子分析及GUS染色

从陆地棉基因组中提取GhPRR9起始密码子上游2 000 bp片段并预测顺式启动子元件。从陆地棉标准系‘TM-1’叶片DNA中分别克隆以起始编码为原点，长500、1 000、1 500和2 000 bp的片段，XcmⅠ酶切链接载体pCXGUS-P，热激法转入大肠埃希菌Escherichia coli，测序无误后将质粒转入农杆菌中侵染拟南芥得到种子。在卡那霉素培养基上播种筛选阳性植株培养至开花，取相关组织染色并观察。

1.4   烟草瞬时转化

将完成转化的表达载体以及绿色荧光蛋白(GFP)空载体通过热激法转入农杆菌菌株GV3101。培养后离心收集菌体重新悬浮，注射幼嫩烟草下表皮。注射后的烟草黑暗培养1 d后恢复正常光照周期。取下表皮制成临时切片，在激光共聚焦显微镜(LSM880)下观察记录影像。

1.5   实时荧光定量PCR (RT-qPCR)分析

相对定量使用2^−ΔΔCt法，内参基因为GhHistone3 (陆地棉)和AtUBQ5 (拟南芥)。扩增程序为95 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。

陆地棉时空表达分析取样：选取4个品种陆地棉材料的不同器官组织，每个品种20株随机取样，混合研磨。日周期节律分析：取三叶期的陆地棉标准系‘TM-1’植株，在人工气候室中培养1周后，隔4 h取1次顶芽，重复3株混样研磨。

1.6   病毒诱导沉默(VIGS)株系的构建

用SGN VIGS Tool设计最佳VIGS片段。以测序正确的T载为模板进行扩增，SpeI和AscI酶切位点链接到pCLCrVA载体并转化至农杆菌LBA4404中。pCLCrVA-GhPRR9、pCLCrVA、pCLCrVA-PDS重悬液分别与pCLCrVB的重悬液按体积比1∶1混合均匀。

选取子叶完全展平，第1片真叶尚未完全显形的健康植株进行注射。侵染后的陆地棉设置辅助对照、沉默株、烟草花叶病毒株和空白对照植株，避光培养1 d后转入正常光照培养至开花，记录现蕾开花时间。

2.   结果与分析

2.1   陆地棉GhPRR亚家族基因特性分析

2.1.1   陆地棉GhPRR亚家族成员鉴定及定位分析

在陆地棉全基因组中共鉴定到14个PRR亚基因家族成员，分别命名为GhPRR1~GhPRR14 (表1)。理化性质分析显示：PRR亚家族成员蛋白有552~775个氨基酸，相对分子量为60.76~85.30 kDa，平均等电点为6.77，酸性蛋白8个，碱性蛋白6个。亚细胞定位结果显示：有11个蛋白定位于细胞核中，2个定位于叶绿体，1个定位于内质网。

表 1  GhPRR亚家族蛋白理化性质

Table 1  Physicochemical properties of protein in GhPRR subfamily

蛋白名称	染色体位置	等电点	分子量/kDa	氨基酸/个	亚细胞定位	亲水性
GhPRR1	ChrA03	5.49	53.53	487	细胞核	−0.876
GhPRR2	ChrA05	7.32	76.62	696	细胞核	−0.725
GhPRR3	ChrA05	8.07	81.80	743	叶绿体	−0.738
GhPRR4	ChrA05	8.55	60.76	552	细胞核	−0.834
GhPRR5	ChrA09	6.33	73.66	669	内质网	−0.592
GhPRR6	ChrA11	6.53	68.72	625	细胞核	−0.565
GhPRR7	ChrA11	5.16	73.11	665	细胞核	−0.688
GhPRR8	ChrA11	6.84	82.54	750	细胞核	−0.689
GhPRR9	ChrD03	5.66	61.96	563	细胞核	−0.743
GhPRR10	ChrD09	7.11	85.30	775	叶绿体	−0.677
GhPRR11	ChrD11	7.56	70.20	638	细胞核	−0.692
GhPRR12	ChrD11	5.62	72.77	661	细胞核	−0.622
GhPRR13	ChrD11	7.91	76.08	691	细胞核	−0.680
GhPRR14	ChrD12	6.67	70.92	645	细胞核	−0.742

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用TBtools绘制出染色体定位图(图1A)，可观察到GhPRR家族基因保守分布在染色体两端，14个成员分布在8条染色体上，A亚族8个，D亚族6个，其中Chr A05、Chr A11、Chr D11染色体上分别拥有3个该家族的基因，其余染色体均为1个，表明GhPRR亚家族在陆地棉AD亚基因组上呈现不完全均匀分布。

图 1  陆地棉GhPRR亚家族成员定位及多重序列对比

Figure 1  Mapping and multiple sequence comparison of GhPRR subfamily members in cotton

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2.1.2   陆地棉GhPRR亚家族进化树及蛋白序列对比

从水稻、拟南芥、玉米、草棉、可可、大豆、毛果杨中分别鉴定出5、6、9、9、24、35、49个PRR亚家族成员，与陆地棉GhPRR亚家族成员蛋白构建系统进化树(图1B)。聚类结果显示：陆地棉GhPRR亚家族进化关系最接近的物种是草棉和可可。不同物种中该基因家族成员的数量差异较为明显，也体现出PRR家族成员在不同物种中的多样性。

多重序列比对(图1C)显示：陆地棉GhPRR亚家族蛋白共有4处位点保守性较强，其中有2个高度保守的g位点，说明该家族拥有2段特征结构域(REC与CCT)。

2.1.3   陆地棉GhPRR亚家族成员结构分析

蛋白结构分析显示：14个蛋白均含有CCT结构域(图2A)。GhPRR6、GhPRR1、GhPRR2、GhPRR4、GhPRR8和GhPRR13含有REC超家族结构域(cl19078)，其余成员含有psREC_PRR结构域(cd17852，属cl19078超家族)，亚家族成员有一定的保守性，REC结构域主要功能为核酸识别，CCT结构域主要标志转录因子，以上2个结构的保守性显示了该家族成员的功能。

图 2  陆地棉GhPRR亚家族成员结构(A~D)及时空表达量(E~F)分析

Figure 2  Structure (A－D) and spatiotemporal expression (E－F) of GhPRR subfamily members in cotton

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MEME分析共得到5个保守基序(图2B)。除GhPRR5外其余成员均含有Motif 2和Motif 5。GhPRR1仅有Motif 1，没有Motif 3和Motif 4，GhPRR4没有Motif 1、Motif 3和Motif 4，其余成员都拥有Motif 1、Motif 3和Motif 4。

基因结构(图2C)显示：该亚家族成员GhPRR1外显子最少(5个)，GhPRR2最多(11个)，其中，5个成员有8个外显子，3个成员有9个外显子，2个成员有7个外显子，2个成员有6个外显子。最长外显子在3′端较为保守，结构相似度和进化关系基本一致。

2.1.4   陆地棉GhPRR亚家族启动子顺式元件分析

使用Plant Care对陆地棉GhPRR亚家族成员上游2 000 bp顺式启动子元件进行分析(图2D)发现：主要存在三类顺式元件，一是生长发育响应元件，如光响应元件、生物钟控件；二是激素响应元件，如赤霉素、脱落酸等响应元件；三是非生物胁迫元件，如逆境、盐胁迫等响应元件。其中光响应元件最多(184个)，其次为赤霉素响应元件(28个)。说明该亚家族成员主要参与光响应和赤霉素通路。

2.1.5   陆地棉GhPRR亚家族成员表达分析

利用公开的转录组数据对陆地棉GhPRR亚家族成员进行组织表达分析(图2E)发现：不同成员组织表达水平差异较大。其中茎叶和花药中表达量最高的是GhPRR4，最少的分别是GhPRR8、GhPRR3和GhPRR2。GhPRR13和GhPRR9在花丝、花苞、花萼中表达量较高，GhPRR2和GhPRR6最少。根中GhPRR13表达量最多，GhPRR7最少，雌蕊花托中GhPRR13表达量最高，GhPRR12和GhPRR2最少。GhPRR4、GhPRR11和GhPRR6可能主要作用于维管组织，GhPRR13和GhPRR9可能作用于花器官组织。

时间表达模式分析(图2F)显示：除GhPRR7、GhPRR12、GhPRR2、GhPRR3和GhPRR10外，GhPRR亚家族其他成员表达量均呈现开花前3 d至开花后1 d逐渐增加，开花后3~5 d逐渐降低的趋势，说明其可能集中在开花前和开花时发挥作用。GhPRR7主要作用在开花后5 d及之后，GhPRR12和GhPRR2可能较少参与开花过程。胚珠中GhPRR13表达量在第10天达到顶峰，说明它在胚珠发育前期可能发挥着一定的作用，GhPRR10、GhPRR5、GhPRR9、GhPRR18、GhPRR3、GhPRR4和GhPRR14也呈现相似的趋势，说明这些基因可能拥有类似的作用模式。纤维发育期间，GhPRR13、GhPRR10和GhPRR4表达量较高，说明这些基因可能参与纤维发育调控。时间模式上，GhPRR13在10~25 d纤维中表达量持续下降，而GhPRR10和GhPRR4则表现出持续上升的趋势，可知GhPRR10和GhPRR4可能参与纤维发育的后期调控，而GhPRR13则参与早期的纤维发育调控。丰富的时空表达说明陆地棉GhPRR家族成员广泛参与到开花前后、胚珠和纤维的发育过程中。

2.2   GhPRR9基因启动子和表达特性分析

使用Plant Care在线工具对该基因上游2 000 bp进行启动子顺式元件分析(表2)，发现拟南芥AtTOC1的同源基因GhPRR9上存在着大量的光响应元件，说明光对该基因的转录有着重要的调控作用。除此之外，在GhPRR9基因的启动子区域还存在茉莉酸等激素响应元件，说明该基因可能参与激素相关通路的调节。

表 2  GhPRR9启动子顺式元件预测

Table 2  Cis-acting element prediction of GhPRR9 promoter

名称	起始位置/bp	所在链	功能		名称	起始位置/bp	所在链	功能
ARE	43	−	厌氧胁迫响应		TATA-box	635	−	核心元件
P-box	1 121	−	赤霉素响应		TATA-box	636	−	核心元件
G-box	167	+	光响应		Sp1	1 057	−	光响应
G-box	1 070	+	光响应		G-Box	1 009	−	光响应
A-box	882	−	顺式调节		ABRE	168	+	脱落酸响应
TCCC-motif	871	+	光响应		TGACG-motif	878	+	茉莉酸响应
CAAT-box	249	+	增强区域		TGACG-motif	1 991	−	茉莉酸响应
CAAT-box	354	+	增强区域		Box Ⅱ	1 007	−	光响应
AE-box	535	−	光响应		Box 4	419	+	光响应
GATA-motif	710	+	光响应		MRE	1 513	−	光响应MYB结合
ATCT-motif	1 343	−	光响应		CGTCA-motif	878	−	茉莉酸响应
TATA-box	634	−	核心元件

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对陆地棉标准系‘TM-1’进行荧光定量分析(图3A)表明：GhPRR9在花丝、萼片、花托中表达量较高，叶片最低，表明GhPRR9可能更多参与陆地棉的生殖生长。

图 3  基因GhPRR9的时空表达量、亚细胞定位和启动子染色

Figure 3  Spatial and temporal expression of GhPRR9 gene, subcellular localization and promoter staining

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对在人工光照条件下陆地棉三叶期标准系‘TM-1’顶芽隔4 h取样并进行荧光定量分析(图3B)表明：GhPRR9在光照开始后逐渐积累，并在中午达到顶峰，之后慢慢下降，在光周期内的表达呈现出一定的周期性。

进一步对GhPRR9早熟品种‘中50’‘ZHONG 50’、‘中58’‘ZHONG 58’和晚熟品种‘TM-1’、‘豫棉21号’‘YM21’的表达量分析发现：GhPRR9在早熟品种中表达量显著高于晚熟品种(图3C)，说明GhPRR9和早熟性状呈正向相关。

将未转化的GFP质粒和35S::GhPRR9-GFP质粒分别转入农杆菌GV3101，并侵染烟草叶片组织，制作表皮切片置于激光共聚焦显微镜下发现：对照组分布于整个细胞中，而GFP融合蛋白荧光仅分布于细胞核(图3D)。

截取GhPRR9不同长度的启动子与携带GUS报告基因的质粒进行重组，分别转入农杆菌GV3101后通过沾花法侵染拟南芥，获得纯合转基因株系染色观察，结果显示上游500 bp启动子几乎没有表达(图3E)，而上游2 000 bp的启动子着色程度最深，说明GhPRR9启动子上游500~2 000 bp内可能存在关键调控元件诱导基因的表达。

2.3   GhPRR9在拟南芥中的功能分析

将拟南芥GhPRR9过表达株系培养至抽薹，并观察表型性状(图4A)发现：过表达株系GhPRR9表达量比野生型明显提高(图4B)，且转基因过表达株系连座叶数量明显减少(图4C)，抽薹时间和开花提前(图4D和图4E)，首花抽薹高度极显著矮于野生型(图4F，P＜0.01)，说明GhPRR9正向调控植物的早花性状。过表达GhPRR9能促进开花关键基因LFY与FT表达(图4G和图4H)，表明GhPRR9也可能通过影响关键基因表达调控通路进而影响开花时间。

图 4  拟南芥过表达株系的表型及表达量

Figure 4  Phenotype and expression levels of A. thaliana overexpressed strains

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2.4   病毒诱导(VIGS)的GhPRR9基因沉默实验

对VIGS沉默株系进行表达量检测发现：沉默株系中，GhPDS株系出现白化表型(图5A)，且GhPRR9的表达量极显著降低(图5B，P＜0.01)，表明GhPRR9基因成功得到了沉默。与对照株系相比，沉默株系现蕾时间延迟约3~4 d，开花时间延迟约2~5 d，表明沉默GhPRR9可推迟开花时间，反向证明其调节陆地棉早花的功能。

图 5  陆地棉病毒诱导(VIGS)植株的表型及影响

Figure 5  Phenotype and effect of G. hirsutum virus induced silencing (VIGS) plants

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3.   讨论

本研究共鉴定出陆地棉14个GhPRR亚家族成员，成员含有CCT和REC保守结构域，说明其行使转录因子功能。转录组分析显示：大部分成员主要在开花前的茎叶、纤维发育后期和胚珠发育中期发挥作用，表明大部分成员可能存在功能冗余或协同拮抗作用。启动子元件分析显示：陆地棉GhPRR亚家族可能频繁地参与光感效应相关的生理过程，这与在拟南芥的结果中一致，据此可推测其与拟南芥同源基因作用相似。进化分析表明：陆地棉GhPRR亚家族成员基因数量多于拟南芥。前人研究也发现：棉花基因组进化加倍使该家族基因得到了扩增^[52]。

对过表达株系研究发现：抽薹日期、开花日期都稍有提前，抽薹高度显著高于同期野生型植株，证明GhPRR9可以使拟南芥花期提前。构建GFP表达载体侵染烟草叶片，表明GhPRR9蛋白定位于细胞核，与生物信息学分析相互印证，进一步确认该基因行使转录因子的功能。对GhPRR9基因1 d内表达水平分析显示：光暗交替条件下基因表达量存在着周期性变化，按照其表达模式推断该基因在光照开始后积累，中午达到顶峰后慢慢下降，这与拟南芥同源基因的表达模式^[53]相似，据此推测，陆地棉早花基因GhPRR9可能与拟南芥中的同源基因行使着类似的功能。陆地棉三叶期叶片的基因表达量结果显示：GhPRR9基因在早熟种中表达量高于晚熟种，据此可推断其与早熟性状有正向关联。构建VIGS株系发现：沉默株系高度降低，生育期推迟，反向证明了其促进生育期的功能。启动子分析显示：光和赤霉素可能影响该基因的转录。GUS染色结果显示：启动子上游500~2 000 bp可能存在关键调控元件。有研究显示：陆地棉转录因子与通路主要基因启动子的结合可随温度产生变化^[54]，且同源转录因子可能存在相互调控的作用^[55]。

4.   结论

本研究预测了陆地棉GhPRR亚家族的功能和作用模式，找到拟南芥早花基因AtTOC1的陆地棉同源基因GhPRR9，并成功克隆，构建遗传转化株系对其功能进行验证显示：GhPRR9对早花性状存在正向促进作用。