留言板

尊敬的读者、作者、审稿人, 关于本刊的投稿、审稿、编辑和出版的任何问题, 您可以本页添加留言。我们将尽快给您答复。谢谢您的支持!

姓名
邮箱
手机号码
标题
留言内容
验证码

雷竹PvJ3基因克隆及功能分析

陈晓沛 施泉 郭小勤 曹友志 徐英武

陈晓沛, 施泉, 郭小勤, 曹友志, 徐英武. 雷竹PvJ3基因克隆及功能分析[J]. 浙江农林大学学报, 2018, 35(2): 298-305. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2018.02.014
引用本文: 陈晓沛, 施泉, 郭小勤, 曹友志, 徐英武. 雷竹PvJ3基因克隆及功能分析[J]. 浙江农林大学学报, 2018, 35(2): 298-305. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2018.02.014
CHEN Xiaopei, SHI Quan, GUO Xiaoqin, CAO Youzhi, XU Yingwu. Cloning and functional analysis of the PvJ3 gene from Phyllostachys violascens[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2018, 35(2): 298-305. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2018.02.014
Citation: CHEN Xiaopei, SHI Quan, GUO Xiaoqin, CAO Youzhi, XU Yingwu. Cloning and functional analysis of the PvJ3 gene from Phyllostachys violascens[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2018, 35(2): 298-305. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2018.02.014

雷竹PvJ3基因克隆及功能分析

doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2018.02.014
基金项目: 

国家自然科学基金资助项目 31270715

国家自然科学基金资助项目 30901155

详细信息
    作者简介: 陈晓沛, 从事生物大分子结构与功能研究。E-mail:970787428@qq.com
    通信作者: 曹友志, 讲师, 博士, 从事林木分子生物学等研究。E-mail:yzcao@zafu.edu.cn
  • 中图分类号: S722.3

Cloning and functional analysis of the PvJ3 gene from Phyllostachys violascens

  • 摘要: 拟南芥Arabidopsis thalianaJ3基因参与花期的调节,调控开花时间。为了探究竹类植物中J3基因的功能,根据植物中J同源基因的高度保守性,采用同源克隆技术从雷竹Phyllostachys vilascens中克隆出1个J3基因,命名为PvJ3。该基因的开放阅读框(ORF)区长为1 260 bp,编码419个氨基酸。通过同源比对和系统进化树分析,可知雷竹PvJ3蛋白和其他物种中J3同源蛋白的氨基酸序列同源性很高。通过实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR),发现PvJ3基因在同一竹鞭的笋、花芽、花,开花与不开花雷竹的茎秆、成叶、幼叶中都有表达,且开花雷竹茎秆中表达量最高,表明PvJ3基因在雷竹各组织部位都有表达。亚细胞定位分析结果显示,PvJ3蛋白定位在细胞质和细胞核。通过转化拟南芥对其功能进行了初步分析,表型统计结果显示,PvJ3转基因拟南芥与野生型相比,开花时间明显提早,而且出现多主茎现象,表明PvJ3可以促使植物提前开花并且参与植物茎秆的发育。
  • 图  1  PvJ3蛋白结构示意图

    Figure  1  Structure diagram of PvJ3

    图  2  PvJ3与其同源基因的氨基酸序列比对

    Figure  2  Alignment of the PvJ3 amino acid sequences from different plant species

    图  3  不同物种J3蛋白的系统进化树分析

    Figure  3  Phylogenetic tree analysis of J3 in different plant species

    图  4  PvJ3在开花雷竹与不开花雷竹的不同部位表达水平

    Figure  4  Expression of PvJ3 in different tissues of Phyllostachys violascens

    图  5  PvJ3蛋白亚细胞定位结果

    Figure  5  Subcellular localization of PvJ3 fusion protein

    图  6  PvJ3过表达拟南芥T1植株表型

    Figure  6  Phenotypes of the PvJ3 transgenic Arabidopsis thaliana in T1 generation

    表  1  本研究所用的引物

    Table  1.   PCR primers used in this study

    引物名称 序列(5'→3') 用途
    J3-F CTCTCCGTCTCACTCCGCTC 基因开放阅读框(ORF)扩增
    J3-R GTCAAATTGCCTTTATAGAA
    PvJ3-F ATGTTCGGGCGCGCGCCG ORF扩增
    PvJ3-R TTACTGTTGTGCGCACTGCAC
    PvJ3-1-F CCGGAATTCTGGAGAGAGCATTAACG 荧光定量PCR
    PvJ3-1-R CCGGAATTCCTTCTGCTGGAGGAC
    PeNTB-F TCTTGTTTGACACCGAAGAGGAG 荧光定量PCR内参引物
    PeNTB-R AATAGCTGTCCCTGGAGGAGTTT
    PvJ3-2-F TCCCCCGGGATGTTCGGGCGCGCG 亚细胞定位
    PvJ3-2-R CGCGGATCCCTGTTGTGCGCACTGCACTC
    PvJ3-3-F tccATCGATATGTTCGGGCGCGCG 过表达载体构建
    PvJ3-3-R cgcGGATcCttaCTGTTGTGCGCACTGCACTC
    下载: 导出CSV
  • [1] QUESADA V, DEAN C, SIMPSON G G, et al. Regulated RNA processing in the control of Arabidopsis flowering[J]. Int J Dev Biol, 2005, 49(5/6):773-780. http://europepmc.org/abstract/MED/16096981
    [2] SIMPSON G G, DEAN C. Arabidopsis, the Rosetta stone of flowering time?[J]. Science, 2002, 296(5566):285-289. doi:  10.1126/science.296.5566.285
    [3] LIU Chang, CHEN Hongyan, HONG Linger, et al. Direct interaction of AGL24 and SOC1 integrates flowering signals in Arabidopsis[J]. Development, 2008, 135(8):1481-1491. doi:  10.1242/dev.020255
    [4] DENNIS E S, PEACOCK W J. Epigenetic regulation of flowering[J]. Curr Opin Plant Biol, 2007, 10(5):520-527. doi:  10.1016/j.pbi.2007.06.009
    [5] BOSS P K, BASTOW R M, MYLNE J S, et al. Multiple pathways in the decision to flower:enabling, promoting, and resetting[J]. Plant Cell, 2004, 16(suppl):S18-S31. http://www.plantcell.org/content/16/suppl_1/S18
    [6] WANG Cunxi, TIAN Qing, HOU Zhenglin, et al. The Arabidopsis thaliana AT PRP39-1 gene, encoding a tetratricopeptide repeat protein with similarity to the yeast pre mRNA processing protein PRP39, affects flowering time[J]. Plant Cell Rep, 2007, 26(8):1357-1366. doi:  10.1007/s00299-007-0336-5
    [7] MOURADOV A, CREMER F, COUPLAND G. Control of flowering time interacting pathways as a basis for diversity[J]. Plant Cell, 2002, 14(suppl):S111-S130. http://med.wanfangdata.com.cn/Paper/Detail?id=PeriodicalPaper_JJ0212663309
    [8] PENG Zhenhua, LU Ying, LI Lubin, et al. The draft genome of the fast-growing non-timber forest species moso bamboo (Phyllostachys heterocycla)[J]. Nat Gen, 2013, 45(4):456-461. doi:  10.1038/ng.2569
    [9] TORTI S, FORNARA F. AGL24 acts in concert with SOC1 and FUL during Arabidopsis floral transition[J]. Plant Sign Behav, 2012, 7(10):1251-1254. doi:  10.4161/psb.21552
    [10] NAVARRO C, CRUZ-ORÓE, PRAT S. Conserved function of FLOWERING LOCUS T (FT) homologues as signals for storage organ differentiation[J]. Curr Opin Plant Biol, 2015, 23(1):45-53. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25449726
    [11] YAMASHINO T, YAMAWAKI S, HAGUI E, et al. Clock-controlled and FLOWERING LOCUS T (FT)-dependent photoperiodic pathway in Lotus japonicus Ⅰ:verification of the flowering-associated function of an FT homolog[J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2010, 77(4):747-753. http://europepmc.org/abstract/MED/23563564
    [12] NAKANO Y, HIGUCHI Y, YOSHIDA Y, et al. Environmental responses of the FT/TFL1 gene family and their involvement in flower induction in Fragaria×ananassa[J]. J Plant Physiol, 2015, 177(24):60-66. doi:  10.1111/pbi.12574/full
    [13] LEE J, LEE I. Regulation and function of SOC1, a flowering pathway integrator[J]. J Exp Bot, 2010, 61(9):2247-2254. doi:  10.1093/jxb/erq098
    [14] LEE J H, YOO S J, PARK S H, et al. Role of SVP in the control of flowering time by ambient temperature in Arabidopsis[J]. Genes Dev, 2007, 21(4):397-402. doi:  10.1101/gad.1518407
    [15] SHEN Lisha, KANG Y G G, LIU Lu, et al. The J-domain protein J3 mediates the integration of flowering signals in Arabidopsis[J]. Plant Cell, 2011, 23(2):499-514. doi:  10.1105/tpc.111.083048
    [16] RAJAN V, D'SILVA P. Arabidopsis thaliana J-class heat shock proteins:cellular stress sensors[J]. Funct Int Genom, 2009, 9(4):433-446. doi:  10.1007/s10142-009-0132-0
    [17] MIERNYK J A. The J-domain proteins of Arabidopsis thaliana:an unexpectedly large and diverse family of chaperones[J]. Cell Stress Chap, 2001, 6(3):209-218. doi:  10.1379/1466-1268(2001)006<0209:TJDPOA>2.0.CO;2
    [18] QIAN Yanqiu, PATEL D, HARTL F U, et al. Nucleic magnetic resonance solution structure of the human Hsp40(HDJ-1) J-domain[J]. J Mol Biol, 1996, 260(2):224-235. doi:  10.1006/jmbi.1996.0394
    [19] CRAIG E A, HUANG P, ARON R, et al. The diverse roles of J-proteins, the obligate Hsp70 co-chaperone[J]. Rev Physiol Biochem Pharmacol, 2006, 156(1):1-21. doi:  10.1007/s10254-005-0001-0.pdf
    [20] MARTINEZ-YAMOUT M, LEGGE G B, ZHANG Ouwen, et al. Solution structure of the cysteine-rich domain of the Escherichia coli chaperone protein DnaJ[J]. J Mol Biol, 2000, 300(4):805-818. doi:  10.1006/jmbi.2000.3923
    [21] MIERNYK J A. The J-domain proteins of Arabidopsis thaliana:an unexpectedly large and diverse family of chaperones[J]. Cell Stress Chap, 2001, 6(3):209-218. doi:  10.1379/1466-1268(2001)006<0209:TJDPOA>2.0.CO;2
    [22] SALAS-MUÑOZ S, RODRÍGUEZ-HERNÁNDEZ A A, ORTEGA-AMARO M A, et al. Arabidopsis AtDjA3 null mutant shows increased sensitivity to Abscisic acid, salt, and osmotic stress in germination and post-germination stages[J]. Plant Sci, 2016, 7(2):220. doi: 10.3389/fpls.2016.00220.
    [23] VITHA S, FROEHLICH J E, KOKSHAROVA O, et al. ARC6 is a J-domain plastid division protein and an evolutionary descendant of the cyanobacterial cell division protein Ftn2[J]. Plant Cell, 2003, 15(8):1918-1933. doi:  10.1105/tpc.013292
    [24] CHEN Kunming, HOLMSTROM M, RAKSAJIT W, et al. Small chloroplast-targeted DnaJ proteins are involved in optimization of photosynthetic reactions in Arabidopsis thaliana[J]. BMC Plant Biol, 2010, 10(1):43. doi: 10.1186/1471-2229-10-43.
    [25] SHIMADA H, MOCHIZUKI M, OGURA K, et al. Arabidopsis cotyledon-specific chloroplast biogenesis factor CYO1 is a protein disulfide isomerase[J]. Plant Cell, 2007, 19(10):3157-3169. doi:  10.1105/tpc.107.051714
    [26] SEKI M, NARUSAKA M, ABE H, et al. Monitoring the expression pattern of 1300 Arabidopsis genes under drought and cold stresses by using a full-length cDNA microarray[J]. Plant Cell, 2001, 13(1):61-72. doi:  10.1105/tpc.13.1.61
    [27] CHAI Tuanyao, ZHANG Yuxiu, ZHAO Wenming. Cloning of cDNA and expression analysis of DnaJ-like gene under heavy metal stress in bean[J]. Progr Nat Sci, 2000, 10(2):135-140. http://industry.wanfangdata.com.cn/dl/Detail/Periodical?id=Periodical_zrkxjz200003006
    [28] SEDBROOK J C, CHEN Rujin, MASSON P H. ARG1(altered response to gravity) encodes a DnaJ-like protein that potentially interacts with the cytoskeleton[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1999, 96(3):1140-1145. doi:  10.1073/pnas.96.3.1140
    [29] GUAN Changhui, ROAEN E S, BOONSIRICHAI K, et al. The ARG1-LIKE2 gene of Arabidopsis functions in a gravity signal transduction pathway that is genetically distinct from the PGM pathway[J]. Plant Physiol, 2003, 133(1):100-112. doi:  10.1104/pp.103.023358
    [30] THEIβEN G, KIM J T, SAEDLER H. Classification and phylogeny of the MADS-box multigene family suggest defined roles of MADS-box gene subfamilies in the morphological evolution of eukaryotes[J]. J Mol Evol, 1996, 43(5):484-516. doi:  10.1007/BF02337521
    [31] WIGGE P A, KIM M C, JAEGER K E, et al. Integration of spatial and temporal information during floral induction in Arabidopsis[J]. Science, 2005, 309(5737):1056-1059. doi:  10.1126/science.1114358
    [32] de CARVALHO A L, NELSON B W, BIANCHINI M C, et al. Bamboo-dominated forests of the southwest Amazon:detection, spatial extent, life cycle length and flowering waves[J]. PLoS One, 2013, 8(1):e54852. doi: 10.1371/journal.pone/0054852.
    [33] 齐飞艳, 胡陶, 彭镇华, 等.毛竹实时荧光定量PCR内参基因的筛选及成花基因PheTFL1表达分析[J].西北植物学报, 2013, 33(1):48-52. http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_xbzwxb201301010.aspx

    QI Feiyan, HU Tao, PENG Zhenhua, et al. Screening of reference genes used in qRT-PCR and expression analysis of PheTFL1 gene in moso bambo[J]. Acta Bot Boreal-Occident Sin, 2013, 33(1):48-52. http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_xbzwxb201301010.aspx
    [34] LIVAK K J, SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-△△Cr method[J]. Methods, 2001, 25(4):402-408. doi:  10.1006/meth.2001.1262
    [35] 王小利, 吴佳海, 刘晓霞, 等.高羊茅春化基因FaVRN1亚细胞定位与差异表达分析[J].基因组学与应用生物学, 2011, 30(2):152-158. http://www.wanfangdata.com.cn/details/detail.do?_type=perio&id=gxnyswkx201102004

    WANG Xiaoli, WU Jiahai, LIU Xiaoxia, et al. Subcellular localization and differential expression analysis of vernalizational gene FaVRN1 in tall fescue[J]. Genomics Appl Biol, 2011, 30(2):152-158. http://www.wanfangdata.com.cn/details/detail.do?_type=perio&id=gxnyswkx201102004
    [36] CLOUGH S J, BENT A F. Floral dip:a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana[J]. Plant J Cell Mol Biol, 1998, 16(6):735-743. doi:  10.1046/j.1365-313x.1998.00343.x
    [37] 高志民, 范少辉, 高健, 等.基于CTAB法提取毛竹基因组DNA的探讨[J].林业科学研究, 2006, 19(6):725-728. http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_lykxyj200606009.aspx

    GAO Zhimin, FAN Shaohui, GAO Jian, et al. Extract genomic DNA form Phyllostachys edulis by CTAB-based method[J]. For Res, 2006, 19(6):725-728. http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_lykxyj200606009.aspx
    [38] 张素芝, 左建儒.拟南芥开花时间调控的研究进展[J].生物化学与生物物理进展, 2006, 33(4):301-309. http://www.doc88.com/p-28531525578.html

    ZHANG Suzhi, ZUO Jianru. Advance in the flowering time control of Arabidopsis[J]. Prog Biochem Biophys, 2006, 33(4):301-309. http://www.doc88.com/p-28531525578.html
    [39] LI Dan, LIU Chang, SHEN Lisha, et al. A repressor complex governs the integration of flowering signals in Arabidopsis[J]. Dev Cell, 2008, 15(1):110-120. doi:  10.1016/j.devcel.2008.05.002
  • [1] 程占超, 马艳军, 侯丹, 刘俊, 高健.  毛竹PheMADS15基因的克隆及功能分析 . 浙江农林大学学报, 2017, 34(3): 421-426. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2017.03.006
    [2] 武丹阳, 杨洋, 李慧玉.  3个白桦BpBEE基因的克隆与表达分析 . 浙江农林大学学报, 2017, 34(1): 137-144. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2017.01.019
    [3] 施泉, 陈晓沛, 林新春, 徐永汉, 徐英武.  雷竹和拟南芥SOC1多聚体差异性分析 . 浙江农林大学学报, 2016, 33(2): 183-190. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2016.02.001
    [4] 潘月, 戎洁庆, 盛卫星, 桂仁意.  硅对雷竹抗旱性的影响 . 浙江农林大学学报, 2013, 30(6): 852-857. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2013.06.008
    [5] 郭安娜, 桂仁意, 宋瑞生, 潘月, 戎洁庆.  不同磷水平下雷竹幼苗叶绿素荧光特性 . 浙江农林大学学报, 2013, 30(1): 9-14. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2013.01.002
    [6] 何奇江, 李楠, 傅懋毅, 周文伟, 王波.  氯化钠胁迫对雷竹根系活力和细胞膜透性的影响 . 浙江农林大学学报, 2013, 30(6): 944-949. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2013.06.021
    [7] 张振, 张含国, 张磊, 朱航勇, 李雪峰.  兴安落叶松基本群体与育种群体RAPD多样性分析 . 浙江农林大学学报, 2012, 29(1): 130-136. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2012.01.022
    [8] 杨汉奇, 阮桢媛, 田波, 杨宇明, 孙茂盛.  通直型巨龙竹不同地理种源遗传分化的ISSR分析 . 浙江农林大学学报, 2010, 27(1): 81-86. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2010.01.013
    [9] 徐秋芳, 姜培坤, 陆贻通.  不同施肥对雷竹林土壤微生物功能多样性影响初报 . 浙江农林大学学报, 2008, 25(5): 548-552.
    [10] 俞友明, 余学军, 於琼花, 傅深渊, 姜志宏.  雷竹-水泥混合物的水化特性研究 . 浙江农林大学学报, 2004, 21(1): 1-5.
    [11] 付顺华, 余永清.  雷竹人工制种技术的初步研究 . 浙江农林大学学报, 2001, 18(1): 6-9.
    [12] 黄必恒, 方伟, 许加意.  中国雷竹引种与适生区域 . 浙江农林大学学报, 2001, 18(1): 10-14.
    [13] 方伟, 何祯祥, 黄坚钦, 史钱均, 林新春.  雷竹不同栽培类型RAPD 分子标记的研究 . 浙江农林大学学报, 2001, 18(1): 1-5.
    [14] 金爱武, 郑炳松, 陶金星, 方道友.  雷竹光合速率日变化及其影响因子 . 浙江农林大学学报, 2000, 17(3): 271-275.
    [15] 姜培坤, 俞益武, 张立钦, 许小婉.  雷竹林地土壤酶活性研究 . 浙江农林大学学报, 2000, 17(2): 132-136.
    [16] 郑炳松, 金爱武, 董林根.  雷竹地下鞭笋芽分化过程中营养动态初步研究 . 浙江农林大学学报, 1998, 15(3): 232-235.
    [17] 周国模, 金爱武, 郑炳松, 方伟浩, 余伟朵.  雷竹保护地栽培林分立竹结构的初步研究 . 浙江农林大学学报, 1998, 15(2): 111-115.
    [18] 沈月琴, 周国模, 顾蕾, 楼涛.  雷竹发展的参与机制和效果分析* . 浙江农林大学学报, 1997, 14(2): 193-198.
    [19] 胡超宗, 金爱武, 郑建新.  雷竹地下鞭的系统结构 . 浙江农林大学学报, 1994, 11(3): 264-268.
    [20] 方伟, 何钧潮, 卢学可, 陈健华.  雷竹早产高效栽培技术 . 浙江农林大学学报, 1994, 11(2): 121-128.
  • 加载中
  • 链接本文:

    http://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.2018.02.014

    http://zlxb.zafu.edu.cn/article/zjnldxxb/2018/2/298

图(6) / 表(1)
计量
  • 文章访问数:  1241
  • HTML全文浏览量:  220
  • PDF下载量:  306
  • 被引次数: 0
出版历程
  • 收稿日期:  2017-03-24
  • 修回日期:  2017-04-17
  • 刊出日期:  2018-04-20

雷竹PvJ3基因克隆及功能分析

doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2018.02.014
    基金项目:

    国家自然科学基金资助项目 31270715

    国家自然科学基金资助项目 30901155

    作者简介:

    陈晓沛, 从事生物大分子结构与功能研究。E-mail:970787428@qq.com

    通信作者: 曹友志, 讲师, 博士, 从事林木分子生物学等研究。E-mail:yzcao@zafu.edu.cn
  • 中图分类号: S722.3

摘要: 拟南芥Arabidopsis thalianaJ3基因参与花期的调节,调控开花时间。为了探究竹类植物中J3基因的功能,根据植物中J同源基因的高度保守性,采用同源克隆技术从雷竹Phyllostachys vilascens中克隆出1个J3基因,命名为PvJ3。该基因的开放阅读框(ORF)区长为1 260 bp,编码419个氨基酸。通过同源比对和系统进化树分析,可知雷竹PvJ3蛋白和其他物种中J3同源蛋白的氨基酸序列同源性很高。通过实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR),发现PvJ3基因在同一竹鞭的笋、花芽、花,开花与不开花雷竹的茎秆、成叶、幼叶中都有表达,且开花雷竹茎秆中表达量最高,表明PvJ3基因在雷竹各组织部位都有表达。亚细胞定位分析结果显示,PvJ3蛋白定位在细胞质和细胞核。通过转化拟南芥对其功能进行了初步分析,表型统计结果显示,PvJ3转基因拟南芥与野生型相比,开花时间明显提早,而且出现多主茎现象,表明PvJ3可以促使植物提前开花并且参与植物茎秆的发育。

English Abstract

陈晓沛, 施泉, 郭小勤, 曹友志, 徐英武. 雷竹PvJ3基因克隆及功能分析[J]. 浙江农林大学学报, 2018, 35(2): 298-305. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2018.02.014
引用本文: 陈晓沛, 施泉, 郭小勤, 曹友志, 徐英武. 雷竹PvJ3基因克隆及功能分析[J]. 浙江农林大学学报, 2018, 35(2): 298-305. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2018.02.014
CHEN Xiaopei, SHI Quan, GUO Xiaoqin, CAO Youzhi, XU Yingwu. Cloning and functional analysis of the PvJ3 gene from Phyllostachys violascens[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2018, 35(2): 298-305. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2018.02.014
Citation: CHEN Xiaopei, SHI Quan, GUO Xiaoqin, CAO Youzhi, XU Yingwu. Cloning and functional analysis of the PvJ3 gene from Phyllostachys violascens[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2018, 35(2): 298-305. doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2018.02.014
  • 开花是高等植物进入生殖生长的标志,是植物完成生活史的必要环节。在拟南芥Arabidopsis thaliana中的研究发现,开花过程受多种内源因素和外源环境因素的影响,由复杂基因网络严格调控[1]。光周期途径中植物开花受季节性昼长变化影响[2];赤霉素(GA)途径是在非诱导光周期途径的条件下,在开花过程中发挥作用[3];春化途径中植物开花要受到低温积累的影响[4];自主途径中通过感知植物自身内部发育状态而调控植物开花[5],多种途径的成花调节信号最终都集中于2个整合因子:开花促进因子FLOERING LOCUS T(FT)和SUPPRESSPR OF OVEREXPRESION OF CONSTANS 1(SOC1)[6-8]。在拟南芥中,过表达FT基因会明显促进SOC1基因的表达量;同时在ft突变体中,SOC1的表达量明显下降[9-11],但是对ftsoc1双突变体与ft单突变体植株的开花时间进行统计,结果显示没明显差异,可知除FT蛋白调控SOC1的表达外,还存在另外的途径影响SOC1基因的表达[10-13]。其他开花控制因子可以通过FTSOC1参与开花途径的调控,例如开花抑制因子SHORT VEGETATIVE PHASE(SVP)可以结合SOC1和FT的调控序列,对FTSOC1产生抑制作用[14],进而下调它们的表达量。近年,发现拟南芥中属于J蛋白家族一员的J3蛋白,可以与SVP蛋白相互作用调控SOC1和FT基因的表达量,而实现对成花信号的调节,在调控开花途径中发挥着十分重要的作用[15]。J蛋白(J-domain protein)是广泛存在于动植物中的一个庞大的分子伴侣家族,该类蛋白N末端包含1个约由70个氨基酸构成的保守序列——J结构域而被命名为J蛋白[16-17]。J蛋白的J结构域由4个α-螺旋组成,第2和第3个螺旋之间有一个极为保守的由组氨酸、脯氨酸、天冬氨酸组成的HPD三肽,这是J结构域的重要特征[18];邻近J结构域的是G/F结构域(富含甘氨酸和苯丙氨酸);之后是锌指结构域。根据结构域的不同J蛋白可分为4类[19]:Ⅰ类J蛋白包含所有常见的结构;Ⅱ类J蛋白缺少锌指结构;Ⅲ类J蛋白只有J结构域;Ⅳ类J蛋白也被称作J-like蛋白,这类蛋白的J结构域没有HPD模块[20-21]。目前发现拟南芥中共有120个J蛋白,其中Ⅰ类J蛋白8个,Ⅱ类J蛋白16个,Ⅲ类J蛋白92个,Ⅳ类J蛋白4个[22]。在植物中,有关J蛋白的研究主要集中在拟南芥中,现有的结果表明,J蛋白可以参与多种生物学过程,包括叶绿体的发育[23-25]、植物的抗逆性[26-27]、信号转导[28-29]和成花途径[15]等。在拟南芥开花调控中,J3蛋白通过与SVP等其他开花关键因子相互作用而影响植物成花过程,SVP的突变体svp-41表现为早花现象,J3的突变j3-1表现为晚花现象,同时在j3-1和svp-41的双突变体中,拟南芥表现出早花现象,与svp-41的单突变体的表型相似,这一结果表明J3基因通过与SVP的相互作用实现对开花时间的调控[30-31],进一步研究发现在细胞核中J3基因通过与营养生长短期(SVP)蛋白直接相互作用,衰减SVP蛋白与SOC1和FT调控序列的结合从而上调SOC1和FT基因的表达量[15]。竹类植物开花周期较长并具有时间上的不确定性,而且很多竹子开花后会成片死亡,雷竹Phyllostachys violascens是一种优良的笋用竹种,近年来,雷竹普遍开花,开花后部分雷竹会死亡,导致雷竹笋产量大幅度下降,带来严重的经济损失。有关竹类植物开花的研究已经很多,但是竹子成花机制和花期调控模式至今尚未完全清楚[32]。目前,竹子中还未见有关J3基因生物学功能的研究,本研究以雷竹为研究对象,通过同源克隆技术获得1个J3同源基因,经过亚细胞定位、表达模式和功能分析,以期能为深入研究J3同源基因在竹类植物开花调控机制中的作用提供科学依据。

    • 雷竹材料来源于浙江农林大学智能温室大棚,选取位于同一竹鞭上的笋、花芽、花,开花和不开花雷竹的幼叶、成叶、茎秆,标记分装后放入液氮中速冻,保存在-80 ℃超低温冰箱。

    • 用全RNA提取试剂盒(鼎国)分别提取采集的雷竹材料的RNA,以提取的RNA(少于0.5 g·L-1)为模板,用Prime ScriptTM RT Master Mix(Perfect Real Time)试剂盒(Clontech),反转录获得雷竹各组织的cDNA,检测合格后,于-20 ℃保存备用。

    • 通过本地Blast,从毛竹Phyllostachys edulis基因组文库中找到一个候选基因序列号(bphylf027h21),根据该候选基因的基因序列设计引物(J3,表 1),雷竹cDNA为模板,进行聚合酶链式反应(PCR)扩增,琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增条带,用胶回收试剂盒(上海生工生物公司)回收纯化电泳条带,将获得的目的片段与pMD19(simple)-T载体置于连接仪上16 ℃连接1.0~3.0 h,之后转化大肠埃希菌Escherichia coli DH5α感受态细胞(热转化法),37 ℃恒温培养箱培养6.0~8.0 h,挑取白色圆形单菌落,菌落PCR鉴定出阳性单克隆,送测序,得到碱基序列。

      表 1  本研究所用的引物

      Table 1.  PCR primers used in this study

      引物名称 序列(5'→3') 用途
      J3-F CTCTCCGTCTCACTCCGCTC 基因开放阅读框(ORF)扩增
      J3-R GTCAAATTGCCTTTATAGAA
      PvJ3-F ATGTTCGGGCGCGCGCCG ORF扩增
      PvJ3-R TTACTGTTGTGCGCACTGCAC
      PvJ3-1-F CCGGAATTCTGGAGAGAGCATTAACG 荧光定量PCR
      PvJ3-1-R CCGGAATTCCTTCTGCTGGAGGAC
      PeNTB-F TCTTGTTTGACACCGAAGAGGAG 荧光定量PCR内参引物
      PeNTB-R AATAGCTGTCCCTGGAGGAGTTT
      PvJ3-2-F TCCCCCGGGATGTTCGGGCGCGCG 亚细胞定位
      PvJ3-2-R CGCGGATCCCTGTTGTGCGCACTGCACTC
      PvJ3-3-F tccATCGATATGTTCGGGCGCGCG 过表达载体构建
      PvJ3-3-R cgcGGATcCttaCTGTTGTGCGCACTGCACTC

      用Vector NTI预测基因序列的开放阅读框(ORF)区,据此设计引物(PvJ3,表 1),重复上述实验过程,最终测序得到雷竹PvJ3基因序列。运用TMHMM和ProtScale分析PvJ3蛋白的结构特征和理化性质;Smart在线分析其蛋白的结构域;通过Clustal X2比对雷竹PvJ3与其他物种中的J3同源基因的氨基酸序列的相似性;并用Mega 5.0构建系统发育树,选择邻近法(NJ),bootstrap回复次数为1 000次。

    • 用雷竹各组织部位的cDNA为模板,通过实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR),分析雷竹PvJ3基因的表达模式。根据实验要求设计目的基因的定量引物(PvJ3-1,表 1),毛竹的PeNTB基因作为内参基因[33]。各种雷竹组织做3次重复,避光条件下操作,参照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Takara)试剂盒要求加样。PCR扩增程序(两步法):预变性95 ℃,5 min;95 ℃,30 s;60 ℃,30 s,循环数为40。反应结束后,分析确定数据的可靠性,选择合适的数据,用2-△△CT方法[34]对数据进行分析。

    • 根据PvJ3基因ORF区序列(不含终止密码子)和pCaM35S-sGFP载体序列上的酶切位点,在目的基因ORF区的上下游分别引入酶切位点SmaI和BamHI,设计引物(PvJ3-2,表 1),提取pMD19-PvJ3质粒做为模板,进行PCR反应,胶回收纯化得到带有酶切位点的基因片段与pMD19(simple)-T载体连接转化后,阳性单克隆送测序。将测序正确的单克隆进行扩大培养,用质粒提取试剂盒(上海生工生物公司)提取质粒,用限制性内切酶SmaI和BamHI分别对pMD19-PvJ3和pCaM35S-sGFP载体质粒进行双酶切实验,之后用T4 DNA连接酶在16 ℃条件下过夜连接胶回收的酶切产物,连接产物转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞,经测序正确,瞬时表达载体PvJ3-GFP构建成功。通过基因枪轰击洋葱Allium cepa表皮,25 ℃下避光暗培养1~2 d后,用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白信号,金粉的准备和样品的制备参照文献[35]。

    • 根据PvJ3基因ORF区序列和pC1301载体(含有35 S启动子)的序列设计引物(PvJ3-3,表 1),在目的基因ORF区的上下游同样分别引入酶切位点SmaI和BamHI,构建过表达载体pC1301-PvJ3,实验方法参照1.5节。

    • 通过热转化法将构建成功的pC1301-PvJ3过表达载体转入农杆菌Agrobacterium tumefaciens GV3101感受态细胞中,提取阳性单克隆的质粒,重新转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞,再次测序检验转入重组质粒是否正确。用已正确转入pC1301-PvJ3重组载体的农杆菌配制侵染液,侵染进入花期的野生型拟南芥花序[36],侵染3次,间隔约1周·次-1,侵染后的拟南芥即T0代植株,将消毒处理后的T0代种子均匀撒在加入潮霉素的1/2 MS(Murashige and Skoog)固体培养基上,潮霉素质量浓度为100.00 mg·L-1,按照V(潮霉素溶液):V(1/2MS培养基)=1.50:1 000.00比例加入培养基中,筛选抗性植株,以采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法[37]提取的抗性植株的基因组DNA为模板,PCR鉴定出T1代阳性植株,并对植株表型进行初步统计。

    • 根据在毛竹转录组数据库中挑选的基因设计引物,利用同源克隆的方法,从雷竹中分离得到1个J3同源基因,命名为PvJ3,分析PvJ3基因的碱基序列,可知,其ORF区由1 260 bp个碱基组成,能编码419个氨基酸。经蛋白结构域和氨基酸序列分析(图 1~2),可知PvJ3蛋白的N端有J蛋白家族典型的J结构域,同时具有锌指结构域,C末端有法尼基化信号CAQQ序列。用ClustalX2软件对不同物种的J3同源蛋白的氨基酸进行序列比对,结果发现:J3蛋白在各类物种中的相似性很高,与拟南芥J3蛋白的一致性可达80.90%(图 2)。采用临近法构建系统进化树,结果显示:雷竹J3蛋白与单子叶植物高粱Sorghum bicolor和玉米Zea mays的亲缘关系最近,水稻Oryza sativa,大麦Hordeum vulgare和小麦Triticum aestivum次之,与双子叶拟南芥和亚麻荠Camelina sativa的亲缘关系最远(图 3)。

      图  1  PvJ3蛋白结构示意图

      Figure 1.  Structure diagram of PvJ3

      图  2  PvJ3与其同源基因的氨基酸序列比对

      Figure 2.  Alignment of the PvJ3 amino acid sequences from different plant species

      图  3  不同物种J3蛋白的系统进化树分析

      Figure 3.  Phylogenetic tree analysis of J3 in different plant species

    • 通过qRT-PCR技术,对同一竹鞭上开花和不开花雷竹中PvJ3基因在不同组织部位的表达水平进行分析。结果表明:PvJ3基因在同一竹鞭的笋、花芽、花,开花与不开花的茎秆、成叶、幼叶中均有表达。在开花雷竹的茎秆中PvJ3基因的表达量最高,茎、花芽、花、幼叶和成叶中的表达依次降低。在不开花雷竹的茎秆中PvJ3基因的表达量同样也是最高,幼叶、成叶中表达量基本一样(图 4)。

      图  4  PvJ3在开花雷竹与不开花雷竹的不同部位表达水平

      Figure 4.  Expression of PvJ3 in different tissues of Phyllostachys violascens

    • 用基因枪轰击洋葱表皮细胞,通过荧光显微镜观察瞬时表达载体PvJ3-GFP绿色荧光蛋白的信号,确定PvJ3蛋白的定位情况(图 5)。pCaM35S-GFP对照在整个洋葱细胞里均有荧光信号,而PvJ3-GFP在细胞质核细胞核里有荧光信号,因此推断PvJ3蛋白主要定位在细胞质和细胞核中。

      图  5  PvJ3蛋白亚细胞定位结果

      Figure 5.  Subcellular localization of PvJ3 fusion protein

    • 构建过表达载体pC1301-PvJ3转化野生型拟南芥收取T0代种子,潮霉素筛选抗性植株,以抗性植株基因组DNA为模板,经PCR检测得到T1代拟南芥共37株。观察统计T1代植株中长势较好的30株转基因植株的表型,发现PvJ3基因的过表达植株开花时间明显早于野生型(图 6B)。统计结果显示:转基因植株开花天数比野生型植株显著提早(P=6.51E-15<0.01),平均提早3.50 d(图 6C),开花时莲座叶数目比野生型植株显著减少(P=9.24E-09<0.01),平均减少4.43叶(图 6D),且表现出多主茎现象(图 6A)。

      图  6  PvJ3过表达拟南芥T1植株表型

      Figure 6.  Phenotypes of the PvJ3 transgenic Arabidopsis thaliana in T1 generation

    • 高等植物成花过程存在多种诱导途径,大量基因参与这些途径的调控,成花关键基因的研究对于开花过程及花发育调控有着重要意义[38]。拟南芥中研究发现,SOC1和FT是感知不同开花途径信号的整合因子,SVP是直接调控FTSOC1的转录调控因子[8, 39],J3蛋白通过与SVP直接相互作用而衰减SVPSOC1和FT调控序列的结合从而上调SOC1和FT的表达量,参与拟南芥的成花过程,这一发现使得拟南芥成花调控网络更加完善[15]。本研究成功从雷竹中克隆得到J3同源基因并命名为PvJ3,雷竹PvJ3所编码的氨基酸序列与拟南芥J3蛋白氨基酸序列一致性达80.90%,对其蛋白结构域分析可知,PvJ3拥有相对保守的J结构域以及锌指结构域,可以说明PvJ3属于J家族中的一员。

      为了研究雷竹PvJ3蛋白的功能,本研究通过qPCR技术和亚细胞定位分析该蛋白在雷竹中的表达模式和表达部位。对雷竹PvJ3基因进行了不同组织部位特异性表达分析,结果显示雷竹PvJ3基因在同一竹鞭的不同组织部位都有表达,已发现双子叶植物拟南芥J3基因同样在根、茎、叶、花芽、花和果荚等不同组织中表达[29],说明J3基因在单双子叶植物中均表现出全株表达的现象。在相对表达量上,PvJ3基因在开花雷竹茎秆中表达量最高,在花芽和花中的表达量降低,这与已报道的拟南芥中J3基因在花中表达量最高[15]的结果存在差异。PvJ3蛋白亚细胞定位结果显示该蛋白定位在细胞质和细胞核,与拟南芥中J3蛋白的亚细胞定位结果相一致[15],拟南芥中和J3蛋白具有互作关系的SVP,SOC1和FT蛋白都是核蛋白,说明雷竹PvJ3可能在细胞核中与这些开花整合因子相互作用,从而对开花途径进行调控。

      PvJ3基因导入野生型拟南芥植株验证其功能,T1代转基因植株的表型统计结果表明:转基因拟南芥植株开花时间明显早于野生型植株,开花时莲座叶数量明显减少(图 6 C,图 6D),而拟南芥J3基因的过表达植株和野生型植株的开花时间并没有明显差别[15],这说明雷竹PvJ3基因可以显著影响花期,可能是一个开花促进因子。值得注意的是,转雷竹PvJ3基因拟南芥植株同时表现出多主茎现象(图 6A),这一现象在拟南芥J3过表达植株中并没有被观测到[15]。以上结果表明,雷竹PvJ3基因不仅在成花调控中的功能和拟南芥J3基因存在一定差异,同时还可能参与茎的发育等其他生长发育过程,在基因功能上比拟南芥同源基因要复杂的多。

      目前,J3基因功能的有关研究主要以模式植物拟南芥为研究对象,单子叶植物中还未见报道。通过对比J3基因在雷竹和拟南芥中的表达模式不难发现:雷竹PvJ3基因和拟南芥J3基因都是全株表达,同时编码蛋白都定位在细胞质和细胞核,这表明J3基因在不同植物中的表达部位不存在明显差异,并且可能是一个核内作用蛋白。在相对表达量上,雷竹PvJ3基因和拟南芥J3基因存在一定差异,同一竹鞭上开花和不开花雷竹中PvJ3基因在茎秆中表达量最高,而拟南芥中J3基因表达量在花中最高,这可能与雷竹PvJ3基因参与茎的发育有关。转基因实验的结果表明:雷竹PvJ3基因不仅可以显著提早拟南芥开花时间,同时还促使拟南芥出现多主茎现象,这表明雷竹PvJ3基因很可能参与除了开花调节以外的其他生长发育过程的调控。由于拟南芥和竹子之间的差异很大,雷竹PvJ3基因在竹子中是否可以促进植物提早开花,同时还参与哪些生物学过程,需要后续研究进一步验证。

参考文献 (39)

目录

    /

    返回文章
    返回