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随着中国集体林权制度改革稳步推进,林木采伐受到了限制,发展林下经济能达到不砍树而致富的目的,化解生态保护与农民增收间的矛盾,为维持和提高林农收入水平开辟了新思路。《关于加快林下经济发展的意见》的颁布也为林下经济的发展带来了机遇[1]。发展林下经济已经成为吸纳农民就业、增加林地产出、提高农户林业收入的重要途径[2]。浙江作为全国林业大省之一,森林覆盖率59.50%,森林资源丰富,具备开展林下经济的良好条件。林下经济是在林下开展林、农、牧等多种活动,或者进行间作经营,充分发挥林木与其他经济生物的综合效益的一种与传统林业和现代农业并存的新的林业经济业态[3]。在国外相关概念主要是农林复合系统[4]。国外学者认为,这种林业经营模式具有生态和社会文化优势,有利于保护生物多样性和景观美学[5],是一种有利于作物和生物的生态土地利用系统,可提供可持续的生物质资源和生态效益[6]。因地制宜选择合理的林下种植及养殖形式,既可以构建稳定的生态系统,又能促进林区经济发展[7]。目前,已有文献从林下经济的含义[8]、基础理论[9-10]、发展模式[11-12]、经济效益[7]等进行了研究。基于农户视角,从微观层面探讨林下经济的文献较少。徐玮等[13]针对国有林区职工家庭参与林下经济意愿的影响因素进行了研究,他们发现被访者个人特征、家庭收入水平以及是否承包林地等对林下经济经营意愿有显著影响。王团真等[14]在对福建省三明市农村居民发展林下经济意愿影响因素的研究发现,户主作为家庭的重要决策者,其个人特征对农户发展林下经济的意愿具有显著影响。本研究在已有研究基础上,进一步探讨影响浙江省集体林区农户林下经济经营意愿的因素,以期为提高农户林下经济参与意愿,促进林区经济发展提供政策参考。
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使用数据来源于2016年国家林业局调研项目“集体林区林权改革监测”。该项目通过随机抽样方法,选择了浙江省临安、开化、龙泉和庆元4个样本县(市、区)。依据分层随机抽样原则从每个县(市、区)随机抽取2个乡镇,每个乡镇随机抽取3个行政村,每个行政村中再随机选取10户农户,共获得240个农户样本。剔除部分缺失样本,最终使用的样本为224户。
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户主作为家庭的主要决策者,其个人特征可能会通过他在家庭中的主导作用,影响家庭意志与决策。一般情况下,随着年龄增长,户主对林业生产新形势、新政策的接受能力逐渐下降,不愿意进行林下经济经营的可能性更大。户主健康状态良好,自身劳动能力较强,愿意从事林下经济的可能性较大。但户主健康状态较好也面临更多的工作选择,从而降低了他开展林下经济的意愿。因此,户主健康状态的预期影响无法确定。户主受教育程度较高,一方面就业机会相对更好,而放弃其他工作选择从事林下经济的机会成本相对较高;另一方面,前瞻性更强,更愿意尝试新的事物,因此发展林下经济的意愿更加强烈。可见,户主受教育水平的预期影响方向也无法确定。
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浙江农村林地资源丰富,但不同农户拥有的林地资源差异较大。林地资源是决定农户是否愿意从事林下经济活动的重要因素,拥有的林地资源越丰富,农户依靠林地生产获得较高收入的可能性越大,因而愿意发展林下经济的可能性也越大。由于林下经济劳动需求量相对较大,林地离家越近,经营管理越方便,农户愿意发展林下经济的可能性也越大。
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林下经济的劳动需求较大,家庭劳动力数量越多,农户愿意进行林下生产的可能性也越大。较之年轻劳动力,老年劳动力工作能力和效率都有所下降。家庭劳动力中,老年劳动力占比越高,则该家庭愿意发展林下经济的可能性越低。农村年轻劳动力可能更倾向于外出就业,愿意从事林业生产的通常是留守老人,反而可能出现家庭老年劳动力占比越高,愿意经营林下经济的可能性越大的现象。因此,老年劳动力占比的影响方向无法确定。村干部是村里的积极分子,信息获取和接受能力都较强,同时,为积极响应政策号召,愿意发展林下经济的可能性相对更大。农户参加森林保险,表明其风险意识较强,可能不太愿意尝试新的林业经营方式,但又使农户安全感上升,愿意加大林业投入和管理的可能性上升,因而,农户是否参加森林保险的预期影响也无法明确。农户家庭收入中林业收入占比高,说明该家庭对林业的经济依赖性较强,营林经验相对丰富,从而继续从事林业并进一步发展林下生产的可能性较大。家庭收入在村中相对水平的预期影响还无法判断,收入越高,一方面,说明该家庭具有较强的经济实力,思想观念较新,愿意从事林下经济的可能性更高,另一方面,农户可能因为放弃已有工作的机会成本较高,而不愿发展林下经济。本研究的因变量为农户是否愿意参与林下经济经营,“愿意”用“1”表示,“不愿意”用“0”表示。解释变量中,健康指标根据问卷分为是否健康状态良好,“是”包含健康1项,“否”包含基本健康但只能干轻活、不健康但生活能自理和生活不能自理等3项。家庭劳动力根据健康、年龄以及是否务农或从事非农工作3个指标进行确定,健康人群年满16周岁但不超过60周岁被认为是家庭劳动力,现实中,超过60周岁但务农或参与其他非农工作的老年人也认为是家庭劳动力。老年劳动力占比是指家庭劳动力中60周岁以上劳动力所占的比例。林业收入占比,是指年林业收入占家庭总收入的比例,其中家庭总收入包括林业收入、非林农业收入、工资性收入、自营工商业收入以及转移性收入等(表 1)。
表 1 变量定义与描述统计
Table 1. Definition and description of variables
项目 变量 赋值及单位 平均值 标准差 预期影响 因变量 参与林下经济经营的意愿 1代表愿意; 0代表不愿意 0.205 0.405 户主特征 年龄 周岁 56.879 8.999 - 健康状态良好 1代表是; 0代表否 0.808 0.395 ? 高中及以上学历 1代表是; 0代表否 0.188 0.391 ? 资源禀赋 林地面积 hm2 5.151 7.167 + 林地距家平均距离 km 16.067 28.781 + 家庭特征 劳动力数量 人 3.192 1.173 + 老年劳动力占比 % 22.768 31.228 ? 是否有村干部 1代表是; 0代表否 0.371 0.484 + 是否参加森林保险 1代表是; 0代表否 0.701 0.459 ? 林业收入占比 % 31.224 31.315 + 家庭收入在村中的水平 1代表较高; 2代表中等; 3代表较低 2.031 0.587 ? 说明:数据来源于实地调查。~“+”代表解释变量对因变量有正向影响,代表解释变量对因变量有负向影响,“?”代表影响方向不确定 -
为考察农户林下经济经营意愿的影响因素,建立了Logit模型:L(I=1)= α+ηiHi+γjRj+ρlFl+δtAt+ε。其中,I表示农户林下经济经营意愿,愿意为1,不愿意为0。Hi,Rj和Fl分别是衡量户主特征、资源禀赋和家庭特征的向量。户主特征Hi包括户主年龄、健康状态和受教育水平;农户林地资源禀赋Rj包括林地面积以及林地离家平均距离,理论上,林地资源越丰富,离家越近,农户愿意从事林业及林下生产的可能性越大。家庭特征Fl由劳动力数量、老年劳动力占比、是否有村干部、是否参加森林保险、林业收入占比以及家庭收入在村中所处的水平等变量构成。本研究还控制了地区虚拟变量At。ηi,γj,ρl和δt是待估计的未知参数,ε是误差项。
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由表 1可知:农户林下经营意愿较低,因此,我们对农户不愿意发展林下经济的原因进行了进一步了解,列于表 2。从表 2可知:林下经济劳动需求较高,因此,缺乏劳动力成为农户不愿发展林下经济的最主要原因。这可能是年轻劳动力外流以及女性劳动力非农就业率提高造成的。缺乏资源优势是农户不愿发展林下经济的第二大原因,资源越差,可获得的利润空间小,从而导致林下经济缺乏吸引力。交通不便、资金缺乏、放弃其他工作的机会成本较高也是农户不愿发展林下经济的重要原因。
表 2 农户不愿参与林下经济经营的主要原因
Table 2. The main reasons for households reluctant to participate in the under-forest economy
原因 比例/% 缺乏资源优势 14.45 交通不便 7.51 缺乏劳动力 55.49 缺乏资金 6.94 缺乏技术 2.89 不感兴趣 3.47 其他工作效益更高 6.36 其他 2.89 说明:数据来源于实地调查。178户不愿参与林下经济经营,其中173户对不愿发展林下经济的原因进行了回答 -
从表 3可以看出:资金补贴是多数农户最希望政府出台的林下经济发展扶持政策,其次是技术推广和道路基础设施建设。农户对通电、通水基础设施建设以及完善产品监管标准和检测体系无迫切需求。
表 3 农户发展林下经济的政策需求分布
Table 3. Distribution of policy demand for households to develop under-forest economy
政策需求 频数/户 频率/% 政府投入 建设信息服务平台 10 4.46 发展专业合作社 5 2.23 技术推广 34 15.18 资金补贴 118 52.68 金融支持 林下经济产品抵押贷款 7 3.13 税收减免 3 1.34 贷款贴息 12 5.36 基础设施建设 通路 32 14.29 通电 0 0 通水 0 0 产品监管 开展原产地保护 3 1.34 完善标准和检测体系 0 0 合计 224 100 说明:数据来源于实地调研 -
运用Stata 13统计软件对浙江省集体林区农户林下经济经营意愿的影响因素进行Logit回归分析,模型通过了整体显著性检验,拟合效果较好,说明解释变量较好地解释了因变量(表 4)。为检验结果的稳健性,还进行了Probit和OLS回归。3个模型中各解释变量对农户林下经济经营意愿的影响及方向基本保持一致,表明模型稳定性较好。
表 4 回归结果
Table 4. Regression results
项目 变量 Logit Probit OLS 系数 边际效应 系数 边际效应 系数 户主特征 年龄 -0.123(0.033)*** -0.015 -0.068(0.018)*** -0.015 -0.015(0.004)*** 健康状态良好 -1.033(0.572)* -0.128 -0.598(0.326)* -0.132 -0.145(0.074)* 高中及以上学历 -1.472(0.627)** -0.182 -0.814(0.354)** -0.180 -0.146 (0.073)** 资源禀赋 林地面积 0.133(0.038)*** 0.016 0.077(0.021)*** 0.017 0.018(0.004)*** 林地距家平均距离 -0.038(0.021)* -0.005 -0.021(0.011)* -0.005 -0.003(0.001)*** 家庭特征 劳动力数量 0.062(0.179) 0.008 0.037(0.102) 0.008 0.010(0.024) 老年劳动力占比 0.020(0.008)** 0.003 0.011(0.005)** 0.002 0.002(0.001)** 是否有村干部 0.463 (0.453) 0.057 0.224(0.255) 0.050 0.042(0.059) 是否参加森林保险 1.240(0.566)* 0.154 0.714(0.323)** 0.158 0.177(0.075)** 林业收入占比
家庭收入在村中的水平
(参照组:高)0.012(0.007)* 0.001 0.006(0.004)* 0.001 0.002(0.001)* 中 -0.626(0.528) -0.089 -0.375(0.305) -0.094 -0.091(0.075) 低
(参照组:临安)-1.224(0.774) -0.155 -0.717(0.441) -0.162 -0.161(0.102) 地区 开化 -0.132(0.594) -0.020 -0.064(0.339) -0.017 -0.025(0.078) 庆元 -0.777(0.564) -0.105 -0.445(0.327) -0.105 -0.124(0.081) 龙泉 -1.613(0.634)** -0.186 -0.900(0.359)** -0.185 -0.233(0.084)*** F统计量(Prob > chi2) 0.000 0.000 0.000 Pseudo R2/R2 0.225 0.223 0.211 说明:数据来源于实地调研数据。*,**和***分别表示10%,5%和1%水平显著。括号内数值表示标准误 -
回归结果表明:户主作为一家之主,其个人特征通过影响其个人意愿,进一步对家庭林下经济发展意愿产生了较大影响。与预期一致,随着年龄增长,户主更倾向于从事已有工作,开展新工作的意愿较低,不愿经营林下经济的概率上升。户主健康状态良好显著降低了该家庭参与林下生产的意愿,这可能是由于户主健康状态良好可以获得更好、更稳定的工作机会,放弃现有工作的机会成本较大,从而导致发展林下经济的意愿较低。接受过中、高等教育的农村居民,外出就业的可能性相对更大,愿意从事林下经济生产的概率相对更低。
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林地资源禀赋越好,农户愿意开展林下经济的可能性越大,农户从林地中获得较高收入的可能性越大,愿意对林地进行投入并加以管理的可能性也越大。同时,林地资源丰富,能够因地制宜开展林下经济,获得可观收益的可能性较大,因此,农户愿意发展林下经济的可能性也较大。由于林下经济需要较多的时间投入,是否便于经营管理是农户的重要考量。林地离家越近,越便于经营管理,农户愿意经营林下经济的意愿也越大。
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农村地区,年轻劳动力大量外流,老年劳动力成为从事农林业生产的主力军,导致老年劳动力占比高的家庭愿意经营林下经济。参加森林保险显著提高了农户林下经济经营意愿,这可能是森林保险增加了林地经营的安全性。家庭林业收入占比越大的家庭对林业生产依赖性越强,林业生产经验也相对丰富,希望进一步发展林下经济的可能性越大。而家庭劳动力数量、是否有村干部以及家庭收入在村中的水平对农户林下经济经营意愿无显著影响。
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本研究得出以下主要结论:第一,农户经营林下经济意愿较低,主要是因为缺乏劳动力,其次是缺乏资源优势,交通不便、缺乏资金、放弃其他工作机会成本较高等。第二,林下经济作为新的经济发展模式,能否得到民众支持,政府的资金补贴、技术推广以及道路建设支持非常关键。第三,户主个人特征、林地资源禀赋、家庭中老年劳动力比例、林业收入占比以及是否参与森林保险都是农户是否愿意开展林下经济的重要影响因素。
本研究提出以下几点建议:第一,建立扶持林下经济发展的专项基金,提高年轻劳动力林下经济经营意愿。林下经济作为新的林业生产经营模式,前期投资相对较高,对劳动力需求量也较大,政府资金支持和政策优惠或能吸引年轻劳动力回流,提高他们参与林下经济经营的意愿。虽然老年劳动力农林业生产经验丰富,是农林业主要从事者,愿意发展林下经济,但是,老年劳动力也存在不敢冒险,获取新技术及农林产品市场信息能力不足等弱点,同时无法胜任高强度劳动。因此,加强政策扶持,解决农户部分资金短缺问题,吸引年轻劳动力返乡,提高林区农户林下经济经营意愿。第二,加快林地流转,完善相关制度建设。林地细碎化降低了农户生产效率,导致部分农户不愿进行投入和管理,因此,鼓励农户将部分林地进行流转,以实现资源分配和规模经营。鼓励林地流转的同时,相关部门应完善林地流转相关政策,简化林地流转程序,降低林农因手续繁杂而放弃流转的可能性,在保证林地流转自由的基础上,充分保障流转双方的权益。第三,加强林区道路及配套设施建设,提高通达性。林下经济经营劳动需求量较大,林间管理也较为频繁,因而,林区交通不便成为农户不愿经营林下经济的原因之一。加强林区道路及配套设施建设,克服由距离造成的阻碍,或能提高农户林下经济经营意愿。第四,扩大森林保险覆盖面,完善风险补偿机制。当前林下经济发展各项机制还不成熟,存在较大的经营风险,因此,扩大森林保险覆盖面,并在此基础上完善风险补偿机制,有利于减轻林下经济的经营风险,增强农村居民林地经营安全感,从而提高农户发展林下经济的意愿。
Households' willingness to develop under-forest economy and its determinants in collective forest areas of Zhejiang
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摘要: 林下经济作为一种生态经济复合发展模式,对实现农户增产增收、促进林区经济发展具有重要意义。基于浙江省临安、开化、庆元和龙泉4个县(市、区)农户的抽样调查数据,在分析集体林区农户不愿发展林下经济的主观原因及农户发展林下经济的政策需求基础上,采用计量经济方法定量分析了影响农户林下经济经营意愿的客观因素。研究发现:不愿经营林下经济的农户认为主要原因在于缺乏劳动力、没有资源优势、交通不便、资金不足以及收益不理想等。多数农户最希望政府出台的林下经济发展扶持政策是资金补贴,其次是技术推广和道路基础设施建设。回归结果表明:户主特征、林地资源禀赋以及家庭特征中的老年劳动力占比、林业收入占比和是否参加森林保险是农户林下经济经营意愿的重要影响因素。Abstract: Under-forest economy as an ecological and economic compound development model, plays an important role in increasing households' income and promoting economic development in forest areas. Based on the survey data from Lin'an, Kaihua, Qingyuan, and Longquan, which are counties(city or district) in Zhejiang Province, this research analyzed the subjective reasons why many households in the collective forest areas were unwilling to develop under-forest economy as well as the households' demand for policy of developing under-forest economy, then used the quantitative analysis method to identify the objective determinants of the households' willingness to develop under-forest economy. The findings indicated that the farmers who do not want to develop under-forest economy believe that the major reasons were shortage of labor and resource advantages, inconvenient traffic, lack of funds and low investment return. Financial subsidies were most popular policy for under-forest economy development, followed by technical extension and traffic infrastructure construction. The regression results showed that the major determinants of households' willingness to develop under-forest economy included the characteristics of household heads, forest land resources, the proportion of the old laborers and the proportion of forestry income in the household, and whether having forest insurance or not.
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Key words:
- forest econmics /
- under-forest economy /
- households' willingness /
- Zhejiang Province
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换锦花Lycoris sprengeri为石蒜属Lycoris球根花卉,春初出叶,叶片为带状,宽约1.0 cm,长约30.0 cm,叶顶钝圆;秋初开花,花茎高约60.0 cm,伞形花序4~6朵,6片倒披针形花瓣,长约4.5 cm,宽约1.0 cm;花多淡紫红色,花被顶端蓝色,花色花型丰富,是石蒜属特殊的复色花卉[1]。
目前,换锦花的花色性状改良主要以传统的种间杂交和选择育种为主,分子标记育种为辅的育种模式。徐炳声等[2]利用杂交授粉技术,以换锦花为母本,中国石蒜L. chinensis为父本,选育出粉白色的秀丽石蒜L.× elegans;张定成等[3]在安徽和淮南发现三倍体和二倍体野生换锦花资源,表明换锦花可能是由其他石蒜属植物杂交而来。然而换锦花生长周期长,在自然状态下授粉率低且结实少,种子萌发率低,制约了换锦花传统育种研究。为了克服传统杂交育种的缺陷,不少研究者利用现代分子生物学技术探索换锦花花色分子育种性状改良的有效手段[4−6]。花色苷生物合成途径是类黄酮生物合成的一个分支途径,主要由结构基因和调控基因共同调控,花色苷积累受光照、温度和水分等多种因素的影响,植物受到强光、低温、氮亏缺等逆境协迫时会大量合成花色苷以增强自身抗性[7],花色苷的生物合成也受到植物体自身生长发育过程的影响[8]。大量研究表明:R2R3-MYB 是花色苷生物合成的重要调控因子,常与bHLH和WD40形成MBW复合体结合到结构基因启动子序列上共同调控葡萄Vitis vinifera、风信子Hyacinthus orientalis、苹果Malus pumila花色素苷的生物合成[9]。许振渊等[10]和侯朔等[11]克隆了换锦花R2R3-MYB转录因子LsMYB4和LsMYB5基因,周洋丽等[12]通过病毒介导的基因沉默(VIGS)技术研究发现LsMYB4和LsMYB5是换锦花花青素合成的抑制性转录因子。周洋丽[13]和薛惠敏等[14]成功克隆了换锦花LsANS、LsF3'H、LsUFGT1和LsUFGT2基因启动子序列,为研究换锦花花色形成的调控机制和遗传改良提供基础。为进一步探讨换锦花花色形成的调控网络,本研究根据换锦花花瓣(红色部分和蓝色部分)转录组信息筛选到与换锦花花色形成相关的差异R2R3-MYB转录因子LsMYB7并进行生物信息学分析,通过病毒介导的基因沉默(VIGS)技术研究该基因调控花色苷积累的相关功能,结果可为通过基因工程手段改良换锦花的花色奠定理论基础。
1. 材料与方法
1.1 材料
2019年8—9月于浙江农林大学石蒜属植物种质资源圃采集换锦花花瓣,取换锦花小花苞(2.0~3.5 cm)、大花苞(4.5~6.0 cm)、盛花期和败花期4个不同花发育时期(图1A)和不同花色无性系H1、H2、H3、H4和H5盛花期花瓣(图1B),液氮速冻后于−80 ℃冰箱保存备用。
1.2 方法
1.2.1 换锦花花瓣总RNA提取和cDNA第1链的合成
采用RNAiso plus法提取换锦花花瓣总RNA[15],参照PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(Takara)方法合成cDNA 第1链。
1.2.2 换锦花LsMYB7基因cDNA序列的PCR扩增
根据转录组测序信息设计LsMYB7基因 cDNA序列特异引物LsMYB7-F:CAAGCAGTGGTCTCAACA和LsMYB7-R:AGAACAGCACTACTAAAGGT,参照Premix PrimeSTAR HS的PCR扩增体系扩增目的基因cDNA序列,PCR扩增反应程序为94 ℃变性30 s;58 ℃ 退火30 s;72 ℃延伸90 s,32个循环,72 ℃延伸10 min,质量浓度为1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物,于凝胶成像系统(Bio-RAD)观察拍照;采用Hingene琼脂糖凝胶回收试剂盒(杭州麦克德勒科技有限公司)回收目的DNA,于−20 ℃保存备用。
1.2.3 目的基因连接和转化
参照pEASY-Blunt Zero Cloning Kit说明书将目的基因LsMYB7序列连接到pEASY-Blunt载体,转化大肠埃希菌Escherichia coli DH5α感受态细胞;在含有氨苄青霉素(Amp)、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和5-溴-4-氯-3-吲哚 β-D-半乳糖苷(X-Gal)的LB培养基(Luria-Bertani medium)上培养过夜,挑取阳性克隆于LB液体(含50 mg·L−1 Amp)培养基中,37 ℃振荡培养,PCR检测呈阳性的菌液送浙江有康生物科技有限公司测序;采用质粒DNA提取试剂盒(杭州创试生物科技有限公司)提取目的序列重组质粒DNA,于−20 ℃保存。
1.2.4 LsMYB7及花色形成相关基因的表达
采用Primer 5.0设计LsMYB7基因和花色形成相关基因(LsCHS、LsF3H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2)的RT-qPCR引物(表1),使用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(Takara)方法合成cDNA 第1链。参照SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ(Takara)方法,于CFX96TM荧光定量 PCR 仪(BIO-RAD)进行RT-qPCR验证。RT-qPCR体系(20.0 uL):cDNA(<100 ng) 1.6 uL,正反引物各0.8 uL,TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 10.0 uL,RNase Free ddH2O 6.8 uL。RT-qPCR程序为95 ℃ 30 s,95 ℃ 3 s,60 ℃ 30 s,循环40次。以LsGADPH为内参基因[15],2−ΔΔCt方法计算实时荧光各基因的相对表达量,重复3次。
表 1 RT-qPCR所用引物Table 1 Primers for fluorescence RT-qPCR引物 正向(5′→3′) 反向(5′→3′) LsGADPH AGGGTTTGATGACCACCGTGCA ACAGCCTTGGCAGCTCCAGTAC LsMYB7 GCGCGGAGTTCTTGGCTCTGAT TCTGGCACCGTTCTCATCACGC LsCHS CAAGACATGGTGGTGGTCGAGGTC CGAGGAGTTTGGTGAGCTGGTAGTC LsF3H AACCGAGGACGCAACGGAATGC ACCATCTTCATCGCAGCCACCA LsANS CGTGCCAGGTCTCCAGGTCTTCTA TCGAGAGTGTCACCGACGTGAACTA LsUFGT1 GGTGGTGAAGGATGAGGAAGGTAGG GTTGAACCGCTCGAACCGCAATC LsUFGT2
LsF3'HGCGTAGCCTTCTCCTTCCTCACCT
TTGTACAGCCATGCACAGAATCCGCCATGAATCGCTTCACCTCCTC
GCAACCAAGGCAAGAAATCA说明:引物参考文献[16]。 1.2.5 换锦花花瓣花色苷的HPLC测定
参照刘跃平等[17]方法提取并用高效液相色谱(HPLC)测定换锦花花瓣花色苷质量浓度。精密称量换锦花花瓣干粉0.040 0 g,加入2 mL体积分数为1%甲醇/HCl提取溶液,振荡混匀;20 ℃超声提取30 min;12 000 r·min−1,离心15 min,取上清液;0.45 μm滤膜过滤;梯度洗脱:流动相为甲醇(A)-体积分数为1%的甲酸水(B),0~20 min(A体积分数从5%升至60%),20~25 min(A体积分数从60%升至100%),25~30 min(A体积分数保持100%),流速1 mL·min−1,检测波长280 nm,柱温30 ℃,进样量10 uL;以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷、飞燕草素-3-O-葡萄糖苷等3个花色苷为标准品。每样3个生物学重复。
1.2.6 亚细胞定位
采用XbaⅠ和BamHⅠ分步酶切法酶切亚细胞定位载体pAN580,再采用ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit (杭州霆喜生物科技有限公司)将LsMYB7基因序列连接到pAN580上,并转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞,在含有50 g·L−1Amp的LB培养基上进行筛选,挑选阳性克隆进行菌液PCR检测,成功构建pAN580-LsMYB7亚细胞定位载体,采用无内毒素质粒提取试剂盒(AxyPrep)提取pAN580-LsMYB7重组载体质粒DNA;聚乙二醇法(PEG 4000)转化烟草Nicotiana tabacum原生质体,用激光共聚焦荧光显微镜观察拍照。
1.2.7 VIGS沉默载体构建
采用双酶切法构建VIGS沉默载体pTRV2-LsMYB7:利用Primer 5.0设计长为400 bp的LsMYB7基因cDNA序列插入片段引物pTRV-LsMYB7-F: TACCGAATTCTCTAGAGAGGACAACATGCTACAATCCC和pTRV-LsMYB7-R:GCTCGGTACCGGATCCGCTCGAATCGCTAACATCCG;用限制性内切酶XbaI和BamHI分别双酶切VIGS载体(pTRV2)与LsMYB7基因的插入序列,T4 DNA连接酶连接载体与目的序列,转化大肠埃希菌DH5α,并在含有50 g·L−1 卡那霉素(Kan)的LB固体培养基筛选,提取pTRV2-LsMYB7重组质粒DNA。
1.2.8 换锦花花瓣瞬时转化
采用微量注射法转化换锦花花苞[12],将重组质粒pTRV2-LsMYB7、pTRV2和pTRV1质粒DNA转化根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens GV3101,于YEP液体培养基(50 mg·L−1 Rif和50 mg·L−1 Kan)中,28 ℃,220 r·min−1振荡培养12~14 h;4 000 r·min−1, 离心10 min,去上清液;加入侵染液(10 mmol·L−1 MES + 200 μmol·L−1 AS + 10 mol·L−1 MgCl2,pH 5.6±0.03)重悬后的菌液D(600)=0.8~1.0;将pTRV1与pTRV2空载体、pTRV2-LsMYB7农杆菌液按照体积比1∶1混合均匀,室温黑暗静置4~6 h;使用1 mL注射器,吸取1 mL混合农杆菌菌液。选取3~4 d的换锦花花苞,在花苞基部缓慢注射混合根癌农杆菌菌液,充分侵染换锦花花苞,侵染5 d后采集花瓣用于LsMYB7和花色形成相关结构基因的表达分析(见1.2.4和表1)。
1.2.9 数据统计分析与作图
采用Excel 2020 统计和整理数据,采用SPSS 20.0 对数据进行差异显著性分析,采用Graphpad 8.0作图。
2. 结果与分析
2.1 LsMYB7 基因的克隆和序列分析
以换锦花花瓣的cDNA为模板,采用RT-qPCR技术扩增获得长度为951 bp 的LsMYB7 cDNA序列(图2)。该cDNA序列含有1个825 bp的开放阅读框(ORF),编码274个氨基酸,分子量为6.84 kD,蛋白分子式为C2402H3981N825O982S258,理论等电点(pI)为5.04,不稳定系数为43.43,总体亲水性(GRAVY)为0.936。
2.2 LsMYB7氨基酸序列同源性分析
通过与美国国家生物技术信息中心(NCBI)搜索的其他植物MYB氨基酸同源序列进行比对,发现换锦花LsMYB7蛋白含有2个R2R3-MYB典型的SANT结构域R2和R3[18](图3),属于R2R3-MYB类转录因子。与茶Camellia sinensis KAF5956278.1、狭叶油茶Camellia lanceoleosa KAI8015846.1、粗柄象腿蕉Ensete ventricosum RRT35038.1/RWV93016.1、椰子Cocos nucifera XP_KAG1363931.1、番红花Crocus sativus QBF29477.1、香根鸢尾Iris pallida KAJ6804060.1/KAJ6829988.1、河岸葡萄Vitis riparia XP_034676575.1和拟南芥Arabidopsis thaliana等其他植物的同源性为44.52%~60.57%,其中,与茶KAF5956278.1的同源性最高达60.57%,其次是香根鸢尾 KAJ6804060.1/KAJ6829988.1(59.32%),与拟南芥AtMYB44(Q9FDW1.1)、AtMYB70(AEC07437.1)、AtMYB73(O23160.1)和AtMYB77(Q98N12.1)的同源性为44.52%~47.44%,且同源部分均集中在N端的R2R3 DNA结合结构域,而C端的同源性较低。
2.3 LsMYB7系统进化与功能预测
从NCBI数据库下载拟南芥(AtMYB 16条)、换锦花(LsMYB 2条)和石蒜L. radiata (LrMYB 2条) R2R3-MYB氨基酸序列进行比对并构建系统进化树(图4)。参考拟南芥MYB基因家族的分类方法[19],LsMYB7与拟南芥R2R3-MYB S22亚家族的AtMYB44、AtMYB70、AtMYB73和AtMYB77 聚为一类,由于拟南芥S22亚家族参与调控拟南芥的生长和发育过程,响应高盐、干旱低温等非生物胁迫反应,同一亚族基因的功能相似,结合花色基因表达分析,推测LsMYB7可能通过响应干旱和高温等调控换锦花花瓣花色苷的形成。
2.4 换锦花花瓣花色苷质量浓度
利用HPLC分别测定换锦花4个花发育时期和5个不同花色无性系(H1、H2、H3、H4和H5)盛花期花瓣的花色苷质量浓度(图5A和5B),结果表明:换锦花花瓣花色苷的主要成分为矢车菊素,含有少量的天竺葵素和飞燕草素,说明花色苷的种类和质量浓度决定换锦花花色的多样性。随着换锦花花器官的生长发育,花瓣花色苷总质量浓度和矢车菊素质量浓度呈逐渐下降的趋势,小花苞时期矢车菊素质量浓度大约是败花期的3倍,说明换锦花花瓣花色苷的积累可能主要在花瓣发育的早期完成(图1A和5A);在浅色换锦花无性系H4和H5中,矢车菊素质量浓度明显低于深色换锦花无性系H1、H2和H3(图1B和5B)。因此,从换锦花不同花发育时期和不同花色无性系花瓣颜色和花色苷质量浓度来看,矢车菊素对换锦花花瓣的颜色影响最大,矢车菊素质量浓度越高,换锦花花瓣的颜色就越深。
2.5 换锦花LsMYB7和花色形成相关基因的表达
2.5.1 在换锦花不同发育时期的表达
利用RT-qPCR对LsMYB7和换锦花花色形成相关基因(LsC4H、LsCHS、LsF3H、LsF3'H、LsANS和LsUFGT1、LsUFGT2)在换锦花不同发育时期花瓣中的表达进行分析,结果(图6)表明:LsMYB7与LsCHS和LsF3'H基因的表达随着换锦花花苞发育呈逐渐上升趋势,LsC4H、LsCHS、LsUFGT1、LsUFGT2、LsF3'H和LsMYB7在败花期大量表达,LsF3H则在花苞发育前期几乎无表达,盛花期开始大量表达,而在败花期表达量开始下降;LsANS、LsUFGTs等花色苷合成的后期基因在盛花期的表达最低。其中LsCHS和LsF3'H基因的表达与花色苷总质量浓度和矢车菊素质量浓度正好相反(图5A)。
2.5.2 在换锦花不同花色无性系花瓣中的表达
LsMYB7和换锦花花色形成关键基因LsC4H、LsCHS、LsF3H、LsF3'H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2在换锦花不同花色无性系中的表达差异显著(图7)。2个花色苷合成的前期基因LsC4H和LsCHS及后期基因LsANS在淡色的无性系换锦花花瓣中表达量高。LsF3H在蓝色为主的H3无性系中表达量达到最高。LsMYB7在H1和H4中表达量比较高。LsMYB7基因的表达与LsCHS和LsF3'H基因的表达正好相反,而与不同花色无性系花色苷总质量浓度和矢车菊素质量浓度基本一致,这一结果与不同花发育时期的基因表达结果一致。因此,LsMYB7可能对LsCHS和LsF3'H基因的表达有一定的调控作用。
2.6 换锦花LsMYB7基因的亚细胞定位
通过双酶切法构建亚细胞定位载体pAN580-LsMYB7,转化烟草原生质体,于激光共聚焦荧光显微镜观察,LsMYB7荧光信号定位在细胞核中(图8),说明LsMYB7基因为转录因子基因,在细胞核中起转录调控的作用。
2.7 LsMYB7基因沉默后对换锦花花瓣花色苷形成相关基因表达的影响
构建LsMYB7的VIGS基因沉默载体pTRV2-LsMYB7,通过微量注射法转化换锦花花苞,LsMYB7 基因沉默后,换锦花同朵花中一半花瓣明显变短,且颜色变深(图9A);对LsMYB7和花色苷形成相关基因在换锦花花瓣中的表达进行分析(图9B和C),与ck (空载)相比,LsMYB7基因换锦花花瓣中的表达量明显下降,同时,花色苷形成相关基因LsCHS、LsF3'H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2的表达量极显著下降(P<0.01),而LsF3H基因的表达量反而上升,LsC4H基因表达变化不大,说明LsMYB7转录因子可能参与调控花瓣的生长发育,且对LsCHS、LsF3'H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2的表达起正调控作用,而对LsF3H基因的表达起负调控作用。
3. 讨论
植物R2R3-MYB转录因子广泛参与调控次生代谢、细胞形态发生、激素刺激、环境胁迫应答、分生组织形成和细胞周期等过程[20]。根据C-末端的不同,拟南芥R2R3-MYB基因家族可分成22个不同的亚族,其中,拟南芥S4、S5、S6和S7亚族基因参与花青素和类黄酮类化合物生物合成途径的结构基因的转录调控[18, 21−22],换锦花LsMYB4、LsMYB5和拟南芥S4亚族基因聚为一类。通过花青素形成相关基因表达和VIGS基因沉默技术研究表明,LsMYB4和LsMYB5对花青素生物合成基因的表达有负调控的作用[10−12]。
S22亚族基因AtMYB44、AtMYB77、AtMYB73和AtMYB70主要参与拟南芥响应高盐、干旱、低温等非生物胁迫反应,其中,AtMYB73基因启动子中含有ABA响应元件ABRE及干旱胁迫和热胁迫顺式作用元件。AtMYB73突变体atmyb73在干旱胁迫处理下,ABA 下游基因ABI2、ABI5 的表达水平均较野生型明显增强。外源 ABA 处理野生型和突变体种子、幼苗,获得了与干旱胁迫处理类似的结果[23−24]。本研究结果表明:LsMYB7蛋白含有2个R2R3-MYB典型的SANT结构域R2和R3,属R2R3-MYB类转录因子,且R2和R3的保守结构域与其他植物高度同源,系统进化树分析结果显示LsMYB7和S22亚族基因AtMYB44、AtMYB77、AtMYB73和AtMYB70聚为一类,推测LsMYB7可能与S22亚族基因有相似的功能。
本研究中,LsMYB7基因的表达与换锦花花色苷形成相关基因LsCHS、Ls4CL2和LsUFGT2的表达趋势一致,推测LsMYB7可能参与换锦花花瓣花色苷的生物合成。而LsMYB7属于拟南芥S22亚族,未见该亚族基因AtMYB44、AtMYB77、AtMYB73和AtMYB70参与花色苷的生物合成的转录调控。已有报道认为AtMYB73/44能够参与调控拟南芥对干旱胁迫的响应[25−26],而干旱胁迫可诱导植物细胞合成和积累花色苷。花色苷的光化学性质、亚细胞积累位点及在植物器官、组织中的空间分布决定了花色苷能强化植物的耐旱性,其中,花色苷提高植物细胞在干旱胁迫下的抗氧化能力可能是花色苷强化植物耐旱性的主要原因[27]。有研究表明:干旱胁迫可激活紫麦Triticum aestioum ‘Guizi 1’、甘薯Ipomoes batats等植物花色苷合成相关基因表达,通过提高花青素含量抵御干旱胁迫[28−29]。本研究中LsMYB7 基因沉默后,花色苷形成相关基因LsCHS、LsF3'H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2的表达明显下降,说明LsMYB7可能直接或间接调控花色苷的积累,而LsMYB7与S22亚族基因聚为一类,由于换锦花开花季为夏末秋初的8—9月,此时多为高温和干旱季节,因此推测LsMYB7可能通过对干旱胁迫响应来调控花色苷形成相关基因的表达,大量积累花色苷。这一研究结果与云南文山辣椒Capsicum annuum、番茄Lycopersicon esculentum的研究[30−31]相似,因此,植物可以通过干旱胁迫激活与花色苷合成相关基因的表达水平促进花色苷积累,进而提高抗旱能力。
4. 结论
本研究通过RT-qPCR获得长为951 bp 的LsMYB7 cDNA序列,开放阅读框(ORF) 825 bp,编码274个氨基酸,LsMYB7为R2R3-MYB转录因子家族,定位于细胞核,与其他植物R2R3-MYB有较高的同源性。系统进化分析表明LsMYB7和参与调控干旱等非生物胁迫响应的S22亚族基因聚为一类;LsMYB7基因主要在败花期和花色苷含量较高的H1无性系中表达,与花色苷合成相关基因的表达趋势一致;LsMYB7基因沉默后,换锦花部分花瓣明显变短,颜色变深,LsCHS、LsF3'H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2等花色苷形成相关基因的表达显著下调,因此,LsMYB7参与调控换锦花花瓣的生长发育,且通过对LsCHS、LsF3'H、LsANS、LsUFGT1和LsUFGT2花色苷形成相关基因的表达调控花色苷的积累。此外,LsMYB7可能通过响应干旱胁迫激活花青素合成相关基因表达促进花色苷积累,进而提高换锦花的抗旱能力,LsMYB7调控花色苷积累抵御干旱的机制需要进一步研究。
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表 1 变量定义与描述统计
Table 1. Definition and description of variables
项目 变量 赋值及单位 平均值 标准差 预期影响 因变量 参与林下经济经营的意愿 1代表愿意; 0代表不愿意 0.205 0.405 户主特征 年龄 周岁 56.879 8.999 - 健康状态良好 1代表是; 0代表否 0.808 0.395 ? 高中及以上学历 1代表是; 0代表否 0.188 0.391 ? 资源禀赋 林地面积 hm2 5.151 7.167 + 林地距家平均距离 km 16.067 28.781 + 家庭特征 劳动力数量 人 3.192 1.173 + 老年劳动力占比 % 22.768 31.228 ? 是否有村干部 1代表是; 0代表否 0.371 0.484 + 是否参加森林保险 1代表是; 0代表否 0.701 0.459 ? 林业收入占比 % 31.224 31.315 + 家庭收入在村中的水平 1代表较高; 2代表中等; 3代表较低 2.031 0.587 ? 说明:数据来源于实地调查。~“+”代表解释变量对因变量有正向影响,代表解释变量对因变量有负向影响,“?”代表影响方向不确定 表 2 农户不愿参与林下经济经营的主要原因
Table 2. The main reasons for households reluctant to participate in the under-forest economy
原因 比例/% 缺乏资源优势 14.45 交通不便 7.51 缺乏劳动力 55.49 缺乏资金 6.94 缺乏技术 2.89 不感兴趣 3.47 其他工作效益更高 6.36 其他 2.89 说明:数据来源于实地调查。178户不愿参与林下经济经营,其中173户对不愿发展林下经济的原因进行了回答 表 3 农户发展林下经济的政策需求分布
Table 3. Distribution of policy demand for households to develop under-forest economy
政策需求 频数/户 频率/% 政府投入 建设信息服务平台 10 4.46 发展专业合作社 5 2.23 技术推广 34 15.18 资金补贴 118 52.68 金融支持 林下经济产品抵押贷款 7 3.13 税收减免 3 1.34 贷款贴息 12 5.36 基础设施建设 通路 32 14.29 通电 0 0 通水 0 0 产品监管 开展原产地保护 3 1.34 完善标准和检测体系 0 0 合计 224 100 说明:数据来源于实地调研 表 4 回归结果
Table 4. Regression results
项目 变量 Logit Probit OLS 系数 边际效应 系数 边际效应 系数 户主特征 年龄 -0.123(0.033)*** -0.015 -0.068(0.018)*** -0.015 -0.015(0.004)*** 健康状态良好 -1.033(0.572)* -0.128 -0.598(0.326)* -0.132 -0.145(0.074)* 高中及以上学历 -1.472(0.627)** -0.182 -0.814(0.354)** -0.180 -0.146 (0.073)** 资源禀赋 林地面积 0.133(0.038)*** 0.016 0.077(0.021)*** 0.017 0.018(0.004)*** 林地距家平均距离 -0.038(0.021)* -0.005 -0.021(0.011)* -0.005 -0.003(0.001)*** 家庭特征 劳动力数量 0.062(0.179) 0.008 0.037(0.102) 0.008 0.010(0.024) 老年劳动力占比 0.020(0.008)** 0.003 0.011(0.005)** 0.002 0.002(0.001)** 是否有村干部 0.463 (0.453) 0.057 0.224(0.255) 0.050 0.042(0.059) 是否参加森林保险 1.240(0.566)* 0.154 0.714(0.323)** 0.158 0.177(0.075)** 林业收入占比
家庭收入在村中的水平
(参照组:高)0.012(0.007)* 0.001 0.006(0.004)* 0.001 0.002(0.001)* 中 -0.626(0.528) -0.089 -0.375(0.305) -0.094 -0.091(0.075) 低
(参照组:临安)-1.224(0.774) -0.155 -0.717(0.441) -0.162 -0.161(0.102) 地区 开化 -0.132(0.594) -0.020 -0.064(0.339) -0.017 -0.025(0.078) 庆元 -0.777(0.564) -0.105 -0.445(0.327) -0.105 -0.124(0.081) 龙泉 -1.613(0.634)** -0.186 -0.900(0.359)** -0.185 -0.233(0.084)*** F统计量(Prob > chi2) 0.000 0.000 0.000 Pseudo R2/R2 0.225 0.223 0.211 说明:数据来源于实地调研数据。*,**和***分别表示10%,5%和1%水平显著。括号内数值表示标准误 -
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链接本文:
https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.2018.03.020