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扦插繁殖是无性繁殖的重要技术手段之一，操作简单，应用广泛，后代很好地保持了亲本的优良遗传性状，但受母树年龄影响较大。对双色栎Quercus bicolor、使君子Quisqualis indiaca及水黄皮Pongamia pinnata 等树种的研究发现[1-3]：诱导插穗产生不定根是植物扦插成功的关键，随着母树年龄的增加，林木插穗生根能力出现下降，插穗生根率随母树年龄的增加逐渐降低[4-5]。解剖结构观察发现：不同年龄母树的插穗组织结构不同；植物开花度过幼年期后进入到成年期，是生理老化的开始，植物内部生根抑制物质增加，生根促进物质减少，再生作用降低、生活力下降[6]。一般来说，幼年期是无性繁殖采条的最佳时期。扦插生根过程中，吲哚乙酸氧化酶(IAAO)通过影响内源生长素(IAA)氧化及含量的变化来影响生根[7]，过氧化物酶(POD)活性升高被认为是诱导生根启动的信号，多酚氧化酶(PPO)在根起始阶段与酚类的代谢有关[8]。栓皮栎Quercus variabilis 是壳斗科Fagaceae栎属Quercus 植物，是中国重要的珍贵用材树种，经济和生态价值极高[9-10]。近年来，学者利用扦插繁殖对栓皮栎嫩枝扦插进行了相关研究[11-12]，但对不同母树年龄的栓皮栎扦插生根研究报道并不多。本研究以1年生、5年生及10年生栓皮栎母树的半木质化嫩枝为插穗材料，测定插穗的生根率、生根数量、根直径和根长等特征变化，观察不同时期插穗茎段的组织结构和酶活性变化，旨在揭示不同母树年龄栓皮栎不定根诱导形成的相关机制，为不同年龄栓皮栎的扦插繁殖提供参考。
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栓皮栎扦插繁殖试验在中国林业科学研究院科研温室进行。该温室顶部设有天窗和遮阳网，室内有风扇和湿帘。扦插期间室温为25~31 ℃，相对空气湿度≥85%，晴天9:00—11:00的光合有效辐射为800 μmol·m−2·s−1，二氧化碳(CO2)摩尔分数约380 μmol·mol−1[13]。试验苗床为南北走向，规格21.0 m×1.5 m，试验时间为2019年7—9月。
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2019年7月16日分别在中国林业科学研究荒漠化研究所1年生、5年生和10年生的栓皮栎母树上采集树冠中下部生长势良好、无病虫害的当年生嫩枝。将嫩枝修剪为8~10 cm的插穗，每个插穗顶端保留1~2个叶片，每个叶片保留1/3面积；每个插穗预留2~3个腋芽，插穗枝的顶端在距上端芽1 cm处平切，底端斜切。
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珍珠岩和泥炭按体积比7∶3配制成基质，用质量分数0.1%高锰酸钾灭菌后装入轻基质无纺布育苗袋中，育苗袋高9.0 cm，上下内径均为3.8 cm。
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参照ABT生根粉使用说明，以200 mg·L−1植物生长调节剂ABT-1号(北京艾比蒂生物科技有限公司)浸泡2 h处理插穗。①解剖结构观察试验。以1年生、5年生和10年生插穗为试验材料，各年龄母树的插穗设置3次重复，各重复45个插穗，共135个。②酶活性测定试验。各年龄母树的插穗设置3次重复，各重复150个插穗，共450个。③生根率统计试验。各年龄母树的插穗设置3次重复，各重复105个插穗，共315个。所有年龄处理共900个插穗，采用完全随机区组设计，在相对一致的环境下，进行统一浸泡处理。
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扦插前用小棒在基质内引孔，深度为2~3 cm。每个容器扦插1根插穗。扦插后用小棒将插穗周边的基质稍加压实，浇透水，将容器摆放在塑料托盘中。扦插完成后在插床搭建高约45 cm白色塑料薄膜拱棚，扦插基质湿度保持为55%~65%，拱棚内相对空气湿度保持为85%以上，天气晴朗时插穗上方30 cm处覆盖50%遮阳网。
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扦插60 d后，统计各处理的生根株数和每个插穗的生根数量，测量各插穗不定根的直径与长度。计算扦插生根率(%)。从各处理已生根插穗中随机抽取5个插穗，计算平均不定根数量、不定根长及不定根直径。
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栓皮栎生根过程中，扦插前进行第1次取样，每个处理随机取3根插穗，重复取样3次，取其基部2~3 cm茎段部分。10 d后再次取样，之后隔7 d取样1次，直到9月1日结束取样工作。所有样品均保存在FAA溶液(V甲醛∶V冰醋酸∶V70%酒精=1∶1∶18) 里，抽真空。常规石蜡切片，切片厚度为10~12 μm，甲苯胺蓝染色，在光学显微镜(Olympus BX51)下观察插穗基部组织结构并拍照。
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栓皮栎生根过程中，扦插前第1次取样，取其基部3~4 cm范围内的韧皮部，每次取样10根，设置3次重复，用锡箔纸包好后放入液氮中，再转移至−80℃冰箱进行保存；10 d后再次取样，之后7 d取样1次，直至9月1日结束。参考李墨野[14]和刘俊芳[15]方法测定样品PPO和POD活性，参考王小虎[16]测量IAAO活性。
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采用单因素方差分析和Duncan法进行多重比较，采用SPSS 19.0软件进行数据统计处理。
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由图1可知：栓皮栎生根部位为插穗基部，不定根从皮层长出。1年生栓皮栎嫩枝插穗在扦插17 d后发现白色不定根突出(图1A1)，31 d不定根形成(图1A2)，38 d不定根由白色发育为褐色，并出现根伸长的现象(图1A3)，44 d不定根数目增多(图1A4)。5年生栓皮栎嫩枝插穗在扦插44 d才发现白色的不定根形成(图1B4)，此前的插穗叶子长势良好，插穗顶部有愈伤组织形成。10年生栓皮栎插穗在整个实验期间未见不定根形成，且叶子逐渐干枯，部分插穗变黑，直至死亡(图1C4)。
图 1 不同年龄栓皮栎母树插穗在生根期间的外部形态
Figure 1. External morphological of mother cuttings of Q. variabilis at different ages during rooting
从表1可以看出：栓皮栎嫩枝扦插生根率及其根系特征存在明显的年龄效应。栓皮栎嫩枝扦插生根率和平均不定根数量从多到少依次均为1年生、5年生、10年生，各年龄插穗差异显著(P＜0.05)，平均不定根长和根直径从大到小依次均为5年生、1年生、10年生，各年龄插穗差异显著(P＜0.05)。
表 1 栓皮栎不同年龄母树插穗的生根情况
Table 1. Rooting of cuttings of Q. variabilis mother tree at different ages
年龄 生根率/% 平均不定根数量/条 平均不定根长/mm 平均不定根直径/mm 1年生 92.69±0.02 b 3.6±2.15 b 40.22±10.09 b 1.19±0.25 b 5年生 10.79±0.10 a 2.6±0.49 b 52.82±8.35 c 1.42±0.21 b 10年生 0 a 0 a 0 a 0 a 说明：数值为平均值±标准差，同列不同字母表示差异显著(P＜0.05) -
解剖学观察(图2)可知：插穗基部由外向内依次为表皮、皮层、厚壁组织、韧皮部、形成层及木质部等。扦插0 d时3个年龄的栓皮栎厚壁组织宽度不一，表现为5年生和10年生较大，1年生较小(图2A1、图2B1和图2 C1)。1年生栓皮栎嫩枝扦插生根约需44 d，经历诱导期—表达期—形成期—伸长期等阶段；5年生栓皮栎嫩枝扦插44 d后插穗生根才进入形成期，而10年生栓皮栎嫩枝则一直处于诱导期，未发生生根迹象。1年生和5年生栓皮栎嫩枝最终都形成了不定根，其根原基是在不定根形成后期产生，由此判断栓皮栎根原基为诱生型。1年生栓皮栎嫩枝扦插10 d时，插穗没有发现根原基的存在，处于不定根诱导期(图2A2)；扦插17 d后靠近表皮位置出现不定根，此时为不定根表达期(图2A3)；扦插31 d后不定根明显形成，此时为不定根形成期。不定根主要由靠近形成层附近的薄壁细胞分化而来，依次向外突破韧皮部、厚壁组织、皮层及表皮(图2A4)。扦插44 d后，不定根向外延伸，处于伸长阶段(图2A5)。5年生栓皮栎嫩枝扦插44 d后不定根出现，其由维管形成层附近的薄壁细胞分化而来，向外伸展，处于不定根的形成期(图2B5)。10年生栓皮栎嫩枝在整个生根过程中插穗基部的组织没有任何明显变化。
图 2 1年生、5年生及10年生栓皮栎解剖学结构观察
Figure 2. Anatomical structure of 1, 5 and 10-year-old Q. variabilis
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不同年龄栓皮栎嫩枝生根过程中的POD、PPO及IAAO活性变化规律存在差异。由图3可知：不同年龄插穗POD活性水平1年生和5年生要高于10年生；PPO活性水平从大到小依次为1年生、5年生、10年生；扦插17 d之前IAAO活性水平10年生大于5年生和1年生，17 d后从大到小依次为1年生、5年生、10年生。1年生和5年生插穗POD活性整体呈先上升后下降的单峰趋势，1年生在扦插17 d时达到峰值；5年生在扦插31 d时达到峰值，此时插穗都处于不定根的表达期(图2 A3、图2B4)。10年生插穗POD活性呈先下降后上升的趋势，在扦插17 d时达最低值。
图 3 栓皮栎扦插生根过程中酶活性变化
Figure 3. Changes of enzyme activities during the rooting process of Q. variabilis cuttings
1年生插穗的PPO活性呈先上升后下降的单峰趋势，在扦插17 d时出现峰值，此时PPO活性显著高于5年生和10年生插穗；5年生插穗的PPO活性则出现了双峰趋势，最大值出现在扦插31 d时，此时PPO活性与1年生插穗差异不显著，却显著高于10年生插穗；10年生插穗的PPO活性整体变化趋势不明显。
1年生和5年生插穗的IAAO活性整体上呈先上升后下降的单峰趋势，在扦插31 d时出现峰值，1年生IAAO活性显著高于5年生和10年生。此时1年生栓皮栎进入不定根形成期(图2 A4)，5年生进入不定根表达期(图2 B4)。10年生插穗IAAO活性整体变化呈现先下降后上升趋势。
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本研究发现：1年生和5年生栓皮栎扦插均产生了不定根，10年生无不定根；插穗生根率从高到低依次为1年生、5年生、10年生，且差异显著。可见植物插穗的母树年龄越小，不定根形成时间越短，生根率也越高。原因可能是母本年龄越小，代谢更加活跃，酶活性含量会增加，POD活性增加有利于增加细胞壁的强度[17]，能更好地抵御病原体入侵，有助于插穗生根，这与十月樱Prunus subhirtella ‘Autumnalis’和夏栎Quercus robur的研究类似[4, 18]。母树年龄越大，插穗的组织分化程度会更高，进行再分化的能力下降[19]；而随着年龄增加，韧皮纤维厚度会加大，韧皮纤维细胞壁厚，会增加生根的机械阻力[20]，这些都会影响不定根的生成。
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对插穗组织解剖结构的观察发现：栓皮栎的不定根根原基是在生根过程中形成的，由此判定栓皮栎根原基类型为诱生型。通常来说，诱生型根原基的出现需要一定时间，导致植物插穗难以生根[20]，这可能是栓皮栎插穗生根难的原因之一。栓皮栎插穗的皮层和韧皮部间存在连续的环状厚壁组织，观察发现5年生和10年生厚壁组织的宽度大于1年生，这可能也是造成栓皮栎5年生和10年生生根率低的原因。在沙棘Hippophae rhamnoide[21]及冬青llex×altaclerensis ‘Belhica Aurea’[22]扦插繁殖过程中也发现厚壁组织的存在和生根率不高存在一定相关性。
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POD、PPO和IAAO的活性与不定根形成关系密切[7]。扦插前POD活性升高，可以保护插穗免受活性氧自由基的侵害[12]。高活性POD有利于细胞分化产生不定根[23]，1年生和5年生插穗在不定根表达期POD活性出现峰值，使得插穗内的IAA含量降低，从而有助于不定根的形成[24]。随后POD活性开始下降，至不定根伸长期后又开始升高。10年生插穗则出现先下降后上升的趋势，其POD活性在扦插下降，预示其对插穗保护效果下降，自由基及活性氧对插穗细胞侵害加大，不利于不定根的形成。
PPO可以催化酚类物质，在根原基诱导和发育过程中起至关重要作用[25]。本研究中1年生栓皮栎生根过程中PPO活性呈单峰趋势，在扦插17 d(不定根表达期)出现峰值，此时高活性的PPO有助于催化酚类物质与IAA形成生根辅助因子“IAA-酚酸复合物”，以此促进生根[26-27]。5年生栓皮栎生根过程PPO活性水平呈双峰趋势，扦插31 d(形成期)，峰值明显大于扦插第10 d(诱导期)。诱导期(10 d)时插穗的切口暴露在外，高水平PPO活性可降低其被细菌侵害的可能[28]；至不定根形成期(31 d)，插穗需要更高的PPO活性来形成生根辅助因子促进生根。10年生的PPO活性整体趋势变化不明显，这可能是其难生根的原因。
IAAO通过调节内源IAA的水平来影响不定根的形成。1年生和5年生IAAO活性均呈现单峰趋势，且1年生的IAAO活性显著高于5年生。IAAO活性升高有助于消除插穗体内多余的IAA[29]，利于生根诱导[30]。10年生插穗IAAO的酶活性整体上趋势变化不大，并且在31 d出现下降的趋势，使得IAAO活性降低，内源IAA水平过高，导致生根率低。
总体上，1年生和5年生插穗在不定根表达期不定根开始形成，这时的POD和PPO活性最高；1年生IAAO活性低，5年生IAAO活性偏高，导致插穗体内IAA被大量降解，最终影响生根率。同时，ABT属于外源激素，对内源激素也会产生影响，所以IAAO活性也会受到一定影响。
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母树年龄影响插穗不定根的生成，栓皮栎嫩枝扦插生根率和平均不定根数量从高到低依次为1年生、5年生、10年生，平均生根率1年生为92.69%，5年生为10.79%，10年生为0。栓皮栎的生根类型为皮部生根型，其根原基属于诱生型根原基，不定根主要由靠近形成层附近的薄壁细胞分化而来，最终突破韧皮部、厚壁组织、皮层及表皮向外伸长，但皮层与韧皮部中间存在的连续环状厚壁组织对不定根的形成有一定的阻碍作用。POD活性增加有利于增加细胞壁强度，使植物能更好地抵御病菌，有助于插穗生根；PPO活性增加能促进生根辅助因子“IAA-酚酸复合物”的形成，IAAO活性增加有助于减少体内IAA含量，较低质量浓度的IAA有助于促进生根；栓皮栎插穗1年生和5年生POD、PPO及IAAO活性整体呈现“先上升后下降”趋势，POD和PPO活性升高有利于不定根的表达，IAAO活性升高有助于不定根的生成。
Rooting, anatomical analysis and changes of enzyme activity of softwood cuttings of Quercus variabilis at different ages
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摘要:
目的 探讨母树年龄对栓皮栎Quercus variabilis嫩枝扦插生根的影响，解析其可能成因，为栓皮栎扦插繁殖提供依据。 方法 以1年生、5年生和10年生栓皮栎母树的半木质化嫩枝为材料，用200 mg·L−1 生根粉(ABT-1号)浸泡处理2 h。扦插60 d后，测定各插穗生根率、生根数量、根直径、根长及多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)及吲哚乙酸氧化酶(IAAO)活性；采用石蜡切片法观察不同年龄插穗茎段的组织结构变化。 结果 ①母树年龄越大，嫩枝扦插生根率越低。②栓皮栎不定根根原基在不定根形成后期被诱导；不同年龄插穗产生不定根时间存在差异，1年生为17 d，5年生为44 d，10年生未产生不定根。③1年生和5年生母树的插穗中IAAO、PPO和POD这3种酶活性总体呈“先上升后下降”的单峰趋势，10年生母树的插穗POD活性总体呈增加趋势，PPO和IAAO活性变化不明显。 结论 母树年龄影响插穗不定根的生成，栓皮栎嫩枝扦插生根率和平均不定根数量从高到低依次为1年生、5年生、10年生，1年生平均生根率为92.69%，5年生的平均生根率为10.79%，10年生的为0。栓皮栎的生根类型为皮部生根型，其不定根原基类型为诱生根原基。高水平POD、PPO活性有助于不定根的诱导，IAAO活性升高有助于不定根的形成。图3表1参30 Abstract:Objective This study aims to explore the effect of mother tree age on the cutting rooting of Quercus variabilis as well as the possible causes, so as to provide basis for the cutting propagation of Q. variabilis. Method The semi-lignified shoots of 1, 5 and 10-year-old oak mother trees were soaked with 200 mg·L−1 root powder (ABT-1) for 2 h. The rooting rate, rooting number, root diameter, root length and activities of polyphenol oxidase (PPO), peroxidase (POD) and IAA-oxidase (IAAO) were determined after 60 d. The changes of tissue structure of stem segments of cuttings at different ages were observed by paraffin sectioning. Result (1) The older the mother tree was, the lower the cutting rooting rate was. (2) The adventitious root primordium of Q. variabilis was induced in the late stage of adventitious root formation. The adventitious root generation time of cuttings at different ages was different (17 d for trees of 1 year old , 44 d for 5 years old, and none for 10 years old). (3) The activities of IAAO, PPO and POD in the cuttings of 1-year-old and 5-year-old mother trees showed a single-peak trend of ‘first increasing and then decreasing’, while the activities of POD in the cuttings of 10-year-old mother trees showed an increasing trend. The activities of PPO and IAAO did not change significantly. Conclusion The age of mother trees affects the generation of adventitious roots of cuttings. The rooting rate and the average adventitious root number of Q. variabilis softwood cuttings from high to low are trees of 1 year old, 5 years old and 10 years old, with an average rooting rate of 92.69%, 10.79%, and 0, respectively. The rooting type of Q. variabilis is dermal rooting type and its adventitious root primordium is induced root primordium. High levels of POD and PPO activity are conducive to adventitious root induction, while increased IAAO activity is conducive to adventitious root formation. [Ch, 3 fig. 1 tab. 30 ref.] -
Key words:
- Quercus variabilis /
- cutting /
- age effect /
- rooting rate /
- anatomical structure /
- enzyme activity
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陆地棉Gossypium hirsutum是主要的经济作物之一，在经济发展过程中占有重要地位。而今因优质耕地面积减少导致的粮棉争地问题日益突出，中国陆地棉产区又整体呈现西北内陆棉区面积不断扩大，黄河、长江棉区面积持续减少的趋势[1]。在西北内陆地区栽培早熟棉能充分发挥其可晚播的特点，减少因早春干燥、降温，以及晚霜等原因造成的育苗病虫害，降低杀虫剂施用量[2]，增加霜前开花率并改善陆地棉品质[3]。因此，筛选早熟棉对提高耕地利用效率具有重要意义[4]。
植物从生理生长转向生殖生长的过程为开花[5]，受环境激素影响[6]，目前较为广泛的调控开花途径是光周期途径、春化途径、自主途径及年龄途径等[7]。自主及春化途径主要通过开花抑制基因FLC位点进行[8]，FLC调控FT和SOC1抑制开花[9]，受光周期途径正向调控[10]，可被FLD等通路抑制[11]。光周期靠CO/FT表达改变模式[12]。CO是光周期的核心基因[13]，其蛋白有2个锌指结构域正向调控FT[14−15]，N端蛋白控制光稳定，C端CCT区域用于核定位[16]。对拟南芥Arabidopsis thaliana研究表明：CCA1/LHY在TOC1上游调控光形态建成抑制其节律[17−18]。激活CCA1/LHY和TOC1翻译组蛋白可调控昼夜节律[19]。RVE8/LCL5也可通过结合TOC1启动子调节昼夜节律[20]，节律核心基因限制TOC1的降解[21]。TOC1和CCA1的mRNA转录水平受Hesp调控[22]。
PRR亚家族成员是生物钟重要组分。中心环CCA1和LHY通过结合启动子负调控TOC1(APRR1)[23]。CCA1和LHY是PRR9、PRR7的正调控因子[24]，也可能是PRR5的正调控因子。3个PRR基因通过结合启动子负调控CCA1和LHY[25]。PRR5促进TOC1积累使其稳定[26]，PRR3和PRR5阻断TOC1与ZTL互作使其稳定[24]。对玉米Zea mays研究表明：PRR家族成员参与包括光响应在内的多种信号传导[27]。对大豆Glycine max研究表明：PRR家族CCT结构缺失与无意义突变影响开花时间[28]。对大白菜Brassica pekinensis[29]、大豆突变体[30]研究也表明：TOC1可控制早花，参与非生物胁迫应答[31]。
陆地棉中开花相关基因大多数属于光周期和生物钟相关途径[32]。前人对陆地棉中光周期通路CO[33]、FT[34]，赤霉素途径FPF1[35]、SPL3[36]和部分MADS-box[37−38]家族基因进行研究，说明研究开花通路相关基因具有重要意义。结合生物信息学分析的基因功能研究有助于更好地理解基因功能[39−40]。本研究将从陆地棉群体高密度遗传图谱[41]及数量性状基因座(QTL)定位[42]中发掘陆地棉中拟南芥TOC1(APRR1)的同源基因GhPRR9进行家族分析和功能验证，预测GhPRR9的结构及可能行使的功能，并对GhPRR9功能加以验证，为培育早熟棉提供一定的理论参考。
1. 材料与方法
1.1 生物信息学分析
陆地棉全基因组数据下载于Cottongen[43]，拟南芥全基因组数据下载于TAIR[44]，水稻Oryza sativa、草棉Gherbaceum、可可Theobroma caca、玉米、大豆、毛果杨Populus trichocarpa基因组数据下载于Phytozome[45]。
根据拟南芥PRR亚家族的定义，在Pfam上获得CCT (PF06203)和REC (PF00072)结构域隐马模型，用HMMER扫描整个陆地棉基因组取交集，利用在线工具[46]鉴别所筛选出的基因是否同时包含CCT和REC结构域，最终得到GhPRR家族基因成员。使用ExPASY网站[47]分析工具和WoLF对家族成员进行蛋白理化性质分析。
用MEGA[48]对8个物种的PRR亚家族蛋白进行多序列比对，邻接法JJT模型构建系统进化树，校验重复100次。用DNAMAN进行保守序列比对和绘制。
利用TBtool[49]软件制作染色体定位图和domain结构；使用MEME[50]网站分析家族成员所含Motif并进行可视化。使用Plant Care[51]分析GhPRR亚基因家族上游2 000 bp顺式启动子元件，使用TBtools进行可视化。在美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中下载陆地棉相关的表达数据(序列号：PRJNA490626，编号：490626)，用TBtools绘制热图。
1.2 拟南芥阳性植株构建
提取陆地棉标准系‘TM-1’花蕾RNA，并用试剂盒(CAT#037A)反转录得到底物。使用Primer 5设计引物并扩增目标片段。使用TaKaRa纯化试剂盒(9761)纯化片段，pMD18-T Vector Cloning Kit (CAT# 6011)连接T载。热激法转化DH5α感受态菌株，活化涂板后挑单菌落进行菌液PCR分析，选取合理条带单克隆测序。
以T载为模板克隆片段并连接至过表达载体，热激转化农杆菌Agrobacterium tumefaciens GV3101，筛选阳性单克隆后取带花序的健康拟南芥提前剪下角果。浸入活化农杆菌液侵染1 min，沥干后黑暗1 d正常培养，收集种子为T0代。消毒播种T0代种子至相应抗性培养基上，其中，正常生长幼苗转入正常条件培养。筛选并验证拟南芥的阳性植株，成熟后收取T1代种子，如此培养至T3代。
1.3 启动子分析及GUS染色
从陆地棉基因组中提取GhPRR9起始密码子上游2 000 bp片段并预测顺式启动子元件。从陆地棉标准系‘TM-1’叶片DNA中分别克隆以起始编码为原点，长500、1 000、1 500和2 000 bp的片段，XcmⅠ酶切链接载体pCXGUS-P，热激法转入大肠埃希菌Escherichia coli，测序无误后将质粒转入农杆菌中侵染拟南芥得到种子。在卡那霉素培养基上播种筛选阳性植株培养至开花，取相关组织染色并观察。
1.4 烟草瞬时转化
将完成转化的表达载体以及绿色荧光蛋白(GFP)空载体通过热激法转入农杆菌菌株GV3101。培养后离心收集菌体重新悬浮，注射幼嫩烟草下表皮。注射后的烟草黑暗培养1 d后恢复正常光照周期。取下表皮制成临时切片，在激光共聚焦显微镜(LSM880)下观察记录影像。
1.5 实时荧光定量PCR (RT-qPCR)分析
相对定量使用2−ΔΔCt法，内参基因为GhHistone3 (陆地棉)和AtUBQ5 (拟南芥)。扩增程序为95 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。
陆地棉时空表达分析取样：选取4个品种陆地棉材料的不同器官组织，每个品种20株随机取样，混合研磨。日周期节律分析：取三叶期的陆地棉标准系‘TM-1’植株，在人工气候室中培养1周后，隔4 h取1次顶芽，重复3株混样研磨。
1.6 病毒诱导沉默(VIGS)株系的构建
用SGN VIGS Tool设计最佳VIGS片段。以测序正确的T载为模板进行扩增，SpeI和AscI酶切位点链接到pCLCrVA载体并转化至农杆菌LBA4404中。pCLCrVA-GhPRR9、pCLCrVA、pCLCrVA-PDS重悬液分别与pCLCrVB的重悬液按体积比1∶1混合均匀。
选取子叶完全展平，第1片真叶尚未完全显形的健康植株进行注射。侵染后的陆地棉设置辅助对照、沉默株、烟草花叶病毒株和空白对照植株，避光培养1 d后转入正常光照培养至开花，记录现蕾开花时间。
2. 结果与分析
2.1 陆地棉GhPRR亚家族基因特性分析
2.1.1 陆地棉GhPRR亚家族成员鉴定及定位分析
在陆地棉全基因组中共鉴定到14个PRR亚基因家族成员，分别命名为GhPRR1~GhPRR14 (表1)。理化性质分析显示：PRR亚家族成员蛋白有552~775个氨基酸，相对分子量为60.76~85.30 kDa，平均等电点为6.77，酸性蛋白8个，碱性蛋白6个。亚细胞定位结果显示：有11个蛋白定位于细胞核中，2个定位于叶绿体，1个定位于内质网。
表 1 GhPRR亚家族蛋白理化性质Table 1 Physicochemical properties of protein in GhPRR subfamily蛋白名称 染色体位置 等电点 分子量/kDa 氨基酸/个 亚细胞定位 亲水性 GhPRR1 ChrA03 5.49 53.53 487 细胞核 −0.876 GhPRR2 ChrA05 7.32 76.62 696 细胞核 −0.725 GhPRR3 ChrA05 8.07 81.80 743 叶绿体 −0.738 GhPRR4 ChrA05 8.55 60.76 552 细胞核 −0.834 GhPRR5 ChrA09 6.33 73.66 669 内质网 −0.592 GhPRR6 ChrA11 6.53 68.72 625 细胞核 −0.565 GhPRR7 ChrA11 5.16 73.11 665 细胞核 −0.688 GhPRR8 ChrA11 6.84 82.54 750 细胞核 −0.689 GhPRR9 ChrD03 5.66 61.96 563 细胞核 −0.743 GhPRR10 ChrD09 7.11 85.30 775 叶绿体 −0.677 GhPRR11 ChrD11 7.56 70.20 638 细胞核 −0.692 GhPRR12 ChrD11 5.62 72.77 661 细胞核 −0.622 GhPRR13 ChrD11 7.91 76.08 691 细胞核 −0.680 GhPRR14 ChrD12 6.67 70.92 645 细胞核 −0.742 用TBtools绘制出染色体定位图(图1A)，可观察到GhPRR家族基因保守分布在染色体两端，14个成员分布在8条染色体上，A亚族8个，D亚族6个，其中Chr A05、Chr A11、Chr D11染色体上分别拥有3个该家族的基因，其余染色体均为1个，表明GhPRR亚家族在陆地棉AD亚基因组上呈现不完全均匀分布。
图 1 陆地棉GhPRR亚家族成员定位及多重序列对比Figure 1 Mapping and multiple sequence comparison of GhPRR subfamily members in cotton2.1.2 陆地棉GhPRR亚家族进化树及蛋白序列对比
从水稻、拟南芥、玉米、草棉、可可、大豆、毛果杨中分别鉴定出5、6、9、9、24、35、49个PRR亚家族成员，与陆地棉GhPRR亚家族成员蛋白构建系统进化树(图1B)。聚类结果显示：陆地棉GhPRR亚家族进化关系最接近的物种是草棉和可可。不同物种中该基因家族成员的数量差异较为明显，也体现出PRR家族成员在不同物种中的多样性。
多重序列比对(图1C)显示：陆地棉GhPRR亚家族蛋白共有4处位点保守性较强，其中有2个高度保守的g位点，说明该家族拥有2段特征结构域(REC与CCT)。
2.1.3 陆地棉GhPRR亚家族成员结构分析
蛋白结构分析显示：14个蛋白均含有CCT结构域(图2A)。GhPRR6、GhPRR1、GhPRR2、GhPRR4、GhPRR8和GhPRR13含有REC超家族结构域(cl19078)，其余成员含有psREC_PRR结构域(cd17852，属cl19078超家族)，亚家族成员有一定的保守性，REC结构域主要功能为核酸识别，CCT结构域主要标志转录因子，以上2个结构的保守性显示了该家族成员的功能。
图 2 陆地棉GhPRR亚家族成员结构(A~D)及时空表达量(E~F)分析Figure 2 Structure (A－D) and spatiotemporal expression (E－F) of GhPRR subfamily members in cottonMEME分析共得到5个保守基序(图2B)。除GhPRR5外其余成员均含有Motif 2和Motif 5。GhPRR1仅有Motif 1，没有Motif 3和Motif 4，GhPRR4没有Motif 1、Motif 3和Motif 4，其余成员都拥有Motif 1、Motif 3和Motif 4。
基因结构(图2C)显示：该亚家族成员GhPRR1外显子最少(5个)，GhPRR2最多(11个)，其中，5个成员有8个外显子，3个成员有9个外显子，2个成员有7个外显子，2个成员有6个外显子。最长外显子在3′端较为保守，结构相似度和进化关系基本一致。
2.1.4 陆地棉GhPRR亚家族启动子顺式元件分析
使用Plant Care对陆地棉GhPRR亚家族成员上游2 000 bp顺式启动子元件进行分析(图2D)发现：主要存在三类顺式元件，一是生长发育响应元件，如光响应元件、生物钟控件；二是激素响应元件，如赤霉素、脱落酸等响应元件；三是非生物胁迫元件，如逆境、盐胁迫等响应元件。其中光响应元件最多(184个)，其次为赤霉素响应元件(28个)。说明该亚家族成员主要参与光响应和赤霉素通路。
2.1.5 陆地棉GhPRR亚家族成员表达分析
利用公开的转录组数据对陆地棉GhPRR亚家族成员进行组织表达分析(图2E)发现：不同成员组织表达水平差异较大。其中茎叶和花药中表达量最高的是GhPRR4，最少的分别是GhPRR8、GhPRR3和GhPRR2。GhPRR13和GhPRR9在花丝、花苞、花萼中表达量较高，GhPRR2和GhPRR6最少。根中GhPRR13表达量最多，GhPRR7最少，雌蕊花托中GhPRR13表达量最高，GhPRR12和GhPRR2最少。GhPRR4、GhPRR11和GhPRR6可能主要作用于维管组织，GhPRR13和GhPRR9可能作用于花器官组织。
时间表达模式分析(图2F)显示：除GhPRR7、GhPRR12、GhPRR2、GhPRR3和GhPRR10外，GhPRR亚家族其他成员表达量均呈现开花前3 d至开花后1 d逐渐增加，开花后3~5 d逐渐降低的趋势，说明其可能集中在开花前和开花时发挥作用。GhPRR7主要作用在开花后5 d及之后，GhPRR12和GhPRR2可能较少参与开花过程。胚珠中GhPRR13表达量在第10天达到顶峰，说明它在胚珠发育前期可能发挥着一定的作用，GhPRR10、GhPRR5、GhPRR9、GhPRR18、GhPRR3、GhPRR4和GhPRR14也呈现相似的趋势，说明这些基因可能拥有类似的作用模式。纤维发育期间，GhPRR13、GhPRR10和GhPRR4表达量较高，说明这些基因可能参与纤维发育调控。时间模式上，GhPRR13在10~25 d纤维中表达量持续下降，而GhPRR10和GhPRR4则表现出持续上升的趋势，可知GhPRR10和GhPRR4可能参与纤维发育的后期调控，而GhPRR13则参与早期的纤维发育调控。丰富的时空表达说明陆地棉GhPRR家族成员广泛参与到开花前后、胚珠和纤维的发育过程中。
2.2 GhPRR9基因启动子和表达特性分析
使用Plant Care在线工具对该基因上游2 000 bp进行启动子顺式元件分析(表2)，发现拟南芥AtTOC1的同源基因GhPRR9上存在着大量的光响应元件，说明光对该基因的转录有着重要的调控作用。除此之外，在GhPRR9基因的启动子区域还存在茉莉酸等激素响应元件，说明该基因可能参与激素相关通路的调节。
表 2 GhPRR9启动子顺式元件预测Table 2 Cis-acting element prediction of GhPRR9 promoter名称 起始位置/bp 所在链 功能 名称 起始位置/bp 所在链 功能 ARE 43 − 厌氧胁迫响应 TATA-box 635 − 核心元件 P-box 1 121 − 赤霉素响应 TATA-box 636 − 核心元件 G-box 167 + 光响应 Sp1 1 057 − 光响应 G-box 1 070 + 光响应 G-Box 1 009 − 光响应 A-box 882 − 顺式调节 ABRE 168 + 脱落酸响应 TCCC-motif 871 + 光响应 TGACG-motif 878 + 茉莉酸响应 CAAT-box 249 + 增强区域 TGACG-motif 1 991 − 茉莉酸响应 CAAT-box 354 + 增强区域 Box Ⅱ 1 007 − 光响应 AE-box 535 − 光响应 Box 4 419 + 光响应 GATA-motif 710 + 光响应 MRE 1 513 − 光响应MYB结合 ATCT-motif 1 343 − 光响应 CGTCA-motif 878 − 茉莉酸响应 TATA-box 634 − 核心元件 对陆地棉标准系‘TM-1’进行荧光定量分析(图3A)表明：GhPRR9在花丝、萼片、花托中表达量较高，叶片最低，表明GhPRR9可能更多参与陆地棉的生殖生长。
图 3 基因GhPRR9的时空表达量、亚细胞定位和启动子染色Figure 3 Spatial and temporal expression of GhPRR9 gene, subcellular localization and promoter staining对在人工光照条件下陆地棉三叶期标准系‘TM-1’顶芽隔4 h取样并进行荧光定量分析(图3B)表明：GhPRR9在光照开始后逐渐积累，并在中午达到顶峰，之后慢慢下降，在光周期内的表达呈现出一定的周期性。
进一步对GhPRR9早熟品种‘中50’‘ZHONG 50’、‘中58’‘ZHONG 58’和晚熟品种‘TM-1’、‘豫棉21号’‘YM21’的表达量分析发现：GhPRR9在早熟品种中表达量显著高于晚熟品种(图3C)，说明GhPRR9和早熟性状呈正向相关。
将未转化的GFP质粒和35S::GhPRR9-GFP质粒分别转入农杆菌GV3101，并侵染烟草叶片组织，制作表皮切片置于激光共聚焦显微镜下发现：对照组分布于整个细胞中，而GFP融合蛋白荧光仅分布于细胞核(图3D)。
截取GhPRR9不同长度的启动子与携带GUS报告基因的质粒进行重组，分别转入农杆菌GV3101后通过沾花法侵染拟南芥，获得纯合转基因株系染色观察，结果显示上游500 bp启动子几乎没有表达(图3E)，而上游2 000 bp的启动子着色程度最深，说明GhPRR9启动子上游500~2 000 bp内可能存在关键调控元件诱导基因的表达。
2.3 GhPRR9在拟南芥中的功能分析
将拟南芥GhPRR9过表达株系培养至抽薹，并观察表型性状(图4A)发现：过表达株系GhPRR9表达量比野生型明显提高(图4B)，且转基因过表达株系连座叶数量明显减少(图4C)，抽薹时间和开花提前(图4D和图4E)，首花抽薹高度极显著矮于野生型(图4F，P＜0.01)，说明GhPRR9正向调控植物的早花性状。过表达GhPRR9能促进开花关键基因LFY与FT表达(图4G和图4H)，表明GhPRR9也可能通过影响关键基因表达调控通路进而影响开花时间。
图 4 拟南芥过表达株系的表型及表达量Figure 4 Phenotype and expression levels of A. thaliana overexpressed strains2.4 病毒诱导(VIGS)的GhPRR9基因沉默实验
对VIGS沉默株系进行表达量检测发现：沉默株系中，GhPDS株系出现白化表型(图5A)，且GhPRR9的表达量极显著降低(图5B，P＜0.01)，表明GhPRR9基因成功得到了沉默。与对照株系相比，沉默株系现蕾时间延迟约3~4 d，开花时间延迟约2~5 d，表明沉默GhPRR9可推迟开花时间，反向证明其调节陆地棉早花的功能。
图 5 陆地棉病毒诱导(VIGS)植株的表型及影响Figure 5 Phenotype and effect of G. hirsutum virus induced silencing (VIGS) plants3. 讨论
本研究共鉴定出陆地棉14个GhPRR亚家族成员，成员含有CCT和REC保守结构域，说明其行使转录因子功能。转录组分析显示：大部分成员主要在开花前的茎叶、纤维发育后期和胚珠发育中期发挥作用，表明大部分成员可能存在功能冗余或协同拮抗作用。启动子元件分析显示：陆地棉GhPRR亚家族可能频繁地参与光感效应相关的生理过程，这与在拟南芥的结果中一致，据此可推测其与拟南芥同源基因作用相似。进化分析表明：陆地棉GhPRR亚家族成员基因数量多于拟南芥。前人研究也发现：棉花基因组进化加倍使该家族基因得到了扩增[52]。
对过表达株系研究发现：抽薹日期、开花日期都稍有提前，抽薹高度显著高于同期野生型植株，证明GhPRR9可以使拟南芥花期提前。构建GFP表达载体侵染烟草叶片，表明GhPRR9蛋白定位于细胞核，与生物信息学分析相互印证，进一步确认该基因行使转录因子的功能。对GhPRR9基因1 d内表达水平分析显示：光暗交替条件下基因表达量存在着周期性变化，按照其表达模式推断该基因在光照开始后积累，中午达到顶峰后慢慢下降，这与拟南芥同源基因的表达模式[53]相似，据此推测，陆地棉早花基因GhPRR9可能与拟南芥中的同源基因行使着类似的功能。陆地棉三叶期叶片的基因表达量结果显示：GhPRR9基因在早熟种中表达量高于晚熟种，据此可推断其与早熟性状有正向关联。构建VIGS株系发现：沉默株系高度降低，生育期推迟，反向证明了其促进生育期的功能。启动子分析显示：光和赤霉素可能影响该基因的转录。GUS染色结果显示：启动子上游500~2 000 bp可能存在关键调控元件。有研究显示：陆地棉转录因子与通路主要基因启动子的结合可随温度产生变化[54]，且同源转录因子可能存在相互调控的作用[55]。
4. 结论
本研究预测了陆地棉GhPRR亚家族的功能和作用模式，找到拟南芥早花基因AtTOC1的陆地棉同源基因GhPRR9，并成功克隆，构建遗传转化株系对其功能进行验证显示：GhPRR9对早花性状存在正向促进作用。
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图 1 不同年龄栓皮栎母树插穗在生根期间的外部形态
Figure 1 External morphological of mother cuttings of Q. variabilis at different ages during rooting
图 2 1年生、5年生及10年生栓皮栎解剖学结构观察
Figure 2 Anatomical structure of 1, 5 and 10-year-old Q. variabilis
图 3 栓皮栎扦插生根过程中酶活性变化
Figure 3 Changes of enzyme activities during the rooting process of Q. variabilis cuttings
表 1 栓皮栎不同年龄母树插穗的生根情况
Table 1. Rooting of cuttings of Q. variabilis mother tree at different ages
年龄 生根率/% 平均不定根数量/条 平均不定根长/mm 平均不定根直径/mm 1年生 92.69±0.02 b 3.6±2.15 b 40.22±10.09 b 1.19±0.25 b 5年生 10.79±0.10 a 2.6±0.49 b 52.82±8.35 c 1.42±0.21 b 10年生 0 a 0 a 0 a 0 a 说明：数值为平均值±标准差，同列不同字母表示差异显著(P＜0.05) 
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