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扦插育苗是将离体植物营养器官如根、茎（枝）、叶等插入基质中，利用植物的再生能力，经过人工培育使之发育成完整新植株的繁育方法。扦插育苗方法简单，取材方便，能够保持母本优良性状并实现快速批量繁殖，是木本植物的重要繁育方法之一，但很多树种因生根困难而无法利用扦插进行繁殖[1]。以往扦插育苗主要应用于较易生根的树种，近年来针对难生根树种的生根机制和生根技术等方面开展了大量研究，发现通过插穗消毒处理、流水冲洗生根抑制物质、黄化处理及激素处理、调控环境温湿度等技术措施[2]，能够大大提高难生根树种的扦插生根率。生物磁学（biomagnetism）是研究外磁场对生物体的影响以及生物磁性与生命活动关系的磁学和生物学相互渗透的新兴交叉学科。随着生物磁学在农业、医学、环保、食品以及生物工程等领域的广泛应用，生物磁学已经得到国内外各领域专家的重视，这为揭示生物磁学机制提供了有利的证据。研究发现磁化处理能够促进种子萌发[3]、提高作物产量[4]、促进植物细胞分裂[5-6]、对植物的生理生化反应也有一定的影响[7-11]。目前，磁化处理对于木本植物扦插生根的相关研究却很少见，在促进难生根树种生根、根系发育和扦插苗生长及生理特性方面，仍需做大量研究工作。绒毛白蜡Fraxinus velutina具有抗旱、耐涝、耐盐碱、速生、材性好、树姿美观等特点，广泛用于盐碱地造林和城乡园林绿化。绒毛白蜡优良无性系‘鲁蜡5号’Fraxinus velutina ‘Lula-5’耐旱性强、生长迅速、观赏价值高，然而由于其扦插繁殖困难，限制了该优良品种的快速繁育和大面积推广应用。本研究采用磁处理技术对绒毛白蜡新品种插穗进行处理，以探讨磁处理技术在难生根树种扦插育苗中的应用前景。
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试验材料为绒毛白蜡优良无性系‘鲁蜡5号’，采自山东省济南市德林种苗有限公司3年生采穗圃。2015年8月下旬取采穗母树上无病虫害的当年生半木质化健壮新梢，剪取插穗长度12~15 cm，粗度1.0~1.2 cm，在芽上1 cm剪成平口，下切口剪成马耳形，保持切口平滑。保留2叶片并剪成半叶，将插穗在质量浓度为1.0 g·L-1高锰酸钾溶液中消毒0.5 h，然后将插穗基部浸泡在200 mg·L-1的吲哚丁酸（IBA）溶液中4 h。选用珍珠岩作为基质，扦插前5 d喷淋质量浓度为0.5%的高锰酸钾溶液消毒，用黑色塑料薄膜覆盖3 d后揭开薄膜，待药剂挥发后扦插。扦插棚为智能控制温湿度的联栋大棚。
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试验设置磁化水喷淋（MW）+磁化毯（MR），磁化水喷淋（MW）和对照（ck，清水喷淋）3个处理，重复4次，扦插100株·小区-1。其中：① 喷淋处理：采用PP-25-ADS-600型磁化水处理器（Φ=25 mm，磁场强度为600 T，水流量为6 m3·h-1）处理的磁化水对插床进行喷淋处理，所用喷淋水为饮用自来水；② 磁化毯处理：将磁场强度为300 T的磁化毯铺设在扦插基质下方25 cm处，插穗下端高于磁化毯5 cm。设定棚内温度为25~27 ℃，相对湿度（85±5）%，自动控制喷淋。喷头采用十字雾化喷头（KL3073）。扦插后每7 d采样1次，随机抽样10株·处理-1，观察插穗生根进程及生长状况（在愈伤组织形成以后至生根以前，适当加大观测密度，以确定不定根产生的准确时间）。扦插90 d，调查各处理所有材料的生根率、根系特征及生长量、新梢及叶片生长量。
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11月中旬，采用冲洗法将全部扦插苗整株取出，统计生根率，新梢高，茎、叶片生长量。随机抽样扦插苗10株·处理-1，去离子水冲洗根系表面残留物，将每个插穗构型完整的根系，按照PREGITZER等[12]的方法对根系进行分级，即将根系最外端的细根定为1级根，其母根为2级根，2级根的母根为3级根。将各级根序细根放入装有去离子水的培养皿中并进行编号，用根系分析仪Winrhizo（德国）测定各级根序细根长度、直径、表面积和体积，计算根系效果指数[13]。将各处理植株置于103 ℃烘箱中杀青10 min后80 ℃烘干至恒量，测定单株根系干质量。将烘干的根系及新梢分别研磨过100目筛，采用张志良等[14]的方法测定可溶性糖，凯氏定氮法测定总氮，采用燃烧氧化法用总碳分析仪（Elementar Vario，德国）测定总碳含量。
根系效果指数I=（L×M×R）/N。其中：L为插穗平均根长，M为插穗根系数量，R为插穗生根率，N为生根插穗数。
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利用统计软件SAS 9.2，Excel 2016对数据进行分析，采用Duncan多重比较法（Duncan’s multiple-range）进行处理间差异性分析。生根率百分数经过反正弦转换。
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由表 1可知：MW+MR处理的绒毛白蜡嫩枝扦插生根率最高，达到84.2%，MW为60.4%，分别比ck高60.7%和36.9%，差异极显著（P＜0.01）；扦插后第10天分别随机抽取10株发现，MW+MR处理有4株出现愈伤组织，MW和ck分别只有2株和1株出现愈伤组织；MW+MR处理在扦插后15 d出现不定根，MW不定根出现于19 d，ck则在扦插后25 d左右才出现不定根；MW+MR处理的插穗根系干质量相对较大（0.090 g），高于MW及ck，差异极显著（P＜0.01）；MW+MR处理的根系含水量比ck高0.516 g，MW比ck高0.284 g，差异极显著（P＜0.01）。不同处理根系效果指数比较，MW+MR及MW处理根系效果指数均高于ck，而MW+MR比MW高0.577，说明磁化毯能够促进插穗生根。
表 1 扦插后不定根出现期、成活率、根干质量、根含水量和根系效果指数的比较
Table 1. Comparison of different treatment on rooting date, rooting rate, root drought weight, root water contet and root effect index
处理 不定根出现期/d 生根率/% 根干质量/g 根含水量/g 根系效果指数 ck 25 23.5 ± 1.594 C 0.062 ± 0.002 C 0.510 ± 0.057 B 0.410 MW 19 60.4 ± 2.838 B 0.081 ± 0.005 B 0.782 ± 0.077 AB 0.987 MW+MR 15 84.2 ± 2.341 A 0.107 ± 0.005 A 0.996 ± 0.100 A 1.567 说明:数据为3次测定的平均值±标准误, 同列中不同大写字母表示处理间的差异达到极显著水平(P＜0.01)。 -
由图 1可知：磁化处理能有效促进绒毛白蜡扦插苗的新梢和叶片生长。MW+MR，MW和ck等3个处理75 d龄扦插苗新梢平均基径分别为0.26，0.24和0.22 cm，MW+MR处理显著（P＜0.05）高于MW及ck，MW显著（P＜0.05）高于ck；MW+MR，MW和ck处理的新梢平均长度分别为4.95，4.07和2.83 cm，MW+MR显著（P＜0.05）高于MW及ck，MW显著（P＜0.05）高于ck。MW+MR处理的叶片数量及面积最高，分别为4.7片和24.15 cm2，其次为MW，分别为4.2片和17.41 cm2，ck最低，分别为2.8片和11.31 cm2，MW+MR和MW处理的叶片数量及面积显著（P＜0.05）高于ck，MW+MR处理的叶片面积显著高于（P＜0.05）MW，但MW+MR和MW处理的叶片数量差异性不显著（P＞0.05）。说明磁化处理显著促进了插穗苗新梢和叶片的生长。
图 1 不同处理对新梢基径（A），长度（B），叶片数量（C）和叶片面积（D）的影响
Figure 1. Effect of different treatment on new shoot diameter (A), new shoot length (B), blade quantity (C) and blade area (D)
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从图 2中看出：不同处理根系形态参数存在较大差异，MW+MR及MW处理的一级根序细根长度、直径、表面积、体积均显著（P＜0.05）高于ck，虽然二级根系形态差异不显著（P＞0.05），但是MW+MR及MW处理的根系分为3级，ck的根系只有2级，表明磁场有助于促进生根及根系发育，这与磁化处理高于ck的生根成活率是一致的。
图 2 不同处理根长度（A）表面积（B）直径（C）体积（D）的比较
Figure 2. Comparison of differene treatment on root length(A), surface area(B), diameter(C)and volume(D)
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由表 2可知：MW+MR处理的碳氮比极显著（P＜0.01）低于MW及ck，MW+MR处理扦插苗氮质量分数最高，其次为MW，ck的氮质量分数最低，差异极显著（P＜0.01）。MW+MR及MW处理钾、钙、镁、铁、锰、锌、铜质量分数均高于ck，差异极显著（P＜0.01）。然而磁化处理后钠质量分数则减少，与ck相比，MW+MR及MW处理分别减少了22.8%和9.7%，差异极显著（P＜0.01）。MW+MR处理的可溶性糖质量分数最高，MW次之，但高于ck，差异显著（P＜0.05），因此磁化处理能够明显加快插穗可溶性糖的积累，促进不定根的形成，从而缩短生根周期。
表 2 不同处理碳氮比及营养物质质量分数的比较
Table 2. Comparison of different treatment on C/N and element
处理 碳氮比 氮/(mg.g-1) 磷/(mg.g-1) 钾/(mg.g-1) 钙/(mg.g-1) 钠/(mg.g-1) ck 8.135±0.456 A 41.618±2.013 C 160.029±5.405 B 1.899±0.093 B 5, 566±0, 420 C 28, 732±1, 007 A MW 5.369±0.348 B 72, 326±2, 936 B 208.781±13.194 A 2.227±0.010 B 7, 499±0, 455 B 25.937±0.717 B MW+MR 3.966±0.315 C 103.797±8.508 A 226.402± 13.749 A 2.625±0.128 A 9.075±0.511 A 22.180±0.812 C 处理 镁/(mg.g-1) 铁/(mg.g-1) 锰/(mg.g-1) 锌/(mg.g-1) 铜/(mg.g-1) 可溶性糖/(mg.g-1) ck 0, 644±0, 021 A 0, 523±0, 098 B 0.128±0.017 A 0, 112±0, 008 C 0, 037±0, 001 C 142.954±1.175 C MW 0, 736±0, 008 B 1, 532±0, 257 B 0, 075±0, 003 B 0.198±0.016 B 0.228±0.013 B 154.554±2.544 B MW+MR 0.835±0.014 C 2, 963±0, 387 A 0.050±0.001 B 0.321±0.012 A 0.393±0.004 A 167.819±3.379 A 说明:数据为3次测定的平均值±标准误, 同列中不同大写字母表示处理间的差异达到极显著水平（P＜0.01）。 -
绒毛白蜡嫩枝插穗经过磁化处理对插穗形成愈伤组织、缩短生根时间以及对提升根系质量与扦插成活率有显著的促进作用。有研究认为：磁化处理能够影响酶的活性及内源激素的成分，从而促进植物愈伤组织与生根基因的表达，产生不定根[15]。磁化水水培小麦Triticum aestivum和水稻Oryza sativa能够促进次生根的分化，提高对矿质元素和水分的吸收效率[16]。也有研究认为：磁化处理后亚麻Linum sp.和小扁豆Polygala tatarinowii的细胞增殖活性减弱，增殖周期减缓[17]。本次研究发现，磁化处理后绒毛白蜡的一级根系形态参数明显高于对照组，表明在磁场环境下很可能激活了植物生长的某条代谢途径，或者生根关联酶活性，从而促进了绒毛白蜡生根及生长发育。
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磁化处理技术在扦插繁育中起到有效的促进作用，不仅能够促进插穗生根，增加根系数量，而且提高了苗木繁育速度，大大缩短了育苗周期。本研究证明，磁化处理能够明显加快插穗可溶性糖的积累，促进插穗不定根的形成，从而缩短生根周期；能够促进扦插苗生物量积累，能够降低植物根系中钠质量分数，促进氮磷钾及微量元素的累积。有研究表明，磁化水通过影响水的渗透力、溶解力与缔合度产生的物理效应来促进插穗对水分的吸收[15]，从而对植物生长发育、产量和生物量的提高具有显著影响。磁化处理提高了有效态养分的利用率，抑制了对钠离子（Na+）的吸收、积累，促进植株对钾离子（K+），钙离子（Ca2+），镁离子（Mg2+）等矿物养分离子的选择吸收能力[18]。磁化微咸水能够增强欧美杨-107 Populus × euramericanna ‘Neva’根系对水分和养分的吸收，能够极显著地提高其根、叶的生物量累积[19]。磁化处理能够显著提高鹰嘴豆Cicer arietinum的种实量、秸秆量及生物产量[7]。高矿化度水经过磁化处理能够促进绒毛白蜡植株的光合作用，从而促进其生长及生物量的累积[20]。
也有研究表明：不同磁场强度对植物影响不同，这可能与磁场环境改变了某些关联酶活性有关[21]。磁场对于植物的效应还与磁场的分布及频率有关，所以磁场作用于植物生长是由多种机制共同作用决定最终效应的[22]。磁化作用对于植物的最佳作用机制和技术条件还需进一步探究，以促进该技术在林业领域更广泛的应用。
Magnetic treatment on rootings of semi lignified twigs of Fraxinus velutina
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摘要: 以绒毛白蜡‘鲁蜡5号’Fraxinus velutina‘Lula-5’无性系3年生母树的当年生半木质化枝条为试材，采用完全随机区组试验设计，研究了磁化水喷淋（MW）+磁化毯（MR），磁化水喷淋（MW）及非磁化水喷淋（ck）等3个处理对绒毛白蜡生根率、生物量积累、根系营养物质含量的影响。结果表明：① MW+MR处理有利于促进插条生根，插穗生根率和根系效果指数均极显著高于MW处理及ck（P < 0.01）；新梢平均基径和平均长度均显著高于MW处理及ck（P < 0.05）。② 磁化处理对扦插苗细根形态有显著影响，其中MW+MR处理和MW处理的细根长度、直径、表面积和体积显著高于ck（P < 0.05）。③ MW+MR及MW处理氮、磷、钾、钙、镁、铁、锰、锌、铜、可溶性糖质量分数均高于ck，钠质量分数则低于ck，差异极显著（P < 0.01）。因此，磁化处理有利于提高绒毛白蜡嫩枝扦插生根率，根系生长发育、生物量积累和营养物质的积累得到进一步提高。Abstract: This research explored the effect of magnets on the rooting of cutting slips, young seedling growth and biomass accumulation, and nourishing matter content in roots. Using a current year, sprouting branchlet from a cloned 3-year-old female Fraxinus velutina 'Lula-5' tree as cuttage material and three treatments of magnetized water spray (MW), [magnetized water spray (MW) + magnetization blanket (MR)], and non-magnetized water spray (NMW) (the control) an experiment was carried out with a randomized complete block design trial. Results showed that: (1) the cuttage segment rootage ratio and the root effective index for (MW + MR) were greater and highly significant (P < 0.01) compared to the MW and NMW treatments (control). The average diameter and length growth of young sprouting shoots in the (MW + MR) treatment were also significantly higher than MW and NMW treatments (P < 0.05). (2) The fine root length, diameter, surface area, and volume showed no difference for the three treatments; whereas, all root morphology indexes in (MW + MR) and MW treatments were significantly higher than the NMW treatment (P < 0.05). (3) Compared to the control, nutrient content of N, P, K, Ca, Mg, Fe, Mn, Zn, Cu, and soluble sugar in the other two treatments was greater and highly significant (P < 0.01), but Na was lower and highly significant (P < 0.01). In conclusion, magnetization was beneficial for enhancement of the rooting rate, for promoting root growth as well as forbiomass and nutrient accumulation.
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Key words:
- silviculture /
- Fraxinus velutina /
- cuttage /
- root system /
- magnetization treatment
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桂花Osmanthus fragrans为木犀科Oleaceae木犀属Osmanthus，是中国十大传统名花之一，也是园林造景常用植物。根据开花时间不同，桂花可以分为秋桂和四季桂；根据花色差异，秋桂又可以分为丹桂、金桂和银桂。已有研究分析了桂花不同花色品种呈色物质成分，证实类胡萝卜素的种类及其质量分数是决定桂花花色的最主要因素[1−2]。目前，桂花类胡萝卜素的定性定量及其代谢途径中相关催化酶基因已被陆续分离得到[3−5]。桂花不同花色品种花瓣所含的类胡萝卜素中，β-胡萝卜素相对含量最高[1]。桂花番茄红素β-环化酶OfLCYB具备使番茄红素两端环化转化为β-胡萝卜素的能力，且OfLCYB对番茄红素的底物亲和性强于其他番茄红素环化酶，是桂花类胡萝卜素代谢途径中的关键催化酶[6−7]。沈子又等[8]分离得到了OfLCYB基因启动子，发现其启动子序列均包含有TATA-box、CAAT-box响应元件及水杨酸、赤霉素、脱落酸等激素响应元件等，但目前有关桂花OfLCYB基因上游转录因子的筛选及鉴定鲜见报道。
已有研究认为：ERF[9]、MYB[10]、NAC[11]等转录因子参与调控植物类胡萝卜素代谢。AP2/ERF转录因子家族具有众多的家族成员。根据AP2/ERF结构域的数目和序列特征，AP2/ERF家族转录因子分为AP2、ERF、CBF/DREB、RAV和Soloist这5个亚组，其中ERF类转录因子仅含有1个AP2/ERF结构域。ERF转录因子通过结合下游靶基因的GCC (GCCGCC)或DRE (CCGAC)序列[12]调节基因的表达，参与调节植物生长发育、生物或非生物胁迫应答、调控果实成熟等。此外，在拟南芥Arabidopsis thaliana[9]、番茄Solanum lycopersicum[13]和苹果Malus domestica[14]中还发现B2亚组的ERF转录因子具有调控植物类胡萝卜素合成的功能。拟南芥B2亚组ERF转录因子包括At3g16770.1(AtERF72/AtRAP2.3)、At1g72360.2 (AtERF73)、At1g53910.1 (AtERF74/AtRAP2.2)等5个成员。AtRAP2.2蛋白可以结合到拟南芥AtPSY启动子和AtPDS启动子的ATCTA元件上，从而调控相关基因的表达[15]。在苹果MdPSY1和MdPSY2基因启动子中也存在多个ATCTA顺式作用元件，能被AtRAP2.3的同源基因蛋白AP2D15强烈激活表达[14]。在黄龙胆Gentiana lutea[16]中，GlLCYB、GlLCYE、GlZEP、GlPDS、GlZDS、GlBCH基因的启动子上均存在ATCTA作用元件，说明ATCTA元件广泛存在于类胡萝卜素合成基因启动子上，表明B2亚组的ERF转录因子可能对一系列类胡萝卜素代谢基因具有调控作用。
本研究以桂花丹桂品种‘堰虹桂’O. fragrans ‘Yanhong Gui’为材料，首先对OfLCYB基因启动子的ATCTA顺式作用元件进行分析，再对桂花B2亚组的ERF转录因子基因进行序列分析和表达分析，利用酵母单杂交技术筛选和鉴定与OfLCYB互作的关键B2亚组的OfERF转录因子，不仅可以扩展桂花花色研究领域，同时为揭示桂花类胡萝卜素代谢的调控网络提供理论依据，为桂花品种培育和种质创新提供新的思路。
1. 材料与方法
1.1 材料
选择浙江农林大学桂花资源圃生长状况良好的地栽桂花品种‘堰虹桂’为材料，分别采集‘堰虹桂’的新鲜嫩叶以及顶壳期(S1)、铃梗期(S2)、初花期(S3)、盛开期(S4)的花瓣样品[17]，每个样品3次生物学重复，取样时间均为10:00。上述叶片与花瓣样品快速采集后放入液氮冷冻，随后保存于−80 ℃超低温冰箱，供后续使用。
1.2 方法
1.2.1 OfLCYB启动子序列分析、克隆及OfLCYB基因表达分析
根据诺禾致源的Ultraclean plant DNA purification Kit试剂盒操作说明提取‘堰虹桂’的嫩叶鲜样DNA。借助PlantCARE数据库(
http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/ )分析启动子顺式作用元件。根据OfLCYB的启动子序列信息[8]设计引物，以‘堰虹桂’嫩叶DNA为模板扩增得到其启动子。以‘堰虹桂’不同时期的花瓣cDNA为模板，以OfLCYB基因序列设计表达引物，以桂花OfACT基因[18]为内参基因，按照TB Green® Premix Ex TM TapⅡ说明进行实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)分析。引物序列见表1。利用参照基因的2−ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。表 1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences引物名称 引物序列(5′→3′) LCYB-PRO-GW-F ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcCTGCTTCTTGTTGTTGTACG LCYB-PRO-GW-R ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcCAATTTTGGCATGTTCTTAG OfLCYB-qF GAAAGGAGACGCCAAAGGGAG OfLCYB-qR GGAAGAAATAGCCGAGATGATAAGA 说明：小写字母表示部分attB序列。 1.2.2 B2亚组OfERFs生物信息学分析
使用天根公司RNA perp Pure Plant Kit试剂盒，根据产品说明提取‘堰虹桂’不同时期的花瓣RNA。随后用紫外分光光度计和质量分数为1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA浓度和质量。按照PrimeScriptTM RT Master Mix说明书将检验合格的盛花期RNA进行反转录。
应用Prot-Param在线软件 (
http://web.expasy.org/protparam/ ) 预测所编码蛋白的分子量、理论等电点、不稳定系数等；采用MEGAX软件中的邻位相邻法(NJ)进行同源聚类，建立系统发育树，并采用Bootstrap法(重复1 000次) 评估检测系统进化树。运用DNAMAN 7.0对4个OfERF基因推测所得的序列进行多序列比对分析。1.2.3 B2亚组OfERFs表达分析
以‘堰虹桂’不同时期的花瓣cDNA为模板，以筛选得到的桂花B2亚组OfERFs序列设计引物，以桂花OfACT为内参基因。分析方法参照1.2.1。引物序列见表2。
表 2 OfERFs基因RT-qPCR引物序列Table 2 RT-qPCR primer sequences of OfERFs引物名称 引物序列(5′→3′) 引物名称 引物序列(5′→3′) OfERF73a-qF CTGAAGAGAAACCGCCAACAA OfERF72a-qR GGGTAGTAAACTTCTTGTTGCTGCGTA OfERF73a-qR TTAACGCCATCAGAAGACACAAGT OfERF72b-qF CAAATATCCTATGTTCAGAGG OfERF73b-qF AATTGGGATGCCGCCTCA OfERF72b-qR ATAGCATACCATAACATACCA OfERF73b-qR TTAAATCCCACCAAACATAGCACT OfACT-qF CCCAAGGCAAACAGAGAAAAAAT OfERF72a-qF CCAACCCCACCGGCTC OfACT-qR ACCCCATCACCAGAATCAAGAA 1.2.4 OfERFs与OfLCYB启动子酵母互作验证
通过Gateway方法构建pAbAi-OfLCYB-pro载体，之后利用限制性内切酶BstB I线性化质粒pAbAi-OfLCYB-pro、阳性对照p53-AbAi以及阴性对照pAbAi载体。按照Yeastmaker™ Yeast Transformation System 2 User Manual产品说明制备酵母感受态，并将线性化的质粒转入感受态细胞中，涂布于尿嘧啶缺陷培养基(SD/-Ura)酵母板筛选培养基上，28 ℃倒置培养2~3 d。挑取单菌落扩大培养，提取酵母DNA。以粗提酵母DNA为模板，进行PCR检验。用质量分数为0.9% 的无菌氯化钠溶液稀释菌液，D(600)=0.002时，均匀涂布于金担子素A (AbA)不同浓度的SD/-Ura固体培养基上，倒置于28 ℃培养箱内培养2~3 d，以检测AbAr基因本底表达水平。将pGADT7-OfERF72a、pGADT7-OfERF72b、pGADT7-OfERF73a、pGADT7-OfERF73b和pGADT7-53、pGADT7分别转入诱饵菌株pAbAi-OfLCYB-pro和阳性对照p53-AbAi、阴性对照pAbAi的酵母感受态细胞，悬浮液均匀涂布于SD/-Leu缺陷培养基上，倒置于30 ℃培养箱内培养3~5 d，再将长出的单菌落分别在亮氨酸缺陷培养基(SD/-Leu)与含300 μg·L−1的亮氨酸缺陷培养基[SD/-Leu/AbA(300 μg·L−1)]点斑检测其互作情况。
2. 结果与分析
2.1 OfLCYB启动子序列分析及表达分析
由图1可见：桂花OfLCYB基因启动子序列含有2个ATCTA顺式作用元件。
图 1 OfLCYB启动子的ATCTA顺式作用元件分析Figure 1 Analysis of ATCTA cis-acting elements of the OfLCYB promoter通过荧光定量检测‘堰虹桂’不同发育时期花瓣中OfLCYB的表达水平(图2)，发现OfLCYB的表达量从顶壳期到盛开期逐渐升高，在盛开期表达量最高。
图 2 OfLCYB在‘堰虹桂’不同花期的表达Figure 2 Expression of OfLCYB at different flowering stages in O. fragrans ‘Yanhong Gui’2.2 B2亚组OfERFs生物信息学分析
通过对桂花转录组数据库分析，筛选获得4个B2亚组ERF有关的Unigene序列。利用MEGAX软件对4个桂花OfERFs氨基酸全长和拟南芥ERF家族的122个成员的氨基酸序列构建系统进化树，结果显示：4个桂花OfERFs与5个拟南芥ERF序列聚集在B2亚组(图3)。其中CL2088.Contig2和CL2088.Contig3聚为一小支，与拟南芥At3g16770.1 (AtERF72)的关系最为接近，将CL2088.Contig2和CL2088.Contig3分别命名为OfERF72a和OfERF72b。此外，CL550.Contig3、Unigene4342与拟南芥At1g72360.2 (AtERF73)关系较近，将CL550.Contig3和Unigene4342分别命名为OfERF73a和OfERF73b。
图 3 桂花B2亚组OfERFs系统发育分析Figure 3 Phylogenetic analysis of OfERFs in subgroup B2 of O. fragrans多序列比对分析发现(图4) ：4个OfERF基因均包含1个AP2保守结构域。4个OfERFs蛋白序列的基本理化性质(表3)分析发现：OfERF72a基因的氨基酸数量为232个，分子量为26 144 Da；OfERF72b基因的氨基酸数量为228个，分子量为25 841 Da；OfERF73a基因的氨基酸数量为386个，分子量为43 632 Da；OfERF73b基因的氨基酸数量为375个，分子量为41 607 Da。4个OfERF的理论等电点为4.63~5.33，均属于偏酸性蛋白质；总平均亲水指数均为负值，都属于亲水性蛋白。OfERF72a、OfERF72b、OfERF73a不稳定系数分别为43.67、54.42、43.21，判断为不稳定的蛋白质；OfERF73b不稳定系数为38.40，判断为稳定的蛋白质。
图 4 B2亚组OfERFs氨基酸序列比对分析Figure 4 Amino acid multiple sequence alignment analysis of OfERFs of subgroup B2表 3 B2亚组OfERFs基本理化性质分析Table 3 Analysis of basic physicochemical properties OfERFs of subgroup B2基因名称 氨基酸数量/个 分子量/Da 理论等电点 不稳定系数 总平均亲水指数 OfERF72a 232 26 144 5.33 43.67 −0.744 OfERF72b 228 25 841 5.30 54.42 −0.796 OfERF73a 386 43 632 4.63 43.21 −0.739 OfERF73b 375 41 607 5.01 38.40 −0.710 2.3 B2亚组OfERFs表达分析
利用RT-qPCR技术分析‘堰虹桂’不同发育时期花瓣中OfERF72a、OfERF72b、OfERF73a与OfERF73b相对表达量(图5)发现：从顶壳期到盛开期，OfERF72a、OfERF72b的相对表达量基本呈现逐渐下降的趋势，OfERF73a的相对表达量在顶壳期、铃梗期与盛花期之间差异较小，在初花期相对表达量略有下降。OfERF73b的相对表达量在顶壳期、铃梗期较高，随后在初花期相对表达量显著下降(P＜0.05)。
图 5 B2亚组OfERF在‘堰虹桂’不同花期的表达Figure 5 Expression of OfERF genes of subgroup B2 at different flowering stages in O. fragrans ‘Yanhong Gui’为了验证OfERFs与OfLCYB之间的关系，用y表示OfERFs的相对表达量取以10为底的对数，用x表示OfLCYB相对表达量取以10为底的对数进行相关性分析(图6)。其中，OfERF72a直线回归方程为y= − 0.987 6x − 0.010 0，决定系数(R2)为0.933 6，P=0.033 8；OfERF72b直线回归方程为y= − 1.208 0x − 0.077 9，R2=0.941 6，P=0.029 6。OfLCYB的表达水平与OfERF72a、OfERF72b呈显著负相关。
图 6 OfERFs与OfLCYB相对表达量的相关性分析Figure 6 Correlation analysis of relative expression levels of OfERFs with OfLCYB2.4 酵母单杂交分析B2亚组OfERFs与OfLCYB启动子互作
为了探究B2亚组OfERFs与OfLCYB启动子之间是否存在物理互作，同时将阴性对照pAbAi+pGADT7、阳性对照p53-AbAi+pGADT7-Rec-p53以及实验组pAbAi-OfLCYB-Pro+AD-OfERF分别接种于SD/-Leu与SD/-Leu/AbA (300 μg·L−1)的酵母培养基上，于30 ℃倒置培养3~5 d。结果发现(图7)：在SD/-Leu培养基上，酵母均能正常生长，而在SD/-Leu/AbA (300 μg·L−1)培养基上，只有阳性对照与pAbAi-OfLCYB-Pro+AD-OfERF72b正常生长，其余酵母菌均不能生长，表明OfERF72b可以与OfLCYB启动子物理结合。
图 7 OfERF蛋白与OfLCYB启动子互作验证Figure 7 Verification of physical interaction between OfERF proteins and OfLCYB promoter3. 讨论
本研究得到4个桂花‘堰虹桂’B2亚组的OfERFs基因，编码区长度为687~1 161 bp，编码228~386个氨基酸残基。拟南芥B2亚组ERF At1g53910.1、At1g72360.2、At2g47520.1、At3g14230.1以及At3g16770.1分别编码358、262、171、397和248个氨基酸残基[15]。牡丹Paeonia suffruticosa ERF家族中B2亚组基因PsERF1编码区长度为1 158 bp，编码385个氨基酸残基[19]。在番木瓜Carica papaya中，属于B2亚组的基因CpERF4、CpERF6、CpERF9则分别编码431、253、234个氨基酸残基[20]。而在番茄ERF中，其B2亚组的SlERF6、SlERF.E.1、SlERF90、SlERF91、SlERF.A.3分别编码255、260、386、1 454和372个氨基酸残基[21]。由此可以发现：同一物种B2亚组ERF基因编码不同长度的氨基酸序列，推测其不同成员的功能存在差异。
对4个桂花OfERFs基因的氨基酸序列进行系统进化分析，发现OfERFs与拟南芥B2亚组ERF聚集在一起，说明它们的同源性较高。其中2个基因与At3g16770.1 (AtERF72/AtRAP2.3)聚为一支，2个基因与At1g72360.2 (AtERF73/AtRAP2.2)聚为另一小支。据此将4个OfERFs基因分别命名OfERF72a与OfERF72b、OfERF73a与OfERF73b。桂花OfERF72与OfERF73均存在2个拷贝，说明桂花OfERF基因家族成员在进化和扩张过程中与基因重复事件有着紧密联系。在拟南芥中，AtERF72能够与缺铁反应基因IRT1、HA2和CLH1的启动子区域结合，负调控拟南芥的缺铁响应。与野生型植株相比，AtERF72突变体中铁和镁质量分数显著增加[22]。AtRAP2.3的同源基因SlERF6被证实是番茄中类胡萝卜素合成的负调控因子[13]。此外，在苹果中也有研究证明：AtRAP2.3的同源基因AP2D15可以负调控苹果PSY1和PSY2基因启动子序列中的ATCTA顺式作用元件[14]。拟南芥AtRAP2.2可以结合到拟南芥AtPSY启动子和AtPDS启动子的ATCTA元件上调控基因的表达，过表达AtRAP2.2后导致植物体内类胡萝卜素降低[15]。
桂花花瓣中主要类胡萝卜素为β-胡萝卜素，其生物合成由OfLCYB直接催化生成，是桂花花瓣中类胡萝卜素代谢的重要催化酶[23]。OfLCYB基因启动子中存在2个ATCTA顺式作用元件，推测其响应B2亚组ERF转录因子的调控。AtRAP2.2蛋白可以结合到拟南芥AtPSY启动子和AtPDS启动子的ATCTA元件上，从而调控相关基因的表达[15]。在苹果MdPSY1和MdPSY2基因启动子中也存在多个ATCTA顺式作用元件，能被AtRAP2.3的同源基因蛋白AP2D15强烈激活表达[14]。进一步研究发现：OfERF72a和OfERF72b的表达趋势与OfLCYB基因呈显著负相关。酵母单杂交结果表明：OfERF72b与OfLCYB启动子存在物理结合，表明B2亚组的OfERF72b可能通过结合OfLCYB基因启动子ATCTA顺式作用元件调控其表达。ATCTA元件也存在于桂花OfPSY[24]和OfCCD1[25]等其他类胡萝卜素代谢基因的启动子上，其是否响应B2亚组的ERF转录因子的调控需要进一步研究。
4. 结论
本研究基于桂花‘堰虹桂’转录组数据筛选了4个OfERF基因，OfERF72a与OfERF72b基因表达量均随着开花进程逐渐下降，与OfLCYB基因的表达量显著负相关。OfLCYB基因启动子含有2个ATCTA顺式作用元件，OfERF72b与OfLCYB启动子之间存在互作，表明OfERF72b可能参与调控OfLCYB的表达。
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图 1 不同处理对新梢基径（A），长度（B），叶片数量（C）和叶片面积（D）的影响
Figure 1 Effect of different treatment on new shoot diameter (A), new shoot length (B), blade quantity (C) and blade area (D)
图 2 不同处理根长度（A）表面积（B）直径（C）体积（D）的比较
Figure 2 Comparison of differene treatment on root length(A), surface area(B), diameter(C)and volume(D)
表 1 扦插后不定根出现期、成活率、根干质量、根含水量和根系效果指数的比较
Table 1. Comparison of different treatment on rooting date, rooting rate, root drought weight, root water contet and root effect index
处理 不定根出现期/d 生根率/% 根干质量/g 根含水量/g 根系效果指数 ck 25 23.5 ± 1.594 C 0.062 ± 0.002 C 0.510 ± 0.057 B 0.410 MW 19 60.4 ± 2.838 B 0.081 ± 0.005 B 0.782 ± 0.077 AB 0.987 MW+MR 15 84.2 ± 2.341 A 0.107 ± 0.005 A 0.996 ± 0.100 A 1.567 说明:数据为3次测定的平均值±标准误, 同列中不同大写字母表示处理间的差异达到极显著水平(P＜0.01)。 
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表 2 不同处理碳氮比及营养物质质量分数的比较
Table 2. Comparison of different treatment on C/N and element
处理 碳氮比 氮/(mg.g-1) 磷/(mg.g-1) 钾/(mg.g-1) 钙/(mg.g-1) 钠/(mg.g-1) ck 8.135±0.456 A 41.618±2.013 C 160.029±5.405 B 1.899±0.093 B 5, 566±0, 420 C 28, 732±1, 007 A MW 5.369±0.348 B 72, 326±2, 936 B 208.781±13.194 A 2.227±0.010 B 7, 499±0, 455 B 25.937±0.717 B MW+MR 3.966±0.315 C 103.797±8.508 A 226.402± 13.749 A 2.625±0.128 A 9.075±0.511 A 22.180±0.812 C 处理 镁/(mg.g-1) 铁/(mg.g-1) 锰/(mg.g-1) 锌/(mg.g-1) 铜/(mg.g-1) 可溶性糖/(mg.g-1) ck 0, 644±0, 021 A 0, 523±0, 098 B 0.128±0.017 A 0, 112±0, 008 C 0, 037±0, 001 C 142.954±1.175 C MW 0, 736±0, 008 B 1, 532±0, 257 B 0, 075±0, 003 B 0.198±0.016 B 0.228±0.013 B 154.554±2.544 B MW+MR 0.835±0.014 C 2, 963±0, 387 A 0.050±0.001 B 0.321±0.012 A 0.393±0.004 A 167.819±3.379 A 说明:数据为3次测定的平均值±标准误, 同列中不同大写字母表示处理间的差异达到极显著水平（P＜0.01）。
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https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.2017.05.024
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