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马铃薯Solanum tuberosum是中国主要的粮食作物，黑龙江省的马铃薯种植面积一直居于前列，但近年来由疮痂链霉菌Streptomyces scrabies引起的马铃薯疮痂病日益严重，直接影响马铃薯的品质，造成了较大的经济损失[1]。马铃薯疮痂病首先会在马铃薯表面产生褐色的点状斑块，随着马铃薯的生长，点状斑块会随之扩大形成褐色圆形或不规则形的大斑块，感染后期斑块处细胞木栓化，致马铃薯表面形成凹陷或凸起的疮痂状粗糙硬斑块，严重影响马铃薯的外观品质和经济价值[2]。长期以来，马铃薯疮痂病的防治大多采用化学农药的方法，虽然短期内防治效果显著，但长期使用不仅污染环境和危害人类健康，还会造成土壤中的菌群失调，使得病原菌缺乏有效抑制而导致病害发生更加严重[3]。生物防治是马铃薯疮痂病防治的一个热点和趋势，该方法利用微生物及其分泌物来抑制病害的发生，不会对环境造成污染，是一种友好型的病害防治方法。目前，已报道了多种能够对马铃薯疮痂病具有防治效果的拮抗菌株，其中以芽孢杆菌Bacillus占多数，抑制效果也更加显著[4-5]。但是在前人利用芽孢杆菌作为生防菌防治植物病害的研究中，却发现有些生防菌株会出现异地防治效果不理想的状况，究其原因可能与菌株在土壤中的定殖能力以及受土壤中土著微生物的抑制有关[6-11]。生防菌株施用到土壤中，会面临生存环境的改变，抑菌物的分泌量可能会受到影响，进而影响生防菌株的抑菌效果。此外，不同地区土壤的菌群结构也存在差异，导致一个地区的生防菌株在另一个地区施用可能会由于不适应新的微生物菌群结构及生态环境，同样发挥不了理想的生物防治效果[12]。鉴于此，本研究从黑龙江省当地马铃薯疮痂病发病土壤中筛选鉴定适宜本地生态环境及土壤菌群结构的拮抗菌，对菌株的培养条件进行优化，通过盆栽实验检验菌株的实际防治效果，旨在为该菌应用到马铃薯疮痂病的生物防治提供理论依据。
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病原菌疮痂链霉菌由本实验室保存提供。
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土样采自黑龙江省克山县马铃薯发病地块；马铃薯品种为‘大西洋’Solanum tuberosum ‘Atlantic’。
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YME固体培养基：麦芽糖10.0 g·L-1，酵母提取物4.0 g·L-1，葡萄糖4.0 g·L-1，琼脂20.0 g·L-1，pH 7.2；LB固体培养基：氯化钠(NaCl)10.0 g·L-1，蛋白胨10.0 g·L-1，酵母浸粉5.0 g·L-1，琼脂20.0 g·L-1，pH 7.5；发酵条件优化基础培养基[13]：葡萄糖10.0 g·L-1，蛋白胨10.0 g·L-1，氯化钠10.0 g·L-1，磷酸二氢钾(KH2PO4)1.5 g·L-1，硫酸镁(MgSO4·7H2O)1.5 g·L-1。
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采集有伤病的马铃薯周围的土壤带回实验室，土壤加水匀浆并倍比稀释至10-6，把10-4，10-5，10-6倍的土壤稀释液涂布。在平板上挑取单个菌落纯化培养，保存分离到的单个菌株，在涂有链霉菌的平板上做抑菌实验。
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形态观察：显微镜观察单菌的颜色、形状、状态。分子生物学鉴定：基于16S rDNA序列分析的生防菌株种属鉴定。50.0 μL聚合酶链式反应(PCR)反应体系：2.0 μL细菌基因组DNA，4.0 μL 10 mmol·L-1 16S引物27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-TACCTTGTTACGACTT-3′，1.2 μL 10 μmol·L-1三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTPs)，4.0 μL 50 mmol·L-1氯化镁(MgCl2)，5.0 μL 10×PCR缓冲液，0.3 μL DNA聚合酶。PCR扩增条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，40个循环，4 ℃无限循环。反应结果经8 g·L-1琼脂糖凝胶电泳进行条带检测，纯化后样品送交上海生工完成测序。所获得的碱基序列在美国生物技术信息中心(NCBI)数据库中进行Blast同源性对比，利用MEGA 5软件进行多序列比对并构建系统发育树。
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根据种子培养基的营养条件，分别更换不同质量浓度和种类的碳源、氮源及不同比例的无机盐离子和碳氮比(C/N)加入装有50 mL发酵液培养基的100 mL的三角瓶中，改变培养菌株的发酵条件(培养温度、pH值、培养时间等)，将活化好的菌株接种到发酵液培养基中，37 ℃，160 r·min-1恒温振荡培养24 h后。菌液离心4 min，12 000 r·min-1，菌液上清使用0.22 μm滤膜过滤后采用管碟法进行抑菌实验。
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抑菌活性的测定采用管碟法，把培养好的病原菌用涂布棒涂匀在已制作好的平板，在平板上放牛津杯加入抑菌物粗提液。抑菌活性通过测量抑菌圈的半径，计算平均值比较大小进行确定。
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根据培养基的营养条件，采用单因素多水平试验设计方法，分别加入10.0 g·L-1的葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖作为不同的碳源，其他因素同种子液培养基，重复5次·水平-1，采用管碟法测定抑菌活性确定适宜碳源的种类。
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在适宜碳源试验结果基础上，根据培养基的营养条件，设计氮源单因素多水平试验，分别加入10.0 g·L-1的蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母浸粉、牛肉粉作为不同的氮源，其他因素不变，重复5次·水平-1，采用管碟法测定抑菌活性确定适宜的氮源种类。
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在适宜碳、氮源试验结果基础上，根据培养基的营养条件，设计C/N单因素多水平试验，选取C/N分别为1:1，1:2，1:3，1:4，1:5进行发酵试验，其他因素不变，重复5次·水平-1，采用管碟法测定的抑菌活性确定适宜的C/N。
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在适宜碳、氮源及C/N试验结果基础上，根据培养基的营养条件，选择培养基中的KH2PO4，MgSO4·7H2O，NaCl为正交试验因素，设计3水平3因素试验(表 1)，设置空白项为对照(ck1)。分别将不同水平的KH2PO4，MgSO4·7H2O，NaCl加入发酵培养基中，培养基pH值调至pH 7.0，其他因素不变，重复5次·水平-1，采用管碟法测定抑菌物活性确定适宜的无机离子。
表 1 无机离子实验因素质量浓度表
Table 1. Level of orthogonal experimental factors of inorganic ions
水平 KH2PO4/(g·L-1) MgSO4·7H2O/(g·L-1) NaCl/(g·L-1) 1 0.5 0.5 5.0 2 1.0 1.0 10.0 3 1.5 1.5 15.0 -
在适宜碳，氮源，C/N，无机离子正交试验结果基础上，根据培养基的营养条件，设计初始最适pH值单因素多水平试验，分别调节初始pH值为pH 5，pH 6，pH 7，pH 8，pH 9，重复5次·水平-1，采用管碟法测定抑菌活性确定适宜的pH值。
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在适宜碳，氮源，C/N及pH值，无机离子正交试验结果基础上，根据培养基的营养条件，设计培养温度单因素多水平试验，分别调节初始温度为22，28，32，37，44 ℃，重复5次·水平-1，采用管碟法测定抑菌活性确定最适温度。
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在上述最佳培养条件确定基础上，根据培养基的营养条件，设计培养时间单因素多水平试验，分别设置8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28和30 h的培养时间，重复3次·水平-1，采用管碟法测定的抑菌活性确定适宜的培养时间。
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实验在黑龙江八一农垦大学大庆市重点实验室中进行，采用盆栽实验，实验用盆钵为28 cm × 20 cm的聚乙烯塑料盆，钵装风干土为3 kg·盆-1，装入马铃薯疮痂病发病土壤。选取健康的有芽马铃薯，用清水冲洗干净，切成三角块，在盆钵土壤中植入2块有芽马铃薯，芽尖向上。同时制备发酵培养基，接种BU108生防菌。设置3组处理，重复6次·处理-1，分别为对照(ck2)，低浓度BU108(1×108 cfu·m-2)和高浓度BU108(1×1010 cfu·m-2)。各个处理中菌液最终施用量为100 mL，在栽种时加入菌液，之后不再添加，栽种前浇水1 000 mL。根据马铃薯生长情况定量加水，待马铃薯成熟后，进行病斑数的统计与分析。
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从有病害马铃薯根际土壤中分离得到200余株菌株，命名按BU1，BU2，BU3等依次排列，对所有得到的菌株进行抑菌实验。结果显示：BU108与其他菌株相比抑菌圈半径最大，抑菌效果最为明显(图 1)。BU108菌落形态白色不透明，边缘不整齐、干燥、中间有星状皱起；在液体培养基中色暗、皱褶、完整的膜、轻度混浊，可知BU108对疮痂链霉菌有抑菌效果。在16S rDNA序列分析的基础上进行NCBI序列比对，找到与目的菌株相似度最为接近的碱基序列。应用MEGA5软件对这些碱基序列进行分析，构建系统进化树。从图 2可以看出：BU108属于芽孢杆菌属，但与目前鉴定到的芽孢杆菌种之间存在不同，与Bacillus sp.(KT583425.1)亲缘关系最近。
图 1 BU108抑制疮痂链霉菌
Figure 1. Inhibiton of BU108 against Streptomyces scabies
图 2 BU108的16S rDNA序列系统进化树
Figure 2. Phylogenetic tree of BU108 16S rDNA
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分别用葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖代替培养基中的葡萄糖。结果显示：抑菌实验的半径平均值分别为11，7.6，7.8和8.2 mm。由图 3可知：当葡萄糖作为碳源时，抑菌效果最为明显。由方差分析可知：组内间的差异较小，而且葡萄糖与其他的碳源有极显著差异(P＜0.01)，因此确定葡萄糖为最佳碳源。
图 3 碳源对芽孢杆菌BU108抑菌活性的影响
Figure 3. Effect of carbon source on the activity of Bacillus BU108
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在最佳碳源确定的基础上，分别用胰蛋白胨、蛋白胨、大豆蛋白、牛肉粉、酵母浸粉代替培养基中的蛋白胨。结果(图 4)显示：抑菌实验的半径平均值分别为6.8，6.6，6.4，7.2和8.6 mm。当酵母浸粉作为氮源时，抑菌效果最为明显。由方差分析可知：酵母浸粉与其他的氮源有极显著差异(P＜0.01)，因此确定酵母浸粉为最佳氮源。
图 4 氮源对芽孢杆菌BU108抑菌活性的影响
Figure 4. Effect of nitrogen source on the activity of Bacillus BU108
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碳源和氮源之间的比例对微生物的生长和代谢同样重要。在最佳碳、氮源确定的基础上，设置C/N为1:1，1:2，1:3，1:4，1:5。结果显示(图 5)：抑菌圈的半径平均值分别9.0，12.5，7.3，7.8和7.0 mm。当C/N为1:2时抑菌效果最为明显，与方差分析组内间的差异较小，与其他组间有极显著差异(P＜0.01)，因此确定最佳C/N为1:2。
图 5 C/N对芽孢杆菌BU108抑菌活性的影响
Figure 5. Effect of C/N on the antagonistic activity of Bacillus BU108
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在最佳碳源、氮源和C/N确定的基础上改变无机离子的浓度，并检测无机离子对抑菌活性影响。由表 2可知：NaCl对抑菌效果影响最大，极差R大小依次为NaCl＞MgSO4·7H2O＞KH2PO4＞ck。由表 3可知：NaCl对抑菌物的产生影响最大，影响最小的为KH2PO4。可见，NaCl质量浓度为5.0 g·L-1时对菌株的抑菌效果最佳。
表 2 无机离子对抑菌活性影响的正交试验结果
Table 2. Results of orthogonal tests on the effect of inorganic ions on the yield of antimicrobial agents
试验号 KH2PO4 MgSO4·7H2O NaCl 空白项(ck1) 抑菌圈半径/mm 1 1 1 1 1 15.2 2 1 2 2 2 8.7 3 1 3 3 3 7.2 4 2 1 2 3 10.3 5 2 2 3 1 7.2 6 2 3 1 2 12.8 7 3 1 3 2 7.5 8 3 2 1 3 13.6 9 3 3 2 1 6.8 K1 31.1 33 41.6 29.2 K2 30.3 29.5 25.8 29.0 K3 27.9 26.8 21.9 31.1 R 3.2 6.2 19.7 2.1 说明：1，2，3表示相对应的水平；K1代表每组水平1的抑菌圈半径之和，K2和K3同理。R代表极差，对照组(空白项)的1，2，3不代表水平，只代表正交表里的检验项 表 3 无机离子对抑菌活性影响的方差分析
Table 3. Variance analysis of the effect of inorganic ions on antibacterial activity
因素 偏差平方和 自由度 均方 F Fα=0.05 KH2PO4 1.85 2 0.93 2.06 19 MgSO4 6.44 2 3.22 7.16 NaCl 72.55 2 36.28 80.62 空白项 0.90 2 0.45 -
在最佳碳源、氮源和C/N及无机离子比例确定的基础上，改变培养基pH为5，6，7，8，9。结果(图 6)显示：抑菌圈的半径平均值分别为9.0，9.6，9.8，12.4和8.4 mm。当pH为8时，抑菌效果最为明显，由方差分析可知各个组内间的差异较小而且pH为8时与其他组有极显著差异(P＜0.01)，因此确定pH 8是最佳pH值。
图 6 pH对芽孢杆菌BU108抑菌活性的影响
Figure 6. pH effect on the antibacterial activity of Bacillus BU108
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在最佳碳源、氮源、C/N和无机离子比例及pH确定的基础上，设置培养温度为22，28，32，37，44 ℃。结果(图 7)显示：抑菌圈的半径平均值分别为9.0，12.6，9.0，8.2和7.0 mm。芽孢杆菌BU108在22，32，37 ℃下生长良好，在44 ℃下生长一般，28 ℃下生长情况最佳。由方差分析可知：培养温度为28 ℃时组内间的差异较小，与其他组相比具有极显著差异(P＜0.01)，因此28 ℃为最佳培养温度。
图 7 培养温度对芽孢杆菌BU108抑菌活性的影响
Figure 7. Effect of culture temperature on the antibacterial activity of Bacillus BU108
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培养时间过长营养物质消耗殆尽不利于菌株的生长，时间过短微生物代谢物质的分泌量不足影响菌株的抑菌效果。在最佳碳源、氮源、C/N、无机离子比例和pH值及培养温度确定的基础上，设置培养时间为8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28和30 h。结果显示(图 8)：抑菌实验的半径平均值分别5.2，5.2，6.7，7.2，7.7，8.3，8.7，11.7，9.0，7.7，7.0和6.3 mm。22 h时抑菌半径最大，抑菌效果最好。由方差分析可知：组内间的差异较小，与其他组相比具有极显著差异(P＜0.01)，因此最适培养时间为22 h。
图 8 培养时间对芽孢杆菌BU108抑菌活性的影响
Figure 8. Effect of culture time on the antibacterial activity of Bacillus BUI08
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对3组处理的盆栽实验的病斑数进行统计(图 9)：对照组的病斑数平均值为12.0，高浓度BU108组的病斑数平均值为1.0，低浓度BU108组的病斑数平均值为8.3。由方差分析可知：高浓度BU108组与其他组别间有极显著差异，抑制率为91.6%。低浓度BU108组与对照之间有极显著差异(P＜0.01)，抑制率为30.8%。表明芽孢杆菌BU108能够抑制马铃薯疮痂病的发生，且浓度越高，抑制效果越好。
图 9 芽孢杆菌BU108对马铃薯疮痂病的影响
Figure 9. Effect of Bacillus BUI08 on potato scab
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本研究通过平板涂布法、平板划线法分离单菌，利用本实验室提供的病原菌筛选拮抗菌，对200余株菌株做抑菌实验，测量抑菌圈的半径，发现菌株BU108抑菌圈半径最大，抑菌效果最为明显。通过形态学观察和菌株的进化树分析，初步确定BU108属于芽孢杆菌。因BU108与目前已知的芽孢杆菌序列之间存在较大不同，无法归类到具体的种。
通过摇瓶发酵对芽孢杆菌BU108抑菌活性物质的培养条件进行了研究，BU108的最佳培养条件：碳源为葡萄糖，氮源为酵母浸粉，C/N为1:2，无机离子KH2PO4为0.5 g·L-1，MgSO4·7H2O为0.5 g·L-1，NaCl为5.0 g·L-1，pH 8，培养时间为22 h，培养温度为28 ℃。有些生防菌的最佳碳源为葡萄糖、氮源为大豆饼粉[14-15]，最佳的pH偏酸性[16]，而BU108的最佳碳源为葡萄糖、氮源为酵母浸粉，在偏碱性条件下生长良好并且抑菌效果最佳。证明其培养条件的不同对芽孢杆菌BU108菌株抑菌物的产生有很大影响。无机离子质量浓度对BU108菌株抑菌物的产生也有很大影响，在本研究中无机离子质量浓度最小时，抑菌效果最好。由此可见，生防菌株不同其培养条件相差很大，每个菌株都有其相应的营养要求和培养方式。
本研究采用盆栽实验检验了菌株BU108对马铃薯疮痂病的抑制效果。实验设置了不同浓度的生防菌发酵液处理土壤，发现抑菌效果与发酵菌液的浓度之间存在正相关，发酵液浓度高的处理组其抑菌效果也高。原因可能是低浓度的发酵液菌数少则抑菌物分泌量也相对较少，抑制率也低。本研究确定了BU108在土壤中具有抑制疮痂病发病的效果，可以作为生物防治的候选。本次盆栽试验为了保证马铃薯发病，盆栽土壤采用马铃薯疮痂病发病土壤，马铃薯发病和生防菌抑菌效果表现良好，但是在实际应用中面对复杂的土壤微生物，能否取得理想效果还有待检验。
在前人利用芽孢杆菌防治植物病害的研究中，芽孢杆菌多与其他微生物或药剂共同使用[17-20]。在今后的实际应用中也可以尝试与其他生防菌组合使用，增强对马铃薯疮痂病的抑制效果。
Screening and identification of Bacillus strain BU108 and bio-control effects on potato scab
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摘要: 为改善马铃薯Solanum tuberosum疮痂病日益加重的情况，以疮痂链霉菌Streptomyces scrabies为指示菌筛选拮抗菌，优化菌株的发酵条件，检测菌株对马铃薯疮痂病的抑制情况。首先，利用稀释涂布法、平板划线法和抑菌圈法分离筛选到了1株对疮痂链霉菌具有抑制作用的拮抗菌株，通过形态学观察和16S rDNA序列比对鉴定为芽孢杆菌Bacillus，并命名为BU108。随后，采用单因素多水平试验设计方法，对该菌株培养条件进行了优化，确定最适培养条件为：碳源为葡萄糖，氮源为酵母浸粉，碳氮比为1:2，磷酸二氢钾（KH2PO4）为0.5 g·L-1，硫酸镁（MgSO4·7H2O）为0.5 g·L-1，氯化钠（NaCl）为5.0 g·L-1，培养温度为28℃，pH 8，培养时间为22 h。最后，通过盆栽实验检验了芽孢杆菌BU108对马铃薯疮痂病的实际抑制效果，结果显示：BU108施用浓度为1×1010cfu·m-2时效果最好，抑制率为91.6%，差异达极显著水平（P < 0.01）。Abstract: To improve bio-controls on potato scab, the scab Streptomyces scrabies was used as an indicator bacteria for screening of antagonistic bacterial strains, for optimization of fermentation conditions, and inhibition of potato scab. First, an outstanding strain (BU108) was obtained and identified as Bacillus by morphological observation and subsequent 16S rDNA sequencing. Then the culture conditions of BU108 were optimized for best inhibition by a single factor and a multi-level experimental design, Repeat five times at each level. Finally, the inhibiting effect of BU108 on potato scab was detected through a pot experiment. Results of the optimal culture conditions were as follows:glucose as carbon source, yeast extract as nitrogen source, C/N ratio of 1:2, 0.5 g·L-1 KH2PO4, 0.5 g·L-1 MgSO4·7H2O, 5.0 g·L-1 NaCl, 28℃ culture temperature, pH 8, and 22 h culture time. The pot experiment showed that a better effect was obtained with an application concentration of 1×1010 cfu·m-2. The inhibition rate reached 91.6% with marked differences (P < 0.01). This result not only provided material for a biological control of potato scab, but also helped accumulate experience for applying BU108 in actual production.
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Key words:
- plant pathology /
- potato scab /
- Bacillus /
- optimization /
- biological control
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图 3 碳源对芽孢杆菌BU108抑菌活性的影响
Figure 3 Effect of carbon source on the activity of Bacillus BU108
图 4 氮源对芽孢杆菌BU108抑菌活性的影响
Figure 4 Effect of nitrogen source on the activity of Bacillus BU108
图 5 C/N对芽孢杆菌BU108抑菌活性的影响
Figure 5 Effect of C/N on the antagonistic activity of Bacillus BU108
图 6 pH对芽孢杆菌BU108抑菌活性的影响
Figure 6 pH effect on the antibacterial activity of Bacillus BU108
图 7 培养温度对芽孢杆菌BU108抑菌活性的影响
Figure 7 Effect of culture temperature on the antibacterial activity of Bacillus BU108
图 8 培养时间对芽孢杆菌BU108抑菌活性的影响
Figure 8 Effect of culture time on the antibacterial activity of Bacillus BUI08
表 1 无机离子实验因素质量浓度表
Table 1. Level of orthogonal experimental factors of inorganic ions
水平 KH2PO4/(g·L-1) MgSO4·7H2O/(g·L-1) NaCl/(g·L-1) 1 0.5 0.5 5.0 2 1.0 1.0 10.0 3 1.5 1.5 15.0 
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表 2 无机离子对抑菌活性影响的正交试验结果
Table 2. Results of orthogonal tests on the effect of inorganic ions on the yield of antimicrobial agents
试验号 KH2PO4 MgSO4·7H2O NaCl 空白项(ck1) 抑菌圈半径/mm 1 1 1 1 1 15.2 2 1 2 2 2 8.7 3 1 3 3 3 7.2 4 2 1 2 3 10.3 5 2 2 3 1 7.2 6 2 3 1 2 12.8 7 3 1 3 2 7.5 8 3 2 1 3 13.6 9 3 3 2 1 6.8 K1 31.1 33 41.6 29.2 K2 30.3 29.5 25.8 29.0 K3 27.9 26.8 21.9 31.1 R 3.2 6.2 19.7 2.1 说明：1，2，3表示相对应的水平；K1代表每组水平1的抑菌圈半径之和，K2和K3同理。R代表极差，对照组(空白项)的1，2，3不代表水平，只代表正交表里的检验项
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表 3 无机离子对抑菌活性影响的方差分析
Table 3. Variance analysis of the effect of inorganic ions on antibacterial activity
因素 偏差平方和 自由度 均方 F Fα=0.05 KH2PO4 1.85 2 0.93 2.06 19 MgSO4 6.44 2 3.22 7.16 NaCl 72.55 2 36.28 80.62 空白项 0.90 2 0.45
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