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芽孢杆菌Bacillus因能产生耐热、耐旱、抗紫外线和有机溶剂的芽孢[1]，具有在不同环境下存活、定殖与繁殖等方面的优势[2]，对植物病菌的作用机制多样[2-3]，使得芽孢杆菌成为一种理想的生防菌。芽孢杆菌的作用机制主要包括竞争作用、拮抗作用和诱导植物抗性[2-3]等方面，其中拮抗作用是指生防菌株产生次生代谢产物抑制有害病原菌的生长、发展或直接杀灭病原菌，或是通过次生代谢产物改变自身周围的微环境，使之不利于病原微生物的生长繁殖[4]。芽孢杆菌产生的拮抗物质主要有抗生素、细菌素、细胞壁降解酶类和其他抗菌蛋白及挥发性抗菌物质[3]。脂肽类抗生素是一大类重要的拮抗物质[5]，其理化性质稳定，对高温、酸和弱碱具有一定的耐受[6]，已成为芽孢杆菌拮抗物质领域的研究重点。研究发现，解淀粉芽孢杆菌植物亚种Botryosphaeria amyloliquefaciens subsp. plantarun FZB42能够产生surfactin, fengycin等脂肽类物质抑制立枯丝核菌[7]，解淀粉芽孢杆菌SWB16菌株产生的fengycin和iturin对球孢白僵菌分生孢子的发芽和菌丝生长具有显著的抑制作用[8]。借助扫描电子显微镜探究脂肽类抗生素对植物病原菌的抑菌机制表明，脂肽类抗生素导致真菌菌丝及孢子畸形，细胞膜破裂，从而使细胞代谢无法正常进行，最终导致细胞的死亡[9-11]。山核桃Carya cathayensis是投入产出效益很高的经济树种之一[12]。由于纯林化及片面追求产量的经营措施，导致山核桃林病虫害日趋严重[13]，其中危害最大的是山核桃干腐病。山核桃干腐病又称山核桃溃疡病、墨汁病，病原菌为葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea。2009年以来，浙江省与安徽省将近90%的山核桃林感染山核桃干腐病，且病情继续加重。2015年仅临安市枯死的山核桃树累计达3.7万株，损失1 000万元之多。迄今为止对山核桃干腐病缺乏有效的防治方法，虽然某些化学农药有一定的效果，但化学农药的长期大量使用，产生了环境污染、病虫抗药性及农药残留等令人担忧的问题。因此，从生物防治角度来控制山核桃干腐病病情将是有效的途径。本研究应用实验室前期分离得到的微生物资源，通过平板对峙法筛选出1株对病原菌有明显抑制效果的解淀粉芽孢杆菌，经鉴定为解淀粉芽孢杆菌植物亚种（菌种保藏号：CGMCC 11640）。为初步了解CGMCC 11640产生的拮抗物质对山核桃干腐病病原菌的抑菌机制，推测拮抗物质中是否含有耐高温的脂肽类抗生素，本研究利用扫描电子显微镜观察CGMCC 11640菌体及其灭菌发酵上清液对山核桃干腐病病原菌菌丝生长及形态的影响，为山核桃干腐病生防菌的开发利用提供初步理论基础。
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山核桃干腐病病原菌，解淀粉芽孢杆菌植物亚种（菌种保藏号为CGMCC 11640）。
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平板对峙法共同培养病原菌与CGMCC 11640。在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）平板中央接种病原菌圆饼，在距平板中心10 mm的两侧接CGMCC 11640圆饼，3个圆饼保持在一条水平线上，28 ℃培养。从抑菌带一侧的病原菌菌落边缘切正方形小块制备扫描电镜样品，观察对峙培养4，6，7 d后病原真菌的形态变化，以单独培养的病原菌作为对照。
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选取CGMCC 11640菌的单菌落，接种于100 mL PDA液体培养基中，在37 ℃，摇瓶转速为180 r·min-1条件下培养14 h，得到CGMCC 11640菌株种子液。CGMCC 11640种子液按接种量为3%（体积分数）分别接种于500 mL PDA液体培养基中，在37 ℃，180 r·min-1条件下培养48 h，即得到CGMCC 11640菌株发酵液。将CGMCC 11640菌株发酵液3 000 r·min-1离心15 min后，去除菌体，得到CGMCC 11640灭菌上清液。将CGMCC 11640发酵上清液与水分别按V（上清液）:V（水）=1 : 9（处理1），2 : 8（处理2），5 : 5（处理3）的比例配制成的含有CGMCC 11640灭菌发酵上清液的PDA混合培养基。
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采用生长速率法测定菌丝抑制率。将含有CGMCC 11640灭菌发酵上清液的PDA混合培养基，在培养基中央分别接种直径10 mm的病原菌菌饼，重复3次·处理-1。28 ℃培养5 d后，十字交叉法测量病原菌菌落直径，计算菌丝抑制率。抑制率（%）=[（对照组菌落直径-处理组菌落直径）/对照组菌落直径]×100%。
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在含有CGMCC 11640灭菌发酵上清液的PDA混合培养基中央接种直径10 mm的病原菌菌饼，28 ℃培养。重复3次·处理-1。从病原菌菌落边缘切正方体小块制备扫描电镜样品，观察培养3 d后病原真菌菌丝的形态变化，以在不含CGMCC 11640灭菌发酵上清液的PDA纯培养基上生长的病原菌作为对照。
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将切取的菌落边缘正方体小块，浸没于体积分数为2.5%的戊二醛，4 ℃下静置过夜。0.1 mol·L-1磷酸缓冲盐溶液（PBS）浸洗样品15 min，重复3次。随后，将样品依次浸没于梯度体积分数为30%，50%，70%，80%，90%，95%的乙醇中15 min，再用体积分数为100%的乙醇洗脱2次，20 min·次-1。用V（乙醇）:V（醋酸异戊酯）＝1 : 1混合液处理样品30 min，再用体积分数为100%醋酸异戊酯处理样品2 h。样品自然风干后镀金，使用扫描电镜观察。
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平板对峙培养时病原菌与CGMCC 11640形成抑菌带，说明CGMCC 11640抑制病原菌菌丝的生长。用扫描电镜观察病原菌单独培养（对照组）以及病原菌与CGMCC 11640对峙培养4，6，7 d时病原菌丝形态发现，对照组培养4，6，7 d的病原菌菌丝均通体完整饱满，粗细均匀，图 1A为对照组培养4 d时的扫描电镜图；对峙培养的病原菌菌落边缘菌丝明显异常，培养第4天时有部分菌丝出现萎缩干瘪现象（图 1B），第6天则绝大多数菌丝出现缩干瘪现象（图 1C），到培养第7天菌丝全部萎缩干瘪（图 1D），说明后期干瘪程度比前期严重。对照组的孢子形态饱满（图 2A），而对峙培养第4天时病原菌孢子正常（图 2B），而到第6天时部分病原菌孢子表现出凹陷、萎缩现象（图 2C），第7天异常孢子数量增加花板（图 2D）。畸形孢子的数量随之培养时间的延长而增多。
图 1 扫描电镜下CGMCC 11640菌体对山核桃干腐病菌丝形态的影响
Figure 1. Effect of CGMCC 11640 cells on hypha of Botryosphaeria dothidea under scanning electron microscope
图 2 扫描电镜下CGMCC 11640菌体对山核桃干腐病孢子形态的影响
Figure 2. Effect of CGMCC 11640 cells on spores of Botryosphaeria dothidea under scanning electron microscope
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11640灭菌发酵上清液对病原菌菌丝生长的抑制效果测量含有不同比例CGMCC 11640灭菌发酵上清液的PDA混合培养基上生长5 d后的病原菌菌落直径，计算出菌丝抑制率如表 1。结果表明：CGMCC 11640灭菌发酵上清液对山核桃干腐病病原菌菌丝生长均具有较强的抑制作用，含灭菌发酵上清液与水的比例分别为V（上清液）:V（水）=1 : 9，2 : 8，5 : 5的PDA混合培养基上生长的病原菌菌丝抑制率分别为75.81%，88.84%和94.30%，说明抑制效果在实验范围内随着发酵液含量的增加而增强。
表 1 CGMCC 11640灭菌发酵上清液对山核桃干腐病菌丝抑制率
Table 1. Hyphal inhibitory ratio of CGMCC 11640 sterilized supernatant liquor against B. dothidea
V(发酵上清液）:V(水） 对照组菌落直径/mm 处理组菌落直径/mm 抑制率/% 1:9 86.0±0.1 20.8±2.3 a 75.81 2:8 86.0±0.1 9.6±1.4 b 88.84 5:5 86.0±0.1 4.9±0.1 c 94.30 说明：不同字母表示不同处理之间病原菌菌落直径在5%水平上差异显著，即P＜0.05。 -
分别切取不含CGMCC 11640灭菌发酵上清液的PDA纯培养基（对照组）和含有CGMCC 11640灭菌发酵上清液PDA混合培养基（处理组）上生长3 d后的病原菌边缘菌落，制成扫描电镜样品，观察菌丝形态变化。结果发现：对照组病原菌丝菌丝整体圆润光滑，粗细均匀（图 3A），处理组病原菌菌丝出现萎缩干瘪现象（图 3 B），观察结果与2.1相同，说明耐高温的CGMCC 11640的代谢产物对病原菌起抑制作用。
图 3 扫描电镜下CGMCC 11640灭菌发酵上清液对山核桃干腐病菌丝形态的影响
Figure 3. Effect of sterilized supernatant liquor from CGMCC 11640 on hypha of B. dothidea under scanning electron microscope
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本研究通过扫描电镜观察，结合其他研究者对芽孢杆菌抑真菌的机制成果推测，得出结论：CGMCC 11640菌株及其代谢物对病原菌的抑制作用主是通过破坏菌丝和孢子细胞壁和细胞膜，使细胞内原生质的泄露，从而导致菌丝和孢子萎缩，最终杀死病原菌细胞。
非核糖体合成的脂肽类抗生素是芽孢杆菌产生的拮抗物质中重要的一类。常见的三大家族脂肽类物质surfactins，iturins和fengycins在防治植物病害中最早开始研究[14-16]。因脂肽类稳定的理化性质及广泛的抗菌活性使其成为生防菌剂的研究热点。脂肽类的抗菌机制研究主要集中在作用于细胞膜，引起细胞膜的破裂和细胞质的泄露[17-19]。陶阳等[10]采用显微技术观察发现2种抗菌脂肽surfctin和fengycin能够导致桃软腐病菌菌丝体变形，细胞壁和细胞膜的破裂，原生质的泄露，细胞器、细胞核出现异常，使细胞代谢无法正常进行，最终导致细胞的死亡。胡陈云等[11]通过扫描电镜观察发现，被抗菌脂肽抑制的人参病原菌菌丝出现明显萎缩、皱缩现象。有研究表明：脂肽抗生素理化性质稳定，如较好的热稳定性，121 ℃高温处理仍有较高的活性[20]。本研究用含有CGMCC 11640灭菌发酵上清液的PDA混合培养基培养病原菌，发现病原菌菌丝生长受到抑制，说明CGMCC 11640发酵液中含有耐高温的抑菌物质。然后利用扫描电镜观察与CGMCC 11640菌株对峙培养以及在含有CGMCC 11640灭菌发酵上清液的培养基上生长的病原菌菌丝形态结构，发现病原菌菌丝形态均发生异常，主要表现为菌丝萎缩、干瘪、形成褶皱，但没有观察到菌丝体的外壁溶解现象；对峙培养6 d时观察病原菌孢子出现凹陷、萎缩现象，畸形孢子的数量随着培养时间的延长而增多。由此说明：CGMCC 11640通过代谢产物破坏细胞壁和细胞膜，使细胞内原生质的泄露，从而导致菌丝和孢子萎缩，与报道的有关脂肽抗生素的作用机制相一致。后续采用酸沉淀法提取脂肽类物质，经HPLC，LC-MS技术分析鉴定得出，CGMCC 11640菌株能够产生surfactins，iturins和fengycins三大类脂肽类物质。2015年5月进行初步林间试验，将脂肽粗提物与愈合剂混合后涂在山核桃干腐病斑处，2016年5月观察发现，伤口愈合，不再有黑色液体流出，表明CGMCC 11640产生的脂肽类物质对山核桃干腐有较好的抑制作用。因此，可以将CGMCC 11640菌株产生的脂肽类抗生素制成生物农药防治山核桃干腐病。
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本研究承蒙浙江农林大学林业与生物技术学院王彦先生在扫描电镜使用方面的技术指导。谨此致谢！
Inhibitory mechanism of Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum CGMCC 11640 against Botryosphaeria dothidea, the pathogen of canker disease of Carya cathayensis
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摘要: 葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea引起的山核桃Carya cathayensis干腐病是导致山核桃树发病甚至死亡的主要病害之一，对山核桃产业带来了严重威胁。通过平板对峙法成功筛选出1株对病原菌有明显抑制效果的解淀粉芽孢杆菌植物亚种Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum（菌种保藏号：CGMCC 11640）。试图通过扫描电镜探究该菌株对山核桃干腐病菌的抑制机制。对峙培养4，6和7 d后，比较菌丝和孢子形态，发现病原菌菌丝出现萎缩干瘪现象，培养时间越长，菌丝萎缩干瘪程度越大；对峙培养4 d时病原菌孢子正常，而到第6天时部分病原菌孢子表现出凹陷、萎缩现象，第7天异常孢子数量增加。用CGMCC 11640发酵上清液与水分别按V（上清液）：V（水）=1：9，2：8，5：5的比例配制成的马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）混合培养基培养病原菌，结果发现病原菌菌丝抑制率分别为75.81%，88.84%和94.30%，说明灭菌发酵上清液对病原菌有抑制作用。电镜观察发现，病原菌菌丝在含有灭菌发酵上清液的PDA混合培养基上出现萎缩干瘪现象。通过扫描电镜观察，推测CGMCC 11640菌株及其代谢物对病原菌的抑制作用主是通过破坏菌丝和孢子细胞壁和细胞膜，使细胞内原生质泄露，从而导致菌丝和孢子萎缩，最终杀死病原菌细胞。
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关键词:
- 森林保护学 /
- 山核桃干腐病 /
- 解淀粉芽孢杆菌植物亚种 /
- 抑菌机制 /
- 扫描电镜
Abstract: The canker disease of Carya cathayensis caused by Botryosphaeria dothidea, is one of the diseases in China that has resulted in serious damage and even death for the tree. To overcome the serious disease threat to the C. cathayensis industry, Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum CGMCC 11640, which has shown a strong inhibitive activity in vitro against Botryosphaeria dothidea, was obtained by screening with the dual-culture method and cultured in medium mixtures with ratios of sterilized fermentation supernate to PDA being 1:9, 2:8, and 5:5(volume ratio). Then, the inhibitory mechanisms of strain CGMCC 11640 against Botryosphaeria dothidea were further explored by scanning electron microscopy (SEM). Results revealed that the Botryosphaeria dothidea strain growth rate for the three volume ratio mediums were restrained by 75.8% for 1:9, 88.8% for 2:8, and 94.3% for 5:5. The SEM results showed that both bacterial cells and their sterilized fermentation supernate exhibited strong inhibition activity in vitro against Botryosphaeria dothidea and that the hyphae and spores of Botryosphaeria dothidea exhibited atrophy and introcession. Thus, CGMCC 11640 inhibited Botryosphaeria dothidea by destroying cell membranes (e.g. punching holes in them) and walls of hyphae and spores resulting in leakage of plasmatic material from the inside of the cells. -
木材在中国可再生资源中占有很大的比例。随着国民经济逐步增长，木材市场不断扩大。目前，由于优质木材频频出现供需不平衡、木材造假等问题，因此采用多种识别技术来甄别木材种类已成为必然。木材种类识别除了依照形态学处理外，还可以使用计算机图像识别、DNA识别等方法[1-3]，但是这些方法和传统的取样方法一样[4]，都需要对树木进行剖析和制样，对于一些珍贵的木材会造成不必要的浪费，甚至会降低本身的价值。近红外光谱分析技术是20世纪70年代兴起的一种新的木材识别分析技术。它作为一种常用的测量工具，具有快速、无损、在线分析等优势。近几年，学者们应用近红外光谱技术对木材种类进行了识别研究[5]，如王学顺等[6]利用近红外光谱技术，结合主成分分析(PCA)和BP神经网络对不同木材种类进行了识别研究，效果良好。谭念等[7]基于近红外光谱技术，联合PCA和支持向量机实现了木材种类的有效鉴别。
目前，近红外光谱分析技术用于木材种类识别大多采用PCA进行特征提取，实现数据降维，但这种方法的特征值筛选有一定的局限性，仅凭累计贡献率决定特征值的个数，无法通过参数化等方法对处理过程进行干预，效率和物理实用性不高。连续投影算法(SPA)是一种常用的特征波长筛选算法。它能够利用向量的投影分析，寻找含有最低限度冗长信息的变量组，通过参数调整可实现较强物理实用性的数据压缩。陈远哲等[8]基于SPA构建了最小偏二乘法回归模型，适用于淡水鱼储藏期质构品质的快速无损检测。郭文川等[9]通过比较不同特征提取方式，得出采用SPA和随机森林识别准确率最高。遗传算法(GA)用于寻优，广泛应用于机器学习等领域。
本研究将SPA和GA联用，在运用SPA获得特征值后，应用GA进一步寻找最佳特征参数，以提升木材识别的效率和准确率。本研究以红檀Swartizia spp.、刺猬紫檀Pterocarpus erinaceus、巴里黄檀Dalbergia bariensis、大果紫檀Pterocarpus macrocarpus、红檀香Myroxylon balsamu、破布木Cordia dichotoma、豆瓣香Osmanthus delavayi、檀香紫檀Pterocarpus santalinus、中美洲黄檀Dalbergia granadillo和黑檀Dalbergia nigra为研究对象，应用可见/近红外光谱仪采集10种木材的光谱图，运用不同的预处理方式叠加进行降噪分析，以BP神经网络为木材种类的分类识别算法，探讨经GA优化的SPA较之常规特征提取算法的优越性，为更精确高效的木材识别提供参考。
1. 材料与方法
1.1 数据采集与主要仪器
数据采集：参与试验的木材共10种，试样为6 cm×5 cm×2 cm的木块。每种木材制备5块样本，共计50块。每块木材分10个点采集光谱，以木块横向等分2份，纵向等分5份，取每份的中心点作为标记进行采样，每个点采集10组数据，取平均值作为此样点的实验数据，即1块试样采集10组实验数据，10种木材共计采集500组实验数据。样点采集遵循以下原则：①采谱过程中每15 min进行1次空白校正，以保证光谱的稳定性。②每块木材样本大小、薄厚和形状均保持一致，确保样点在每块样本木块上的属性相同，最大程度缩小误差。
主要仪器：LabSpec 5000光谱仪(ASD公司，美国)，波长为350~2 500 nm。用光谱仪配套的软件Indico Pro Version 3.1采集光谱数据。
1.2 主成分分析法(PCA)
PCA是一种常用的波段降维手段。主成分通常表示为原始变量的某种线性组合，它们不仅能够代表原始变量绝大多数的信息，还可以一定程度上去除噪声，压缩数据，对高维数据进行降维，减少预测变量的个数[10]。
1.3 连续投影算法(SPA)
SPA是一种使矢量空间共线性最小化的前向变量选择算法，在降低共线信息的研究和有效信息获取的研究中取得较好的成效[11-12]。本研究应用SPA在光谱全波段中筛选出少量几个特征波段，不仅能够减少参与识别的光谱波段个数，并且可以保证特征波段之间的共线性最小，进而提高识别正确率和速度。
1.4 SPA-GA-BP神经网络识别方法
当SPA筛选后的输入自变量较多且不是相互独立时，利用BP神经网络容易出现过拟合的现象，从而导致所建立的模型精度低、建模时间长等问题，因此，在构建模型前，有必要对输入自变量进行优化，选择最能反映输入与输出关系的自变量参与建模。GA优化能较好解决上述问题。利用GA进行优化计算，需要将解空间映射到编码空间，每个编码对应问题的1个解。本研究将编码长度设计为10，木材光谱特征的每位对应1个输入自变量，每一位的基因取值只能是“1”和“0”，如果一位值为“1”，表示该位对应的输入自变量参与最终的建模；反之，则表示“0”对应的输入自变量不作为最终的建模自变量。选取测试集数据均方误差的倒数作为GA的适应度函数，这样，经过不断的迭代进化，最终筛选出最具代表性的输入自变量参与建模[13-14]。GA优化的设计步骤主要为：首先产生初始种群，对适应度函数进行计算，其次进行选择、交叉和变异的基础操作，最后优化结果输出，构建其模型。设计步骤如图1所示。
2. 结果与分析
2.1 10种木材的原始光谱图
应用LabSpec 5000光谱仪采集10种木材的原始光谱图，其中选取红檀的50个样本进行对比分析(图2)。
为了更直观地对比10种木材光谱图的差异，分别取10种木材中第1组数据进行绘图分析(图3)。由图3可见：大果紫檀、红檀和檀香紫檀的强度数值过小，几乎与x轴重叠。
由图2和图3可以看出：同一种木材光谱图的波形基本一致，但强度值略有差异；刺猬紫檀、巴里黄檀、红檀香、破布木、豆瓣香、中美洲黄檀这6种木材的光谱图从波峰、形状上相似性均较高，黑檀与这6种木材的光谱图也较相似，仅在第1个波谷处形状上略有差异。
2.2 主成分分析的BP神经网络识别
原始光谱图往往带有一定的噪声，影响BP神经网络识别的正确率，因此有必要对光谱数据进行预处理[15-17]。数据的预处理方法较多，本研究分别采用了移动平均法、移动平均法+多元散射校正(MSC)、移动平均法+标准正态变量变换(SNV)、Savitzky-Golay卷积平滑算法(S-G滤波器)、S-G滤波器+MSC和S-G滤波器+SNV对10种木材的原始光谱进行了预处理，通过对比分析以确定最佳的预处理方法。
针对上述的几种预处理方法，分别进行主成分特征提取。以累计贡献率达95%及以上为主成分个数的选取标准。以选取的主成分为输入向量，40个样本作为训练，10个样本作为测试(后文测试数据均与此相同，不再赘述)。应用BP神经网络进行木材种类识别测试，经过20次的随机试验，获得各种预处理下BP神经网络的平均识别结果(表1)。由表1可以看出：采用S-G滤波器+SNV预处理时，BP 神经网络获得的平均识别率最高，达到了84.7%。
表 1 不同预处理的PCA-BP神经网络识别率Table 1 PCA-BP neural network recognition with different preprocessing检测方式 预处理方法 累计贡
献率/%主成分
个数/个平均识
别率/%可见/近红外光谱 对照组 95 12 80.2 移动平均法 95 14 81.4 移动平均法+MSC 95 10 82.1 移动平均法+SNV 95 11 83.5 S-G滤波器 95 12 81.3 S-G滤波器+MSC 95 13 82.9 S-G滤波器+SNV 95 15 84.7 为了方便对比10种木材各自的识别效果，整理了S-G滤波器+SNV预处理时10种木材的BP神经网络识别结果：10种木材的识别效果相差不大，最低为豆瓣香(83.1%)，最高为刺猬紫檀(85.8%)。
2.3 SPA-BP神经网络识别
2.3.1 不同预处理的对比分析
针对2.2节中的几种预处理方法进行SPA的BP神经网络识别探讨，以确定最佳的预处理方法。为了对比预处理的效果，针对SPA方法中的起始波段和特征值个数进行了随机设置。令SPA方法中的起始波段(Winitial)为15 nm，特征值个数(Ntot)为10，对各种预处理后的数据进行SPA特征提取，应用BP神经网络进行20次的随机识别，得出10种木材的平均识别率(表2)。由表2可以看出：对于不同的预处理方式，SPA-BP的正确识别率有所不同，移动平均法+SNV的预处理方法最佳，正确率可达88.2%，因此，后续在分析SPA-BP神经网络识别木材时，本研究仅针对移动平均法和SNV叠加的预处理方法进行分析。
表 2 不同预处理的SPA-BP神经网络平均识别率Table 2 Average recognition rate of SPA-BP neural network with different pretreatments预处理方法 平均识
别率/%预处理方法 平均识
别率/%对照组 86.1 S-G滤波器 86.4 移动平均法 87.2 S-G滤波器+MSC 86.8 移动平均法+MSC 86.5 S-G滤波器+SNV 87.3 移动平均法+SNV 88.2 2.3.2 基于吸收峰的最佳起始波段分析
影响SPA特征提取的因素通常有2个，分别是Winitial和Ntot。随着Winitial和Ntot的改变，提取的特征波长分布会有所不同，从而影响最终BP神经网络的正确识别率，此处探讨最佳Winitial的选取方法。光谱图中的特征吸收峰对被分析物质是很关键的特征，因此首先考虑分别以木材的吸收峰和非吸收峰作为起始波段，通过对比分析，确定最佳起始波段。①吸收峰作为起始波段的选取。光谱图中分布了大小不一的波峰，选取波峰特征较明显的吸收峰进行分析，以波峰点为中心点，取宽度相等的波段区间(每个波段均取51个数据)作为吸收峰的集中分布波段，10种木材的吸收峰集中波段如表3所示。由表3可以看出：10种木材的吸收峰重叠的波段有1 230~1 260、1 780~1 810、1 940~1 970 nm。分别取3个波段的中位数作为起始波段值，即1 245、1 795和1 955 nm。因为Winitial的数值表示为序列号，所以在此基础上减去初始波段350 nm，Winitial最终取值分别为895、1 445、1 605 nm。②非吸收峰作为起始波段的选取。将全波段350~2 500 nm等分成5份，分别在每个等分波段中随机选取1个非吸收峰作为起始波段。本研究随机选取的5个波段的波长分别为365、1 145、1 345、1 700、2 300 nm。在此基础上减去初始波段350 nm，Winitial最终取值分别为15、795、995、1350、1 950。分别以上述的吸收峰和非吸收峰为起始波段值，即以15、795、895、995、1 350、1 445、1 605、1 950 nm作为SPA的起始波段。SPA的特征值个数统一取10，进行BP神经网络识别，经过20次的随机试验，10种木材提取的特征波长分布和平均识别率如表4所示。由表4可以看出：以吸收峰作为起始波段时，特征波长分布大多追溯在吸收峰附近。对比表4的识别率可见，起始波段为1 445 nm时最高，达90.4%，其余按照1605、895、795、995、1 350、1 950和15 nm的顺序依次递减。不难看出，吸收峰作为起始波段的识别率普遍优于非吸收峰。
表 3 10种木材吸收峰个数和集中波段Table 3 Number of absorption peaks and concentrated bands of 10 species of wood木材种类 吸收峰个数/个 集中分布波段/nm 红檀 7 920~970、1 010~1 060、1 210~1 260、1 570~1 620、1 779~1 829、1 921~1 971、2 122~2 172 大果紫檀 7 930~980、1 020~1 070、1 220~1 270、1 580~1 630、1 780~1 830、1 920~1 970、2 120~2 170 檀香紫檀 7 932~982、1 023~1 073、1 221~1 271、1 568~1 618、1 777~1 827、1 921~1 971、2 123~2 173 刺猬紫檀 9 763~813、1 222~1 272、1 308~1 358、1 461~1 511、1 548~1 598、1 760~1 810、1 931~1 981、
2 092~2 142、2 211~2 261巴里黄檀 9 765~815、1 221~1 271、1 307~1 357、1 466~1 516、1 545~1 595、1 769~1 819、1 930~1 980、
2 087~2 137、2 219~2 269红檀香 9 753~803、1 223~1 273、1 309~1 359、1 463~1 513、1 558~1 608、1 771~1 821、1 932~1 982、
2 092~2 142、2 212~2 262破布木 9 763~813、1 222~1 272、1 317~1 367、1 463~1 513、1 551~1 601、1 772~1 822、1 933~1 983、
2097~2147、2214~2264豆瓣香 9 766~816、1230~1280、1317~1367、1468~1518、1554~1604、1775~1825、1940~1990、
2095~2145、2 216~2 266中美洲黄檀 9 753~803、1 218~1 268、1 305~1 355、1 457~1 507、1 544~1 594、1 769~1 819、1 928~1 978、
2 084~2 134、2 209~2 259黑檀 9 881~931、1 218~1 268、1 305~1 355、1 452~1 502、1 557~1 607、1 772~1 822、1 923~1 973、
2 092~2 142、2 218~2 268表 4 不同起始波段的SPA-BP神经网络平均识别率Table 4 Average recognition rate of SPA-BP neural network with different starting bands特征值数/个 起始波段/nm 10种木材提取特征波长分布/nm 平均识别率/% 10 895 364~368、2 141~2 144；402~410；418~426；324、2 135~2 142；375~383；432~440；400~408；476~484；420~428；1 452~1 460 89.7 10 1 445 478~586；410~418；423~431；500~508；405~413；436~444；418~426；693~701；891~899；888~896 90.4 10 1 605 133~135、2 137~2 142；891~899；891~899；2 135~2 142、2 132；419~427；819~827；420~428；446~454；892~990；893~901 90.1 10 15 2133~135、2 137~2 142；2 133~2 135、2 137~2 142；408~416；292、22 135~2 142；375~383；430~438；414~422；461~469；420~428；890~898 88.3 10 795 61~64、2 139~2 143；405~413；420~428；326、2 135~2 142；378~386；527~535；403~411；478~486；420~422、1 453~1 458；1 350~1 358 89.5 10 995 203~209、2 141~2 142；399~407；418~426；349~352、2 138~2 142；3381~389；434~442；421~429；485~493；527~535；1 452、1 454~ 1458、1 461~1 463 89.2 10 1 350 82~90；891~899；434~442；519~527；416~424；886~894；420~428；694~702；891~899；888~896 88.9 10 1 950 13、2 135~2 142；379~387；407~415；281、2 135~2 142；293~301；428~436；
1 058~1 066；450~458；413、1 452~1 459；1 452~1 46088.6 说明：木材依次为红檀、大果紫檀、檀香紫檀、刺猬紫檀、巴里黄檀、红檀香、破布木、豆瓣香、中美洲黄檀、黑檀 2.3.3 最佳特征值个数分析
将起始波段固定为最佳，即Winitial=1 445 nm，探讨Ntot取不同数值时，对BP神经网络识别木材的影响。从图3的光谱图可以看出：红檀、大果紫檀、檀香紫檀3种木材样本的吸收峰有7个，刺猬紫檀、巴里黄檀、红檀香、破布木、豆瓣香、中美洲黄檀和黑檀有9个。考虑吸收峰能更好地反映木材光谱图的特征，Ntot分别取了7和9，同时参考SPA的相关文献[18-21]，且基于BP神经网络输入向量过多也会影响识别精度，又分别取了5、8、10、20、25进行了对比分析。基于以上特征数，分别应用BP神经网络进行木材识别，每个状态仍随机运行20次，获得的结果如表5所示。分析表5可知：整体上，当特征值个数取7和9时正确率偏高，说明特征值个数的取值和吸收峰值有关；当特征值个数取9时识别率最高，达93.2%，说明特征值个数和单个木材的吸收峰无关，应由整体的吸收峰来确定。
表 5 同一起始波段不同特征波段的SPA-BP神经网络平均识别率Table 5 Average recognition rate of SPA-BP neural network with the same starting band and different characteristic bands起始波
段/nm特征值
数/个平均识
别率/%起始波
段/nm特征值
数/个平均识
别率/%1 445 5 92.3 1 445 10 90.6 1 445 7 93.0 1 445 20 92.7 1 445 9 93.2 1 445 25 91.2 1 445 8 91.6 2.3.4 10种木材的最佳识别结果分析
基于最佳预处理方式(移动平均法+SNV)、最佳起始波段(Winitial=1 445 nm)和最佳特征值个数(Ntot=9)，整理出SPA-BP神经网络识别10种木材各自的识别结果(表6)。由表6可以看出：在最佳参数设置下，SPA-BP神经网络的识别率较高，大果紫檀、红檀香、中美洲黄檀和黑檀的平均识别率均为100.0%，其他木材的平均识别率最低达90.7%，最高达95.1%。
表 6 同一预处理方式10种木材的SPA-BP神经网络平均识别率Table 6 Average recognition rate of SPA-BP neural network for 10 species of wood with the same pretreatment method木材种类 平均识
别率/%木材种类 平均识
别率/%木材种类 平均识
别率/%红檀 90.9 巴里黄檀 94.2 中美洲黄檀 100.0 大果紫檀 100.0 红檀香 100.0 黑檀 100.0 檀香紫檀 90.7 破布木 94.6 平均 95.7 刺猬紫檀 95.1 豆瓣香 91.0 说明：预处理方式为移动平均法+SNV，起始波段为1 445 nm, 特征值数为9个 2.4 SPA-GA-BP神经网络识别
针对SPA的最佳预处理方式(移动平均法+SNV)、最佳起始波段(Winitial=1 445 nm)和最佳特征值个数(Ntot=9)，基于SPA-GA的BP神经网络识别方法随机运行20次，采用GA优化前后建模时间明显缩短；大果紫檀、红檀香、中美洲黄檀和黑檀在采用GA优化前后正确识别率均为100.0%，说明这4种木材在采用SPA特征提取时，识别率较高，采用GA优化后对正确识别率影响不大；其他6种木材采用SPA特征提取时均有一定的误判，运用GA优化后识别率有一定的提高。其中破布木的识别率由90.0%提升到了100.0%，巴里黄檀由88.9%提升到了100.0%，刺猬紫檀由90.9%提升到了100.0%。虽然每次仅提升1种木材，但通过多次运行，可达到整体提升的效果。
针对上述20次运行结果，获得10种木材各自的识别结果：大果紫檀、中美洲黄檀、刺猬紫檀、巴里黄檀、红檀香、破布木和黑檀平均识别正确率高达100.0%，其他3种木材的平均识别率最低达91.5%，最高达95.7%，10种木材的平均识别率达98.0%。
已有的木材识别研究的特征提取方法主要集中于主成分分析[22]、导数处理[23]等，主成分分析的平均识别率为70.0%~95.3%，导数处理识别率达98.6%。虽然这些研究识别率较高，但这些研究参与识别的木材种类大多仅为4~5个，对于同时识别10种木材未见尝试。经研究，参与识别的木材种类越多，识别率越难保证。本研究的主成分分析法识别10种木材，平均识别率仅为84.7%。本研究采取SPA-GA联合的特征提取方法，识别对象为10种木材，通过调整吸收峰、特征值等参数，最终7种木材的平均识别率达100.0%，且识别速度提高为原来的2~3倍。为了进一步验证识别率的鲁棒性，本研究还采用多种预处理的方式，使得原始数据表现出良好的稳定性和容错性。最后实验数据均为随机20次运行的结果，说明训练好的模型可以随时间和频次迁移应用，识别性能不会降低。
3. 结论
研究结果表明：①SPA-GA法识别木材时，选择移动平均法+SNV的预处理方式效果最佳。②对于参数的选择，起始波段选取吸收峰比选取非吸收峰识别率更高，特征值个数结合光谱图的峰值个数选取更恰当。本研究分别选取起始波段为1 445 nm，特征值个数为9个。③SPA-GA提取光谱图特征时识别性能最佳。SPA特征值经GA寻优后，特征个数大多减少为原来的一半左右，优化后BP神经网络的平均识别速度显著提升，大果紫檀、中美洲黄檀、刺猬紫檀、巴里黄檀、红檀香、破布木和黑檀等7种木材的平均识别正确率均高达100.0%，总体识别率较SPA显著提高。
本研究仅选择了红檀、刺猬紫檀、巴里黄檀、大果紫檀、红檀香、破布木、豆瓣香、檀香紫檀、中美洲黄檀和黑檀这10种木材样本进行了探讨，对于其他木材的识别有待进一步研究验证。
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图 1 扫描电镜下CGMCC 11640菌体对山核桃干腐病菌丝形态的影响
Figure 1 Effect of CGMCC 11640 cells on hypha of Botryosphaeria dothidea under scanning electron microscope
图 2 扫描电镜下CGMCC 11640菌体对山核桃干腐病孢子形态的影响
Figure 2 Effect of CGMCC 11640 cells on spores of Botryosphaeria dothidea under scanning electron microscope
图 3 扫描电镜下CGMCC 11640灭菌发酵上清液对山核桃干腐病菌丝形态的影响
Figure 3 Effect of sterilized supernatant liquor from CGMCC 11640 on hypha of B. dothidea under scanning electron microscope
表 1 CGMCC 11640灭菌发酵上清液对山核桃干腐病菌丝抑制率
Table 1. Hyphal inhibitory ratio of CGMCC 11640 sterilized supernatant liquor against B. dothidea
V(发酵上清液）:V(水） 对照组菌落直径/mm 处理组菌落直径/mm 抑制率/% 1:9 86.0±0.1 20.8±2.3 a 75.81 2:8 86.0±0.1 9.6±1.4 b 88.84 5:5 86.0±0.1 4.9±0.1 c 94.30 说明：不同字母表示不同处理之间病原菌菌落直径在5%水平上差异显著，即P＜0.05。 
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[1] 李晶, 杨谦.生防枯草芽孢杆菌的研究进展[J].安徽农业科学, 2008, 36(1):106-111. LI Jing, YANG Qian. Research progress on biocontrol Bacillus subtilis[J]. J Anhui Agric Sci, 2008, 36(1):106-111. [2] 陈中义, 张杰, 黄大昉.植物病害生防芽孢杆菌抗菌机制与遗传改良研究[J].植物病理学报, 2003, 33(2):97-103. CHEN Zhongyi, ZHANG Jie, HUANG Dafang. Research progress on antimicrobial mechanism and genetic engineering of Bacillus for plant diseases biocontrol[J]. Acta Phytopathol Sin, 2003, 33(2):97-103. [3] 彭研, 陈相艳, 裘纪莹, 等.生防芽孢杆菌的研究进展[J].山东农业科学, 2013, 45(7):138-140. PENG Yan, CHEN Xiangyan, QIU Jiying, et al. Research progress on biocontrol Bacillus[J]. Shandong Agric Sci, 2013, 45(7):138-140. [4] 赵东洋. 解淀粉芽孢杆菌SWB16脂肽类代谢产物对球孢白僵菌的拮抗作用及发酵条件的初步优化[D]. 重庆: 西南大学, 2014. ZHAO Dongyang. Antagonism of the Lipopeptide Metabolites Produced by Bacillus amyloliquefaciens strain SWBl6 Against Beauveria bassiana and Prelimary Optimization of Its Formation[D]. Chongqing:Southwest Universuty, 2014. [5] 王智文, 刘训理.芽孢杆菌非核糖体肽的研究进展[J].蚕业科学, 2006, 32(3):392-398. WANG Zhiwen, LIU Xunli. Research advances in nonribosomal peptides produced by Bacillus[J]. Sci Sericul, 2006, 32(3):392-398. [6] 徐杨, 王楠, 李伟, 等.海洋枯草芽孢杆菌3512A抗真菌脂肽的分离纯化及结构特性鉴定[J].中国生物防治, 2009, 25(4):328-333. XU Yang, WANG Nan, LI Wei, et al. Purification and structural identifications of the antifungal lipopeptides produced by Marine bacterium Bacillus subtilis 3512A[J]. ChinJ Biol Control, 2009, 25(4):328-333. [7] CHOWDHURY S P, HARTMANN A, GAO Xuewen, et al. Biocontrol mechanism by root-associated Bacillus amyloliquefaciens FZB42:a review[J]. Front Microbiol, 2015, 6:780. doi:10.3389/fmicb. 2015. 00780. [8] 汪静杰, 赵东洋, 刘永贵, 等.解淀粉芽孢杆菌SWB16菌株脂肽类代谢产物对球孢白僵菌的拮抗作用[J].微生物学报, 2014, 54(7):778-785. WANG Jingjie, ZHAO Dongyang, LIU Yonggui, et al. Antagonism against Beauveria bassiana by lipopeptide metabolites produced by entophyte Bacillus amyloliquefaciens strain SWB16[J]. Acta Microbiol Sin, 2014, 54(7):778-785. [9] 孔建, 赵白鸽, 王文夕, 等.枯草芽孢杆菌抗菌物质对镰刀菌抑制机理的镜下研究[J].植物病理学报, 1998, 28(4):337-340. KONG Jian, ZHAO Baige, WANG Wengxi, et al. Survey on the antifungal mechanism of Bacillus subtilis cohen to Fusarium oxysporum under the microscope[J]. Acta Phytopathol Sin, 1998, 28(4):337-340. [10] 陶阳. Bacillus subtilis fmbJ抗菌脂肽对Rhizopus stolonifer作用机理研究[D]. 南京: 南京农业大学, 2010. TAO Yang. Antifungal Mechanism of Antimicrobial Lipopeptide Produced by Bacillus subtilis fmbJ against Rhizopus stolonifer[D]. Nanjing:Nanjing Agricultural University, 2010. [11] 胡陈云, 李勇, 刘敏, 等.枯草芽孢杆菌ge25对2种人参病原菌的抑制作用及脂肽类抑菌代谢产物的鉴定[J].中国生物防治学报, 2015, 31(3):386-393. HU Chenyun, LI Yong, LIU Min, et al. Antagonism of Bacillus subtilis ge25 against two kinds of ginseng pathogens and identification of antifungal lipopeptide metabolites[J]. Chin J Biological Control, 2015, 31(3):386-393. [12] 郑万钧.中国树木志[M].北京:中国林业出版社, 1985:23-79. [13] 杨淑贞, 丁立忠, 楼君芳, 等.山核桃干腐病发生发展规律及防治技术[J].浙江林学院学报, 2009, 26(2):228-232. YANG Shuzhen, DING Lizhong, LOU Junfang, et al. Occurrence regularity of Carya cathayensis canker disease and its control[J]. J Zhejiang For Coll, 2009, 26(2):228-232. [14] CHAN Y K, SAVARD M E, REID L M, et al. Identification of lipopeptide antibiotics of a Bacillus subtilis isolate and their control of Fusarium graminearum diseases in maize and wheat[J]. Biocontrol, 2009, 54(4):567-574. [15] ONGENA M, JOURDAN E, ADAM A, et al. Surfactin and fengycin lipopeptides of Bacillus subtilis as elicitors of induced systemic resistance in plants[J]. Environ Microbiol, 2007, 9(4):1084-1090. [16] GANZ T, LEHRER R I. Defensin[J]. Curr Opin Immunol, 1994, 66(4):584-589. [17] DELEU M, BOUFFIOUX O, RAZAFINDRALAMBO H, et al. Interaction of surfactin with membranes:a computational approach[J]. Langmuir, 2003, 19(8):3377-3385. [18] DELEU M, PAQUOT M, NYLANDER T. Effect of fengycin, a lipopeptide produced by Bacillus subtilis, on model biomembranes[J]. Biophys J, 2008, 94(7):2667-2679. [19] MAGET-DANA R, PEYPOUX F. Iturins, a special class of pore-forming lipopeptides:biological and physicochemical properties[J]. Toxicologyl, 1994, 87(1/3):151-174. [20] 裴炎, 李先碧, 彭红卫, 等.抗真菌多肽APS-1的分离纯化与特性[J].微生物学报, 1999, 39(4):344-349. PEI Yan, LI Xianbi, PENG Hongwei, et al. Purification and characterization of a novel antifungal peptide APS-1 produced by Bacillus cereus[J]. Acta Microbiol Sin, 1999, 39(4):344-349. 期刊类型引用(5)
1. 金航峰，于昌昊，范锴萍，吴健清，颜菲菲，汪涵. 基于近红外高光谱成像技术的地方鸡品种鉴别. 现代食品科技. 2024(05): 247-254 . 
百度学术2. 岳蓉，尹本酥，李振发，李粉玲. 基于无人机RGB影像的染条锈冬小麦花青素含量监测. 麦类作物学报. 2024(07): 936-946 . 百度学术3. 王延年，李鹏程，廉继红，范昊，王炳炎. 纱线卷绕系统恒张力先进控制策略. 纺织高校基础科学学报. 2023(01): 49-56 . 百度学术4. 孙晓荣，田密，刘翠玲，吴静珠，郑冬钰，靳佳蕊. 基于太赫兹成像技术的发芽葵花籽无损检测研究. 食品科技. 2023(02): 296-302 . 百度学术5. 付立岩，冯国红，刘旭铭. 基于多元经验模态分解的可见/近红外光谱识别木材研究. 森林工程. 2023(04): 101-109 . 百度学术其他类型引用(9)
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