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无距虾脊兰Calanthe tsoongiana为兰科Orchidaceae虾脊兰属Calanthe地生草本，花朵娇艳，造型独特，受到人们的喜爱。近些年来，由于人为破坏，以及自身繁殖困难，导致野生无距虾脊兰种群数量锐减，现已被列为极度濒危等级[1]。
植物和真菌之间的互惠共生是自然界中普遍存在的现象[2]。兰科菌根真菌是一类与兰科植物形成共生关系并生成菌丝团的真菌，隶属于根系内生真菌，对兰科植物生长起促进作用[3]。研究表明：兰科植物的整个生命活动都需要菌根真菌的参与，菌根真菌不仅可以帮助兰花种子萌发[4−5]，也在其生长发育过程中扮演着重要的角色。它可以吸收土壤中的矿质元素、有机物等，在侵染兰科植物后被宿主细胞分解并向其传输营养物质[6−7]，若缺乏菌根真菌，兰科植物将无法长期存活。除了菌根真菌，兰科植物中非菌根真菌的数量也十分庞大，远远超过了菌根真菌。镰孢属Fusarium、木霉属Trichoderma和青霉属Penicillinum是兰科植物中常见的内生真菌，在适当的条件下不仅能促进兰科植物种子的萌发和生长发育，还可以有效抑制病原菌的生长[8−10]。由此可见，非菌根真菌的作用也不容忽视。兰科菌根真菌不仅广泛存在于根系内，也存在于植株周围土壤中，且距离植株越远，其相对丰度越低[11−12]，但也有研究表明：菌根真菌少量或者不存在于土壤中[13−14]。蒋玉玲等[15]研究表明：通过对周围土壤中真菌类群的分析，可推断兰科植物能否长期在此生存。因此，研究根际土壤真菌类群对兰科植物保育十分重要。
目前，虾脊兰属植物的研究集中在分类鉴别、育种和繁殖等方面，具体有资源调查、遗传多样性研究、化学与药用价值研究、快速繁育以及引种驯化等等[16−17]。国内外对虾脊兰属根系内生真菌多样性研究较少，尚处于初步阶段，未得到系统且全面的数据，尤其是无距虾脊兰还未见相关报道。鉴于此，本研究以浙江省天目山野生无距虾脊兰为材料，通过分析无距虾脊兰不同时期根际土壤真菌与根系内生真菌多样性，明确其优势真菌和共有真菌类群，以期为无距虾脊兰资源有效保护提供科学参考。
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所用材料采自浙江天目山国家级自然保护区内无距虾脊兰野生居群(海拔550 m，30°21′47″N，119°25′30″E)。该研究区属亚热带季风气候，雨水充沛，年降水量达1 870 mm，相对湿度较大，自然条件优越。
无距虾脊兰生长在海拔450~1 450 m的阔叶混交林下，生长周期可分为萌芽期、花期、果期和衰亡期[18]。选择未遭到破坏、分布集中且长势一致的植株，分别于2、5、7和11月进行根段采集。每次选取9株植株，每株取3~4个长约4~5 cm的根段，用根围土包裹装入采样袋，做好标记并放入4 ℃冰箱保存。
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取出根系并用流水冲洗干净，无菌水冲泡，用体积分数为70%的乙醇洗涤2 min，质量分数为2.5%的次氯酸钠浸泡5 min，体积分数为70%的乙醇洗涤30 s，再经无菌水冲洗2~3次，用无菌滤纸吸去多余水分后转入液氮中紧急速冻。初步处理完成，置于−80 ℃超低温冰箱保存。
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在超净台上抖掉根围土，保留附着在根系1 mm左右的根际土。用无菌镊子将根系转移至装有磷酸缓冲盐溶液(PBS)的离心管中，全温摇床下震荡20 min，挑出根系，将剩余悬浮液6 000 r·min−1高速离心20 min，弃上清液得到根际土。做好标签记录，将离心管放入液氮，待其彻底急速冷冻后，放入−80 ℃超低温冰箱保存。
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使用DNA提取试剂盒提取无距虾脊兰根系与根际土壤DNA，提取后利用质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度，引物合成和测序由上海美吉生物医药科技有限公司进行。
PCR 仪采用ABI Gene Amp® 9700型，每个样本3个重复，20.0 μL PCR反应体系为10.0 μL 2× ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix，0.8 μL上游引物，0.8 μL下游引物，0.4 μL 50 × ROX Reference Dye 1，2.0 μL DNA模板，ddH2O补至20.0 μL。PCR反应条件为95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，35个循环；72 ℃延伸1 min，4 ℃保存。同一样本的PCR产物混合后用质量分数为2%的琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物，纯化后的PCR产物使用Illumina MiSeq平台进行测序。
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首先根据overlap关系利用FLASH (v1.2.11)软件对Illumina测序得到的原始数据进行拼接，并通过FASTP (v.0.19.6)软件对序列质量进行质控、过滤和优化。区分样本后，在97%相似度水平下使用UPARSE (v11.0)软件对优化序列进行分类操作单元(OTU)聚类分析。为了得到每个OTU对应的物种分类信息，基于97%相似水平下采用RDP classifier贝叶斯算法对OTU代表序列与UNITE (v.8.0)数据库进行分类学比对。
基于OTU聚类分析结果，通过Mothur (v1.30.2)软件进行多样性指数分析，从而得到所有样本群落中物种的丰富度、覆盖度和多样性等信息。根据分类学分析结果，通过Qiime (v1.9.1)软件生成各分类学水平丰度表，进行Beta多样性距离计算，找出各样本在某一分类学水平上的优势物种、样本中各优势物种的相对丰度以及不同样本中物种的组成相似性，并利用R语言(version 3.3.1)工具统计和作图，将差异和距离通过二维坐标图呈现出来，从总体上反映各组样本之间的差异和组内样本之间的变异度大小。基于Kruskal-Wallis秩和检验(Kruskal-Wallis H test)，通过R (version 3.3.1)的stats包和python的scipy包运用DP的方法计算影响大小(effect size)，从而找出多组样本的物种进行差异显著性分析。
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无距虾脊兰萌芽期根系测序共获得31 987条优化序列。由图1可知：在门水平上担子菌门Basidiomycota和被孢霉门Mortierellomycota占比较大，属于萌芽期根系内生真菌优势门；在属水平上，被孢霉属Mortierella和红菇属Russula真菌序列占比相差不大，共同作为该时期优势内生真菌。花期根系测序共获得51 913条优化序列。其中，担子菌门为最大优势菌门；在属水平上，粗糙孔菌属Trechispora为该时期优势内生真菌。相较于萌芽期，花期真菌类群中担子菌门和子囊菌门Ascomycota相对丰度分别为萌芽期的1.33和1.97倍，被孢霉门、被孢霉属和红菇属的相对丰度呈现下降趋势，分别减少了67.82%、67.39%和75.70%。
图 1 不同时期无距虾脊兰根系内生真菌在门(A)和属(B)水平上的群落组成
Figure 1. Community composition of root endophytic fungi in different periods of C. tsoongiana at phylum (A) and genus (B) level
果期根系测序共获得43 793条优化序列。其中担子菌门真菌在数量上占绝对优势；在属水平上，蜡壳耳属Sebacina为该时期优势内生真菌。相较于花期，担子菌门、子囊菌门、被孢霉门和红菇属相对丰度变化不大，但Saitozyma、锁瑚菌属Clavulina相对丰度有所增加，由原来占比不足3.00%增长到13.09%和10.29%，蜡壳耳属增加了67.30%。衰亡期根系测序共获得30 000条优化序列。该时期，子囊菌门属于优势菌门，镰孢属为优势内生真菌，相较于其他3个时期，衰亡期根系内生真菌多样性整体出现骤降现象。
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在萌芽期，无距虾脊兰根际土壤测序共获得31 673条优化序列。由图2可知：萌芽期根际土壤与根系在门水平上真菌类群一致，但相对丰度稍有变化；在属水平上，红菇属相对丰度明显下降，占比仅为3.55%，其余真菌相对丰度较小，被孢霉属为该时期根际土壤优势真菌。
图 2 不同时期无距虾脊兰根际土壤真菌在门(A)和属(B)水平上的群落组成
Figure 2. Community composition of rhizosphere soil fungi in different periods of C. tsoongiana at phylum (A) and genus (B) level
在花期，根际土壤测序共获得41 062条优化序列。与同时期根系内生真菌相比，担子菌门相对丰度减少，子囊菌门相对丰度增加。在属水平上，根际土壤和根系真菌类群相对丰度明显不同，其中青霉属Penicillium为该时期根际土壤优势真菌。相较于萌芽期根际土壤真菌，花期子囊菌门和罗兹菌门Rozellomycota相对丰度分别为萌芽期的1.34和4.74倍，担子菌门、被孢霉门真菌相对丰度分别减少了31.93%和67.82%。
在果期，根际土壤测序共获得47 863条优化序列。与根系内生真菌相比，门水平上子囊菌门和担子菌门变化最大，在属水平上，Paraboeremia仅存在于根际土壤真菌中，且占比较大，为该时期根际土壤优势真菌。相较于花期根际土壤真菌，果期子囊菌门、被孢霉门、Paraboeremia和Saitozyma相对丰度分别为花期的1.34、1.61、4.03和1.07倍，担子菌门和罗兹菌门相对丰度分别降低到花期的89.45%和42.21%。
在衰亡期，根际土壤测序共获得28 997条优化序列。在门水平上，担子菌门为根系内生真菌的5.61倍，根系内生真菌无被孢霉门，而在根际土壤中其真菌序列占7.29%。在属水平上，各真菌相对丰度差别较大，其中Paraboeremia为该时期根际土壤优势真菌。相较于果期根际土壤真菌，蜡壳耳属仅存在于衰亡期根际土壤中，担子菌门和被孢霉属真菌相对丰度分别为果期的1.53和1.31倍，Saitozyma相对丰度降低到果期的32.32%。
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通过对无距虾脊兰根际土壤与根系测序分析，发现不同生长发育时期物种注释结果存在较大差别，具体差异见表1。其中萌芽期根际土壤和根系优势真菌分别为被孢霉属和红菇属，花期优势真菌分别为青霉属和粗糙孔菌属，果期优势真菌分别为Paraboeremia和蜡壳耳属，衰亡期优势真菌分别为Paraboeremia和镰孢属，不同生长发育时期优势真菌不同。
表 1 物种注释结果统计
Table 1. Species annotation results statistics
生长
时期优化序
列/条门/个 纲/个 目/个 科/个 属/个 萌芽期 63 660 11 41 91 193 359 花期 92 975 13 46 101 217 367 果期 91 656 12 48 108 224 377 衰亡期 58 997 8 33 75 162 264 在门水平上，子囊菌门真菌在萌芽期、花期和果期的根际土壤与根系中存在显著差异；而被孢霉门真菌则在萌芽期与衰亡期的根际土壤和根系中存在显著差异(图3A，P＜0.05)。在属水平上，被孢霉属、红菇属、罗兹菌门未分类属以及青霉属在萌芽期的根际土壤与根系真菌上差异较为明显。由图4可知：有虫草菌属Cordyceps等321个属为4个时期共有真菌；裸盖菇属Psilocybe等29个属为萌芽期和花期共有真菌，复膜孢酵母属Saccharomycopsis等43个属为花期和果期共有真菌，Melanopsamma等36个属为果期和衰亡期共有真菌，Stenella等23个属为衰亡期和萌芽期共有真菌。
图 3 根际土壤真菌与根系内生真菌在门(A)、属(B)水平下差异显著的类群
Figure 3. The endophytic fungi in rhizosphere soil and root were different at phylum (A) and genus (B) level
图 4 属水平不同时期根际土壤真菌与根系内生真菌分布韦恩图
Figure 4. Venn diagram of endophytic fungi distribution in rhizosphere soil and root at genus level at different periods
从表2可见：果期根系内生真菌的ACE指数、Chao指数、Shannon指数和Sobs指数最高，其次是花期，然后是萌芽期，衰亡期Alpha指数最低。意味着果期根系内生真菌多样性和丰富度最高，衰亡期根系内生真菌多样性和丰富度最低。在无距虾脊兰根际土壤真菌中，花期Alpha多样性指数高于其他3个时期，果期ACE指数、Chao指数和Sobs指数高于萌芽期和衰亡期，萌芽期和衰亡期Alpha多样性指数相对一致。综合来讲，花期的根际土壤真菌多样性和丰富度最高，果期次之。
表 2 Alpha多样性指数
Table 2. Alpha diversity indexes
样本 Alpha多样性指数 ACE指数 Chao指数 Shannon指数 Sobs指数 Coverage指数 MG 1 983±26 c 1 379±81 ab 3.734±0.522 b 680±104 cd 0.964±0.004 a HG 4 078±3 043 bc 2 337±50 ab 3.724±1.606 b 987±423 bcd 0.968±0.009 a GG 8 681±439 ab 4 499±351 ab 4.221±0.501 b 1 342±161 abc 0.926±0.006 b SG 817±292 c 630±308 b 3.298±0.788 b 210±31 d 0.990±0.005 a MT 4 642±3 043 bc 3 057±1 539 a 5.042±0.191 a 1 243±322 abc 0.926±0.017 b HT 12 860±9 858 a 7 178±4 937 a 5.423±0.221 b 1 926±847 a 0.891±0.027 c GT 6 559±1 695 abc 4 109±826 ab 4.713±1.078 b 1 580±398 ab 0.931±0.017 b ST 5 182±642 abc 3 323±465 ab 4.713±0.684 b 1 198±229 abc 0.908±0.014 bc 说明：数据均为平均值±标准差。同列不同字母表示同一指数在不同样本间差异显著(P＜0.05)。MG. 萌芽期根系；HG. 花期根系；GG. 果期根系；SG. 衰亡期根系；MT. 萌芽期根际土壤；HT. 花期根际土壤；GT. 果期根际土壤；ST. 衰亡期根际土壤。 在同一时期中，萌芽期、花期和衰亡期根际土壤真菌的Alpha多样性指数均高于根系内生真菌，说明在该时期根际土壤真菌多样性和丰富度高于根系内生真菌。果期根系内生真菌ACE指数、Chao指数高于根际土壤真菌，但是根际土壤真菌Shannon指数和Sobs指数高于根系内生真菌。
为了进一步明确无距虾脊兰不同时期根际土壤真菌和根系内生真菌群落结构的差异，本研究采用主成分分析(PCA)分析其真菌群落的相似性和差异性。PCA结果显示：无距虾脊兰在花期、果期、萌芽期、衰亡期有明显的聚类区分(图5A)，主成分1解释了差异的12.92%，主成分2解释了差异的7.73%。其中在主成分1轴上花期区分较为明显，主成分2轴上果期区分较为明显，萌芽期和衰亡期距离较近，意味着衰亡期和萌芽期根际土壤真菌、根系内生真菌类群相似度高，进一步说明无距虾脊兰根际土壤真菌和根系内生真菌群落在整个生长发育时期存在阶段性差异。由图5B可知：4个时期根系内生真菌相较于根际土壤真菌，距离较近，意味着根际土壤真菌彼此间真菌类群差异较大，其中花期和果期尤为明显。另外，在每个时期中根际土壤与根系之间彼此分开较远，相较于各自内部样品之间两者真菌类群差别较为明显，其中根系样品之间内生真菌类群差别小于根际土壤。
图 5 根际土壤真菌与根系内生真菌群落主成分分析
Figure 5. Principal component analysis of rhizosphere soil fungi and root endophytic fungi
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本研究表明：无距虾脊兰根际土壤真菌和根系内生真菌优势菌门均为担子菌门和子囊菌门。根际土壤真菌类群与根系内生真菌类群相互重叠存在一定相似性，说明有一部分根系内生真菌来自根际土壤真菌。推测由于根系与根际土壤长期互相接触，彼此真菌类群相互影响[19]，且根系对根际土壤真菌具有一定的选择性等原因造成的[20]。从另一方面来讲，彼此之间也相互独立具有一定差异性，根际土壤真菌群落的丰富度、均匀度以及多样性均高于根系内生真菌。在根际处根系经常与其他根系、土壤微生物互作，从而导致了根际土壤真菌多样性高于根内真菌。
在根系内生真菌中，真菌多样性和丰富度从萌芽期到果期依次递增，并在果期达到顶峰，衰亡期又急剧下降。而根际土壤真菌类群变化情况却与之相差较大，从萌芽期到花期逐渐增加，在花期达到顶峰后逐渐下降，衰亡期与萌芽期真菌多样性和丰富度变化相对平稳。这与吕立新等[21]的观点相吻合，夏季真菌多样性高于春季和秋季，随着季节变化，温度、土壤含水量等环境因子相继发生变化，真菌群落结构也随之发生变化。YOKOYA等[22]在研究兰花时也发现了在雨季分离出的真菌，在旱季不一定出现，而同一类真菌的相对丰度也不尽相同。花期为无距虾脊兰生长初期，此时温度适宜、光线充足，周围伴生植物数量增加，土壤和根际土壤真菌丰富度也相应增加。无距虾脊兰果期为每年的7—9月，此时温度高，周围植物数量相较于花期会有所减少，所以果期根际土壤真菌丰富度少于花期。而根系内生真菌出现上述差异情况可能是从萌芽期到果期，无距虾脊兰生长发育需要大量营养物质持续输入，且夏季温度高，需要增加自身抗逆性，因此根系内生真菌种类和丰富度显著增加并在果期达到顶峰。随着冬季的到来，周围植物逐渐进入休眠期，植被凋落物、土壤微生物的分解等都会使土壤有机质增加，从而促进微生物的生长，造成衰亡期真菌群落丰富度的降低[23]。
兰科植物在自然状态下无法自主萌发，内生真菌通过向兰科植物传输营养物质，从而促进种子萌发和原球茎的分化[24]。李孟凯等[25]用镰孢属菌液处理过的铁皮石斛Dendrobium officinale种子胚膨大，种皮有被假根冲破的迹象。内生真菌对兰科植物的促生作用在生长期也有体现。王亚妮[26]研究发现：接种了内生真菌的铁皮石斛，其鲜质量、移栽成活率相比对照均有所增加；此外，张霞[27]研究表明：接种内生真菌的铁皮石斛，其抗旱性明显增强。由此可见，内生真菌在兰科植物生长发育过程中的作用不可忽视。本研究显示：无距虾脊兰不同时期优势真菌及相对丰度不同，推测兰科植物在相应生长期会选择对自己生长益处最大的真菌共生。有研究表明：在碳的需求方面，果期需求是花期的2倍[28]，而花期的优势真菌不能满足果期对生长素等方面的需求，所以不同时期优势真菌的相对丰度会随之发生变化，也进一步证实了内生真菌极易受周围环境和生长阶段影响[29]。
镰孢属和青霉属是兰科植物中常见的内生真菌，在适当的条件下不仅能促进兰科植物种子的萌发和生长发育，还可以有效抑制病原菌的生长。这2种真菌类群在花期和衰亡期属于优势真菌，由此可以推测：镰孢属和青霉属在无距虾脊兰中同样可以促进其生长，并提高其抗病性。庄鑫等[30]研究不同地点朝鲜淫羊藿Epimedium brevicornu生长时期内生真菌表明：蜡壳耳属真菌与淫羊藿中黄酮类化学成分含量成正比，证明蜡壳耳属真菌可以促进植物对磷元素的吸收，促进植物生长，同时增强植株抗灰霉病的能力。被孢霉属真菌被证实在生物分解以及土壤养分转化的过程中发挥重要作用[31]。红菇属曾被认定为菌根真菌，并与多种兰科植物存在共生关系[32]。上述几类真菌均为无距虾脊兰不同时期的优势真菌，但是这几类优势真菌是否与无距虾脊兰菌根真菌存在共生关系，是否对无距虾脊兰生长发育过程中起促进作用，还需采用石蜡切片观察是否在根细胞中形成菌丝结，并结合共生培养视植株的生长状况而定。然而，另外一些公认的菌根真菌，如胶膜菌科Tulasnellaceae在本研究中尚未见到，有研究表明可能与DNA测序区域有关[33]，在后续实验进行高通量测序时可以采取不同的引物。除此之外，可能与植物种类有关，有些真菌广泛存在于多种植物体内，而有些真菌却只与某种特定植物产生共生关系[34]。
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本研究表明：在不同生长发育时期，无距虾脊兰真菌群落多样性和丰富度存在较大差异。根际土壤真菌多样性高于根系内生真菌，花期根际土壤真菌多样性最高，果期根系内生真菌最丰富。不同时期优势真菌差别较大，萌芽期根际土壤和根系内生优势真菌分别为被孢霉属、红菇属，花期优势真菌分别为青霉属、粗糙孔菌属，果期分别为Paraboeremia、蜡壳耳属，衰亡期分别为Paraboeremia、镰孢属。
Diversity of rhizosphere soil fungi and root endophytic fungi of Calanthe tsoongiana
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摘要:
目的 研究野生无距虾脊兰Calanthe tsoongiana在萌芽期、花期、果期、衰亡期根际土壤真菌和根系内生真菌多样性差异，旨在明确不同生长发育时期真菌多样性特征，为无距虾脊兰种群扩繁提供理论依据。 方法 采用内转录间隔区(internal transcribed spacer，ITS)测序技术，分析野生无距虾脊兰4个时期根际土壤真菌与根系内生真菌群落的物种组成及相对丰度变化，找出各时期优势真菌。 结果 4个时期共获得307 288条优化序列，平均序列长度为643 bp，隶属16门68纲176目413属。萌芽期根际土壤真菌和根系内生优势真菌为分别被孢霉属Mortierella和红菇属Russula，花期优势真菌分别为青霉属Penicillium和粗糙孔菌属Trechispora，果期分别为Paraboeremia和蜡壳耳属Sebacina，衰亡期分别为Paraboeremia和镰孢属Fusarium。Alpha多样性指数显示：根系内生真菌多样性和相对丰度从萌芽期到果期依次递增，在果期达到顶峰，衰亡期又急剧下降。根际土壤真菌中花期多样性最高，其余3个时期变化相对平稳。 结论 无距虾脊兰根际土壤真菌和根系内生真菌多样性和丰富度在整个生长发育时期存在较大差异，花期和果期真菌多样性高于衰亡期和萌芽期。图5表2参34 Abstract:Objective This study, with an investigation into the diversity differences of rhizosphere soil fungi and root endophytic fungi in the wild population of Calanthe tsoongiana, is aimed to clarify the diversity characteristics of fungi in different growth and development stages so as to provide theoretical basis for population propagation. Method Internal transcribed spacer (ITS) sequencing technology was used to analyze the species composition and abundance changes of endophytic fungi communities in the rhizosphere soil and roots at the four stages of C. tsoongiana with the dominant fungi at each stage investigated. Result A total of 307 288 optimized sequences were obtained from the four periods, with an average length of 643 bp, belonging to 16 phyla, 68 classes, 176 orders, and 413 genera. At the germination stage, the dominant fungi in rhizosphere soil and root were Mortierella and Russula, respectively; Penicillium and Trechispora were the dominant fungi at the flowering stage; at the fruiting stage, the dominant fungi were Paraboeremia and Sebacina while Paraboeremia and Fusarium were the dominant fungi at the decay stage. The results of Alpha diversity index showed that the diversity and relative abundance of endophytic fungi increased from the germination stage to the fruiting stage, reaching the peak at the fruiting stage, and decreasing sharply at the declining stage. The diversity of rhizosphere soil fungi was the highest at the flowering stage, and the changes in the other three stages were relatively stable. Conclusion The diversity and richness of rhizosphere soil fungi and root endophytic fungi were significantly different during the whole growth and development period whereas flowering and fruiting fungal diversity was higher than in budding and dying. This study has provided an important reference for artificial breeding and conservation of wild resources in C. tsoongiana. [Ch, 5 fig. 2 tab. 34 ref.] -
Key words:
- Calanthe tsoongiana /
- endophytic fungi /
- diversity /
- different periods
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榧树Torreya grandis四季常绿，是红豆杉科Taxaceae植物中少有的集果用、油用、药用、材用、观赏于一体的植物，雌雄异株，生命周期可达上千年。榧树种子含油量高，主要含油酸和亚油酸，不饱和脂肪酸含量远超饱和脂肪酸[1]。饱和脂肪酸中主要是山俞酸和棕榈酸[2]。榧树自然分布于浙江、安徽南部、福建北部、江西东北部，零星分布于贵州松桃、江苏南部、湖南西南部等地，其中以浙江最多，近年来人类活动的干扰加剧了榧树资源的破坏，威胁到部分种群的生存[3−4]。
遗传多样性是生物多样性的重要组成部分。一个物种的稳定性和进化潜力依赖其遗传多样性，物种的经济和生态价值依赖其特有的基因组成。因此，保护生物多样性的最终目标就是保护遗传多样性[5−7]。DNA分子标记的数量极多，多态性高，受限制少，检测方法简单易掌握，结果稳定可靠，已被广泛应用于植物多样性研究[8−9]。简单重复序列标记(SSR)技术是以特异引物PCR为基础的分子标记技术，其特点是标记在整个基因组DNA中随机分布，多态性较高，操作简单，可通过PCR直接扩增来检测，重复性好，成本低[10]。
香榧T. grandis‘Merrillii’是榧树优良的变异类型，具有较高的经济价值[11]。自然环境中榧树结种迟，一般作为香榧嫁接的砧木，雄株因不结种被大量砍伐，使榧树遗传多样性受到影响，但榧树具有丰富的遗传多样性，产生了丰富的变异类型，形成了物种生存与进化的基础，也为资源的开发利用提供了可供选择的物质基础[12]。因此，本研究利用多重比较、方差分析等对不同种群雌性榧树叶片、种实表型、种实营养成分及遗传多样性指标的变异进行分析，以期为榧树的利用提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料
基于天然榧树的分布情况以及前人的研究成果[13]，于2019年10—11月榧树种实成熟期，从浙江省杭州市富阳区洞桥村(富阳)、杭州市临安区洪岭村(临安)、杭州市建德市大库村(建德)、绍兴市嵊州市榆树村(嵊州)及安徽省黄山市呈坎村(黄山)5个海拔在250~600 m的雌性榧树种群中，分别采集叶片和种实用于表型及种实营养成分的探究。基于詹利云等[14]的研究，选择富阳、临安、嵊州、黄山以及杭州市淳安县半夏村(淳安)的雌性榧树种群，分别采集叶片对榧树种群遗传多样性进行研究。样株间距大于50 m，生长状况良好。每株采集相同位置的新鲜叶片，采集至少100颗自然脱落的成熟种实，样品装入带有硅胶的塑封袋中，并利用全球卫星定位系统(GPS)定位采样点。叶片测量表型后置于−40 ℃冰箱保存，种实测完表型后置于阴凉通风处，等待假种皮自然开裂，用于后续研究。
1.2 表型测定
从各单株选取2个小枝相同部位的叶片共20片，用卡尺测量叶长、叶宽，并计算叶形指数(叶宽/叶长)，用天平称取单片叶的质量。从各单株随机选取30颗种实，用卡尺测量单颗种实和种核的横径、纵径、假种皮厚、种壳厚，并计算种形指数(种实横径/种实纵径)、核形指数(种核横径/种核纵径)，用天平称取单颗种实质量和种核质量。
1.3 营养成分测定
脂肪相对含量参照GB/T 14772—2008《食品中粗脂肪的测定》索氏抽提法测定。脂肪酸组成参照GB/T 17376—2008《食品脂肪酸含量的测定》测定。可溶性糖质量分数参照蒽酮比色法[15]测定。
1.4 DNA提取及SSR标记分析
采用改良的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法[16]提取雌性榧树叶片的DNA。参照郑刘辉等[17]的SSR反应体系，合成引物序列，进行PCR扩增。
1.5 数据分析
采用SPSS 23.0进行数据统计、方差分析、多重比较、主成分分析；用Genemaker软件准确读取SSR位点信息。用Popgene 1.32计算平均等位基因数、观察杂合度、多态信息含量等遗传多样性指标。使用Structure 2.3.4分析种群的遗传结构，并绘制遗传结构图，用Q值表示一种遗传组成的比率，即同一颜色所占比率最大的种群聚类为同一亚群。通过NTSYS2.10e计算Nei’s遗传相似矩阵，使用非加权组平均聚类分析法(UPGMA)分析样品的亲缘关系，并进行聚类分析。
2. 结果与分析
2.1 叶与种实性状的变异研究
从表1可见：在叶质量和叶形指数上，临安种群的变异系数最大。在种实质量上，嵊州种群的变异系数最大。种形指数和种核质量富阳种群的变异系数最大。核形指数的变异系数在富阳种群中最大，但仅为10.2%。种壳厚和假种皮厚的变异系数在嵊州种群中最大。方差分析(表2)表明：叶质量、叶形指数、种实质量、种形指数、种核质量、核形指数、假种皮厚、种壳厚8个指标在种群间和种群内个体间差异极显著(P＜0.01)。
表 1 雌性榧树种群叶片与种实表型Table 1 Leaf and seed phenotypes of female quince populations in T. grandis种群 叶质量 叶形指数 种实质量 种形指数 假种皮厚 种核质量 核形指数 种壳厚 数值/g CV/% 数值 CV/% 数值/g CV/% 数值 CV/% 数值/mm CV/% 数值/g CV/% 数值 CV/% 数值/mm CV/% 富阳 0.02±0.01 31.1 0.15±0.02 10.8 10.70±2.42 22.6 0.78±0.07 9.0 3.53±0.36 10.2 4.77±1.27 26.5 0.66±0.07 10.2 0.54±0.11 19.7 嵊州 0.02±0.01 29.9 0.16±0.02 11.2 11.85±3.36 28.3 0.79±0.05 6.5 3.67±0.78 21.3 4.92±1.18 23.9 0.68±0.06 8.9 0.72±0.25 34.6 黄山 0.02±0.01 19.2 0.16±0.02 11.6 9.50±2.27 22.9 0.81±0.07 5.5 2.94±0.53 17.8 4.51±0.93 19.0 0.71±0.07 5.8 0.91±0.17 21.1 临安 0.02±0.01 33.9 0.16±0.02 15.3 9.50±2.27 23.9 0.81±0.07 8.2 2.94±0.53 18.1 4.51±0.93 20.6 0.71±0.07 9.5 0.91±0.17 19.1 建德 0.02±0.01 33.8 0.17±0.02 9.5 11.19±2.41 21.5 0.83±0.05 6.1 3.63±0.46 12.8 4.58±0.97 21.1 0.70±0.05 7.8 0.85±0.13 14.7 说明：数值为均值±标准差；CV为变异系数。 表 2 榧树叶片与种实表型的方差分析Table 2 Variance analysis of phenotypic parameters of the leaf and seeds in T. grandis指标 变异来源 平方和 自由度 均方 F 指标 变异来源 平方和 自由度 均方 F 叶质量 种群间 0.220 4 0.005 121.000 种核质量 种群间 358.014 4 89.503 112.981 个体间 0.028 29 0.001 21.158 个体间 355.326 29 12.253 15.467 叶形指数 种群间 0.181 4 0.045 50.937 核形指数 种群间 0.600 4 0.150 64.909 个体间 0.252 29 0.009 9.779 个体间 1.256 29 0.043 18.755 种实质量 种群间 2 530.950 4 632.737 191.245 假种皮厚 种群间 796.646 4 199.162 91.175 个体间 1 612.471 29 55.602 16.806 个体间 484.026 29 16.691 7.641 种形指数 种群间 0.408 4 0.102 46.454 种壳厚 种群间 16.018 4 4.005 116.324 个体间 1.194 29 0.041 18.764 个体间 10.813 29 0.373 10.831 说明：所有指标P=0.000。 2.2 种仁营养成分分析
2.2.1 脂肪相对含量和组成
由表3可见：5个种群的脂肪相对含量从大到小依次为嵊州、黄山、临安、建德、富阳，变异系数为7.7%~21.6%。多重分析发现各种群间脂肪相对含量差异显著(P＜0.05)。
表 3 5个榧树种群种仁的脂肪相对含量Table 3 Lipid content of the kernel among 5 T. grandis populations种群 脂肪相对含量/% CV/% 最大值 最小值 平均值±标准差 富阳 47.79 18.25 29.36±6.34 d 21.6 嵊州 48.14 30.62 42.35±3.77 a 8.9 黄山 46.81 33.61 40.93±3.19 ab 7.8 临安 44.90 32.19 39.82±3.07 b 7.7 建德 40.52 16.19 33.96±4.66 c 13.7 说明：不同字母表示不同种群间差异显著(P＜0.05)。CV为变异系数。 榧树种子脂肪酸组成(表4)分析发现：不饱和脂肪酸的相对含量远远高于饱和脂肪酸，且前者是后者的2倍多；脂肪酸中亚油酸的相对含量最高，其次是油酸、金松酸、棕榈酸，亚麻酸相对含量最低。可见，榧树种子中主要的不饱和脂肪酸是亚油酸和油酸。5个种群间的脂肪酸组成存在不同程度的变异，其中多不饱和脂肪酸相对含量最高的是临安种群，随后依次是嵊州、建德、黄山、富阳种群；单不饱和脂肪酸相对平均含量富阳种群最高，为(29.20±6.34)%，建德种群最低，为(24.14±2.59)%；变异系数不饱和脂肪酸远小于饱和脂肪酸。从脂肪酸种类上看，变异系数最大的为花生一烯酸(13.0%~40.0%)，其次是硬脂酸(18.0%~38.0%)、花生二烯酸(15.0%~27.0%)。
表 4 5个榧树种群脂肪酸组成的变异Table 4 Variation in fatty acid composition among 5 T. grandis populations种群 棕榈酸/% 硬脂酸/% 油酸/% 亚油酸/% 亚麻酸/% 花生一烯酸/% 相对含量 CV 相对含量 CV 相对含量 CV 相对含量 CV 相对含量 CV 相对含量 CV 富阳 10.70±2.59 24.0 2.97±1.14 38.0 28.29±6.06 21.0 41.82±8.01 19.0 0.52±0.17 32.0 0.91±0.37 40.0 嵊州 8.52±1.22 14.0 2.18±0.47 21.0 23.78±4.26 18.0 47.85±2.88 6.0 0.50±0.06 12.0 0.67±0.09 14.0 黄山 8.06±0.98 12.0 2.97±0.54 18.0 26.21±2.87 11.0 46.81±2.35 5.0 0.47±0.05 11.0 0.65±0.08 13.0 临安 8.47±0.88 10.0 2.15±0.46 22.0 23.63±2.40 11.0 49.00±2.45 5.0 0.57±0.00 14.0 0.59±0.09 16.0 建德 9.58±1.83 19.0 2.80±0.92 33.0 23.47±2.63 11.0 46.49±3.67 8.0 0.48±0.07 14.0 0.67±0.10 15.0 种群 花生二烯酸/% 金松酸/% 饱和脂肪酸/% 不饱和脂肪酸/% 单不饱和脂肪酸/% 多不饱和脂肪酸/% 相对含量 CV 相对含量 CV 相对含量 CV 相对含量 CV 相对含量 CV 相对含量 CV 富阳 2.42±0.63 26.0 10.76±2.14 20.0 13.68±3.45 25.0 84.71±4.39 5.0 29.20±6.34 22.0 55.52±10.16 18.0 嵊州 2.80±0.75 27.0 12.61±2.02 16.0 10.70±1.32 12.0 88.22±2.04 2.0 24.45±4.30 18.0 63.77±4.36 7.0 黄山 2.64±0.41 15.0 11.11±1.25 11.0 11.03±0.88 8.0 87.89±0.97 1.0 26.86±2.89 11.0 61.03±2.97 5.0 临安 2.60±0.53 20.0 12.00±0.98 8.0 10.63±1.06 10.0 88.39±1.14 1.0 24.22±2.52 10.0 64.18±2.92 5.0 建德 2.49±0.40 16.0 11.98±1.56 13.0 12.38±2.16 17.0 85.58±2.95 3.0 24.14±2.59 11.0 61.44±4.63 8.0 说明：数值为平均值±标准差。CV为变异系数。 2.2.2 可溶性糖
从表5可见：平均可溶性糖质量分数建德种群最高，为(50.49±9.26) mg·g−1，随后依次是黄山、嵊州、临安种群，富阳种群最低，为(40.23±4.80) mg·g−1。不同种群的变异系数为8.8%~19.3%。多重比较发现：嵊州、黄山种群间无显著差异，但与其他种群间差异显著(P＜0.05)。
表 5 5个榧树种群种仁的可溶性糖质量分数Table 5 Soluble sugar content of the kernel among 5 T. grandis populations种群 可溶性糖质量分数/(mg·g−1) 最大值 最小值 平均值±标准差 CV/% 富阳 47.91 32.10 40.23±4.80 c 11.9 嵊州 65.56 29.35 45.35±8.77 b 19.3 黄山 60.02 31.80 44.38±7.56 b 17.0 临安 54.34 37.24 47.75±4.18 ab 8.8 建德 68.68 34.36 50.49±9.26 a 18.3 说明：不同字母表示不同种群间差异显示(P＜0.05)。CV为变异系数。 2.2.3 主成分分析
20个指标通过主成分分析提取出6个指标，发现特征值均大于1.000的前6个主成分累计贡献率为75.38%，可以全面反映各个指标的信息(表6)。第1主成分贡献率为30.76%，特征值较高的为亚油酸、饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸；第2主成分贡献率为13.09%，特征值较高的为种实质量、种核质量；第3主成分贡献率为10.92%，其大小主要由核形指数、种形指数决定；第4主成分贡献率为7.98%，特征值较高的为叶形指数、叶片质量、种皮厚度；第5主成分贡献率为6.93%，特征值较高的为叶片质量、种形指数、叶形指数；第6主成分贡献率为5.70%，其大小主要由含油率、金松酸、叶形指数决定。
表 6 5个榧树种群叶片和种实表型、品质的主成分分析Table 6 Principal components of leaf and plant phenotypes among 5 T. grandis populations指标 主成分 指标 主成分 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 种实质量 0.074 0.856 −0.082 0.387 −0.007 0.263 硬脂酸 0.724 −0.236 −0.217 0.248 0.062 −0.061 种核质量 0.116 0.819 0.091 0.132 −0.187 0.305 油酸 0.731 −0.431 −0.251 0.157 0.132 0.269 种形指数 0.010 −0.131 0.741 0.370 0.466 −0.085 亚油酸 −0.946 0.142 0.046 −0.106 −0.011 0.009 核形指数 −0.099 −0.097 0.834 0.194 0.370 0.003 亚麻酸 0.239 −0.047 0.295 −0.204 −0.314 0.120 种皮厚度 0.105 0.498 −0.321 0.529 0.259 0.054 花生一烯酸 0.804 −0.046 0.027 −0.047 0.076 −0.017 种壳厚度 −0.367 −0.243 0.340 0.082 −0.333 0.327 花生二烯酸 −0.372 0.114 −0.178 0.152 0.369 −0.310 叶片质量 0.202 0.289 0.049 −0.533 0.496 0.190 金松酸 −0.649 0.424 0.186 −0.152 −0.176 −0.397 叶形指数 −0.116 −0.179 0.056 0.614 −0.416 −0.391 饱和脂肪酸 0.943 0.093 0.160 0.000 −0.124 −0.106 含油率 −0.459 −0.485 −0.195 0.319 0.018 0.426 不饱和脂肪酸 −0.927 −0.113 −0.194 −0.025 0.131 0.114 可溶性糖 −0.199 0.010 0.497 0.044 −0.207 0.330 特征值 6.153 2.618 2.184 1.595 1.387 1.138 棕榈酸 0.843 0.221 0.296 −0.111 −0.181 −0.105 累计贡献率/% 30.76 43.85 54.77 62.75 69.68 75.38 2.3 雌性榧树SSR标记分析
2.3.1 SSR位点分析
13对引物在146个雌性榧树中共获得37个等位基因，每对引物可扩增2~5个等位基因，平均每对引物扩增出2.85个等位基因，TG55平均等位基因数最多，ZAFU-3和TG19最少；每对引物的平均有效等位基因数为1.899个；平均观测杂合度(0.429)略高于平均期望杂合度(0.404)；Nei’s遗传多样性指数平均为0.400，其中GR98 (0.688)最高，TG19 (0.015)最低；Shannon’s指数为0.039~1.252，有11对引物的Shannon’s信息指数高于0.500，其中GR98 (1.252)最高，TG19 (0.039)最低，平均为0.650，说明榧树遗传多样性丰富(表7)。
表 7 榧树13个SSR位点的遗传参数Table 7 Genetic parameters of 13 SSR loci in T. grandis引物
编号平均等位
基因数/个有效等位
基因数/个观测
杂合度期望
杂合度Nei’s遗传
多样性指数Shannon’s
指数引物
编号平均等位
基因数/个有效等位
基因数/个观测
杂合度期望
杂合度Nei’s遗传
多样性指数Shannon’s
指数ZAFU-1 3.750 1.604 0.225 0.366 0.362 0.661 GR98 4.375 3.230 0.697 0.695 0.688 1.252 ZAFU-3 1.625 1.120 0.030 0.091 0.090 0.164 TG19 1.625 1.016 0.000 0.015 0.015 0.039 ZAFU-5 2.500 2.004 0.550 0.506 0.501 0.709 TG55 5.375 2.706 0.584 0.622 0.616 1.112 ZAFU-6 2.000 1.495 0.289 0.329 0.325 0.504 TG70 2.500 1.986 0.912 0.502 0.496 0.698 ZAFU-8 2.000 2.000 0.997 0.505 0.500 0.693 TG81 2.000 1.014 0.000 0.014 0.014 0.041 ZAFU-11 2.625 1.961 0.462 0.491 0.486 0.713 TG88 3.750 2.453 0.492 0.593 0.587 1.022 GR12 3.000 2.095 0.341 0.525 0.519 0.839 平均 2.856 1.899 0.429 0.404 0.400 0.650 2.3.2 种群遗传多样性分析
在种群水平上，Nei’s遗传多样性指数(H)与Shannon’s指数(I)在5个雌性种群间的变化趋势相似。Nei’s遗传多样性指数平均为0.390，从大到小依次为淳安、临安、黄山、富阳、嵊州；Shannon’s指数平均为0.621，从大到小依次为淳安、临安、富阳、黄山、嵊州；多态位点百分比平均为81.54%，其中富阳、黄山、嵊州3个种群的多态位点百分比相等，临安和淳安种群相等。淳安(H=0.410，I=0.658)的遗传多样性最高，嵊州(H=0.369，I=0.565)的遗传多样性最低(表8)。
表 8 5个榧树亲本种群的遗传多样性Table 8 Genetic diversity among 5 T. grandis populations种群 平均等位基因数/个 有效等位基因数/个 观测杂合度 期望杂合度 Nei’s遗传多样性指数 Shannon’s指数 多态位点百分比/% 富阳 2.692 1.848 0.431 0.387 0.381 0.625 84.62 嵊州 2.154 1.791 0.377 0.376 0.369 0.565 84.62 黄山 2.231 1.811 0.451 0.399 0.392 0.611 84.62 临安 2.462 1.917 0.464 0.406 0.399 0.648 76.92 淳安 2.462 1.954 0.423 0.418 0.410 0.658 76.92 种群水平 2.400 1.864 0.429 0.397 0.390 0.621 81.54 物种水平 3.231 1.925 0.429 0.406 0.405 0.671 92.31 说明：种群水平指5个种群平均值；物种水平指5个种群中所有物种平均值。 在物种水平上，5个种群榧树的平均等位基因数为3.231个，平均有效等位基因数为1.925个，期望杂合度(0.406)略小于观测杂合度(0.429)，Nei’s遗传多样性指数为0.405，Shannon’s指数为0.671，多态位点百分比为92.31%(表8)。各种群在种群水平上的多态位点百分比及Shannon’s指数均低于物种水平，仅淳安种群在种群水平上的Nei’s遗传多样性指数高于物种水平。
2.3.3 遗传分化与遗传结构
5个雌性榧树种群间的总遗传多样性平均为0.497；群体内近交系数均为负值，说明群体内杂合子过剩，纯合子缺失[18]，这与榧树雌雄异株的特性相吻合，且这些供试雌株都是杂交后代；种群间近交系数变幅为0.054~0.207，平均为0.129；遗传分化指数变幅为0.153~0.218，平均为0.199，表明5个雌性榧树种群间存在的遗传分化程度不大，这与榧树风媒、花粉流动性大的特性相吻合；基因流的变幅为0.898~1.381，平均为1.029，表明种群间存在基因交流，每代交流约1个基因，基因流动相对来说不是很频繁(表9)。
表 9 5个榧树种群的遗传分化Table 9 Genetic differentiation among 5 T. grandis populations种群 总遗传
多样性种群内
近交系数种群间
近交系数遗传分
化指数基因流 富阳 0.457 −0.113 0.058 0.153 1.381 嵊州 0.475 −0.003 0.206 0.209 0.946 黄山 0.491 −0.132 0.054 0.188 1.082 临安 0.527 −0.143 0.120 0.230 0.838 淳安 0.534 −0.013 0.207 0.218 0.898 平均值 0.497 −0.081 0.129 0.199 1.029 方差分析结果(表10)表明：榧树的遗传变异集中在种群内，种群内(92%)的遗传变异远大于种群间(8%)。
表 10 5个榧树种群的分子方差分析Table 10 Molecular variance among 5 T. grandis populations来源 自由度 平方和 均方 方差分量 变异百
分比/%P 种群间 4 67.427 16.857 0.416 8 0.081 种群内 141 664.251 4.711 4.711 92 总数 145 731.678 5.127 100 对亚群归属分析发现：每个种群的样本基本上都有3个亚群的痕迹，只是比例不同而已(图1)。这说明榧树天然异交导致高度杂合的特性。
图 1 基于Structure分析的5个榧树种群的遗传结构图Figure 1 Genetic structure of 5 T. grandis populations based on structure analysis2.3.4 种群间的遗传距离和遗传相似度
5个榧树种群的遗传相似系数平均为0.969，说明各种群间的遗传相似度很高，亲缘关系较近，存在一定程度的遗传变异(表11)。遗传距离平均为0.032，黄山与淳安种群的遗传距离最大(0.055)，遗传相似度最小(0.946)，富阳与黄山、临安种群的遗传距离最小(0.022)，遗传相似度最大(0.977)。表明雌性榧树群体遗传相似度高，但因雌雄异株天然杂交的特性，使物种内又存在一定的变异。
表 11 5个榧树种群的遗传距离和遗传相似度Table 11 Genetic distance and genetic identity among 5 T. grandis populations种群 富阳 嵊州 黄山 临安 淳安 富阳 0.976 0.977 0.977 0.962 嵊州 0.024 0.970 0.971 0.957 黄山 0.023 0.031 0.973 0.946 临安 0.023 0.030 0.027 0.977 淳安 0.038 0.045 0.055 0.024 说明：对角线下方为遗传距离，对角线上方为遗传相似度。 UPGMA聚类分析发现：富阳与黄山种群相聚之后再与嵊州种群聚在一起，随后上述3个种群与临安种群聚在一起，富阳、黄山、嵊州、临安4个种群与淳安种群之间存在差异 (图2)。
3. 讨论
本研究表明：5个雌性榧树种群叶与种实指标在种群间及个体间均存在显著差异，这与其本身雌雄异株风媒花天然杂交的特性相符。詹利云等[14]对富阳、嵊州、黄山、临安种群雄性榧树的叶片、种实表型指标进行了研究，而本研究则对上述相同种群雌株的叶片、种实表型指标进行探究。比较发现：在种群间，雄株仅叶长这一指标存在显著差异，雌株则各指标均有差异，但种群内雌雄榧树间各指标都有显著差异；黄山种群雌株叶质量的均值要小于雄株，且变异系数雌株种群比雄株种群大；叶形指数雌雄榧树均值接近，变异系数仅嵊州(13.97%)和临安(18.27%)种群的雄株比雌株(分别为11.20%、15.30%)大。
与沈登锋等[19]的研究结果相比，本研究的种实和种核质量与其接近，但变异系数较低，而种实相对脂肪含量两者相近。究其原因，沈登锋等[19]的研究是从种子可食性的角度收集种质，而本研究在各种群的取样则是随机的，数据更能反映自然条件下榧树种群的状况。董雷鸣等[20]对榧树黄山种群的种实进行了分析，发现与本研究在种实质量、种核质量、种形指数、核形指数上接近，而脂肪相对含量本研究的结果要高近7%。尽管研究材料取自同一种群，但榧树雌雄异株天然风媒杂交的特性决定了雄株花粉在其中所起的作用，加之研究的年份不同，气候气象条件也不同，因此研究结果有出入。本研究表明：榧树种实与种核的表型指标中，变异系数大于10%的包括种实质量、假种皮厚、种核质量及种壳厚，这些指标与种实产量有关，而各种群间相差10%以上的指标包括假种皮厚、种壳厚。
本研究的榧树种实可食性较差，其脂肪相对含量不及香榧。金松酸作为一种特殊的不饱和脂肪酸，目前已知来源较少，得率低[21]。本研究各种群金松酸的平均相对含量为10.76%~12.61%，接近或高于香榧及日本榧Torreya nucifera的平均值，且有的单株相对含量更高，进一步说明榧树种子的利用价值。本研究发现：榧树种实脂肪相对含量的变异系数为7.70%~21.80%，而不饱和脂肪酸的变异系数较小，低于5%，脂肪中各脂肪酸组分种群间差异显著，金松酸的变异系数为8.00%~20.00%，因此不仅具有优株选择的潜力，且基于脂肪、金松酸相对含量的高低来进行优株选择理论上是可行的。
本研究表明：天然雌性榧树的遗传变异集中在种群内，种群内(92%)的遗传变异远大于种群间(8%)，这与异交风媒植物90%以上的遗传变异存在于种群内的结果相符[22]，且说明榧树单株间的遗传变异更丰富，选育要基于单株性状表现来进行。以遗传多样性指标来看，仅淳安种群(H=0.410，I=0.658)的遗传多样性大于雌性榧树物种水平(H=0.405，I=0.671)，而雌性物种水平的多态位点百分比(92.31%)均大于5个天然雌性榧树种群。这与刘浩凯[12]用相关系列扩增多态性(SRAP)分析天然雌性榧树种群的结果相似。
天然榧树种群内近交系数均为负值，杂合子过剩而纯合子缺失，这也与该物种风媒传粉天然杂交的特性相吻合，说明天然雌性榧树种群没有近交衰退的现象[10]。WRIGHT[23]研究表明：遗传分化指数(Fst)可反映群体间遗传分化程度，当0＜Fst≤0.05、0.05＜Fst≤0.15、0.15＜Fst≤0.25、Fst＞0.25时，遗传分化程度分别为很弱、中等、较大分化、极大。基因流越大，遗传分化越小[24]。当基因流大于1时，说明种群间存在一定的基因交流，种群间的遗传分化不会太大[25]。在本研究中，5个雌性榧树种群的遗传分化指数为0.199，但基因流为1.029，说明种群间的遗传分化较大。
从榧树染色体水平参考基因组，可获得更加详细和精确的基因组信息[26]。这些信息不仅包括基因的序列，还包括基因的结构、功能和调控网络等。通过深入分析这些信息，可以更准确地识别和定位SSR标记，从而提高其全面性和多态性。
4. 结论
不同雌性榧树种群叶与种实表型指标在种群间及个体间存在显著差异。脂肪相对含量、脂肪酸相对含量及可溶性糖质量分数在种群间差异极显著，榧树种实表型和种仁品质变异丰富。基于遗传多样性指标，发现雌性榧树种群表现出一定程度的变异，淳安种群的遗传多样性最大，且雌性榧树的遗传变异种群内远大于种群间。
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图 1 不同时期无距虾脊兰根系内生真菌在门(A)和属(B)水平上的群落组成
Figure 1 Community composition of root endophytic fungi in different periods of C. tsoongiana at phylum (A) and genus (B) level
图 2 不同时期无距虾脊兰根际土壤真菌在门(A)和属(B)水平上的群落组成
Figure 2 Community composition of rhizosphere soil fungi in different periods of C. tsoongiana at phylum (A) and genus (B) level
图 3 根际土壤真菌与根系内生真菌在门(A)、属(B)水平下差异显著的类群
Figure 3 The endophytic fungi in rhizosphere soil and root were different at phylum (A) and genus (B) level
图 4 属水平不同时期根际土壤真菌与根系内生真菌分布韦恩图
Figure 4 Venn diagram of endophytic fungi distribution in rhizosphere soil and root at genus level at different periods
图 5 根际土壤真菌与根系内生真菌群落主成分分析
Figure 5 Principal component analysis of rhizosphere soil fungi and root endophytic fungi
表 1 物种注释结果统计
Table 1. Species annotation results statistics
生长
时期优化序
列/条门/个 纲/个 目/个 科/个 属/个 萌芽期 63 660 11 41 91 193 359 花期 92 975 13 46 101 217 367 果期 91 656 12 48 108 224 377 衰亡期 58 997 8 33 75 162 264 
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表 2 Alpha多样性指数
Table 2. Alpha diversity indexes
样本 Alpha多样性指数 ACE指数 Chao指数 Shannon指数 Sobs指数 Coverage指数 MG 1 983±26 c 1 379±81 ab 3.734±0.522 b 680±104 cd 0.964±0.004 a HG 4 078±3 043 bc 2 337±50 ab 3.724±1.606 b 987±423 bcd 0.968±0.009 a GG 8 681±439 ab 4 499±351 ab 4.221±0.501 b 1 342±161 abc 0.926±0.006 b SG 817±292 c 630±308 b 3.298±0.788 b 210±31 d 0.990±0.005 a MT 4 642±3 043 bc 3 057±1 539 a 5.042±0.191 a 1 243±322 abc 0.926±0.017 b HT 12 860±9 858 a 7 178±4 937 a 5.423±0.221 b 1 926±847 a 0.891±0.027 c GT 6 559±1 695 abc 4 109±826 ab 4.713±1.078 b 1 580±398 ab 0.931±0.017 b ST 5 182±642 abc 3 323±465 ab 4.713±0.684 b 1 198±229 abc 0.908±0.014 bc 说明：数据均为平均值±标准差。同列不同字母表示同一指数在不同样本间差异显著(P＜0.05)。MG. 萌芽期根系；HG. 花期根系；GG. 果期根系；SG. 衰亡期根系；MT. 萌芽期根际土壤；HT. 花期根际土壤；GT. 果期根际土壤；ST. 衰亡期根际土壤。
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链接本文:
https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20230179
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