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铁皮石斛Dendrobium catenatum是兰科Orchidaceae石斛属Dendrobium植物，其所含的石斛多糖成分具有抗氧化和抑制癌细胞等药用活性，使其具有重要的经济价值[1-6]。铁皮石斛在野外多附生于高大乔木或山石上，适宜其生长环境条件通常为海拔800~1 600 m，树冠透光率约60%，大气相对湿度60%~75%，日间温度20~25 ℃，夜间温度10~13 ℃，日温差为10~15 ℃，年均降水量为1 100~1 500 mm。目前，铁皮石斛已实现规模化人工种植，常采用温室控温控湿栽培于树皮土壤复合基质等方式[2, 7-9]。据2018年统计，中国人工栽培铁皮石斛的面积已经超过6 667 hm2，产量超1万t[10]。不同的生长环境对铁皮石斛的有效成分会产生影响，一般野外环境更利于铁皮石斛积累有效的次生代谢物[2, 7-11]。因此，近年来越来越多的栽培基地采用模拟野外生长环境，将铁皮石斛附生于立木表面进行栽培[7-8]。众多研究发现：植物内生菌对于宿主植物的营养代谢、抗逆适生和抵御病虫害等方面都发挥重要作用[12-16]。兰科植物通常与菌根真菌共生，铁皮石斛的多种内生真菌具有促进组培植株生长的作用，如镰刀菌属Fusarium内生真菌可产生赤霉素促进铁皮石斛生物量和氮磷养分的积累等[6, 17-20]。此外，分离自铁皮石斛的内生细菌被发现可诱使铁皮石斛种子萌发，具备固氮、解磷等功能[10, 20-21]。挖掘铁皮石斛内生菌资源，深度解析菌群结构与宿主植株的内在关联，对于植株种质选育、栽培方式改进、产量及品质提升等都具有积极意义。本研究探讨了铁皮石斛2种人工栽培方式（温室土壤基质培养和露天立木培养）对铁皮石斛内生细菌菌群结构的影响，并对铁皮石斛根、茎、叶各部多糖质量分数与内生细菌种类分布之间的潜在联系进行了分析，以期为开发具有促进铁皮石斛适生和营养等功能的内生细菌资源提供研究基础。
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铁皮石斛（品系C9）植株取自浙江省杭州市天目山种植基地。该品系具有较强的抗霜冻能力，以防露天立木培养的植株在10 ℃下受到霜害。于6月花期，采集2种栽培方式下的3年生健康植株，分别为大棚内的盆栽植株（土培，相对湿度50%~75%，温度15~25 ℃）和栖于树干部（马尾松Pinus massoniana）近野生植株（树培，霜期130~156 d，年降水量1 390~1 870 mm）。选取生长状态较一致的植株，分别采集其根、茎、叶、花苞、果实等部分。所采集的铁皮石斛材料，及时用自来水冲洗进行表面处理，用于后续的总DNA提取和多糖测定。
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分别从土培和树培植株的根、茎、叶、花苞或果实部分（当年新生部分，表面无病斑，每份100 mg）共选取24份样品。将每份样品浸没于5 mL体积分数为70%的乙醇，振荡消毒30 s后，用无菌水振荡清洗3次，每次30 s左右。晾干后，液氮碾磨，随后用Takara细菌基因组提取试剂盒（MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver. 5.0）提取总DNA。操作步骤按试剂盒手册进行，为使内生菌破壁完全，其中裂解细胞阶段延长作用时间至2.0 h。另准备各部分样品表面消毒后置于R2A培养基上检验表面除菌效果，28 ℃培养2~3 d，无菌落生长则为消毒操作合格。
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细菌16S V3~V4可变区（450 bp）为测序目标片段，由杭州沃森生物科技有限公司利用Illumina Miseq平台进行高通量测序。用QⅡME 2.0软件去除低质量序列，剩余序列按照相似度97%以上进行分类操作单元（operational taxonomic unit, OTU）聚类，以丰度最大的序列为代表序列。利用Greengenes数据库（版本13.8）和美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information, NCBI）比对进行序列注释，并除去注释为植株叶绿体和线粒体细胞器16S OTUs信息。统计各样品OTU数量及每个OTU对应的有效序列数，计算相对丰度（占每个样品总序列数的比例），并进行多样性分析。
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将新鲜的土培和树培铁皮石斛根、茎、叶（每份样品鲜质量100.0 g）在80 ℃烘干2~3 d，粉碎后过筛（60目）收集。将每份样品的粉末分别称取3份（每份为0.3 g），放置于250 mL圆底烧瓶200 mL水中，100 ℃水浴加热2.5 h。将烧瓶内样品进行抽滤处理，滤出液体倒入250 mL容量瓶，待冷却至室温用水进行定容。取5.0 mL滤液与25.0 mL无水乙醇混合后进行4 ℃冷藏1.0 h。样品离心1.0 h（转速6 000 r·min-1），弃上清液后加20.0 mL体积分数为80%的乙醇，离心20 min（转速6 000 r·min-1），重复2次。弃上清液，加100 ℃热水溶解沉淀，转移至50 mL容量瓶中待冷却至室温后，进行定容。量取样品溶液0.5 mL，置于10.0 mL具塞试管中，加入蒸馏水0.5 mL以及体积分数为5 %苯酚溶液1.0 mL，摇匀，再加入浓硫酸5.0 mL摇匀，沸水中加热20 min后冰浴5 min。以蒸馏水为空白对照组，分别取200 μL处理液，测定波长488 nm处各组的光密度。配置不同质量分数多糖溶液，测量光密度，绘制标准曲线。重复3次，计算根、茎、叶各部分多糖质量分数。
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利用数据统计软件DPS对2种栽培方式下根、茎、叶、花、果各部分的OTUs、多样性指数和多糖质量分数进行方差分析。利用R软件制作韦恩图、热图等。同时，将筛选出来根、茎、叶各部的OTU相对丰度与相应各部多糖质量分数进行逐步回归分析，筛选出与多糖质量分数关联度最高的OTU信息。
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2种栽培方式下，铁皮石斛各组织部位菌群测序结果分析显示，OTU数量、Shannon-Wiener和Simpson多样性指数，多呈现差异显著（OTU：栽培方式F1, 16=18.405, P=0.000 6;组织部位F3, 16=12.638, P=0.000 2。Shannon-Wiener指数：栽培方式F1, 16=2.504, P=0.133 1;组织部位F3, 16=6.017, P=0.000 6。Simpson指数：栽培方式F1, 16=84.739, P=0.000 1;组织部位F3, 16=34.673, P=0.000 1），说明栽培方式对铁皮石斛内生细菌群落结构产生重要影响，且内生细菌在植株上的分布呈组织特异性。如表 1所示：树培的植株除根部外，其他叶和茎部分OTU数量少于土培环境中的植株；不同组织部分中，叶部、花部的OTU菌群分布数量较少，根、茎、果的部分数量较多。多样性指数方面也呈相似规律。
表 1 2种栽培方式下铁皮石斛内生细菌多样性
Table 1. Diversity of bacterial symbionts of Dendrobium catenatum under two cultivation methods
栽培
方式部位 分类操单元
(OTU)Shannon-Wiener
指数Simpson指数 树培 根 630.67 ± 226.48 a 1.52 ± 0.59 a 0.94 ± 0.09 a 果 447.33 ± 57.84 b 1.58 ± 0.21b 0.92 ± 0.03 b 茎 122.67 ± 26.76 c 0.37 ± 0.20d 0.07 ± 0.04 c 叶 28.33 ± 6.81 c 0.03 ± 0.01 d 0.00 ± 0.00 c 土培 根 112.67 ± 24.19 c 0.34 ± 0.05d 0.06 ± 0.01 c 花 86.67 ± 19.55 c 0.24 ± 0.08d 0.04 ± 0.01 c 茎 310.67 ± 107.58 c 1.62 ± 0.91 c 0.37 ± 0.24 b 叶 73.00 ± 84.92 c 0.27 ± 0.34 d 0.07 ± 0.10 c 说明:数值为3个样品的平均值+标准差;同列不同字母表示差异显著(LSD统计方法，P<0.05) -
由图 1可见：厚壁菌门Firmicutes（16.7%~34.9%）、拟杆菌门Bacteroidetes（8.7%~35.6%）、变形菌门Proteobacteria（15.9%~42.0%）、放线菌门Actinobacteria（2.6%~19.0%）在各组织部位相对丰度较高。厚壁菌门在土培的茎部占比最高（34.9%），与树培茎部（31.3%）相近。拟杆菌门在土培叶部最高（35.6%），为树培叶部（21.7%）的1.6倍。放线菌门在树培根部最高（19.0%），是土培根部（14.1%）的1.3倍。酸杆菌门Acidobacteria在树培果实部位占比最高，达10.9%，但在叶部和花苞部未检出。
图 1 2种栽培方式下铁皮石斛内生细菌门水平菌群结构
Figure 1. Community structure on phylum level of the bacterial symbionts of D. catenatum under two cultivation methods
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氮元素是植物生长所必需的大量元素，自然条件下常呈局部紧缺状态。红螺菌科Rhodospirillaceae中的固氮螺菌属Azospirillum，弗兰克菌科Frankiaceae中的弗兰克菌属Frankia，肠杆菌科Enterobacteriaceae中的肠杆菌属Enterobacter，假单胞菌科Pseudomonadaceae的假单胞菌属Pseudomonas和芽孢杆菌科Bacillaceae的芽孢杆菌属Bacillus中的部分种类有内生固氮功能。这些科属在铁皮石斛各组织中都有分布，除了红螺菌科和弗兰克菌科不存在于叶部。从2种栽培下铁皮石斛内生细菌功能上看，树培状态下具有这些固氮潜能的OTUs占比明显高于温室土培植株（图 2）。
图 2 2种栽培方式下铁皮石斛具固氮潜能的内生细菌
Figure 2. Nitrogen-fixing bacterial symbionts on family level of D. catenatum under two cultivation methods
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从图 3可见：栽培环境对组织内生细菌优势属（相对丰度大于1.0%）影响较大。栖水菌属Enhydrobacter在树培果中占优势，比例高达35.2%；甲醇杆菌属Methylobacterium在土培叶中为优势菌属，比例达35.8%；薄层菌属Hymenobacter仅在土培叶中分布，占9.9%。拟杆菌属Bacteroides、双歧杆菌属Bifidobacterium、韦荣球菌属Veillonella在各组织部位中多有分布，在树培根部、果实和土培叶部相对丰度较低；颤螺旋菌属Oscillospira在树培茎部分布较少；巨单胞菌属Megamonas在树培茎部相对较多，栖热菌属Thermus则在土培花苞内最多；不动杆菌属Acinetobacter则存在于树培和土培的茎部。
图 3 2种栽培方式下铁皮石斛内生细菌属水平热图
Figure 3. Heatmap on genus level of the bacterial symbionts of D. catenatum under two cultivation methods
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如图 4所示：铁皮石斛茎中多糖质量分数显著高于叶部和根部。方差分析结果显示：2种栽培方式下铁皮石斛不同部位多糖质量分数呈极显著差异（根：F1, 4=11.15, P=0.029；茎：F1, 4=9.44, P=0.037；叶：F1, 4=39.31, P=0.003），说明栽培方式影响多糖在植株内的积累。通过韦恩图发现：不同栽培方式对根、茎、叶菌群结构有明显影响，其中根部和叶部影响大，共有的OTUs占24%~26%，而茎部共有部分占49%，这些OTUs的分布差异可能与多糖质量分数间存在一定关联。将2种栽培方式下根、茎和叶优势内生细菌属相对丰度（x自变量，x1~x53分别表示不同属）和各部多糖质量分数（y因变量）进行相关性分析，得逐步回归方程y=0.058+29.688x17-4.146x13-0.424x52-0.085x2（相关系数R2=0.999 8，P < 0.05）。方程中通过逐步回归筛选出的4个属的相对丰度与多糖质量分数最为密切（系数绝对值越大代表其相关性越高），其中：不动杆菌属（x17）影响最大，其次为假单胞菌属（x13）、薄层菌属（x52）和韦荣球菌属（x2）。
图 4 2种栽培环境中铁皮石斛组织多糖质量分数
Figure 4. Polysaccharide contents of D. catenatum under two cultivation methods
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在门水平上，不同栽培环境下铁皮石斛的优势内生细菌门类多集中在厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门和放线菌门，且在不同栽培环境和不同组织中占比有所不同，显示内生细菌分布受外界环境和宿主植物组织特异性的影响较大。其中，果实部位与其他部位差异较明显，变形菌门和酸杆菌门的种类占优势，这很可能跟开花和果实发育过程中植株表面环境菌群进入果实内部有关，或与不同组织营养成分种类和含量不同相关。铁皮石斛内生细菌在属水平上显示，拟杆菌属、双歧杆菌属和韦荣球菌属相对丰度占优势，这些属中通常包含了常见的植物源乳酸菌，广泛存在于各类植物中。其中，不同栽培方式下的韦荣球菌属、栖热菌属、颤球菌属和甲醇杆菌属差异较大，这很可能与露天树培环境复杂，风吹、雨溅、虫噬等使得环境中部分菌属进入植株内部。氮元素往往是野外自然条件下植株的生长限制因子，从高通量测序结果看，铁皮石斛具有多种固氮潜能的菌种包括根瘤菌Rhizobiales和弗兰克菌等[20, 22-23]。尤其在树培环境中固氮菌占比显著高于温室土培植株，这很可能与环境中氮养分含量多寡有关，树培环境中固氮菌具有促进铁皮石斛植株生长的可能。
植物内生细菌对宿主植物积累光合产物等糖类物质的有益作用在不同植物上多有报道。例如，甘蔗Saccharum officinarum茎干部的内生细菌具有促植株生长及糖类产物积累的作用[24]，内生荧光假单胞菌利于草本药用植物苍术Atractylodes lancea植株内光合产物和多糖的提高[25]。有些内生细菌本身可在植物体内合成大量多糖，如分离自禾本科Gramineae芒草Miscanthus sinensis茎秆部的内生菌Mucilaginibacter endophyticus可产生多种外分泌多糖[26]。本研究的2种栽培环境中，铁皮石斛根、茎、叶各部OTU重叠部分仅为24.2%~49.0%，显示出内生菌群的组织分布差异性。从逐步回归分析结果看：仅4个属的内生细菌与多糖质量分数呈相关性。尽管不同栽培方式下铁皮石斛多糖质量分数有所差别，但与多糖质量分数关联最高的不动杆菌属在2种栽培方式下茎部相对丰度都达1.0%，明显高于根部和叶部。从序列比对结果看：该OTU与约氏不动杆菌Acinetobacter johnsonii一致，后者是一种革兰氏阴性反硝化聚磷耐冷菌，其是否与铁皮石斛C9品系耐冷特性及多糖合成相关有待进一步验证[27]。与多糖质量分数相关联仅次于不动杆菌属的是假单胞菌属，但与多糖质量分数呈负相关。该属细菌往往具有固氮、高分子多聚物降解等多种生理功能，铁皮石斛内发现的这株假单胞菌很可能参与糖类分解代谢，不利于多糖积累。这与苍术中发现的促生假单胞菌的作用不同，说明同属菌种在不同宿主植物中作用的多样性。
综上所述，不同栽培条件对铁皮石斛内生细菌菌群结构有显著影响，功能上固氮和耐冷等与宿主营养和抗逆相关的属种变化明显，说明内生细菌群对铁皮石斛适应环境很可能发挥重要作用。同时，发现相对丰度与多糖质量分数相关的4个OTUs，为进一步分析铁皮石斛内生细菌功能与多糖积累之间的关联提供启示。
Effects of two cultivation environments on diversity of bacterial symbionts in Dendrobium catenatum
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摘要:
目的 揭示不同栽培环境对铁皮石斛Dendrobium catenatum内生细菌群落结构的影响，解析与石斛多糖含量存在潜在关联的功能菌种。 方法 针对温室人工基质培养和仿野生立木附生培养2种栽培体系下的铁皮石斛C9品系根、茎、叶等各部组织内生细菌，采用Illumina测序平台的Miseq进行高通量测序分析其菌落结构和多样性，同时利用逐步回归法分析内生细菌分布与组织多糖质量分数的关联性。 结果 铁皮石斛在2种栽培环境不同组织中的菌群结构差异显著（P < 0.05），附生立木仿野生环境比温室环境下物种丰富度更高。同时，根部所含分类操作单元（OTUs）数量最多（112~630个），叶部则最少（28~73个）。其中，厚壁菌门Firmicutes（16.7%~34.9%）、拟杆菌门Bacteroidetes（8.7%~35.6%）和变形菌门Proteobacteria（15.9%~42.0%）的OTUs占优势。从菌种生理功能上看，固氮相关的菌种如弗兰克菌科Frankiaceae在树培环境下相对丰度更高，推测可能受树培寡氮环境的影响使固氮菌富集。逐步回归分析结果显示：不动杆菌Acinetobacter在根、茎、叶不同组织中的相对丰度与多糖质量分数变化关联度最大，其次为假单胞菌Pseudomonas。 结论 铁皮石斛内生细菌资源相当丰富，而栽培方式影响菌群分布，且与石斛多糖质量分数具有关联性。 Abstract:Objective Aimed to discover the effect of different cultivation measures on endophytic bacterial communities and polysaccharides accumulation in Dendrobium catenatum, this research is conducted to compare D. catenatum in two environments of soil cultivation in green house and truck-attaching cultivation in open field. Method With the Miseq high-throughput sequencing on Illumina platform conducted, efforts are made to discover the community structures, diversity, and potential functions of bacterial symbionts in different tissues such as roots, stems and leaves of D. catenatum. Besides, the correlation of polysaccharide content with bacterial community was also analyzed employing the stepwise method. Result (1) There is significant difference (P < 0.05) in bacterial communities in different tissues with different cultivation environments; (2) The bacterial richness was higher in truck-attaching cultivation than that in greenhouse, and the operational taxonomic units (OTUs) in root tissues are the largest in number (112-630 OTUs) while those in leaf tissues (28-73 OTUs) are the smallest in number. Comparatively, the OTUs in phyla of Firmicutes (16.7%-34.9%), Bacteriodetes (8.7%-35.6%) and Proteobacteria (15.9%-42.0%) dominate in tissues; (3) Physiologically, OTUs of nitrogen-fixation related bacteria such as Frankiaceae are larger in number in truck-attaching cultivation environment, reflective of the influence of nitrogen-lacking environment. The stepwise procedure results have shown that the relative abundance of Acinetobacter has the highest correlation with the polysaccharide contents in different tissues of root, stem and leaf, followed by Pseudomonas. Conclusion D. catenatum are rich in endophytic bacteria, cultivation measures exert effect on the bacterial community and some bacteria are correlated with the polysaccharides contents. These results shall shed light on further exploration of endophytic bacterial resources in D. catenatum. -
高温胁迫不仅导致植物表型的变化，而且会引起植物体内细胞稳态失衡，生长发育受到抑制，严重影响观赏植物的品质[1]。环境温度的变化对植物光合作用的多种生理生化过程有直接的影响，包括光合碳固定和还原、蔗糖合成、光合产物的运输与分配等[2]。碳同化是光合作用中植物在同化力形成之后的第3个阶段，此阶段中，植物叶绿体基质中的Rubisco酶利用ATP和NADPH同化二氧化碳(CO2)生成淀粉、蔗糖、葡萄糖、果糖等物质。在高等植物光合作用中，果糖-1,6-二磷酸酶(Fructose-1, 6-diphosphate synthase, FBPase)在卡尔文循环和细胞质中的蔗糖生物合成途径中都起着关键作用，其中存在至少2种酶：叶绿体型FBPase和胞质型FBPase。叶绿体型FBPase主要参与还原磷酸戊糖途径，同时参与叶绿体中淀粉的合成；胞质型FBPase主要参与糖异生途径和蔗糖的合成，在蔗糖的合成中起着重要的调节作用[3-4]。有研究指出蔗糖磷酸合酶(sucrose diphosphate synthase, SPS)与淀粉积累呈现负相关关系，而与蔗糖形成呈正比关系[5-6]，并与蔗糖合成酶(sucrose synthase, SS)一起成为蔗糖调节的关键酶[7]，为淀粉合成提供底物及能量。淀粉是植物体中碳水化合物的主要储存形式，叶片中淀粉合成是一个动态的过程[8]。在淀粉合成通路中，腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glocose pyrophosphorylase, AGP)作为限速酶，参与第一步反应，颗粒结合淀粉合酶(granule-bound starch synthase, GBSS)参与直链淀粉合成，可溶性淀粉合成酶(soluble starch synthase, SSS)和淀粉分支酶(starch branching enzyme, SBE)协作合成支链淀粉[7]。这些碳同化产物既是光合作用的产物，同时还是植物呼吸作用的底物，为植物的生长发育提供碳骨架的同时，还可增强植物的抗逆性。为进一步了解植物对高温的响应，分子生物学与转录组学等应用与解析调控植物耐热的分子基础，培育了相关观赏植物品种[1]。
景宁木兰Magnolia sinostellata是木兰科Magnoliaceae木兰属Magnolia灌木，早春开花，花色浅粉色到粉红色，具有较高的观赏价值，具有开发应用价值[9]。全球变暖带来的极端高温可能对景宁木兰的生长发育带来潜在的威胁。目前已挖掘了景宁木兰热胁迫下实时荧光定量PCR 内参基因，但还未深入研究。因此，本研究以景宁木兰幼苗为对象，采取高温胁迫处理，研究其糖代谢途径变化机制，从而探究景宁木兰对高温的响应情况，同时为木兰属植物的城市应用奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 材料
景宁木兰植株均来自浙江省景宁县草鱼塘林场苗圃(海拔1 100 m)。选择1年生、生长一致的景宁幼苗栽植于装有土壤与珍珠岩按质量比为1∶1混合的容器中，常规管理。所有样品均放置于光照培养箱中[光照20 μmol·m−2·s−1，温度(25±1) ℃，相对湿度(70±10)%，光照黑暗各12 h]。当植株生长到10 cm左右高度时，选取20株健康、长势均匀的幼苗转移到温度设定为40 ℃(H)的光照培养箱中，以25 ℃为对照(ck)。处理0、3、6、9、 12、24和48 h时采集景宁木兰第2~3叶(成熟叶)为样本，迅速保存在液氮中，用于后续的测定，其中选取ck-24、ck-48、H-24、H-48用于转录组测定，每个样本3次生物学重复。
1.2 糖、淀粉及酶活性测定
蔗糖、淀粉、葡萄糖和果糖质量分数的测定采用改进的苯酚-硫酸法[10]，果糖1,6-二磷酸酶(FBPase)的测定方法采用CHEN等[11]的方法，蔗糖磷酸合酶(SPS)根据GROF等[12]方法测定。采用SPSS 19.0进行单因素方差分析，采用LSD法进行显著性差异分析。
1.3 转录组测序与数据分析
使用Trizol试剂盒(天根，北京)提取景宁木兰叶片总RNA。质量检测合格后，经深圳华大基因科技服务有限公司使用DNaseI消化DNA、富集mRNA并反转录合成cDNA和PCR扩增，制备cDNA文库。用Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI StepOnePlusReal-Time PCR System完成文库质量和产量检测后进行转录组测序。对原始数据(raw reads)进行质控(QC)获得滤后的数据(clean reads)，再进行基因定量分析以及基于基因表达水平的各项分析(主成分、相关性、条件特异表达、差异基因筛选等)，并对筛选出的样品间差异表达基因进行GO功能显著性富集分析、pathway显著性富集分析和聚类以及蛋白互作网络和转录因子等深入挖掘分析。
1.4 基因表达量及差异基因分析
用RSEM工具[13−14]进行基因表达定量，运用FPKM法消除基因长度和测序量差异对计算基因表达的影响，计算得到的基因表达量可直接用于比较不同样品间的基因差异表达。将候选响应基因利用RefSeq non-redundant proteins(NR)数据库、Swiss-Prot数据库、Gene Ontology(GO)数据库和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)数据库进行Blast比对，获得候选响应基因的注释信息。用WEGO软件[15]对差异基因做GO功能分类统计，利用Omicshare在线工具库中的动态KEGG富集分析程序进行候选响应基因的注释及功能预测。
1.5 实时荧光定量 PCR
将反转录产物cDNA稀释10倍，使用SYRB Premix Ex Tap Ⅱ (TAKARA：Code No.RR820A)实时定量PCR试剂盒，使用Light Cycler 480 Ⅱ(Roche)实时定量PCR仪进行定量分析。反应体系为SYRB Premix Ex Tap Ⅱ10 μL，cDNA模板2 μL，上下游引物各0.8 μL(10 μmol·L−1)，ddH2O 6.4 μL，共20 μL体系。每个样品3次重复，扩增反应程序为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃预变性30 s，共40个循环。然后95 ℃持续5 s，60 ℃持续1 min，95 ℃持续15 s作为溶解曲线分析程序，进行溶解曲线分析。最后根
${{\text{2}}^{\text{-}\Delta \Delta {{C}_{t}}}} $ 法计算目的基因的相对表达量。2. 结果与分析
2.1 高温胁迫对景宁木兰碳水化合物质量分数与酶活性的影响
与对照相比，高温胁迫下24和48 h时景宁木兰的果糖、葡萄糖和蔗糖质量分数增加(图1A~C)，除高温胁迫24 h的葡萄糖质量分数与对照无显著差异外(图1B)，其他均呈显著差异(P＜0.05)。与对照相比，高温胁迫24 h时的淀粉质量分数显著降低(P＜0.05)，而胁迫48 h时的淀粉质量分数显著升高(P＜0.05)(图1D)。FBPase和SPS是蔗糖合成的关键酶，与对照相比，FBPase活性在胁迫24 h时先显著升高(P＜0.05)，在48 h时下降，但差异不显著(P＞0.05)(图1E)。在高温胁迫下，SPS活性相比对照在24 h下降，48 h时有所上升，但并无显著差异(P＞0.05)(图1F)。相关性分析结果表明(表1)：蔗糖与果糖变化成极显著正相关(P＜0.01)，淀粉、SPS活性与FBPase活性成负相关。
图 1 不同热胁迫处理对景宁木兰碳水化合物同化过程的影响Figure 1 Effects of different heat stress treatments on the carbohydrates assimilation process of M. sinostellata表 1 高温胁迫下景宁木兰碳水化合物质量分数与酶活性的相关系数Table 1 Correlation coefficient between carbohydrate contents and enzyme activities of M. sinostellata under high temperature stress指标 果糖 葡萄糖 蔗糖 淀粉 FBPase活性 SPS活性 果糖 1 葡萄糖 0.945 1 蔗糖 0.999** 0.937 1 淀粉 0.697 0.853 0.670 1 FBPase活性 0.261 0.030 0.298 −0.493 1 SPS活性 0.707 0.738 0.680 0.891 −0.432 1 说明：**表示差异极显著(P＜0.01) 2.2 高温胁迫下景宁木兰叶片的转录组测序
转录组数据(表2)显示：测序碱基对总数为7 054万~ 7 313万条 。每个原始读取从一端测序，长度为50 bp。去除低质量序列后(即含有＜1%的不确定碱基)，各测序样本共获得70 547 818(ck-24)、72 966 866(ck-48)、73 134 592(H-24)和73 140 464(H-48) 条。每个库中clean reads的比例平均为99.53%。来自对照和高温样本的转录组都有至少7 000万个clean reads，这表明景宁木兰转录组数据质量较高，能够开展后续的生物信息学分析。数据筛选后得到的17 884个不同长度的差异unigenes[错误发生率(FDR)≤0.001, log2R≥1]。H-24与ck-24相比，4 662个基因的表达下调，6 611个基因的表达上调；H-48与ck-48相比，4 658个基因的表达下调，5 131个基因的表达上调；H-48与H-24相比，4 548个基因的表达下调，4 056个基因的表达上调(表3)。
表 2 高温胁迫和非高温胁迫下景宁木兰的叶片测序结果与参考基因序列的对比率Table 2 Ratio of leaf sequencing results to reference gene sequences of M. sinotellata under heat stress and non-heat stress处理 总读数 总碱基对 总比对数 高质量比对数 丢失对比数 单一比对数 非单一读数 总未比对读数 ck-24 70 547 818
(100)7 054 781 800
(100)52 601 172
(74.56)33 257 776
(47.14)19 343 396
(27.42)38 336 892
(54.34)14 264 280
(20.22)17 946 644
(25.44)ck-48 72 966 866
(100)7 296 686 600
(100)55 252 592
(75.72)35 172 380
(48.20)20 080 212
(27.52)39 734 140
(54.46)15 518 452
(21.27)17 714 272
(24.28)H-24 73 134 592
(100)73 134 592 009
(100)52 733 028
(72.10)33 645 473
(46.00)19 087 555
(26.10)38 257 910
(52.31)14 475 118
(19.79)20 401 562
(27.90)H-48 73 140 464
(100)7 314 046 400
(100)54 165 208
(74.06)34 404 377
(47.04)19 760 831
(27.02)40 219 158
(54.99)13 946 050
(19.07)18 975 254
(25.94)说明：括号内为参考基因序列的对比率(%) 表 3 差异表达基因统计Table 3 Statistic of differentially expressed genes总计 ck-24/H-24 ck-48/H-48 H-24/H-48 上调 6611 5131 4056 下调 4662 4958 4548 2.3 GO功能注释分类
GO数据库定义了3类系统来描述基因产物的具体功能：生物过程(biological process)、细胞组分(cellar component)和分子功能(molecular function)，这些基因又被具体分为56个小类，从而发挥生物功能。将组装的景宁木兰unigene与GO数据库比对分析，图2A~C显示：景宁木兰序列中有81 573条unigene可以进行功能分类。其中33.03%的基因显著富集于生物过程、34.31%的富集于细胞组分，32.66%的分子功能。生物学过程中的主要途径是细胞途径和代谢过程相关的转录调控，细胞组分中最多的是膜的构成，分子功能中最多的是结合和催化活性。
图 2 3个比较组差异基因的GO分类(A~C)和KEGG富集图(D~F)Figure 2 GO classification (A−C) and KEGG enrichment map (D−F) of DEGs in 3 comparison groups2.4 KEGG代谢通路分析
将组装的景宁木兰unigene与KEGG数据库比对及KEGG富集分析(图2D~E)，结果发现：在景宁木兰高温胁迫的3个比较组中，ck-24与H-24、H-24与H-48代谢相关通路高度富集；ck-24与H-24、ck-48与H-48淀粉和蔗糖代谢通路富集排名第3位，H-24与H-48排名第4位。这些结果表明：淀粉和蔗糖代谢途径在景宁木兰高温胁迫响应机制中具有重要作用。
2.5 热胁迫诱导的淀粉-糖代谢途径差异基因表达分析
在淀粉代谢通路中共有105个差异基因。在该通路中，8个DEGs调控ADP-glucose以促进淀粉酶合成，5个DEGs调控淀粉酶以生产淀粉；淀粉也可以通过同样的途径调控ADP-glucose产生α-D-Glucose-1P，然后再形成UDP-glucose，UDP-glucose再在蔗糖合成酶基因和蔗糖6磷酸合成酶基因的作用下形成蔗糖；蔗糖代谢通路中有17个差异基因，其中有6个属于蔗糖合酶基因，5个属于蔗糖磷酸合成酶(图3A~D)。选取6个淀粉和蔗糖代谢途径高表达基因，即GP(CL3087.contig2)、SS(Unigene40295)、Glc-1-pa(Unigene38453)、GBE(CL4668.contig3)、SUS(Unigene42760)、SPS(CL651.contig6)，通过qPCR定量分析，结果显示(图4)：与对照相比，高温胁迫48 h处理下淀粉和糖代谢途径上的GP(CL3087.contig2)、SS(Unigene40295)、Glc-1-pa(Unigene38453)、GBE(CL4668.contig3)基因表达显著上调(P＜0.05)，SUS(Unigene42760)、SPS(CL651.contig6)基因表达显著下降(P＜0.05)。由此说明，在高温胁迫下，淀粉合成酶基因及蔗糖6磷酸合成酶基因表达均呈现上调的趋势，以促进蔗糖产生。
图 3 高温胁迫下淀粉-糖代谢途径及相关基因表达分析图Figure 3 Analysis of starch and sugar metabolic pathway and related gene expression under high temperature stress metabolism
图 4 淀粉与蔗糖代谢途径6个DEGs在不同时间点的相对表达Figure 4 Relative expression of 6 DEGs in starch and sucrose metabolism pathways at different time points3. 讨论与结论
极端高温天气势必影响植物的生长发育，最终导致部分植物处于濒危状态。本研究转录组数据显示：极端高温处理景宁木兰之后，其大部分基因可注释到生物进程，代谢功能途径中基因分布最多，这与非洲菊Gerbera jamesonii[16]、牡丹Paeonia suffruticosa[1]等相似。景宁木兰的KEGG数据库显示：在高温处理后，大部分基因高度富集于代谢通路，同时淀粉与糖代谢通路中占据重要的比例。由此推断，淀粉和蔗糖代谢对景宁木兰响应高温胁迫机制具有重要的作用。
植物叶片光合作用同化吸收的碳用于叶绿体淀粉的形成，或者运输到细胞质中合成蔗糖，蔗糖随后被运输到植物的非光合位置。不同植物叶片淀粉和蔗糖积累水平差异很大，环境因子(如温度、光照等)也影响着植物叶片所固定碳在蔗糖和淀粉之间的分配[17]。本研究中，随着高温胁迫的加深，24和48 h处理下景宁木兰叶片蔗糖和淀粉质量分数差异不显著，但是均显著高于对照。本研究中FBPase与淀粉显著正相关，与蔗糖负相关。这与马铃薯Solanum tuberosum[18]、拟南芥Arabidopsis thaliana[19]的研究结果一致。FBPase在24 h达到最高值之后，说明景宁木兰对高温具有一定的适应性，然而48 h时与对照相比差异不显著，说明高温对景宁木兰FBPase影响不大。
植物的生长发育所需要的光合产物大部分以蔗糖的形式供应和运输，其中，SPS是蔗糖合成途径的一个重要控制点，同时也是蔗糖进入各种代谢途径所必需的关键酶之一，它的活性可反映蔗糖生物合成途径的能力[20-21]。一些研究指出SPS与淀粉积累呈现负相关，而与蔗糖形成呈正相关[5-6]。本研究结果与之相似。在温州蜜柑Citurs unshiu ‘Miyagawawase’[22]、灌浆期水稻Oryza sativa ‘Koshihikari’和O. sativa ‘Sasanishiki’[23]的研究中也发现了同样的问题，可能是因为光合细胞中同化的碳水化合物在蔗糖和淀粉之间的分配受SPS的调节，但SPS不起主要作用，蔗糖和淀粉的合成还受其他因子的影响[24-25]。
淀粉和蔗糖代谢途径和多种酶密切相关，植物一般利用糖苷键将蔗糖[β-D-frucose-(2→1)-α-D-glucose]和海藻糖[α-D-glucose-(2→1)-α-D-glucose]中的己糖残基连接在一起，蔗糖和海藻糖的形成掩盖了葡萄糖和果糖的活性基团，两者反应活性低于葡萄糖[16]。本研究果糖、葡萄糖质量分数随着胁迫的加深有所下降，从而促进了淀粉质量分数的增加，虽然差异不显著，但是调节淀粉合成的SS(Unigene40295)、Glc-1-pa(Unigene38453)、GBE(CL4668.contig3)基因的表达量增加，进一步证明了高温可能促进胞质蔗糖质量分数的变化，通过ADP-glucose催化促进淀粉的合成[16]。虽然ADP-glucose是否是催化淀粉合成的关键酶还存在争议[16]，但是本研究定量结果显示：SPS(CL651.contig6)基因随着高温胁迫的加深，呈现下降趋势，这进一步说明了淀粉积累与蔗糖积累之间存在相关性，但是具体机制还需要深入研究。
综上所述，景宁木兰在高温胁迫下，积累糖和淀粉以提升抵抗胁迫能力，且淀粉与蔗糖途径的关键基因表达也反映了景宁木兰响应高温胁迫的机制。具体基因的功能验证还需进一步研究。
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图 1 2种栽培方式下铁皮石斛内生细菌门水平菌群结构
Figure 1 Community structure on phylum level of the bacterial symbionts of D. catenatum under two cultivation methods
图 2 2种栽培方式下铁皮石斛具固氮潜能的内生细菌
Figure 2 Nitrogen-fixing bacterial symbionts on family level of D. catenatum under two cultivation methods
图 3 2种栽培方式下铁皮石斛内生细菌属水平热图
Figure 3 Heatmap on genus level of the bacterial symbionts of D. catenatum under two cultivation methods
图 4 2种栽培环境中铁皮石斛组织多糖质量分数
Figure 4 Polysaccharide contents of D. catenatum under two cultivation methods
表 1 2种栽培方式下铁皮石斛内生细菌多样性
Table 1. Diversity of bacterial symbionts of Dendrobium catenatum under two cultivation methods
栽培
方式部位 分类操单元
(OTU)Shannon-Wiener
指数Simpson指数 树培 根 630.67 ± 226.48 a 1.52 ± 0.59 a 0.94 ± 0.09 a 果 447.33 ± 57.84 b 1.58 ± 0.21b 0.92 ± 0.03 b 茎 122.67 ± 26.76 c 0.37 ± 0.20d 0.07 ± 0.04 c 叶 28.33 ± 6.81 c 0.03 ± 0.01 d 0.00 ± 0.00 c 土培 根 112.67 ± 24.19 c 0.34 ± 0.05d 0.06 ± 0.01 c 花 86.67 ± 19.55 c 0.24 ± 0.08d 0.04 ± 0.01 c 茎 310.67 ± 107.58 c 1.62 ± 0.91 c 0.37 ± 0.24 b 叶 73.00 ± 84.92 c 0.27 ± 0.34 d 0.07 ± 0.10 c 说明:数值为3个样品的平均值+标准差;同列不同字母表示差异显著(LSD统计方法，P<0.05) 
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https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.2020.02.012
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