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铁皮石斛Dendrobium catenatum是兰科Orchidaceae石斛属Dendrobium植物，其所含的石斛多糖成分具有抗氧化和抑制癌细胞等药用活性，使其具有重要的经济价值[1-6]。铁皮石斛在野外多附生于高大乔木或山石上，适宜其生长环境条件通常为海拔800~1 600 m，树冠透光率约60%，大气相对湿度60%~75%，日间温度20~25 ℃，夜间温度10~13 ℃，日温差为10~15 ℃，年均降水量为1 100~1 500 mm。目前，铁皮石斛已实现规模化人工种植，常采用温室控温控湿栽培于树皮土壤复合基质等方式[2, 7-9]。据2018年统计，中国人工栽培铁皮石斛的面积已经超过6 667 hm2，产量超1万t[10]。不同的生长环境对铁皮石斛的有效成分会产生影响，一般野外环境更利于铁皮石斛积累有效的次生代谢物[2, 7-11]。因此，近年来越来越多的栽培基地采用模拟野外生长环境，将铁皮石斛附生于立木表面进行栽培[7-8]。众多研究发现：植物内生菌对于宿主植物的营养代谢、抗逆适生和抵御病虫害等方面都发挥重要作用[12-16]。兰科植物通常与菌根真菌共生，铁皮石斛的多种内生真菌具有促进组培植株生长的作用，如镰刀菌属Fusarium内生真菌可产生赤霉素促进铁皮石斛生物量和氮磷养分的积累等[6, 17-20]。此外，分离自铁皮石斛的内生细菌被发现可诱使铁皮石斛种子萌发，具备固氮、解磷等功能[10, 20-21]。挖掘铁皮石斛内生菌资源，深度解析菌群结构与宿主植株的内在关联，对于植株种质选育、栽培方式改进、产量及品质提升等都具有积极意义。本研究探讨了铁皮石斛2种人工栽培方式（温室土壤基质培养和露天立木培养）对铁皮石斛内生细菌菌群结构的影响，并对铁皮石斛根、茎、叶各部多糖质量分数与内生细菌种类分布之间的潜在联系进行了分析，以期为开发具有促进铁皮石斛适生和营养等功能的内生细菌资源提供研究基础。
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铁皮石斛（品系C9）植株取自浙江省杭州市天目山种植基地。该品系具有较强的抗霜冻能力，以防露天立木培养的植株在10 ℃下受到霜害。于6月花期，采集2种栽培方式下的3年生健康植株，分别为大棚内的盆栽植株（土培，相对湿度50%~75%，温度15~25 ℃）和栖于树干部（马尾松Pinus massoniana）近野生植株（树培，霜期130~156 d，年降水量1 390~1 870 mm）。选取生长状态较一致的植株，分别采集其根、茎、叶、花苞、果实等部分。所采集的铁皮石斛材料，及时用自来水冲洗进行表面处理，用于后续的总DNA提取和多糖测定。
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分别从土培和树培植株的根、茎、叶、花苞或果实部分（当年新生部分，表面无病斑，每份100 mg）共选取24份样品。将每份样品浸没于5 mL体积分数为70%的乙醇，振荡消毒30 s后，用无菌水振荡清洗3次，每次30 s左右。晾干后，液氮碾磨，随后用Takara细菌基因组提取试剂盒（MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver. 5.0）提取总DNA。操作步骤按试剂盒手册进行，为使内生菌破壁完全，其中裂解细胞阶段延长作用时间至2.0 h。另准备各部分样品表面消毒后置于R2A培养基上检验表面除菌效果，28 ℃培养2~3 d，无菌落生长则为消毒操作合格。
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细菌16S V3~V4可变区（450 bp）为测序目标片段，由杭州沃森生物科技有限公司利用Illumina Miseq平台进行高通量测序。用QⅡME 2.0软件去除低质量序列，剩余序列按照相似度97%以上进行分类操作单元（operational taxonomic unit, OTU）聚类，以丰度最大的序列为代表序列。利用Greengenes数据库（版本13.8）和美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information, NCBI）比对进行序列注释，并除去注释为植株叶绿体和线粒体细胞器16S OTUs信息。统计各样品OTU数量及每个OTU对应的有效序列数，计算相对丰度（占每个样品总序列数的比例），并进行多样性分析。
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将新鲜的土培和树培铁皮石斛根、茎、叶（每份样品鲜质量100.0 g）在80 ℃烘干2~3 d，粉碎后过筛（60目）收集。将每份样品的粉末分别称取3份（每份为0.3 g），放置于250 mL圆底烧瓶200 mL水中，100 ℃水浴加热2.5 h。将烧瓶内样品进行抽滤处理，滤出液体倒入250 mL容量瓶，待冷却至室温用水进行定容。取5.0 mL滤液与25.0 mL无水乙醇混合后进行4 ℃冷藏1.0 h。样品离心1.0 h（转速6 000 r·min-1），弃上清液后加20.0 mL体积分数为80%的乙醇，离心20 min（转速6 000 r·min-1），重复2次。弃上清液，加100 ℃热水溶解沉淀，转移至50 mL容量瓶中待冷却至室温后，进行定容。量取样品溶液0.5 mL，置于10.0 mL具塞试管中，加入蒸馏水0.5 mL以及体积分数为5 %苯酚溶液1.0 mL，摇匀，再加入浓硫酸5.0 mL摇匀，沸水中加热20 min后冰浴5 min。以蒸馏水为空白对照组，分别取200 μL处理液，测定波长488 nm处各组的光密度。配置不同质量分数多糖溶液，测量光密度，绘制标准曲线。重复3次，计算根、茎、叶各部分多糖质量分数。
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利用数据统计软件DPS对2种栽培方式下根、茎、叶、花、果各部分的OTUs、多样性指数和多糖质量分数进行方差分析。利用R软件制作韦恩图、热图等。同时，将筛选出来根、茎、叶各部的OTU相对丰度与相应各部多糖质量分数进行逐步回归分析，筛选出与多糖质量分数关联度最高的OTU信息。
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2种栽培方式下，铁皮石斛各组织部位菌群测序结果分析显示，OTU数量、Shannon-Wiener和Simpson多样性指数，多呈现差异显著（OTU：栽培方式F1, 16=18.405, P=0.000 6;组织部位F3, 16=12.638, P=0.000 2。Shannon-Wiener指数：栽培方式F1, 16=2.504, P=0.133 1;组织部位F3, 16=6.017, P=0.000 6。Simpson指数：栽培方式F1, 16=84.739, P=0.000 1;组织部位F3, 16=34.673, P=0.000 1），说明栽培方式对铁皮石斛内生细菌群落结构产生重要影响，且内生细菌在植株上的分布呈组织特异性。如表 1所示：树培的植株除根部外，其他叶和茎部分OTU数量少于土培环境中的植株；不同组织部分中，叶部、花部的OTU菌群分布数量较少，根、茎、果的部分数量较多。多样性指数方面也呈相似规律。
表 1 2种栽培方式下铁皮石斛内生细菌多样性
Table 1. Diversity of bacterial symbionts of Dendrobium catenatum under two cultivation methods
栽培
方式部位 分类操单元
(OTU)Shannon-Wiener
指数Simpson指数 树培 根 630.67 ± 226.48 a 1.52 ± 0.59 a 0.94 ± 0.09 a 果 447.33 ± 57.84 b 1.58 ± 0.21b 0.92 ± 0.03 b 茎 122.67 ± 26.76 c 0.37 ± 0.20d 0.07 ± 0.04 c 叶 28.33 ± 6.81 c 0.03 ± 0.01 d 0.00 ± 0.00 c 土培 根 112.67 ± 24.19 c 0.34 ± 0.05d 0.06 ± 0.01 c 花 86.67 ± 19.55 c 0.24 ± 0.08d 0.04 ± 0.01 c 茎 310.67 ± 107.58 c 1.62 ± 0.91 c 0.37 ± 0.24 b 叶 73.00 ± 84.92 c 0.27 ± 0.34 d 0.07 ± 0.10 c 说明:数值为3个样品的平均值+标准差;同列不同字母表示差异显著(LSD统计方法，P<0.05) -
由图 1可见：厚壁菌门Firmicutes（16.7%~34.9%）、拟杆菌门Bacteroidetes（8.7%~35.6%）、变形菌门Proteobacteria（15.9%~42.0%）、放线菌门Actinobacteria（2.6%~19.0%）在各组织部位相对丰度较高。厚壁菌门在土培的茎部占比最高（34.9%），与树培茎部（31.3%）相近。拟杆菌门在土培叶部最高（35.6%），为树培叶部（21.7%）的1.6倍。放线菌门在树培根部最高（19.0%），是土培根部（14.1%）的1.3倍。酸杆菌门Acidobacteria在树培果实部位占比最高，达10.9%，但在叶部和花苞部未检出。
图 1 2种栽培方式下铁皮石斛内生细菌门水平菌群结构
Figure 1. Community structure on phylum level of the bacterial symbionts of D. catenatum under two cultivation methods
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氮元素是植物生长所必需的大量元素，自然条件下常呈局部紧缺状态。红螺菌科Rhodospirillaceae中的固氮螺菌属Azospirillum，弗兰克菌科Frankiaceae中的弗兰克菌属Frankia，肠杆菌科Enterobacteriaceae中的肠杆菌属Enterobacter，假单胞菌科Pseudomonadaceae的假单胞菌属Pseudomonas和芽孢杆菌科Bacillaceae的芽孢杆菌属Bacillus中的部分种类有内生固氮功能。这些科属在铁皮石斛各组织中都有分布，除了红螺菌科和弗兰克菌科不存在于叶部。从2种栽培下铁皮石斛内生细菌功能上看，树培状态下具有这些固氮潜能的OTUs占比明显高于温室土培植株（图 2）。
图 2 2种栽培方式下铁皮石斛具固氮潜能的内生细菌
Figure 2. Nitrogen-fixing bacterial symbionts on family level of D. catenatum under two cultivation methods
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从图 3可见：栽培环境对组织内生细菌优势属（相对丰度大于1.0%）影响较大。栖水菌属Enhydrobacter在树培果中占优势，比例高达35.2%；甲醇杆菌属Methylobacterium在土培叶中为优势菌属，比例达35.8%；薄层菌属Hymenobacter仅在土培叶中分布，占9.9%。拟杆菌属Bacteroides、双歧杆菌属Bifidobacterium、韦荣球菌属Veillonella在各组织部位中多有分布，在树培根部、果实和土培叶部相对丰度较低；颤螺旋菌属Oscillospira在树培茎部分布较少；巨单胞菌属Megamonas在树培茎部相对较多，栖热菌属Thermus则在土培花苞内最多；不动杆菌属Acinetobacter则存在于树培和土培的茎部。
图 3 2种栽培方式下铁皮石斛内生细菌属水平热图
Figure 3. Heatmap on genus level of the bacterial symbionts of D. catenatum under two cultivation methods
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如图 4所示：铁皮石斛茎中多糖质量分数显著高于叶部和根部。方差分析结果显示：2种栽培方式下铁皮石斛不同部位多糖质量分数呈极显著差异（根：F1, 4=11.15, P=0.029；茎：F1, 4=9.44, P=0.037；叶：F1, 4=39.31, P=0.003），说明栽培方式影响多糖在植株内的积累。通过韦恩图发现：不同栽培方式对根、茎、叶菌群结构有明显影响，其中根部和叶部影响大，共有的OTUs占24%~26%，而茎部共有部分占49%，这些OTUs的分布差异可能与多糖质量分数间存在一定关联。将2种栽培方式下根、茎和叶优势内生细菌属相对丰度（x自变量，x1~x53分别表示不同属）和各部多糖质量分数（y因变量）进行相关性分析，得逐步回归方程y=0.058+29.688x17-4.146x13-0.424x52-0.085x2（相关系数R2=0.999 8，P < 0.05）。方程中通过逐步回归筛选出的4个属的相对丰度与多糖质量分数最为密切（系数绝对值越大代表其相关性越高），其中：不动杆菌属（x17）影响最大，其次为假单胞菌属（x13）、薄层菌属（x52）和韦荣球菌属（x2）。
图 4 2种栽培环境中铁皮石斛组织多糖质量分数
Figure 4. Polysaccharide contents of D. catenatum under two cultivation methods
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在门水平上，不同栽培环境下铁皮石斛的优势内生细菌门类多集中在厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门和放线菌门，且在不同栽培环境和不同组织中占比有所不同，显示内生细菌分布受外界环境和宿主植物组织特异性的影响较大。其中，果实部位与其他部位差异较明显，变形菌门和酸杆菌门的种类占优势，这很可能跟开花和果实发育过程中植株表面环境菌群进入果实内部有关，或与不同组织营养成分种类和含量不同相关。铁皮石斛内生细菌在属水平上显示，拟杆菌属、双歧杆菌属和韦荣球菌属相对丰度占优势，这些属中通常包含了常见的植物源乳酸菌，广泛存在于各类植物中。其中，不同栽培方式下的韦荣球菌属、栖热菌属、颤球菌属和甲醇杆菌属差异较大，这很可能与露天树培环境复杂，风吹、雨溅、虫噬等使得环境中部分菌属进入植株内部。氮元素往往是野外自然条件下植株的生长限制因子，从高通量测序结果看，铁皮石斛具有多种固氮潜能的菌种包括根瘤菌Rhizobiales和弗兰克菌等[20, 22-23]。尤其在树培环境中固氮菌占比显著高于温室土培植株，这很可能与环境中氮养分含量多寡有关，树培环境中固氮菌具有促进铁皮石斛植株生长的可能。
植物内生细菌对宿主植物积累光合产物等糖类物质的有益作用在不同植物上多有报道。例如，甘蔗Saccharum officinarum茎干部的内生细菌具有促植株生长及糖类产物积累的作用[24]，内生荧光假单胞菌利于草本药用植物苍术Atractylodes lancea植株内光合产物和多糖的提高[25]。有些内生细菌本身可在植物体内合成大量多糖，如分离自禾本科Gramineae芒草Miscanthus sinensis茎秆部的内生菌Mucilaginibacter endophyticus可产生多种外分泌多糖[26]。本研究的2种栽培环境中，铁皮石斛根、茎、叶各部OTU重叠部分仅为24.2%~49.0%，显示出内生菌群的组织分布差异性。从逐步回归分析结果看：仅4个属的内生细菌与多糖质量分数呈相关性。尽管不同栽培方式下铁皮石斛多糖质量分数有所差别，但与多糖质量分数关联最高的不动杆菌属在2种栽培方式下茎部相对丰度都达1.0%，明显高于根部和叶部。从序列比对结果看：该OTU与约氏不动杆菌Acinetobacter johnsonii一致，后者是一种革兰氏阴性反硝化聚磷耐冷菌，其是否与铁皮石斛C9品系耐冷特性及多糖合成相关有待进一步验证[27]。与多糖质量分数相关联仅次于不动杆菌属的是假单胞菌属，但与多糖质量分数呈负相关。该属细菌往往具有固氮、高分子多聚物降解等多种生理功能，铁皮石斛内发现的这株假单胞菌很可能参与糖类分解代谢，不利于多糖积累。这与苍术中发现的促生假单胞菌的作用不同，说明同属菌种在不同宿主植物中作用的多样性。
综上所述，不同栽培条件对铁皮石斛内生细菌菌群结构有显著影响，功能上固氮和耐冷等与宿主营养和抗逆相关的属种变化明显，说明内生细菌群对铁皮石斛适应环境很可能发挥重要作用。同时，发现相对丰度与多糖质量分数相关的4个OTUs，为进一步分析铁皮石斛内生细菌功能与多糖积累之间的关联提供启示。
Effects of two cultivation environments on diversity of bacterial symbionts in Dendrobium catenatum
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摘要:
目的 揭示不同栽培环境对铁皮石斛Dendrobium catenatum内生细菌群落结构的影响，解析与石斛多糖含量存在潜在关联的功能菌种。 方法 针对温室人工基质培养和仿野生立木附生培养2种栽培体系下的铁皮石斛C9品系根、茎、叶等各部组织内生细菌，采用Illumina测序平台的Miseq进行高通量测序分析其菌落结构和多样性，同时利用逐步回归法分析内生细菌分布与组织多糖质量分数的关联性。 结果 铁皮石斛在2种栽培环境不同组织中的菌群结构差异显著（P < 0.05），附生立木仿野生环境比温室环境下物种丰富度更高。同时，根部所含分类操作单元（OTUs）数量最多（112~630个），叶部则最少（28~73个）。其中，厚壁菌门Firmicutes（16.7%~34.9%）、拟杆菌门Bacteroidetes（8.7%~35.6%）和变形菌门Proteobacteria（15.9%~42.0%）的OTUs占优势。从菌种生理功能上看，固氮相关的菌种如弗兰克菌科Frankiaceae在树培环境下相对丰度更高，推测可能受树培寡氮环境的影响使固氮菌富集。逐步回归分析结果显示：不动杆菌Acinetobacter在根、茎、叶不同组织中的相对丰度与多糖质量分数变化关联度最大，其次为假单胞菌Pseudomonas。 结论 铁皮石斛内生细菌资源相当丰富，而栽培方式影响菌群分布，且与石斛多糖质量分数具有关联性。 Abstract:Objective Aimed to discover the effect of different cultivation measures on endophytic bacterial communities and polysaccharides accumulation in Dendrobium catenatum, this research is conducted to compare D. catenatum in two environments of soil cultivation in green house and truck-attaching cultivation in open field. Method With the Miseq high-throughput sequencing on Illumina platform conducted, efforts are made to discover the community structures, diversity, and potential functions of bacterial symbionts in different tissues such as roots, stems and leaves of D. catenatum. Besides, the correlation of polysaccharide content with bacterial community was also analyzed employing the stepwise method. Result (1) There is significant difference (P < 0.05) in bacterial communities in different tissues with different cultivation environments; (2) The bacterial richness was higher in truck-attaching cultivation than that in greenhouse, and the operational taxonomic units (OTUs) in root tissues are the largest in number (112-630 OTUs) while those in leaf tissues (28-73 OTUs) are the smallest in number. Comparatively, the OTUs in phyla of Firmicutes (16.7%-34.9%), Bacteriodetes (8.7%-35.6%) and Proteobacteria (15.9%-42.0%) dominate in tissues; (3) Physiologically, OTUs of nitrogen-fixation related bacteria such as Frankiaceae are larger in number in truck-attaching cultivation environment, reflective of the influence of nitrogen-lacking environment. The stepwise procedure results have shown that the relative abundance of Acinetobacter has the highest correlation with the polysaccharide contents in different tissues of root, stem and leaf, followed by Pseudomonas. Conclusion D. catenatum are rich in endophytic bacteria, cultivation measures exert effect on the bacterial community and some bacteria are correlated with the polysaccharides contents. These results shall shed light on further exploration of endophytic bacterial resources in D. catenatum. -
板栗Castanea mollissima是著名的木本粮食和干果树种[1]，果实风味独特，营养物质丰富[2−3]，不与粮食作物争耕地，有“千果之王”和“铁杆庄稼”之誉[4]。板栗适应性强，是中国重要的经济林树种[5]，中国板栗栽培总面积与产量稳居世界第一[6]。板栗花为风媒花，雌雄花同株[7]，自花授粉结实率低，空苞率高[8−9]，不同品种间授粉的亲和力也存在较大差异[10−11]。分别以河北迁西[12−13]、河北燕山[14]、广西隆安[15]、云南峨山和永仁[16]的板栗品种为试材，根据花期相遇情况，开展品种授粉配置试验，测定各组合的结实率和果实综合性状，筛选出了一批优良的授粉组合。湖北罗田县作为中国板栗的源生地，也是中国南方板栗主产区的中心[17−18]，尚没有明确的品种授粉配置，单一品种种植和品种随意混植，严重影响了罗田县板栗良种的经济效益。因此，本研究以湖北省罗田县栽培的6个板栗品种为研究对象，根据品种间和品种内的花期相遇情况，选配授粉组合，开展授粉试验，对不同授粉组合的授粉结实性和果实性状进行测定分析，筛选高产优质的授粉组合，创新板栗良种的授粉配置栽培，以期为板栗良种的优质丰产栽培提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 研究区概况
本研究在罗田县国家板栗良种基地进行。该基地位于湖北省罗田县骆驼坳镇赵家湾村，海拔150 m，年均气温为16.4 ℃，无霜期为240 d，日照时数为2 047 h，年降水量为1 230~1 600 mm。板栗林的株行距为5 m×5 m，树高4~7 m，树体健壮，长势良好，处于盛产期，进行常规管理。
1.2 材料
共6个品种。其中，‘浅刺大板栗’‘Qiancidabanli’引自湖北省京山市，‘桂花香’‘Guihuaxiang’、‘八月红’‘Bayuehong’、‘六月暴’‘Liuyuebao’、‘乌壳栗’‘Wukeli’和‘玫瑰红’‘Meiguihong’为罗田县本地品种。分别用浅、桂、八、六、乌、玫代表这6个品种。
1.3 方法
1.3.1 授粉组合设计
授粉组合见表1。根据品种间的雌、雄花花期相遇情况设计授粉组合，开展授粉试验，即选择授粉品种的雄花盛花期与被授粉品种的雌花盛花期相遇天数≥3 d的授粉组合，并设置品种内自交作为对照。授粉试验于2022年5月中下旬进行，采取人工授粉方式，进行品种内自交和品种间异交授粉。每个组合授粉150朵花，3次重复，每重复50朵。其中，品种间异交16个组合2 400朵花；品种内自交6个组合900朵花。共22个组合3 300朵花。
表 1 授粉组合设计Table 1 Design of pollination combination母本
(♀)父本(♂) 桂 八 六 乌 玫 浅 桂 √ √ √ − − − 八 √ √ √ − − − 六 √ √ √ − − − 乌 √ √ √ √ √ √ 玫 − − − √ √ √ 浅 √ − − √ √ √ 说明：√表示雌雄花盛花期相遇天数≥3 d，进行授粉实验；−表示雌雄花盛花期相遇天数＜3 d，不进行授粉试验。 1.3.2 授粉方法
在雌花柱头分叉前，将雌花附近的雄花序去除干净，用硫酸纸袋套住雌花，金属丝扎紧套袋口，防止外来花粉干扰；收集新鲜花粉，在雌花柱头分叉为30°~45°时，去掉套袋，将充分干燥的花粉涂在雌花的柱头上，轻轻涂抹3~4次，之后立即套袋。待所有板栗品种的雄花落尽后，解除套袋。
1.3.3 授粉结实性调查统计
2022年9月上中旬，板栗果实成熟时，采集所有刺苞，统计不同授粉组合的结实率、空苞率和成果率。计算公式如下：结实率=座苞数/授粉雌花数×100%；空苞率=无坚果刺苞数/座苞数×100%；成果率=有坚果刺苞数/授粉雌花数×100%。
1.3.4 果实性状测定
①刺苞性状：每个授粉组合随机取30个实蓬的刺苞，用游标卡尺测定刺苞的横径、纵径和高度。用电子天平称量刺苞质量和每个刺苞内的坚果总质量，记录每个刺苞中的坚果个数。按以下公式计算出籽率：出籽率=每个刺苞内的坚果总质量/刺苞质量×100%。②坚果性状：每个授粉组合随机取30个坚果，用电子天平测定坚果质量和种仁质量。依据以下公式计算出仁率：出仁率=种仁质量/坚果质量×100%。③种仁营养物质：采用GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》第一法测定蛋白质；采用GB 5009.6—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》第一法测定脂肪；采用蒽酮比色法测定可溶性糖和淀粉。各组合每个指标3个重复。
1.3.5 数据统计分析
应用 Excel 和 SPSS 进行数据统计分析。其中，百分数进行方差分析时，先进行反正弦转换；多重比较分析采用 Duncan 检验。
2. 结果与分析
2.1 授粉结实性分析
2.1.1 结实率分析
由图1可见：自交结实率较低，异交显著提高了结实率。以‘桂花香’为母本的3个组合结实率为60.40%~70.16%，其中，‘八月红’为父本授粉最高，自交最低，两者差异显著(P＜0.05)；以‘八月红’为母本的3个组合结实率为70.67%~78.02%，其中，‘六月暴’为父本授粉最高，自交最低，两者差异显著(P＜0.05)；以‘六月暴’为母本的3个组合的结实率为55.78%~70.62%，其中，‘八月红’为父本授粉最高，自交最低，两者差异显著(P＜0.05)；‘乌壳栗’为母本的6个组合的结实率为61.33%~82.26%，其中‘玫瑰红’授粉最高，‘八月红’授粉最低；‘玫瑰红’为母本的3个组合的结实率为60.70%~71.48%，‘浅刺大板栗’授粉最高，自交最低，两者差异显著(P＜0.05)，相差10.78%；‘浅刺大板栗’为母本的4个组合的结实率在58.03%~77.63%，‘桂花香’授粉最高，‘玫瑰红’授粉最低，两者差异显著(P＜0.05)，相差19.60%。
2.1.2 空苞率分析
由图2可见：自交空苞率较高，除‘乌壳栗’外，各品种的自交空苞率均高于异交。‘桂花香’为母本的3个组合空苞率为24.33%~39.72%，‘八月红’授粉最低，自交最高；‘八月红’为母本的3个组合空苞率为18.71%~32.09%，‘六月暴’授粉显著降低了空苞率；‘六月暴’为母本的3个组合空苞率为33.11%~45.72%，异交显著降低了空苞率(P＜0.05)；‘乌壳栗’为母本的6个授粉组合空苞率为10.30%~36.71%，‘六月暴’授粉显著降低了空苞率(P＜0.05)；‘玫瑰红’为母本的3个授粉组合空苞率为17.73%~37.25%，异交显著降低了空苞率(P＜0.05)；‘浅刺大板栗’为母本的4个授粉组合空苞率为10.38%~18.00%，‘桂花香’授粉显著降低了空苞率(P＜0.05)。
2.1.3 成果率分析
自交成果率较低，除‘乌壳栗’外，各品种的自交成果率均低于50.00%。异交显著提高了成果率(P＜0.05)。各组合的成果率详见图3。‘桂花香’为母本的3个组合成果率为36.21%~53.09%，‘八月红’授粉显著提高了成果率(P＜0.05)；‘八月红’为母本的3个组合成果率为48.14%~63.48%，‘六月暴’授粉显著提高了成果率(P＜0.05)；‘六月暴’为母本的3个授粉组合成果率为30.42%~47.28%，异交显著提高了成果率(P＜0.05)；‘乌壳栗’为母本的6个授粉组合成果率为51.34%~70.76%，‘六月暴’授粉显著提高了成果率(P＜0.05)；‘玫瑰红’为母本的3个授粉组合成果率为38.11%~58.89%，‘浅刺大板栗’授粉的成果率最高，自交最低，两者差异显著(P＜0.05)，相差20.78%；‘浅刺大板栗’为母本的4个授粉组合成果率为48.54%~69.56%，‘桂花香’授粉显著提高了成果率(P＜0.05)。
2.2 果实性状分析
2.2.1 刺苞性状分析
由表2可知：授粉品种对同母本的刺苞质量、刺苞横径、刺苞纵径、刺苞高、每刺苞坚果数、出籽率等性状具有显著影响(P＜0.05)。‘桂花香’为母本时，异交显著提高了刺苞横径、每刺苞坚果数和出籽率(P＜0.05)，‘六月暴’授粉显著提高了刺苞质量(P＜0.05)；‘八月红’为母本时，‘桂花香’授粉的每刺苞坚果数显著大于自交，刺苞质量显著小于自交(P＜0.05)；‘六月暴’为母本时，自交的刺苞质量和每刺苞坚果数显著大于异交(P＜0.05)，‘八月红’授粉显著降低了出籽率(P＜0.05)；‘乌壳栗’为母本时，‘桂花香’授粉的每刺苞坚果数显著大于自交(P＜0.05)，‘六月暴’和‘玫瑰红’授粉的出籽率显著低于自交(P＜0.05)；‘玫瑰红’为母本时，异交显著提高了每刺苞坚果数和刺苞横径(P＜0.05)，‘乌壳栗’授粉的刺苞质量显著大于自交(P＜0.05)；‘浅刺大板栗’为母本时，‘玫瑰红’授粉的刺苞质量显著大于自交(P＜0.05)。
表 2 不同授粉组合的主要刺苞性状Table 2 Main bracts characters of different pollination combinations母本(♀) 父本(♂) 质量/g 横径/mm 纵径/mm 高/mm 每刺苞坚果数 出籽率/% 桂 桂 44.03±1.79 b 68.71±1.24 c 61.23±0.95 b 57.64±0.70 a 1.17±0.07 c 31.84±0.40 c 八 47.67±1.40 b 75.68±0.72 b 63.65±1.22 b 54.26±0.65 b 2.37±0.03 a 43.44±0.46 a 六 59.72±0.98 a 79.34±0.58 a 67.89±0.76 a 59.54±0.32 a 1.93±0.03 b 36.48±1.80 b 八 桂 56.65±0.78 b 81.62±0.45 a 71.39±0.62 a 65.47±0.97 a 2.26±0.20 a 39.27±1.51 a 八 66.59±0.91 a 84.00±0.93 a 73.35±0.41 a 64.44±0.27 a 1.65±0.04 b 41.35±0.18 a 六 58.28±2.12 ab 81.78±1.03 a 71.05±1.40 a 65.90±1.37 a 2.18±0.16 ab 38.17±1.65 a 六 桂 73.32±2.60 b 92.63±1.35 ab 77.13±1.61 a 69.47±1.16 a 1.66±0.04 b 33.74±0.77 a 八 62.74±1.28 c 88.75±1.09 b 74.06±1.00 a 63.83±1.07 b 1.46±0.05 c 28.55±1.07 b 六 80.21±0.75 a 93.70±1.08 a 77.70±1.24 a 66.98±0.66 ab 1.91±0.04 a 35.73±1.51 a 乌 桂 70.66±0.93 a 85.53±0.47 a 70.84±0.36 a 62.32±0.67 a 2.82±0.04 a 37.61±0.69 abc 八 58.61±2.45 bc 78.13±1.13 c 68.25±1.43 a 60.23±0.73 ab 2.59±0.14 ab 41.70±0.77 a 六 61.00±4.99 abc 69.81±1.67 b 57.46±1.76 b 57.26±1.46 abc 2.16±0.04 c 33.72±0.17 c 乌 62.82±2.98 abc 81.4±2.39 ab 70.31±1.89 a 60.79±1.24 ab 2.33±0.13 bc 39.39±1.96 ab 玫 66.19±2.00 ab 70.59±1.46 c 58.16±2.52 b 55.34±1.82 bc 2.31±0.12 bc 34.85±1.70 c 浅 52.74±3.17 c 65.19±2.12 c 57.94±2.43 b 53.32±2.65 c 2.38±0.08 bc 36.46±1.39 bc 玫 乌 65.42±1.55 a 82.72±1.04 a 70.89±1.85 a 60.92±0.17 a 2.61±0.09 a 43.83±0.75 a 玫 56.21±1.77 b 79.12±0.20 b 66.37±0.73 a 60.15±0.77 a 2.27±0.12 b 44.85±0.36 a 浅 62.15±2.54 ab 83.99±0.97 a 70.79±0.92 a 61.49±0.53 a 2.60±0.10 a 44.51±0.33 a 浅 桂 54.56±2.29 ab 75.14±2.17 a 65.00±1.03 a 64.23±1.11 a 1.67±0.10 a 43.62±1.27 a 乌 59.96±2.86 ab 78.38±0.76 a 65.08±0.68 a 64.82±1.45 a 1.95±0.28 a 48.86±2.45 a 玫 62.29±2.77 a 76.85±0.32 a 63.81±1.04 a 62.16±0.75 a 2.06±0.06 a 51.10±3.19 a 浅 51.94±1.69 b 76.58±0.70 a 63.86±0.23 a 62.93±0.25 a 2.05±0.15 a 50.62±2.12 a 说明：数值为均值±标准误。不同小写字母表示不同组合间差异显著(P＜0.05)。 2.2.2 坚果性状分析
由表3可知：授粉品种对同母本的坚果质量、仁质量、出仁率具有显著影响(P＜0.05)。‘桂花香’为母本时，‘八月红’授粉的仁质量显著小于自交(P＜0.05)，相差2.54 g；‘八月红’为母本时，‘桂花香’授粉显著减小了坚果质量和仁质量(P＜0.05)；‘六月暴’为母本时，‘八月红’授粉显著减小了坚果质量(P＜0.05)；‘乌壳栗’为母本时，‘六月暴’和‘玫瑰红’授粉的坚果质量显著大于‘浅刺大板栗’授粉，‘六月暴’授粉的仁质量显著大于‘浅刺大板栗’授粉(P＜0.05)，‘桂花香’和‘八月红’授粉的出仁率显著大于‘玫瑰红’授粉(P＜0.05)；‘玫瑰红’为母本时，‘乌壳栗’授粉的坚果质量显著大于‘浅刺大板栗’授粉，‘浅刺大板栗’授粉显著降低了仁质量和出仁率(P＜0.05)；‘浅刺大板栗’为母本时，‘乌壳栗’和‘玫瑰红’授粉的坚果质量显著大于自交，异交显著提高了仁质量(P＜0.05)。
表 3 不同授粉组合的主要坚果性状和种仁营养物质质量分数Table 3 Main nuts characters and nutrient contents in kernel of different pollination combinations母本(♀) 父本(♂) 坚果质量/g 仁质量/g 出仁率/％ 蛋白质质量
分数/%可溶性糖质量
分数/%淀粉质量
分数/%脂肪质量
分数/%桂 桂 11.71±0.19 a 9.82±0.22 a 83.67±0.67 a 6.52±0.02 ab 10.84±0.48 a 65.50±1.24 ab 2.18±0.07 a 八 9.58±0.88 a 7.28±0.16 b 81.00±1.16 a 6.60±0.18 a 12.53±0.49 a 64.32±0.45 b 2.33±0.07 a 六 9.87±0.67 a 8.91±0.42 a 81.69±0.15 a 6.12±0.12 b 10.69±0.68 a 69.57±1.52 a 2.17±0.15 a 八 桂 10.34±0.52 b 8.61±0.31 b 83.38±1.34 a 6.65±0.11 a 10.44±0.50 a 58.91±0.54 b 1.87±0.19 a 八 13.10±1.44 a 11.03±0.74 a 84.13±0.60 a 5.60±0.04 b 10.39±0.15 a 60.38±2.43 ab 2.23±0.20 a 六 12.65±0.71 a 10.80±021 a 85.41±1.38 a 6.56±0.08 a 10.24±0.21 a 67.24±2.17 a 2.17±0.13 a 六 桂 15.22±0.49 a 12.67±1.43 a 82.94±5.24 a 7.56±0.19 a 11.70±0.41 a 51.81±1.47 b 2.47±0.09 a 八 11.79±0.66 b 9.46±0.59 a 80.59±2.76 a 7.22±0.29 a 12.11±0.45 a 54.41±0.81 b 2.60±0.15 a 六 14.67±0.62 a 11.77±0.05 a 80.56±3.62 a 7.54±0.23 a 11.68±0.41 a 58.65±0.34 a 2.73±0.03 a 乌 桂 9.93±0.69 ab 7.87±0.62 ab 79.08±0.79 a 7.24±0.11 b 11.99±0.15 a 62.11±1.94 a 1.53±0.27 ab 八 10.77±0.31 ab 8.58±0.27 ab 79.63±0.16 a 7.34±0.04 b 12.33±0.72 a 62.23±3.75 a 1.60±0.31 ab 六 11.85±0.90 a 9.33±0.80 a 78.64±0.80 ab 6.49±0.17 c 8.67±0.14 b 55.36±0.24 a 1.43±0.03 ab 乌 10.39±0.19 ab 8.12±0.25 ab 78.13±1.00 ab 7.94±0.13 a 12.22±0.79 a 60.44±1.99 a 1.30±0.31 ab 玫 10.82±0.65 a 8.06±0.78 ab 74.20±2.21 b 6.08±0.03 d 7.87±0.13 b 56.61±0.51 a 1.27±0.03 b 浅 8.75±0.30 b 6.82±0.14 b 78.23±1.43 ab 6.81±0.19 d 8.38±0.13 b 59.63±1.06 a 2.07±0.03 a 玫 乌 10.80±0.07 a 8.59±0.03 a 79.57±0.28 a 8.13±0.11 c 9.85±0.38 a 64.55±2.13 a 1.33±0.17 a 玫 10.12±0.31 ab 8.11±0.29 a 80.17±0.69 a 8.84±0.17 b 10.63±0.62 a 61.36±1.11 ab 1.40±0.30 a 浅 9.57±0.18 b 7.36±0.18 b 76.81±0.46 b 10.43±0.09 a 10.78±0.39 a 58.20±1.21 b 1.03±0.28 a 浅 桂 12.40±0.50 ab 10.57±0.36 a 85.33±0.82 a 7.42±0.07 b 10.38±0.50 a 55.39±0.74 a 1.93±0.03 a 乌 12.88±0.29 a 10.25±0.51 a 79.47±2.86 a 7.85±0.05 a 10.25±0.16 a 55.01±1.62 a 2.07±0.03 a 玫 13.88±0.42 a 11.33±0.37 a 81.35±1.77 a 6.52±0.04 c 10.53±0.13 a 56.03±0.80 a 1.67±0.09 b 浅 10.59±0.77 b 8.70±0.22 b 82.84±2.13 a 7.56±0.09 b 10.24±0.29 a 52.25±1.26 a 1.94±0.06 a 说明：数值为均值±标准误。不同小写字母表示不同组合间差异显著(P＜0.05)。 2.2.3 种仁营养物质分析
由表3可知：总体授粉品种对同母本组合的种仁淀粉和蛋白质质量分数的影响显著，对可溶性糖及脂肪质量分数的影响较小。‘桂花香’为母本时，‘八月红’授粉的蛋白质质量分数(6.60%)显著高于‘六月暴’授粉(6.12%)(P＜0.05)，淀粉质量分数(64.32%)显著低于‘六月暴’授粉(69.57%)(P＜0.05)；‘八月红’为母本时，异交显著提高了蛋白质质量分数(P＜0.05)，同时，‘六月暴’授粉的淀粉质量分数(67.24%)显著高于‘桂花香’授粉(58.91%)(P＜0.05)；‘六月暴’为母本时，自交的淀粉质量分数(58.65%)显著高于异交(51.81%、54.41%)(P＜0.05)；‘乌壳栗’为母本时，自交的蛋白质质量分数(7.94%)显著高于异交(P＜0.05)，淀粉质量分数差异不显著；‘玫瑰红’为母本时，‘浅刺大板栗’授粉显著提高了蛋白质质量分数(P＜0.05)，‘乌壳栗’授粉的淀粉质量分数(64.55%)显著高于‘浅刺大板栗’授粉(58.20%)；‘浅刺大板栗’为母本时，‘八月红’授粉显著提升了蛋白质质量分数(P＜0.05)，‘六月暴’授粉显著降低了脂肪质量分数，但各组合的淀粉质量分数差异不显著。
2.3 果实性状主成分分析
由表4可知：按照特征根＞1的原则，共提取到4个主成分，它们的累计贡献率为83.441%。其中，主成分1特征值为5.092，贡献率为39.167%，刺苞高、仁质量、坚果质量、刺苞横径和刺苞纵径的载荷较高；主成分2特征值为2.705，贡献率为20.809%，种仁蛋白质质量分数、单刺苞坚果数、刺苞横径和刺苞质量的载荷较高；主成分3特征值为1.658，贡献率为12.751%，种仁淀粉和可溶性糖质量分数的载荷较高；主成分4特征值为1.389，贡献率为10.688%，出籽率和出仁率的载荷较高。
表 4 果实性状的载荷矩阵Table 4 Component matrix of fruit characters性状 第1主成分 第2主成分 第3主成分 第4主成分 性状 第1主成分 第2主成分 第3主成分 第4主成分 刺苞质量 0.560 0.508 −0.308 −0.485 出仁率 0.532 −0.497 0.331 0.487 刺苞横径 0.797 0.547 0.166 −0.105 蛋白质质量分数 −0.052 0.768 −0.072 0.310 刺苞纵径 0.792 0.477 0.310 −0.069 可溶性糖质量分数 0.459 0.337 0.606 0.142 刺苞高度 0.889 0.219 −0.098 0.224 淀粉质量分数 −0.250 −0.070 0.774 −0.117 单刺苞坚果数 −0.534 0.683 0.052 −0.016 脂肪质量分数 0.637 −0.501 0.276 −0.105 出籽率 −0.161 0.258 −0.204 0.839 特征值 5.092 2.705 1.658 1.389 坚果质量 0.836 −0.211 −0.391 0.009 贡献率/% 39.167 20.809 12.751 10.688 仁质量 0.867 −0.298 −0.274 0.070 累计贡献率/% 39.167 59.975 72.726 83.414 根据主成分1~4的得分(F1~F4)和各主成分权重，计算总得分(F)，得出各授粉组合板栗果实的综合性状排名(表5)。由表5可知：同母本的授粉组合中，排名前 2 的组合(♀×♂)分别为：‘桂花香’ב六月暴’、‘桂花香’ב八月红’；‘八月红’ב八月红’、‘八月红’ב六月暴’； ‘六月暴’ב桂花香’、‘六月暴’ב六月暴’； ‘乌壳栗’ב桂花香’、‘乌壳栗’ב乌壳栗’；‘玫瑰红’ב浅刺大板栗’、‘玫瑰红’ב乌壳栗’；‘浅刺大板栗’ב乌壳栗’、‘浅刺大板栗’ב桂花香’。
表 5 综合主成分值Table 5 Comprehensive principal component values授粉组合(♀×♂) F1 F2 F3 F4 F 排名 六×桂 5.16 0.30 −1.04 −0.58 2.27 1 六×六 4.54 0.99 −0.18 −1.36 2.18 2 六×八 2.44 −0.20 0.60 −1.54 0.99 3 八×八 2.52 −1.32 0.06 −0.08 0.85 4 八×六 1.61 −1.03 1.22 0.36 0.73 5 乌×桂 −0.38 2.38 1.02 −1.01 0.44 6 八×桂 0.32 −0.01 0.66 0.45 0.31 7 玫×浅 −1.61 3.85 −0.39 0.76 0.25 8 浅×乌 0.64 0.04 −1.60 1.29 0.24 9 乌×乌 −0.73 1.92 0.62 −0.29 0.19 10 浅×桂 0.91 −1.62 −0.71 1.70 0.14 11 玫×乌 −0.88 1.92 0.14 0.05 0.09 12 浅×玫 0.67 −0.63 −1.75 1.44 0.08 13 乌×八 −0.88 1.11 1.03 0.20 0.04 14 玫×玫 −1.47 1.30 0.23 1.06 −0.19 15 浅×浅 −0.58 −0.39 −0.90 2.32 −0.20 16 桂×六 −0.42 −1.08 2.03 −0.92 −0.28 17 桂×八 −2.08 −0.69 2.36 0.63 −0.71 18 桂×桂 −0.60 −3.66 1.37 0.06 -0.98 19 乌×六 −1.97 −1.31 −2.05 −1.23 −1.72 20 乌×玫 −3.16 −0.45 −2.39 −2.35 −2.26 21 乌×浅 −4.02 −1.42 −0.32 −0.97 −2.42 22 3. 讨论
父本雄花盛花期与母本雌花盛花期相遇时间较长，能保证充分授粉和受精，是开展授粉配置研究的前提[18−19]。板栗树体高大，同一株树上，树冠上部的雌、雄花进入盛花期较早，树冠下部和内堂的雌、雄花进入盛花期较晚。在实际生产中，为了提高产量，应尽量使整株树的雌花都能够充分授粉，这就要求所选品种的花期相遇天数越多越好。本研究选择的22个授粉组合中，雌、雄花盛花期相遇天数均不少于3 d。
不同授粉组合对板栗的成果率及单个刺苞内的坚果数均有较大影响，表明授粉亲和性对板栗产量的影响较大，这与刘宁伟等[20]对板栗和张旭辉等[21]对锥栗C. henryi的研究结果一致。郭素娟等[22]认为：大部分板栗品种自花授粉亲和性差。在本研究中，多数自交组合不仅空苞率高，且成果率和每个刺苞中的坚果个数均显著低于异交组合。但也有自交授粉成果率较高，自交亲和性较好的品种，如‘乌壳栗’和‘浅刺大板栗’，其中，‘乌壳栗’自交所结果实的品质优良。可见，板栗自交授粉的亲和性也因品种而异。在油茶Camellia oleifera [23]、梨Pyrus[24]、文冠果Xanthoceras sorbifolium [25]、中国李Prunus salicina[26]品种的授粉研究中也发现了类似现象。
在本研究中，异花授粉显著提高了成果率和单刺苞内的坚果个数，可能原有的营养水平难以满足果实生长发育需要，导致‘六月暴’和‘八月红’异交组合的刺苞质量和体积显著小于自交组合。因此，在合理选配板栗品种授粉组合的同时，还需提高水肥供应，做好田间管理，促进板栗果实的生长和发育，提高板栗产量及果实的品质。
本研究发现这6个品种各有优劣。‘六月暴’各授粉组合的刺苞质量较大，为72.32~82.21 g，种仁蛋白质、糖类和脂肪丰富，果实品质综合排名靠前。从果实成熟时间来看，‘六月暴’为早熟品种，在8月下旬成熟，而罗田县大多数板栗品种成熟时间为9月上中旬，因此‘六月暴’可较早进入市场。但‘六月暴’成果率低，仅为30.42%~47.28%，表现出不丰产的特性。‘桂花香’风味独特，但其刺苞和坚果均较小，果实品质综合评分较低。
4. 结论
不同授粉处理对板栗的结实率、空苞率、成果率、刺苞性状、坚果性状和种仁营养物质质量分数均有不同程度的影响。综合成果率和果实品质，结合主成分分析，筛选出6个品种的成果率高、果实品质优良的授粉组合(♀×♂)各1~2个，分别为‘桂花香’ב八月红’、‘八月红’ב六月暴’、‘六月暴’ב桂花香’、‘六月暴’ב八月红’、‘乌壳栗’ב六月暴’、‘玫瑰红’ב浅刺大板栗’、‘浅刺大板栗’ב桂花香’、‘浅刺大板栗’ב乌壳栗’。在实际生产中，‘八月红’和‘六月暴’互相授粉表现均优秀，可以等比例栽植。其余组合正向授粉表现优秀，反向授粉表现一般，应以母本为主，少量栽植授粉树。由此可见，合理的品种授粉配置可以有效降低罗田板栗品种的果实空苞率，提高果实产量与品质，实现高产优质栽培。罗田县板栗品种资源丰富，本研究只研究了其中的6个品种，后续可以对其余品种进行相关研究，掌握开花物候期和适宜的授粉品种。
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图 1 2种栽培方式下铁皮石斛内生细菌门水平菌群结构
Figure 1 Community structure on phylum level of the bacterial symbionts of D. catenatum under two cultivation methods
图 2 2种栽培方式下铁皮石斛具固氮潜能的内生细菌
Figure 2 Nitrogen-fixing bacterial symbionts on family level of D. catenatum under two cultivation methods
图 3 2种栽培方式下铁皮石斛内生细菌属水平热图
Figure 3 Heatmap on genus level of the bacterial symbionts of D. catenatum under two cultivation methods
图 4 2种栽培环境中铁皮石斛组织多糖质量分数
Figure 4 Polysaccharide contents of D. catenatum under two cultivation methods
表 1 2种栽培方式下铁皮石斛内生细菌多样性
Table 1. Diversity of bacterial symbionts of Dendrobium catenatum under two cultivation methods
栽培
方式部位 分类操单元
(OTU)Shannon-Wiener
指数Simpson指数 树培 根 630.67 ± 226.48 a 1.52 ± 0.59 a 0.94 ± 0.09 a 果 447.33 ± 57.84 b 1.58 ± 0.21b 0.92 ± 0.03 b 茎 122.67 ± 26.76 c 0.37 ± 0.20d 0.07 ± 0.04 c 叶 28.33 ± 6.81 c 0.03 ± 0.01 d 0.00 ± 0.00 c 土培 根 112.67 ± 24.19 c 0.34 ± 0.05d 0.06 ± 0.01 c 花 86.67 ± 19.55 c 0.24 ± 0.08d 0.04 ± 0.01 c 茎 310.67 ± 107.58 c 1.62 ± 0.91 c 0.37 ± 0.24 b 叶 73.00 ± 84.92 c 0.27 ± 0.34 d 0.07 ± 0.10 c 说明:数值为3个样品的平均值+标准差;同列不同字母表示差异显著(LSD统计方法，P<0.05) 
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